防治腎臟缺血再灌注損傷的藥物組合物的製作方法

2023-10-11 23:37:39 2

專利名稱：：防治腎臟缺血再灌注損傷的藥物組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及埃他卡林或其可藥用鹽用於製備具有對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用、以及防治腎臟缺血再灌注損傷、以及由此導致的急性腎功能衰竭的藥物中的用途。本發明還涉及一種用於防治腎臟缺血再灌注損傷的藥物組合物，其中包含埃他卡林或其可藥用鹽、以及至少一種藥物載體或稀釋劑。
背景技術：
：腎臟缺血-再灌注損傷(IRI)是導致急性腎功能衰竭的主要原因，而且還有著較高的發病率和病死率。同時，缺血再灌注損傷在移植器官發生急性排斥反應和器官功能喪失等方面有著重要意義，可以明顯增加其危險性，導致移植腎臟出現延遲功能衰竭。缺血再灌注損傷的機制是複雜的、多因素的，近年來，研究表明，缺血再灌注後最早發生的兩件事是ATP減少和鉀離子外流。由於鉀離子的調節與內向鉀離子電流有關，因此ATP敏感性鉀通道(KATP)在腎臟缺血性損傷中具有重要作用。臨床上引起腎臟缺血再灌注損傷的原因主要有心血管疾病、膿毒症、創傷、外科手術等。雖然近年來隨著腎臟缺血再灌注損傷的實驗及臨床研究的深入，急性腎衰的治療取得了很大的進展，但是隨著各種臟器手術尤其腎臟移植手術的增加以及一些新的醫療技術的開展，因缺血再灌注所導致的急性腎功能衰竭的發生率卻呈逐年上升的趨勢。目前臨床上用於治療腎衰的藥物主要有利尿劑、心鈉肽、胰島素樣生長因子-l等，但循證醫學尚未證實利尿藥治療能改變急性腎衰竭的臨床病程或降低死亡率。此外，擴血管藥物、鈣拮抗劑、血管緊張素轉換酶、生長因子等也用於腎衰的治療，但療效均不確切。提示目前臨床上應用的治療腎衰竭的藥物，其保護腎臟的作用還遠遠不夠。因此研究對缺血再灌注性腎損傷有預防或治療作用的藥物具有重要的臨床意義。埃他卡林是軍事醫學科學院毒物藥物研究所發現併合成的一類新型K譜開放劑，已於2005年獲得中國發明專利(具有調節鉀通道功能的胺衍生物及其製備方法和應用，中國專利，專利號ZL01101656.6)。埃他卡林是一種新型抗高血壓藥物，但是在現有文獻中，迄今尚未見到埃他卡林用於防治腎臟缺血再灌注損傷、以及由此導致的急性腎功能衰竭的用途。附圖1描述了埃他卡林對缺血再灌注所致大鼠腎臟皮質損傷的保護作用。附圖2描述了埃他卡林對缺血再灌注所致大鼠腎臟髓質損傷的保護作用。
發明內容本發明涉及埃他卡林或其可藥用鹽用於製備具有對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用、以及防治腎臟缺血再灌注損傷、以及由此導致的急性腎功能衰竭的藥物中的用途。本發明還涉及一種用於防治腎臟缺血再灌注損傷的藥物組合物，其中包含埃他卡林或其可藥用鹽、以及至少一種藥物載體或稀釋劑。為了完成本發明之目的，本發明釆取如下技術方案。N-(1-甲基乙基)-2，3-二曱基-2-丁胺(iptakalim，埃他卡林)本發明所述埃他卡林的可藥用鹽選自鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、氬溴酸鹽；或者是乙酸鹽、草酸鹽、檸檬鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、對甲苯磺酸鹽、曱磺酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽和馬來酸鹽。在按照本發明的技術方案，特別優選所述化合物是埃他卡林。埃他卡林的製備和質量檢測方法可以參照中國專利"具有調節鉀通道功能的胺衍生物及其製備方法和應用"(專利號ZL01101656.6)中所述方法進行。其劑型優選為口服劑型，例如片劑、顆粒劑、口服液或膠嚢，優選片劑和膠嚢，口服給藥的每日給藥劑量優選O.5-100mg，更優選2-50mg，特別優選5-20mg，優選每天1-4次，更優選1-2次，療程為1-8周。藥理學研究表明，以缺血再灌注腎臟損傷大鼠為模型，從整體水平觀察埃他卡林對缺血再灌注腎臟損害的實驗預防治療學效果，發現埃他卡林可有效的降低血清尿素氮、肌酐水平，減輕腎臟病理性改變，同時降低缺血再灌注腎臟損傷後大鼠血漿ET-1水平，以及組織ET-1mRNA表達水平，降低細胞的凋亡，促進細胞增生，但對細胞增殖指數無明顯影響。這些結果提示埃他卡林對缺血再灌注腎臟損傷具有保護作用，此作用可能與其抑制血液及腎組織局部ET系統，減少細胞凋亡，促進細胞增生，加速細胞修復有關。本發明的發明人發現埃他卡林及其可藥用鹽是一類具有腎臟缺血再灌注損傷保護作用的新型Katp幵放刑，可用於由腎臟缺血再灌注損傷導致的急性腎功能衰竭的防治。可以按照任意常用方式給予埃他卡林，例如以腸道給藥方式或非腸道給藥方式。以下將結合實施例對本發明作進一步說明，但並不限制本發明的範圍。實施例1埃他卡林對腎臟缺血再灌注損傷大鼠血清尿素氮和肌酐水平的影5響清潔級雄性Wistar大鼠36隻由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，體重220~280g。伺養條件每籠6隻群居飼養，12小時光照/黑暗，室溫(24土1)。C，相對溼度45~60%，自由攝食進水。實驗動物隨機分為6組^假手術組(shamgroup):手術前3d用生理鹽水灌胃，每天2次，每次3ml/kg，第4天早上再灌胃一次，l小時後手術分離腎動靜脈，穿線但不夾閉左腎動靜脈，24小時後剖腹由右心房取靜脈血及腎組織檢查；缺血再灌注組(I/Rgroup):手術夾閉左腎動靜脈，45min後去除無創動脈夾縫合切口，24小時後取血及組織檢查，其他同假手術組；埃他卡林預防組(Iptpretreatedgroups)分另'J以埃他卡林O.5，1.0，1.5，2.Omg/kg代替生理鹽水灌胃，其餘同缺血再灌注組。埃他卡林由北京恩華醫藥研究院有限公司合成，含量大於99.8%，稱取相應量的埃他卡林，溶於生理鹽水中，動物灌胃容積為3ml/kg。大鼠(兩周前已經切除右腎)用3%戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉後左側腹部切口，分離左側腎動靜脈用無創動脈夾夾閉45min後再放開恢復血流24小時，造成急性缺血/再灌注腎損傷大鼠模型。3%戊巴比妥鈉注射液腹腔麻醉後，開胸腹聯合切口，直視下由下腔靜脈抽取2ml血液，靜置30min後，常溫7500g離心，取血清用7150型全自動生化分析儀測定。如表1所示，缺血再灌注損傷能夠明顯降低腎功能，與假手術組比較，血清尿素氮和肌酐水平分別升高500%和800%以上，差別有顯著統計學意義(代O.01)。應用埃他卡林預防後，能夠明顯改善腎功能，降低血清尿素氮和肌酐水平，且成劑量依賴性降低，其中埃他卡林2.Qmg/kg組與缺血再灌注組比較，血清尿素氮和肌酐水平分別降低52.5%和70.8%,差別有顯著統計學意義(屍<0.01)。本實驗的結論埃他卡林可顯著改善缺血再灌注所致的腎臟功能損傷。表1.埃他卡林對腎臟缺血再灌注損傷大鼠血漿尿素氮和肌酐含量的影響tableseeoriginaldocumentpage7i土s,n=6.BUN:尿素氮；Cr:肌酐。與假手術組比較，"代O.01;與缺血再灌注組比較，#屍<0.05，##<0.01。實施例2埃他卡林對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織病理改變的影響埃他卡林來源及動物分組和給藥方式與實施例l相同。將大鼠處死，取出腎臟，以10%福馬林溶液固定。將固定好的腎臟，經酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察腎臟組織形態學改變，進行改良Miller評分每張切片任選12個高倍鏡視野，評分標準如表2。如附圖l和附圖2所示，光鏡下可見假手術組腎小管排列整齊，間質無充血、水腫及炎症細胞浸潤；而缺血再灌注組腎組織損傷明顯加重，腎皮質區近曲小管上皮細胞水腫變性，刷狀緣壞死、脫落明顯，甚至有上皮細胞壞死脫落，腎小管內細胞和蛋白管型較多，腎髓質及皮髓交界處腎小管排列稀疏、紊亂，腎小管擴張明顯，內有粉染的漿液或細胞管型以及蛋白管型，間質充血、水腫。與缺血再灌注組比較埃他卡林組能夠明顯減輕缺血再灌注損傷，表現為減少腎小管上皮細胞的壞死、細胞核和刷狀緣的脫落，減輕細胞間質水腫，減輕腎髓質及皮髓交界處淤血、充血、細胞及蛋白管型，對腎小球無明顯影響。組織病理評分示埃他卡林1.5，2.0mg/kg組(分別為1.83±0.75、1.17±0.75，)與缺血再灌注組(2.57±0.53)比較差別有統計學意義(代O.05)。本實驗的結論埃他卡林可顯著改善缺血再灌注所致的腎臟組織病理損傷。表2.腎組織病理損傷分級標準o級l級2級3級小管上皮細胞壞死脫落未見1-4個視野5.-8個視野9-12個視野小管上皮細胞水腫正常輕度中度重度蛋白管型未見25%視野間質炎性細胞浸潤未見1-4個視野5.-8個視野9-12個視野間質充血或出血未見50%視野小管上皮細胞核分裂像未見1-4個視野5.-8個視野9-12個視野實施例3埃他卡林對腎臟缺血再灌注損傷大鼠血漿ET-1水平的影響埃他卡林來源及動物分組和給藥方式與實施例l相同。採用放免分析方法，應用免疫分離劑分離。以r"標記製備的特異性ET-1多克隆抗體，依據抗原抗體反應原理及竟爭性拮抗原理，根據樣品管中cpm值直接從標準曲線中讀取相應的ET-1含量。按試劑說明將血漿樣品與緩沖液混合，4X:溫育24小時，加入1125標記ET-1混勻4'C溫育24小時，再加入免疫分離劑後室溫方文置20min，4'C7500g離心20min，吸棄上清液，在y計數器上測定cpm數，ET-1單位pgm廠1。如表3所示，大鼠腎臟缺血再灌注後血漿ET-1水平明顯升高，由假手術組的86.5±7.4pg.mr升高到缺血再灌注組的111.8±10.4pg.m1—1，說明ET-1在腎臟缺血再灌注損傷中起了重要的作用。埃他卡林1.5，2.Oing/kg能夠明顯降低血清ET-1水平，與缺血再灌注組比較，差別有顯著統計學意義(代O.01)，與假手術組比較差別有統計學意義(代O.Ol)，說明內皮素水平尚未降低到正常值。本實驗的結論埃他卡林可顯著降低缺血再灌注時的血漿內皮素-1水平。8表3.埃他卡林對腎臟缺血再灌注損傷大鼠血漿內皮素-1含量的影響tableseeoriginaldocumentpage9i±s,n=6.ET-1:內皮素-l。與假手術組比較，"代O.01;與缺血再灌注組比較，卞<0.05，"<0.01。實施例4埃他卡林對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎組織ET-1mRNA表達的影響埃他卡林來源及動物分組和給藥方式與實施例l相同。引物序列為ET-1:有義鏈5，GCTCCTGCTCCTCCTTGATG3，；反義鏈5，CTCGCTCTATGTAAGTCATGG.3，；GAPDH:有義鏈5，TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3，，反義鏈5，AGATCCACAACGGATACATT3，；採用半定量RT-PCR法(l)總RNA的提取按照Gibco公司Trizol總RNA提取試劑操作說明進行，提取腎組織RNA樣品的A26。/A，比值大於1.8，表明沒有蛋白質汙染。(2)反轉錄成cDNA:25u1反應體系中包括2jagRM,Oligo(dT)"0.02jug/jLtl，50raMTris-HCl(pH8.3)，75mMKCI，10mMDTT，0.5mMdNTP，RMase抑制劑25單位，反轉錄酶M-MLV200單位；設置不加反轉錄酶的為陰性對照，加入反轉錄酶M-MLV為啟動反應。混勻，》文入PCR儀，反應條件42。C50min，最後70°C15min終止反應。(3)PCR反應25jh1PCR反應體系中包括10mMTris-HCI，10mMKCl，8mM(NH4)2S04，2.5mMMgCl2，0.2raMdNTP，2jn1cDNA，2.5單位7^《DNA聚合酶，上下遊引物各為lpM。PCR反應條件94'C5min預變性，然後變性94°C30s，退火6tTC，30s，延伸72°Clmin，共30個循環，最後72°C延伸10min。W半定量分析pcr產物取5m1rt-pcr產物進行以瓊脂糖凝膠電泳分析(2%)，用凝膠成像儀對目的條帶進行掃描，用凝膠成像分析軟體進行分析(Labwork4.0)，以內參照基因GAPDH表達量為基準，讀取目的條帶的光密度值(0D)，計算目的條帶與GAPDH基因0D值的比值間接表示目的基因mRNA表達量。如表4所示，缺血再灌注組腎組織ET-1mRNA表達水平均較假手術組大鼠明顯增加，相同實驗條件下，埃他卡林0.5、1.0、1.5、2.0mg/kg均可明顯下調高表達的ET-1mRNA水平。本實驗的結論埃他卡林可逆轉缺血再灌注所致腎臟損傷時腎組織中內皮素-1基因表達水平的病理性增高。表4.埃他卡林對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中內皮素-lmRNA表達的影響tableseeoriginaldocumentpage10i±s,n=5.ET-1:內皮素-l;GAPDH:內參照基因。與假手術組比較,'屍<0.05;與缺血再灌注組比較，#代0.05,##<0.01。權利要求1.N-(1-甲基乙基)-2，3-二甲基-2-丁胺(iptakalim，埃他卡林)或其可藥用鹽用於製備具有對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用、以及防治腎臟缺血再灌注損傷、以及由此導致的急性腎功能衰竭的藥物中的用途。2.根據權利要求1所述的用途，其中所述埃他卡林的可藥用鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽；或者是乙酸鹽、草酸鹽、檸檬鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、對甲苯磺酸鹽、曱磺酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽和馬來酸鹽。3.根據權利要求1或2所述的用途，其中所述藥物的劑型為片劑、顆粒劑、口月良液或膠嚢，優選片劑和膠嚢。4.根據權利要求1或2所述的用途，其中所述藥物口服給藥的每日給藥劑量為0.5-100mg，更優選2-50mg,特別優選5-20mg，每天給藥1-4次，更優選l-2次，療程為1-8周。5.權利要求l所述的用途，其中所述藥物用於防治腎臟缺血再灌注損傷、以及由此導致的急性腎功能衰竭的藥物組合物中的用途。6.—種用於防治腎臟缺血再灌注損傷的藥物組合物，它包含N-(1-甲基乙基)-2，3-二曱基-2-丁胺(iptakalim，埃他卡林)或其可藥用鹽，以及至少一種藥物載體或稀釋劑。7.根據權利要求6所述的用途，其中所述埃他卡林的可藥用鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽；或者是乙酸鹽、草酸鹽、檸檬鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、對曱苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、苯曱酸鹽、乳酸鹽和馬來酸鹽。8.根據權利要求6或7的藥物組合物，其中所述藥物的劑型為片劑、顆粒劑、口服液或膠嚢，優選片劑和膠嚢。全文摘要本發明涉及埃他卡林或其可藥用鹽用於製備具有對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用、以及防治腎臟缺血再灌注損傷、以及由此導致的急性腎功能衰竭的藥物中的用途。本發明還涉及一種用於防治腎臟缺血再灌注損傷的藥物組合物，其中包含埃他卡林或其可藥用鹽、以及至少一種藥物載體或稀釋劑。文檔編號A61P9/10GK101502502SQ20081000484公開日2009年8月12日申請日期2008年2月4日優先權日2008年2月4日發明者呂昌迎,楊永林,海汪,王汝歡,龍超良申請人:北京恩華醫藥研究院有限公司