一種小麥蚜蟲及其寄生蜂的多重PCR檢測試劑盒的製作方法
2024-03-30 12:49:05
本發明涉及多重pcr檢測技術領域，特別是涉及檢測華北地區小麥蚜蟲及其寄生蜂的試劑盒及其應用。
背景技術：
小麥蚜蟲是世界性農業害蟲，在我國小麥產區也廣泛分布，吸食小麥葉片汁液、影響光合作用、傳播小麥病毒病，導致小麥產量和質量嚴重下降。華北地區麥田蚜蟲種類有麥長管蚜sitobionavenae(fabricius)，禾穀縊管蚜rhopalosiphumpadi(linnaeus),麥二叉蚜schizaphisgraminum(rondani)，麥無網長管蚜metopolophiumdirhodum(walker)。小麥蚜蟲種群發生數量大，每年造成麥田大量減產，百株蚜量逾2000，小麥千粒重減少45％。
小麥蚜蟲寄生蜂群落是麥田生態系統中生物種群的重要組成部分，也是影響麥蚜種群變化的重要天敵類群之一。田間小麥蚜蟲的寄生率可達到70-80％，個別田塊甚至達到90％。因此，我們需要對蚜蟲-寄生蜂食物網關係和寄生蜂對蚜蟲的控制效率進行深入全面的研究。傳統的研究方法包括解剖、飼養出蜂和形態學鑑定等，不僅費時費力，且有時由於蚜蟲和寄生蜂體型微小，很難根據形態鑑定特徵鑑定到具體的物種。為了準確評估小麥田寄生蜂對蚜蟲的控制作用，需要建立一套快速準確的分子檢測方法，但目前未有針對麥田蚜蟲和寄生蜂的系統性標準檢測方法。多重pcr檢測技術在pcr檢測技術的基礎上，可以實現同一反應檢測多個物種的目標。所以多重pcr檢測技術不僅具有靈敏度高、特異性強等特點，在同一反應中，同時檢測3-4個物種，不同物種可通過擴增出的不同大小的特異性目標條帶區分，大大提高檢測效率，為準確鑑定物種和評估寄生蜂對蚜蟲的控制作用提供有效手段支撐。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種檢測小麥蚜蟲及其寄生蜂的試劑盒及其應用，以實現對小麥蚜蟲及其寄生蜂的快速檢測，為準確鑑定物種和評估寄生蜂對蚜蟲的控制作用提供有效幫助。
引物是多重pcr的關鍵因素，本發明在設計引物時，(1)首先應該在保守性高的核苷酸片段中選擇特異性較高的引物，但本發明設計引物的同時，不僅考慮了每種目標物種之間的高度保守區，而且還必需保證每段高度保守區之間的特異性，這樣不同的目標物種才易區分開。(2)避免引物之間形成二級結構，例如自身髮夾結構、上下遊引物之間或者是引物與探針之間形成二聚體，同時引物避免與靶基因錯配，如果一個引物與靶基因多個地方結合，會造成非特異性片段出現。(3)引物的3』端必需保持高度保守，在退火過程中，引物的3』端是開始延伸的地方，這樣才能進行最大效率的複製。(4)tm值為設計引物的重要決定因素，為引物的最佳退火溫度提供參考數據，上下遊引物的tm值應可能的接近，同時考慮到所有上下遊引物tm值最多不能超過10℃，為多重pcr做準備。
為實現上述目的，根據線粒體dna序列，設計篩選得到16對分別針對小麥蚜蟲及其寄生蜂特異性引物，如表1。除一般的引物設計原則外，根據以下標準篩選引物：(1)擴增產物大小在100bp-500bp之間；(2)多重pcr檢測體系結果中，不同擴增產物大小相差5bp以上。
表1引物序列信息
由此，本發明首先提供了一種同時檢測4種小麥蚜蟲的特異性引物對組合，含有以下引物對：
用於檢測麥無網長管蚜【metopolophiumdirhodum(walker)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.1-2所示；
用於檢測麥長管蚜【(sitobionavenae(fabricius)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.3-4所示；
用於檢測麥二叉蚜【(schizaphisgraminum(rondani)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.5-6所示；
用於檢測禾穀縊管蚜【(rhopalosiphumpadi(linnaeus)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.7-8所示。
本發明提供了上述特異性引物對組合在製備小麥蚜蟲檢測試劑盒中的用途。
進一步地，本發明提供一種檢測小麥蚜蟲及其寄生蜂的特異性引物對組合，含有以下引物對：
用於檢測麥無網長管蚜【metopolophiumdirhodum(walker)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.1-2所示；
用於檢測麥長管蚜【(sitobionavenae(fabricius)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.3-4所示；
用於檢測麥二叉蚜【(schizaphisgraminum(rondani)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.5-6所示；
用於檢測禾穀縊管蚜【(rhopalosiphumpadi(linnaeus)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.7-8所示；
用於檢測翼蚜外蚜繭蜂(paronvolucrehaliday)的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.9-10所示；
用於檢測烏茲別克蚜繭蜂(aphidiusuzbekistanicusluzhetski)的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.11-12所示；
用於檢測阿爾蚜繭蜂(aphidiuservihaliday)的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.13-14所示；
用於檢測煙蚜繭蜂【aphidiusgifuensis(ashmead)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.15-16所示；
用於檢測脊柄金小蜂屬(asaphes)的通用引物對的核苷酸序列如seqidno.17-18所示；
用於檢測蚜蟲寬緣金小蜂【pachyneuronaphidis(bouché)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.19-20所示；
用於檢測【phaenoglyphisvillosa(hartig)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.21-22所示；
用於檢測alloxystasp1的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.23-24所示；
用於檢測alloxystasp2的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.25-26所示；
用於檢測alloxystasp3的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.27-28所示；
用於檢測合溝細蜂【dendroceruscarpenteri(curtis)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.29-30所示；
用於檢測黃足分盾細蜂【dendroceruslaticeps(hedicke)】的特異性引物對的核苷酸序列如seqidno.31-32所示。
本發明所述的脊柄金小蜂屬asaphes包括寬肩阿莎金小蜂【asaphessuspensus(nees)】和蚜繭蜂金小蜂(asaphesvulgariswalker)。
本發明還提供一種檢測試劑盒，含有上述特異性引物對組合，且所述特異性引物對組合構成3個多重pcr檢測體系和5個單重pcr檢測體系，其中：第1個多重pcr檢測體系所用的特異性引物序列如seqidno.1-8所示；第2個多重pcr檢測體系所用的特異性引物序列如seqidno.9-16所示；第3個多重pcr檢測體系所用的特異性引物序列如seqidno.17-22所示；
5個單重pcr檢測體系所用的特異性引物序列分別如seqidno.23-32所示。
進一步地，本發明的上述試劑盒還包括multiplexmastermix，ddh2o，牛血清蛋白溶液(bsa，10μg/μl)、四甲基氯化銨(tmac，5m)、標準陽性模板。
本發明的試劑盒，其工作程序包括以下步驟：
(1)提取待測樣品的核酸；
(2)以步驟(1)的核酸為模板，分別進行3個多重pcr和5個單重pcr；
(3)分析pcr產物；
第1個多重pcr檢測體系中：
若pcr產物片段為97bp，則為麥無網長管蚜；
若pcr產物片段為156bp，則為麥長管蚜；
若pcr產物片段為296bp，則為麥二叉蚜；
若pcr產物片段為395bp，則為禾穀縊管蚜；
第2個多重pcr檢測體系中：
若pcr產物片段為185bp，則為翼蚜外蚜繭蜂；
若pcr產物片段為246bp，則為烏茲別克蚜繭蜂；
若pcr產物片段為433bp，則為阿爾蚜繭蜂；
若pcr產物片段為554bp，則為煙蚜繭蜂；
第3個多重pcr檢測體系中：
若pcr產物片段為173bp，則為脊柄金小蜂屬；
若pcr產物片段為328bp，則為蚜蟲寬緣金小蜂；
若pcr產物片段為413bp，則為phaenoglyphisvillosa；
5個單重pcr檢測體系中：
若pcr產物片段為244bp，則為alloxystasp1；
若pcr產物片段為193bp，則為alloxystasp2；
若pcr產物片段為223bp，則為alloxystasp3；
若pcr產物片段為100bp，則為合溝細蜂；
若pcr產物片段為137bp，則為黃足分盾細蜂。
所述多重pcr反應，其工作體系為：
所述mp1為第1個多重pcr，mp2為第2個多重pcr，mp3為第3個多重pcr。
進一步地，本發明試劑盒的5個單重pcr體系試劑組分皆為ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；10μm的上下遊引物各1.0μl，dna模板，1.5μl。
本發明試劑盒pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，退火溫度退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環；72℃後延伸10分鐘；各體系退火溫度為：
mp1-mp3分別為第1-3個多重pcr；sp1-sp5分別為第1-5個單重pcr。
本發明提供了上述特異性引物對組合或含有該特異性引物對組合的試劑盒在檢測小麥蚜蟲及其寄生蜂中的應用。
本發明的有益效果在於：本發明根據genbank中公布的基因序列(accessionno.見下表2)，設計一系列特異性引物，而這些引物僅對目標物種有擴增效果，對麥田其它蚜蟲和寄生蜂無擴增能力，產物片段大小和靈敏度dna濃度檢出限見表2。
表2目標物種對應genbank序列號、片段大小及dna濃度檢出限
本發明在小麥蚜蟲、寄生蜂檢測方面具有很高的價值，通過三次多重pcr和五次單重pcr能夠對4種小麥蚜蟲及其12種寄生蜂實現準確檢測，具有靈敏度高、特異性強，耗時短、簡便快速的優點，特別是在檢測大量樣品時，大大縮短檢測時間和降低人力，提高檢測效率，具有良好的應用前景。
附圖說明
圖1為本發明實施例1中mp1混合引物溶液在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結果；從左至右分別為1,2麥無網長管蚜,3,4麥長管蚜,5,6麥二叉蚜,7,8禾穀縊管蚜,9,10翼蚜外蚜繭蜂,11,12烏茲別克蚜繭蜂,13,14阿爾蚜繭蜂,15,16煙蚜繭蜂,17,18寬肩阿莎金小蜂,19,20蚜繭蜂金小蜂,21,22蚜蟲寬緣金小蜂,23,24phaenoglyphisvillosa,25,26alloxystasp.,27,28蚜蟲跳小蜂,29,30syrphophaguseliavae,31,32syrphophagussp.,33,34syrphophagustaeniatus,35,36合溝細蜂,37,38黃足分盾細蜂，「m」代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，「nc」代表陰性對照。
圖2為本發明實施例2中mp2混合引物溶液在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結果；從左至右分別為1,2翼蚜外蚜繭蜂,3,4烏茲別克蚜繭蜂,5,6阿爾蚜繭蜂,7,8煙蚜繭蜂,9,10寬肩阿莎金小蜂,11,12蚜繭蜂金小蜂,13,14蚜蟲寬緣金小蜂,15,16phaenoglyphisvillosa,17,18alloxystasp.,19,20蚜蟲跳小蜂,21,22syrphophaguseliavae,23,24syrphophagussp.,25,26syrphophagustaeniatus,27,28合溝細蜂,29,30黃足分盾細蜂,31,32麥無網長管蚜,33,34麥長管蚜,35,36麥二叉蚜,37,38禾穀縊管蚜，「m」代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，「nc」代表陰性對照。
圖3為本發明實施例3中mp3混合引物溶液在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結果；從左至右分別為1,2寬肩阿莎金小蜂,3,4蚜繭蜂金小蜂,5,6蚜蟲寬緣金小蜂,7,8phaenoglyphisvillosa,9,10翼蚜外蚜繭蜂,11,12烏茲別克蚜繭蜂,13,14阿爾蚜繭蜂,15,16煙蚜繭蜂,17,18alloxystasp.,19,20蚜蟲跳小蜂,21,22syrphophaguseliavae,23,24syrphophagussp.,25,26syrphophagustaeniatus,27,28合溝細蜂,29,30黃足分盾細蜂,31,32麥無網長管蚜,33,34麥長管蚜,35,36麥二叉蚜,37,38禾穀縊管蚜，「m」代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，「nc」代表陰性對照。
圖4為本發明實施例4中sp1目標物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結果；從左至右分別為1,2alloxystasp1,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網長管蚜,9麥長管蚜,10禾穀縊管蚜,11alloxystasp3,12alloxystasp2,13phaenoglyphisvillosa,14蚜蟲跳小蜂,15syrphophaguseliavae,16syrphophagussp.,17syrphophagustaeniatus,18蚜蟲寬緣金小蜂,19合溝細蜂,20黃足分盾細蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖5為本發明實施例5中sp2目標物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結果；從左至右分別為1,2alloxystasp2,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網長管蚜,9麥長管蚜,10禾穀縊管蚜,11alloxystasp1,12alloxystasp3,13phaenoglyphisvillosa,14蚜蟲跳小蜂,15syrphophaguseliavae,16syrphophagussp.,17syrphophagustaeniatus,18蚜蟲寬緣金小蜂,19合溝細蜂,20黃足分盾細蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖6為本發明實施例6中sp3目標物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結果；從左至右分別為1,2alloxystasp3,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網長管蚜,9麥長管蚜,10禾穀縊管蚜,11alloxystasp1,12alloxystasp2,13phaenoglyphisvillosa,14蚜蟲跳小蜂,15syrphophaguseliavae,16syrphophagussp.,17syrphophagustaeniatus,18蚜蟲寬緣金小蜂,19合溝細蜂,20黃足分盾細蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖7為本發明實施例7中sp4目標物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結果；從左至右分別為1,2合溝細蜂,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網長管蚜,9麥長管蚜,10禾穀縊管蚜,11alloxystasp1,12alloxystasp3,13alloxystasp2,14phaenoglyphisvillosa,15蚜蟲跳小蜂,16syrphophaguseliavae,17syrphophagussp.,18syrphophagustaeniatus,19蚜蟲寬緣金小蜂,20黃足分盾細蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖8為本發明實施例8中sp5目標物種特異性引物在各蚜蟲，寄生蜂物種中的檢測結果；從左至右分別為1,2黃足分盾細蜂,3阿爾蚜繭蜂,4煙蚜繭蜂,5烏茲別克蚜繭蜂,6翼蚜外蚜繭蜂,7麥二叉蚜,8麥無網長管蚜,9麥長管蚜,10禾穀縊管蚜,11alloxystasp1,12alloxystasp3,13alloxystasp2,14phaenoglyphisvillosa,15蚜蟲跳小蜂,16syrphophaguseliavae,17syrphophagussp.,18syrphophagustaeniatus,19蚜蟲寬緣金小蜂,20合溝細蜂,21寬肩阿莎金小蜂,22蚜繭蜂金小蜂，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖9為本發明實施例9中mp1混合引物溶液各目標物種的dna濃度梯度檢測結果；從左至右分別為1麥無網長管蚜coi-1000,2麥無網長管蚜coi-500,3麥無網長管蚜coi-100,4麥無網長管蚜coi-50,5麥無網長管蚜coi-10,6麥無網長管蚜coi-5,7麥長管蚜coi-1000,8麥長管蚜coi-500,9麥長管蚜coi-100,10麥長管蚜coi-50,11麥長管蚜coi-10,12麥長管蚜coi-5,13麥二叉蚜coi-1000,14麥二叉蚜coi-500,15麥二叉蚜coi-100,16麥二叉蚜coi-50,17麥二叉蚜coi-10,18麥二叉蚜coi-5,19禾穀縊管蚜coi-1000,20禾穀縊管蚜coi-500,21禾穀縊管蚜coi-100,22禾穀縊管蚜coi-50,23禾穀縊管蚜coi-10,24禾穀縊管蚜coi-5,25mssrmixcoi-1000,26mssrmixcoi-500,27mssrmixcoi-100,28mssrmixcoi-50,29mssrmixcoi-10,30mssrmixcoi-5，「m」代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，「nc」代表陰性對照。
圖10為本發明實施例10中mp2混合引物溶液各目標物種的dna濃度梯度檢測結果；從左至右分別為1翼蚜外蚜繭蜂coi-1000,2翼蚜外蚜繭蜂coi-500,3翼蚜外蚜繭蜂coi-100,4翼蚜外蚜繭蜂coi-50,5翼蚜外蚜繭蜂coi-10,6翼蚜外蚜繭蜂coi-5,7烏茲別克蚜繭蜂coi-1000,8烏茲別克蚜繭蜂coi-500,9烏茲別克蚜繭蜂coi-100,10烏茲別克蚜繭蜂coi-50,11烏茲別克蚜繭蜂coi-10,12烏茲別克蚜繭蜂coi-5,13阿爾蚜繭蜂coi-1000,14阿爾蚜繭蜂coi-500,15阿爾蚜繭蜂coi-100,16阿爾蚜繭蜂coi-50,17阿爾蚜繭蜂coi-10,18阿爾蚜繭蜂coi-5,19煙蚜繭蜂coi-1000,20煙蚜繭蜂coi-500,21煙蚜繭蜂coi-100,22煙蚜繭蜂coi-50,23煙蚜繭蜂coi-10,24煙蚜繭蜂coi-5,25paaamixcoi-1000,26paaamixcoi-500,27paaamixcoi-100,28paaamixcoi-50,29paaamixcoi-10,30paaamixcoi-5，「m」代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，「nc」代表陰性對照。
圖11為本發明實施例11中mp3混合引物溶液各目標物種的dna濃度梯度檢測結果；從左至右分別為1寬肩阿莎金小蜂coi-1000,2寬肩阿莎金小蜂coi-500,3寬肩阿莎金小蜂coi-100,4寬肩阿莎金小蜂coi-50,5寬肩阿莎金小蜂coi-10,6寬肩阿莎金小蜂coi-5,7蚜繭蜂金小蜂coi-1000,8蚜繭蜂金小蜂coi-500,9蚜繭蜂金小蜂coi-100,10蚜繭蜂金小蜂coi-50,11蚜繭蜂金小蜂coi-10,12蚜繭蜂金小蜂coi-5,13蚜蟲寬緣金小蜂coi-1000,14蚜蟲寬緣金小蜂coi-500,15蚜蟲寬緣金小蜂coi-100,16蚜蟲寬緣金小蜂coi-50,17蚜蟲寬緣金小蜂coi-10,18蚜蟲寬緣金小蜂coi-5,19p.villosacoi-1000,20p.villosacoi-500,21p.villosacoi-100,22p.villosacoi-50,23p.villosacoi-10,24p.villosacoi-5,25aappmixcoi-1000,26aappmixcoi-500,27aappmixcoi-100,28aappmixcoi-50,29aappmixcoi-10,30aappmixcoi-5，「m」代表dnamarker(20bpdnaladder,takara)，「nc」代表陰性對照。
圖12為本發明實施例12中sp1目標物種特異性引物dna濃度梯度檢測結果；從左至右分別為1alloxystasp1.16s-1000,2alloxystasp1.16s-500,3alloxystasp1.16s-100,4alloxystasp1.16s-50,5alloxystasp1.16s-10,6alloxystasp1.16s-5，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖13為本發明實施例13中sp2目標物種特異性引物dna濃度梯度檢測結果；從左至右分別為1alloxystasp2.16s-1000,2alloxystasp2.16s-500,3alloxystasp2.16s-100,4alloxystasp2.16s-50,5alloxystasp2.16s-10,6alloxystasp2.16s-5，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖14為本發明實施例14中sp3目標物種特異性引物dna濃度梯度檢測結果；從左至右分別為1alloxystasp3.16s-1000,2alloxystasp3.16s-500,3alloxystasp3.16s-100,4alloxystasp3.16s-50,5alloxystasp3.16s-10,6alloxystasp3，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖15為本發明實施例15中sp4目標物種特異性引物dna濃度梯度檢測結果；從左至右分別為1合溝細蜂16s-1000,2合溝細蜂16s-500,3合溝細蜂16s-100,4合溝細蜂16s-50,5合溝細蜂16s-10,6合溝細蜂16s-5，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
圖16為本發明實施例16中sp5目標物種特異性引物dna濃度梯度檢測結果；從左至右分別為1黃足分盾細蜂16s-1000,2黃足分盾細蜂16s-500,3黃足分盾細蜂16s-100,4黃足分盾細蜂16s-50,5黃足分盾細蜂16s-10,6黃足分盾細蜂16s-5，「m」代表dnamarker(50bpdnaladder,天根)，「nc」代表陰性對照。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。
實施例1多重pcr體系mp1對目標物種的特異性擴增效果
1、目標蚜蟲物種基因組的製備
單頭麥無網長管蚜、麥長管蚜、麥二叉蚜和禾穀縊管蚜分別放入1.5ml離心管中進行組織研磨並提取dna，將貯存不同蚜蟲dna溶液的離心管標註上物種名，-20℃備用。
2、合成多重pcr體系mp1中所需引物，見表1中的mp1體系對應的4對引物。將各對引物按比例配製成混合引物溶液，各條引物在反應體系中的終濃度為見表1。
3、pcr擴增反應體系以10μl計，包括ddh2o，2.0μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；primermix，1.0μl；10μg/μlbsa，0.5μl和dna模板，1.5μl。
pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，63℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
4、pcr產物鑑定取5.0μlpcr擴增產物，200v電壓下，用4％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經gelred染色後，在凝膠成像儀中可以顯示擴增dna條帶，根據條帶大小判斷是否為目標物種及混合引物溶液特異性。
5、結果以mp1體系中目標蚜蟲物種(麥無網長管蚜、麥長管蚜、麥二叉蚜和禾穀縊管蚜)為模板，並以麥田常見寄生蜂種類15種為對照進行pcr擴增，結果如圖1所示，僅有1、2泳道對應的麥無網長管蚜擴增出97bp的條帶，3、4泳道對應的麥長管蚜擴增出156bp的條帶，5、6泳道對應的麥二叉蚜擴增出296bp的條帶，7、8泳道對應的禾穀縊管蚜擴增出395bp的條帶，即mp1的引物僅對目標物種dna具有擴增作用，說明本發明的引物特異性強。回收上述目標物種條帶，測序所得條帶如seqidno.33、34、35、36。
實施例2多重pcr體系mp2對目標物種的特異性擴增效果
1、目標寄生蜂物種基因組的製備
單頭翼蚜外蚜繭蜂、烏茲別克蚜繭蜂、阿爾蚜繭蜂和煙蚜繭蜂分別放入1.5ml離心管中進行組織研磨並提取dna，將貯存不同寄生蜂dna溶液的離心管標註上物種名，-20℃備用。
2、合成多重pcr體系mp2中所需引物見表1中的mp2體系對應的引物。將各對引物按比例配製成混合引物溶液，各條引物在反應體系中的終濃度表1。
3、pcr擴增反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.8μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；primermix，1.0μl；10μg/μlbsa，0.5μl；5mtmac，0.2μl和dna模板，1.5μl。
pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，61℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
4、pcr產物鑑定取5.0μlpcr擴增產物，200v電壓下，用4％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經gelred染色後，在凝膠成像儀中可以顯示擴增dna條帶，根據條帶大小判斷是否為目標物種及混合引物溶液特異性。
5、結果以mp2體系中目標蚜蟲物種(翼蚜外蚜繭蜂、烏茲別克蚜繭蜂、阿爾蚜繭蜂和煙蚜繭蜂)為模板，並以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類15種為對照進行pcr擴增，結果如圖2所示，僅有1、2泳道對應的翼蚜外蚜繭蜂擴增出185bp的條帶，3、4泳道對應的烏茲別克蚜繭蜂擴增出246bp的條帶，5、6泳道對應的阿爾蚜繭蜂擴增出433bp的條帶，7、8泳道對應的煙蚜繭蜂擴增出554bp的條帶，即mp1的引物僅對目標物種dna具有擴增作用，說明本發明的引物特異性強。回收上述目標物種條帶，測序所得條帶如seqidno.37、38、39、40。
實施例3多重pcr體系mp3對目標物種的特異性擴增效果
1、目標寄生蜂物種基因組的製備
脊柄金小蜂屬、蚜蟲寬緣金小蜂和phaenoglyphisvillosa提取方法參見實施例2。
2、合成多重pcr體系mp3中所需引物，體系中引物序列和各條引物在反應體系中的終濃度見表1。
3、pcr擴增反應體系以10μl計，包括ddh2o，2.0μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；primermix，1.0μl；10μg/μlbsa，0.5μl和dna模板，1.5μl。
pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，58℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
4、pcr產物鑑定取5.0μlpcr擴增產物，200v電壓下，用4％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經gelred染色後，在凝膠成像儀中可以顯示擴增dna條帶，根據條帶大小判斷是否為目標物種及混合引物溶液特異性。
5、結果以mp3體系中目標蚜蟲物種(寬肩阿莎金小蜂、蚜繭蜂金小蜂、蚜蟲寬緣金小蜂和phaenoglyphisvillosa)為模板，並以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類15種為對照進行pcr擴增，結果如圖3所示，僅有1、2泳道對應的寬肩阿莎金小蜂擴增出173bp的條帶，3、4泳道對應的蚜繭蜂金小蜂擴增出173bp的條帶，5、6泳道對應的蚜蟲寬緣金小蜂擴增出328bp的條帶，7、8泳道對應的phaenoglyphisvillosa擴增出413bp的條帶，即mp1的引物僅對目標物種dna具有擴增作用，說明本發明的引物特異性強。回收上述目標物種條帶，測序所得條帶如seqidno.41、42、43。
實施例4單重pcr體系sp1對目標物種的特異性擴增效果
1、alloxystasp1基因組的製備參見實施例2。
2、合成alloxystasp1的特異性引物見表1。
3、pcr擴增反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；上下遊引物各1.0μl；dna模板，1.5μl。
pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，58℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
4、pcr產物鑑定取5.0μlpcr擴增產物，200v電壓下，用2％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經gelred染色後，在凝膠成像儀中可以顯示擴增dna條帶，根據條帶大小判斷是否為目標物種及混合引物溶液特異性。
5、結果以sp1體系中alloxystasp1為模板，並以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進行pcr擴增，結果如圖4所示，僅有1、2泳道對應的alloxystasp1擴增出244bp的條帶，sp1的引物僅對目標物種dna具有擴增作用，說明本發明的引物特異性強。回收上述目標物種條帶，測序所得條帶如seqidno.44。
實施例5單重pcr體系sp2對目標物種的特異性擴增效果
1、alloxystasp2基因組的製備參見實施例2。
2、alloxystasp2的特異性引物見表1。
3、pcr擴增反應體系以10μl計，參見實施例4。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，58℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
4、pcr產物鑑定取5.0μlpcr擴增產物，200v電壓下，用2％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經gelred染色後，在凝膠成像儀中可以顯示擴增dna條帶，根據條帶大小判斷是否為目標物種及混合引物溶液特異性。
5、結果以sp2體系中alloxystasp2為模板，並以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進行pcr擴增，結果如圖5所示，僅有1、2泳道對應的alloxystasp2擴增出193bp的條帶，sp2的引物僅對目標物種dna具有擴增作用，說明本發明的引物特異性強。回收上述目標物種條帶，測序所得條帶如seqidno.45。
實施例6單重pcr體系sp3對目標物種的特異性擴增效果
1、alloxystasp3基因組的製備參見實施例2。
2、合成alloxystasp3的特異性引物見表1。
3、pcr擴增體系見實施例4，pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，58℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
4、pcr產物鑑定
取5.0μlpcr擴增產物，200v電壓下，用2％瓊脂糖凝膠電泳分離。凝膠電泳經gelred染色後，在凝膠成像儀中可以顯示擴增dna條帶，根據條帶大小判斷是否為目標物種及混合引物溶液特異性。
5、結果以sp3體系中alloxystasp3為模板，並以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進行pcr擴增，結果如圖6所示，僅有1、2泳道對應的alloxystasp3擴增出223bp的條帶，sp2的引物僅對目標物種dna具有擴增作用，說明本發明的引物特異性強。回收上述目標物種條帶，測序所得條帶如seqidno.46。
實施例7單重pcr體系sp4對目標物種的特異性擴增效果
1、合溝細蜂基因組的製備參見實施例2。
2、合成合溝細蜂的特異性引物見表1。
3、pcr擴增反應體系以10μl計，參見實施例4。
pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，62℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
4、pcr產物鑑定參見實施例6。
5、結果以sp4體系中合溝細蜂為模板，並以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進行pcr擴增，結果如圖7所示，僅有1、2泳道對應的合溝細蜂擴增出100bp的條帶，sp4的引物僅對目標物種dna具有擴增作用，說明本發明的引物特異性強。回收上述目標物種條帶，測序所得條帶如seqidno.47。
實施例8單重pcr體系sp5對目標物種的特異性擴增效果
1、黃足分盾細蜂基因組的製備同實施例2。
2、合成黃足分盾細蜂的特異性引物見表1。
3、pcr擴增反應體系以10μl計參見實施例4。
pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，63℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
4、pcr產物鑑定同實施例6。
5、結果以sp5體系中黃足分盾細蜂為模板，並以麥田常見蚜蟲、寄生蜂種類20種為對照進行pcr擴增，結果如圖8所示，僅有1、2泳道對應的合溝細蜂擴增出137bp的條帶，sp4的引物僅對目標物種dna具有擴增作用，說明本發明的引物特異性強。回收上述目標物種條帶，測序所得條帶如seqidno.48。
實施例9多重pcr體系mp1對目標物種最低檢出限的測定
1、通用引物擴增按實施例1提取單頭麥無網長管蚜、麥長管蚜、麥二叉蚜和禾穀縊管蚜dna，coi通用引物(forward:5』-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3』,reverse:5』-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3』)擴增，反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
2、檢出限測定pcr產物送測序並檢測濃度，計算拷貝數，原模板溶液單獨進行稀釋並混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴增的模板，反應體系和條件同實施例1中的描述。pcr擴增產物也按實施例1中的凝膠電泳分析判斷。
3、結果如圖9所示，單獨dna模板檢出限皆為50拷貝，混合dna模板達到100拷貝。
實施例10多重pcr體系mp2對目標物種最低檢出限的測定
1、通用引物擴增按實施例2提取單頭翼蚜外蚜繭蜂、烏茲別克蚜繭蜂、阿爾蚜繭蜂和煙蚜繭蜂dna，coi通用引物(forward:5』-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3』,reverse:5』-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3』)擴增，反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
2、檢出限測定pcr產物送測序並檢測濃度，計算拷貝數，原模板溶液單獨進行稀釋並混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴增的模板，反應體系和條件同實施例2中的描述。pcr擴增產物也按實施例2中的凝膠電泳分析判斷。
3、結果如圖10所示，單獨dna模板檢出限皆為50拷貝，混合dna模板達到100拷貝。
實施例11多重pcr體系mp3對目標物種最低檢出限的測定
1、通用引物擴增按實施例3提取脊柄金小蜂屬、蚜蟲寬緣金小蜂和phaenoglyphisvillosa的dna，16s通用引物(forward:5』-cacctgtttatcaaaaacat-3』,reverse:5』-tcgatttgaactcaratcatgta-3』)擴增寬肩阿莎金小蜂和蚜繭蜂金小蜂序列，coi通用引物(forward:5』-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3』,reverse:5』-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3』)擴增蚜蟲寬緣金小蜂和phaenoglyphisvillosa，反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
2、檢出限測定pcr產物送測序並檢測濃度，計算拷貝數，原模板溶液單獨進行稀釋並混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴增的模板，反應體系和條件同實施例3中的描述。pcr擴增產物也按實施例3中的凝膠電泳分析判斷。
3、結果如圖11所示，單獨dna模板檢出限皆為10拷貝，混合dna模板達到100拷貝。
實施例12單重pcr體系sp1對alloxystasp1最低檢出限的測定
1、通用引物擴增按實施例4提取單頭alloxystasp1的dna，16s通用引物(forward:5』-cacctgtttatcaaaaacat-3』,reverse:5』-tcgatttgaactcaratcatgta-3』)擴增，反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
2、檢出限測定pcr產物送測序並檢測濃度，計算拷貝數，原模板溶液單獨進行稀釋並混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴增的模板，反應體系和條件同實施例4中的描述。pcr擴增產物也按實施例4中的凝膠電泳分析判斷。
3、結果如圖12所示單獨dna模板檢出限為50拷貝。
實施例13單重pcr體系sp2對alloxystasp2最低檢出限的測定
1、通用引物擴增按實施例5提取單頭alloxystasp2的dna，16s通用引物(forward:5』-cacctgtttatcaaaaacat-3』,reverse:5』-tcgatttgaactcaratcatgta-3』)擴增，反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
2、檢出限測定pcr產物送測序並檢測濃度，計算拷貝數，原模板溶液單獨進行稀釋並混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴增的模板，反應體系和條件同實施例5中的描述。pcr擴增產物也按實施例5中的凝膠電泳分析判斷。
3、結果如圖13所示，單獨dna模板檢出限為500拷貝。
實施例14單重pcr體系sp3對alloxystasp3最低檢出限的測定
1、通用引物擴增按實施例6提取單頭alloxystasp3的dna，16s通用引物(forward:5』-cacctgtttatcaaaaacat-3』,reverse:5』-tcgatttgaactcaratcatgta-3』)擴增，反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
2、檢出限測定pcr產物送測序並檢測濃度，計算拷貝數，原模板溶液單獨進行稀釋並混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴增的模板，反應體系和條件同實施例6中的描述。pcr擴增產物也按實施例6中的凝膠電泳分析判斷。
3、結果如圖14所示，單獨dna模板檢出限為500拷貝。
實施例15單重pcr體系sp4對合溝細蜂最低檢出限的測定
1、通用引物擴增按實施例6提取單頭合溝細蜂的dna，coi通用引物(forward:5』-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3』,reverse:5』-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3』)擴增，反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
2、檢出限測定pcr產物送測序並檢測濃度，計算拷貝數，原模板溶液單獨進行稀釋並混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴增的模板，反應體系和條件同實施例7中的描述。pcr擴增產物也按實施例7中的凝膠電泳分析判斷。
3、結果如圖15所示，單獨dna模板檢出限為500拷貝。
實施例16單重pcr體系sp5對黃足分盾細蜂最低檢出限的測定
1、通用引物擴增按實施例6提取單頭黃足分盾細蜂的dna，coi通用引物(forward:5』-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3』,reverse:5』-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3』)擴增，反應體系以10μl計，包括ddh2o，1.5μl；2×multiplexpcrmastermix，5.0μl；forwardprimer(10μm)，1.0μl；reverseprimer(10μm)，1.0μl和dna模板，1.5μl。pcr反應條件為：95℃預變性15分鐘；94℃變性30秒，50℃退火1分鐘30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環。
2、檢出限測定pcr產物送測序並檢測濃度，計算拷貝數，原模板溶液單獨進行稀釋並混合，分別為1000、500、100、50、10和5拷貝數。取1.0μl稀釋溶液作pcr擴增的模板，反應體系和條件同實施例7中的描述。pcr擴增產物也按實施例7中的凝膠電泳分析判斷。
3、結果如圖16所示，單獨dna模板檢出限為500拷貝。
sequencelisting
中國農業科學院植物保護研究所
一種小麥蚜蟲及其寄生蜂的多重pcr檢測試劑盒
khp171112741.5
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