一種預布微、納米級籽晶蛋白質結晶板的製備方法與流程
2023-05-24 11:35:21
本發明涉及一種結晶板的製備方法，特別是通過穩定的微、納米級交聯蛋白質籽晶提高蛋白質結晶成功率的結晶板。
背景技術：
解析蛋白質晶體結構對了解蛋白質在生命體中的功能具有重要的作用。利用x-射線晶體衍射技術解析蛋白質三維結構的瓶頸是獲得高質量的蛋白質晶體。蛋白質結晶有兩個關鍵步驟，一是獲得較多的蛋白質結晶篩選條件，二是獲得較高質量的能用於x-射線衍射的蛋白質晶體。現在已經有多種可提高蛋白質結晶條件篩選數的方法，例如添加籽晶，控制溫度，採用不同的結晶板等。文獻1：「houh,wangb,husy,etal.acomparativestudyonthequalityofproteincrystalsobtainedusingthecross-diffusionmicrobatchandsitting-dropvapordiffusionmethods[j].crystengcomm,2015,17(29):5365-5371.」報導基於交互擴散的蛋白結晶板可顯著提高蛋白質結晶成功率；文獻2：「d'arcya,villardf,marshm.anautomatedmicroseedmatrix-screeningmethodforproteincrystallization[j].actacrystallographica,2007,63(4):550–554.」報導，添加蛋白質晶體作為蛋白質結晶的籽晶，可以使蛋白質結晶條件篩選數提高2.5～65倍。然而，儘管該技術效果很好，但仍然存在如下問題：1)該技術直接使用蛋白質晶體作為籽晶，但是由於蛋白質晶體非常脆弱、也不穩定，不能在常規實驗室條件下長期儲存或儲存成本昂貴；2)該技術需要在每次結晶實驗前，將籽晶添加到結晶板中，增加了實驗者的人力與時間成本。由於這些原因，該技術在推廣應用方面受到了明顯的限制。
技術實現要素：
為了克服現有技術的不足，本發明提供一種在結晶板上預布交聯微、納米級蛋白質晶體作為籽晶的途徑，能夠在保證結晶條件篩選的優勢的同時，徹底解決籽晶穩定性、使用方便性等問題。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案包括以下步驟：
第一步，配製溶解蛋白質所需的緩衝液；稱取蛋白質溶解於蛋白質緩衝液中製得蛋白質溶液；吸取蛋白質溶液和沉澱劑溶液均勻混合滴入蛋白結晶板的結晶孔中；密封蛋白結晶板，並將結晶板置於4-20℃環境中結晶；
第二步，把蛋白質晶體從蛋白結晶板的結晶孔中轉移到交聯劑中進行交聯；交聯實驗體系放置於4-16℃環境中，反應過程不斷攪拌，12-24小時後製得微、納米級籽晶儲存液；
第三步，配置體積比為0.1～2％的醋酸溶液作為高分子聚合物殼聚糖、聚乙烯醇的溶劑；稱取高分子聚合物，加入到醋酸溶液中，40-60℃下攪拌5-24小時，配製成質量體積比為0.1～1％的高分子聚合物粘合劑；
第四步，用去離子水洗滌蛋白結晶板三次，並置於40-80℃加熱烘乾；將0.1～1％的高分子聚合物粘合劑均勻的塗布於蛋白結晶板上，形成一層0.1～0.5μm厚度均勻的透明高分子聚合物粘合膜；將蛋白結晶板放置在超淨臺中風乾1～10分鐘；
第五步，在每個結晶孔的高分子聚合物粘合膜上散布微、納米級交聯籽晶的懸浮液；將蛋白結晶板恆溫乾燥，直至蛋白結晶板上溶液完全乾燥，即獲得預布微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶、用於提高蛋白質結晶成功率的結晶板。
本發明的有益效果是：
本發明所採用的交聯蛋白質晶體作為籽晶為微、納米級，微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶為蛋白質分子提供晶格匹配，能夠促進蛋白質分子形成有序的分子團簇，降低形核壁壘，伴隨著晶格的外延生長，進而形成晶核。添加微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶使晶體的形核生長過程處於結晶體系溶液濃度較低的狀態，能夠避免蛋白質結晶體系達到較高的濃度形核後蛋白質晶體依然在高濃度下生長。這種方法在增加結晶篩選條件數的基礎上，同時也能提高蛋白質晶體的衍射質量。
本發明所採用的交聯蛋白質晶體籽晶可穩定存在於常溫環境並且可以適應ph等外界條件的變化。未經過交聯處理的蛋白質晶體非常脆弱，很容易被氧化，不能承受大範圍ph值的變動，而且只能儲存於4℃溫度條件下。經過交聯的蛋白質晶體作為籽晶徹底解決了穩定性問題。
本發明所採用高分子聚合物粘合膜可將籽晶牢固黏附於蛋白質結晶板上。
本發明所採用高分子聚合物粘合膜對晶核形成具有促進作用。高分子聚合物粘合膜可以幫助吸附並聚集蛋白質分子，為結晶體系由最初均一的蛋白質分子狀態向無序的類液滴分子團簇狀態過度提供幫助，有利於蛋白質晶體形核。
本發明為提高蛋白質結晶條件篩選數提供一種有效且省時的方法。直接使用蛋白質晶體作為籽晶需要在每次結晶實驗前將籽晶添加到結晶板中，增加了實驗者的人力與時間成本。由於這些原因，該技術在推廣應用方面受到了明顯的限制。而預布微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶的新型結晶板提前將微、納米級交聯蛋白質晶體布到結晶板上，解決了方便性問題。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進一步說明，本發明包括但不僅限於下述實施例。
本發明提供一種預布微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶、用於提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板的製備方法，這種微、納米級交聯蛋白質籽晶可於室溫穩定儲存並且牢固黏附於結晶板上，可有效提高蛋白質結晶條件篩選的成功率，同時，在研究中，直接使用結晶板，可減少散布籽晶的流程，大幅減少研究者的時間和操作成本，能夠取代現有實驗室常用的結晶板，實現更高效的蛋白質結晶條件篩選和優化。
本發明所採用的方案：首先獲得蛋白質晶體並利用交聯方式製得微、納米級交聯蛋白質籽晶儲存液，其次將粘合劑均勻塗布於蛋白結晶板的結晶孔中，在粘合劑上散布微、納米級交聯蛋白質晶體，最後置於恆溫乾燥箱中乾燥處理，即可獲得預布微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶、用於提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板。具體步驟如下：
第一步：獲得蛋白質晶體。a)配製溶解蛋白質所需的緩衝液。b)稱取蛋白質溶解於配製好的蛋白質緩衝液中製得蛋白質溶液。c)用機械手吸取蛋白質溶液和沉澱劑溶液均勻混合滴入蛋白結晶板的結晶孔中。d)密封蛋白結晶板，並將結晶板放入4-20℃控溫箱中結晶；
第二步：利用交聯方式製得交聯微、納米級籽晶。把蛋白質晶體用移液器從蛋白結晶板的結晶孔中轉移到交聯劑中進行交聯。交聯實驗體系放置於4-16℃環境中，反應過程用轉子不斷的進行攪拌，12-24小時後製得微、納米級籽晶儲存液；
第三步：製取高分子聚合物粘合劑。a)配置體積比為0.1-2％的醋酸溶液作為高分子聚合物殼聚糖、聚乙烯醇的溶劑。b)稱取高分子聚合物，加入到0.1-2％的醋酸溶液中，40-60℃下用轉子攪拌5-24小時，配製成質量體積比為0.1-1％的高分子聚合物粘合劑；
第四步：將粘合劑塗布於蛋白結晶板中。a)用去離子水洗滌蛋白結晶板三次，並置於40-80℃烘箱中加熱烘乾。b)用機械手將0.1-1％的高分子聚合物粘合劑均勻的塗布於蛋白結晶板上，形成一層0.1-0.5μm厚度均勻的透明高分子聚合物粘合膜。c)將塗布好0.1-1％的高分子聚合物粘合劑的蛋白結晶板放置在超淨臺中風乾1-10分鐘，以促進高分子聚合物粘合膜中水分及醋酸的揮發；
第五步：將交聯籽晶散布於蛋白結晶板結晶孔的粘合劑上，乾燥後即可獲得新型蛋白質結晶板。a)用機械手在每個結晶孔的高分子聚合物粘合膜上散布上微、納米級交聯籽晶的懸浮液。b)將散布好籽晶的蛋白結晶板置入恆溫乾燥箱中乾燥處理，直至蛋白結晶板上溶液完全乾燥，即可獲得預布微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶、用於提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板。
本發明的實施例主要包括以下兩個方面：1.製備預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板；2.利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板進行蛋白質結晶條件篩選實驗。
製備預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板主要包括以下五個步驟：
第一步：獲得蛋白質晶體；
第二步：利用交聯方式製得交聯微、納米級籽晶；
第三步：製備高分子聚合物粘合劑；
第四步：將粘合劑塗布於蛋白結晶板中；
第五步：將交聯籽晶散布於蛋白結晶板結晶孔的粘合劑上，乾燥後即可獲得新型蛋白質結晶板。
利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板進行蛋白質結晶條件篩選實驗：
第一步：用蛋白質結晶條件篩選試劑盒進行蛋白質結晶條件篩選實驗，將蛋白質與沉澱劑按一定比例混合，加入新型結晶板的結晶孔中，密封結晶板，將結晶板放於20攝氏度控溫箱中結晶；
第二步：統計蛋白質結晶條件篩選數並觀察蛋白質晶體形貌。
實例1
檢測預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板提升了蛋白酶k蛋白質的結晶條件篩選數。
檢測一種預布微、納米級籽晶提高蛋白酶k蛋白質的結晶成功率的新型結晶板的具體方案主要包括以下兩個方面：1.製備預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板；2.利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板進行蛋白酶k蛋白質結晶條件篩選實驗。
製備預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板主要包括以下五個步驟：
第一步：獲得溶菌酶蛋白質晶體。a)配製溶菌酶蛋白質緩衝液：濃度為0.1m，ph為4.6的醋酸鈉緩衝液。b)購買於日本seikagaku公司的溶菌酶蛋白質不再作進一步的純化等處理直接溶入緩衝液中配成終濃度為20mg/ml的蛋白質溶液。c)用機械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl濃度為60mg/ml的氯化鈉溶液混合均勻後滴入蛋白結晶板的結晶孔中。d)用膠帶密封蛋白結晶板，並將蛋白結晶板放入4℃控溫箱中結晶；
第二步：利用戊二醛作為交聯劑製得交聯微、納米級籽晶。把溶菌酶晶體用移液器從結晶板的結晶孔中轉移到溫度為4℃的5％的戊二醛溶液中進行交聯。交聯實驗體系放置於4℃環境中，反應過程用轉子不斷的進行攪拌，24小時後製得微、納米級籽晶儲存液；
第三步：製取0.1％的高分子聚合物殼聚糖粘合劑。a)配置體積比為1％的醋酸溶液作為殼聚糖的溶劑。b)稱取殼聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用轉子攪拌過夜，配製成質量體積比為0.1％的殼聚糖溶液；
第四步：將粘合劑塗布於蛋白結晶板中。a)用去離子水洗滌蛋白結晶板三次，並置於60℃烘箱中加熱烘乾。b)用機械手系統將0.1％的殼聚糖溶液均勻的塗布於蛋白結晶板上，形成一層0.1μm厚度均勻的透明殼聚糖膜。c)將塗布好的0.1％的殼聚糖溶液的蛋白結晶板放置在超淨臺中風乾3分鐘，以促進殼聚糖膜中水分及醋酸的揮發；
第五步：將交聯微、納米籽晶散布於蛋白結晶板結晶孔的粘合劑上，乾燥後即可獲得新型蛋白質結晶板。a)用機械手系統在每個結晶孔的殼聚糖膜上散布微、納米級交聯籽晶懸浮液。b)將散布好籽晶的蛋白結晶板置入60℃的恆溫乾燥箱中乾燥處理，直至蛋白結晶板上溶液完全乾燥，即可獲得預布微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶、用於提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板。
利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板進行蛋白酶k蛋白質的結晶條件篩選實驗：
利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板檢測蛋白酶k蛋白質結晶條件篩選數提升情況主要有三個步驟。第一步：製備蛋白酶k(美國sigma公司no.p6556)溶液，將蛋白酶k溶入ph為3，0.5mhepes-na緩衝溶液中配成終濃度為16mg/ml蛋白質溶液。第二步：利用indextm結晶條件篩選試劑盒進行結晶條件篩選實驗。利用機械手將蛋白質溶液與沉澱劑按照1：1比例混合，在每個結晶孔中加入2μl的混合溶液，密封結晶板，置於20攝氏度控溫箱中結晶7天。實驗組採用預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板，對照組採用普通的蛋白結晶板。第三步：在顯微鏡下統計對照組與實驗組蛋白酶k蛋白質結晶條件篩選數，並觀察晶體形貌。
觀察發現，預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板中晶體形貌優於普通的蛋白結晶板；此外相對於對照組，實驗組的結晶條件篩選數有大幅度提升，結晶條件篩選成功率提高1.6倍。
實例2
檢測預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板提升了過氧化氫酶蛋白質的結晶條件篩選數。
檢測一種預布微、納米級籽晶提高過氧化氫酶蛋白質結晶成功率的新型結晶板的具體方案主要包括以下兩個方面：1.製備預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板；2.利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板進行過氧化氫酶蛋白質結晶條件篩選實驗。
製備預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板主要包括以下五個步驟：
第一步：獲得溶菌酶蛋白質晶體。a)配製溶菌酶蛋白質緩衝液：濃度為0.1m，ph為4.6的醋酸鈉緩衝液。b)購買於日本seikagaku公司的溶菌酶蛋白質不再作進一步的純化等處理直接溶入緩衝液中配成終濃度為20mg/ml的蛋白質溶液。c)用機械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl濃度為60mg/ml的氯化鈉溶液混合均勻後滴入蛋白結晶板的結晶孔中。d)用膠帶密封蛋白結晶板，並將蛋白結晶板放入4℃控溫箱中結晶；
第二步：利用戊二醛作為交聯劑製得交聯微、納米級籽晶。把溶菌酶晶體用移液器從結晶板的結晶孔中轉移到溫度為4℃的5％的戊二醛溶液中進行交聯。交聯實驗體系放置於4℃環境中，反應過程用轉子不斷的進行攪拌，24小時後製得微、納米級籽晶儲存液；
第三步：製取0.1％的高分子聚合物殼聚糖粘合劑。a)配置體積比為1％的醋酸溶液作為殼聚糖的溶劑。b)稱取殼聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用轉子攪拌過夜，配製成質量體積比為0.1％的殼聚糖溶液；
第四步：將粘合劑塗布於蛋白結晶板中。a)用去離子水洗滌蛋白結晶板三次，並置於60℃烘箱中加熱烘乾。b)用機械手系統將0.1％的殼聚糖溶液均勻的塗布於蛋白結晶板上，形成一層0.1μm厚度均勻的透明殼聚糖膜。c)將塗布好的0.1％的殼聚糖溶液的蛋白結晶板放置在超淨臺中風乾3分鐘，以促進殼聚糖膜中水分及醋酸的揮發；
第五步：將交聯微、納米籽晶散布於蛋白結晶板結晶孔的粘合劑上，乾燥後即可獲得新型蛋白質結晶板。a)用機械手系統在每個結晶孔的殼聚糖膜上散布微、納米級交聯籽晶懸浮液。b)將散布好籽晶的蛋白結晶板置入60℃的恆溫乾燥箱中乾燥處理，直至蛋白結晶板上溶液完全乾燥，即可獲得預布微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶、用於提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板。
利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板進行過氧化氫酶蛋白質的結晶條件篩選實驗：
利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板檢測過氧化氫酶蛋白質結晶條件篩選數提升情況主要有三個步驟：第一步：製備過氧化氫酶(美國sigma公司no.c40)溶液，將過氧化氫酶蛋白質溶入ph為3，0.5mhepes-na緩衝溶液中配成終濃度為10mg/ml蛋白質溶液。第二步：利用indextm結晶條件篩選試劑盒進行結晶條件篩選實驗。利用機械手將蛋白質溶液與沉澱劑按照1：1比例混合，在每個結晶孔中加入2μl相應的混合溶液，密封結晶板，置於20攝氏度控溫箱中結晶7天。實驗組採用預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板，對照組採用普通蛋白結晶板。第三步：在顯微鏡下統計對照組與實驗組過氧化氫酶蛋白質結晶條件篩選數，並觀察晶體形貌。
觀察發現，預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板中晶體形貌優於普通蛋白結晶板；相比於對照組，實驗組的結晶條件篩選數有大幅度提升，結晶條件篩選成功率提高2.5倍。
實例3
檢測預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板提升了葡萄糖異構酶蛋白質的結晶條件篩選數。
檢測一種預布微、納米級籽晶提高葡萄糖異構酶蛋白質結晶成功率新型結晶板的具體方案主要包括以下兩個方面：1.製備預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板；2.利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板進行葡萄糖異構酶蛋白質結晶條件篩選數實驗。
製備預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板主要包括以下五個步驟：
第一步：獲得溶菌酶蛋白質晶體。a)配製溶菌酶蛋白質緩衝液：濃度為0.1m，ph為4.6的醋酸鈉緩衝液。b)購買於日本seikagaku公司的溶菌酶蛋白質不再作進一步的純化等處理直接溶入緩衝液中配成終濃度為20mg/ml的蛋白質溶液。c)用機械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl濃度為60mg/ml的氯化鈉溶液混合均勻後滴入蛋白結晶板的結晶孔中。d)用膠帶密封蛋白結晶板，並將蛋白結晶板放入4℃控溫箱中結晶；
第二步：利用戊二醛作為交聯劑製得交聯微、納米級籽晶。把溶菌酶晶體用移液器從結晶板的結晶孔中轉移到溫度為4℃的5％的戊二醛溶液中進行交聯。交聯實驗體系放置於4℃環境中，反應過程用轉子不斷的進行攪拌，24小時後製得微、納米級籽晶儲存液；
第三步：製取0.1％的高分子聚合物殼聚糖粘合劑。a)配置體積比為1％的醋酸溶液作為殼聚糖的溶劑。b)稱取殼聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用轉子攪拌過夜，配製成質量體積比為0.1％的殼聚糖溶液；
第四步：將粘合劑塗布於蛋白結晶板中。a)用去離子水洗滌蛋白結晶板三次，並置於60℃烘箱中加熱烘乾。b)用機械手系統將0.1％的殼聚糖溶液均勻的塗布於蛋白結晶板上，形成一層0.1μm厚度均勻的透明殼聚糖膜。c)將塗布好的0.1％的殼聚糖溶液的蛋白結晶板放置在超淨臺中風乾3分鐘，以促進殼聚糖膜中水分及醋酸的揮發；
第五步：將交聯微、納米籽晶散布於蛋白結晶板結晶孔的粘合劑上，乾燥後即可獲得新型蛋白質結晶板。a)用機械手系統在每個結晶孔的殼聚糖膜上散布微、納米級交聯籽晶懸浮液。b)將散布好籽晶的蛋白結晶板置入60℃的恆溫乾燥箱中乾燥處理，直至蛋白結晶板上溶液完全乾燥，即可獲得預布微、納米級交聯蛋白質晶體作為籽晶、用於提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板。
利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板進行葡萄糖異構酶蛋白質的結晶條件篩選數實驗：
利用預布微、納米級籽晶的新型結晶板檢測葡萄糖異構酶蛋白質結晶條件篩選數提升情況主要有三個步驟：第一步：製備葡萄糖異構酶(美國hamptonresearch公司no.hr7)溶液，將葡萄糖異構酶蛋白質溶入ph為3，0.5mhepes-na緩衝溶液中配成終濃度為18mg/ml的蛋白質溶液。第二步：利用indextm結晶條件篩選試劑盒進行結晶條件篩選實驗。利用機械手將蛋白質溶液與沉澱劑按照1：1比例混合，在每個結晶孔中加入2μl相應的混合溶液，密封結晶板，置於20攝氏度控溫箱中結晶7天。實驗組採用預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板，對照組採用普通蛋白結晶板。第三步：在顯微鏡下統計對照組與實驗組葡萄糖異構酶蛋白質結晶條件篩選數，並觀察晶體形貌。
觀察發現，預布微、納米級籽晶提高蛋白質結晶成功率的新型結晶板中晶體形貌優於普通蛋白質結晶板；相比於對照組，實驗組結晶條件篩選數有大幅度提升，成功率提高4.5倍。