造血幹細胞基因治療方法

2023-05-19 23:05:06

專利名稱：造血幹細胞基因治療方法
技術領域：
本發明屬於基因治療領域。更特別地，本發明涉及通過刺激患者的胸腺並對造血幹細胞(HSC)或骨髓進行基因治療來對患者的免疫系統進行改造。
與本發明相關的背景技術免疫系統免疫系統的主要功能是區別「外來」和「自身」抗原並相應地進行應答，以保護機體不受感染。在正常的免疫應答中，事件的序列涉及專一性抗原呈遞細胞(APC，antigen presenting cells)捕獲外來抗原並將它處理成小的肽片段，這些肽片段在APC表面呈現為主要組織相容性複合物(MHC)的裂片(clefts)。該MHC分子可為I型(在所有有核細胞上表達，被細胞毒性T細胞(Tc)識別)或II型(主要經免疫系統細胞進行表達，被輔助T細胞(Th)識別)。Th細胞識別APC上的MHCII/肽複合物並進行應答；然後這些細胞釋放的因子可提高Tc細胞或產生B細胞的抗體(這些B細胞對特定抗原具有特異性)的活性。Th細胞在事實上所有免疫應答中的重要性在HIV/AIDS中有最好的體現，其中HIV/AIDS就是因為病毒破壞Th細胞導致Th細胞缺乏，從而引起嚴重免疫缺陷並最終導致死亡。Th細胞的不正常發育(和Tc，但程度較輕)能導致多種其他疾病如過敏症、癌症、和自身免疫病。
T淋巴細胞和B淋巴細胞的細胞膜受體具有識別抗原的能力。這些受體由許多可能基因的複雜重排序列隨機產生，因此每一個獨立的T或B細胞具有獨一無二的抗原受體。這種巨大的潛在多樣性意味著對機體可能遇到的任何單個抗原，多種淋巴細胞都能以不同的結合強度(親和力)對它進行識別，並且產生不同程度的應答。既然抗原受體的特異性隨機產生，因而產生了如下問題為什麼身體中的淋巴細胞不會和自身抗原反應產生「自我摧毀」。幸運的是有許多機制阻止T和B細胞這樣做—它們共同形成免疫系統對自身耐受的環境。
自身耐受最有效的方式是將所有具有潛在反應性的淋巴細胞從它們產生的部位(T細胞在胸腺，B細胞在骨髓)除去(殺死)。所述方式稱為中心耐受(central tolerance)。另一種重要的附加耐受方式是通過調節Th細胞，其可直接地或更有可能地通過細胞因子來抑制自身反應性細胞。鑑於事實上所有免疫應答的引發和調節都需要通過Th細胞，因此任何耐受誘導療法的主要靶向均是這類細胞。同樣地，既然Tc細胞是非常重要的效應細胞，因此對例如抗癌和抗病毒療法而言，產生此類細胞是這些治療策略的主要目標。
胸腺胸腺經證實是免疫系統中的主要器官，因為它是T淋巴細胞產生的主要部位。它的作用是從血液中吸引適當的源於骨髓的前體細胞，並且誘導他們對T細胞譜系的支持(commitment)，其中包括產生抗原的T細胞受體(TCR)所必需的基因重組。與此相聯繫的是程度明顯的細胞分裂，從而增加T細胞數量，由此增加每個外來抗原被識別和消除的可能性。然而，和B細胞不同的是，T細胞識別抗原的很奇怪的特徵是TCR只識別與MHC分子物理上相連的肽片段；一般這是自身MHC並且在胸腺中獲取這種能力。此過程稱為正選擇並且是皮質上皮細胞獨有的特性。如果TCR未能和自身MHC/肽複合物結合，該T細胞將會被「忽略」而死亡—它的繼續成熟需要一定程度的TCR介導信號。
雖然胸腺是功能免疫系統的基礎，每天釋放約1％的T細胞進入血液，哺乳動物的明顯異常之一是，由於性類固醇的產生，該器官會嚴重萎縮。該萎縮甚至在兒童階段就開始發生並在青春期更加明顯。對正常的健康個體而言，這種新的T細胞的產生和釋放的損失並不總是產生臨床效果(儘管隨年齡增長，免疫有關的疾病的發病率和嚴重程度也隨之增加)。當大量喪失T細胞時，如患有AIDS並接受化療或放療時，患者對疾病高度敏感，因為免疫受到抑制。
許多T細胞會繼續發育，然而，其可偶然地(具有較高的親和力)識別自身MHC/肽複合物。這種T細胞因而具有潛在的自身反應性並能引發嚴重的自身免疫病，例如多發性硬化症、關節炎、糖尿病、甲狀腺炎、和系統性紅斑狼瘡(SLE)。幸運的是，如果在胸腺中TCR對自身MHC/肽複合物的親和力太高，正在發育的胸腺細胞就會經誘導產生自殺活性並且通過細胞凋亡而死亡，此過程稱為負選擇。這稱為中心耐受。這種T細胞死亡而不發生應答，因為在胸腺中它們仍未成熟。胸腺中這種負選擇的最有力誘導物是稱為樹突狀細胞(DC)的APC。作為APC，它們給T細胞傳送最強信號；在胸腺中這過程會導致消除，在T細胞更為成熟的外周淋巴器官中，DC起到激活的作用。
胸腺萎縮胸腺在很大程度上受到與神經內分泌系統雙相交流的影響(Kendall，1998)。垂體、腎上腺、和性腺之間的相互作用對胸腺功能的影響尤其重要，包括營養(促甲狀腺激素或TSH，和生長激素或GH)和萎縮的影響(促黃體激素或LH，促卵泡激素或FSH，和促腎上腺皮質激素或ACTH)(Kendall，1988；Homo-Delarche，1991)。事實上胸腺生理學的一個重要特徵是其結構和功能的進行性退化，其與在青春期循環血中性類固醇產生的增加成比例(Hirokawa and Makinodan，1975；Tosi et al.，1982 and Hirokawa，etal.，1994)。誘導胸腺萎縮的激素靶點和機制還有待確定。因為胸腺是產生和維持外周T細胞庫的基本生產和維持位點，所以普遍認為這種萎縮是老年人中免疫紊亂發病率增加的主要原因。特別地，由T細胞依賴的免疫功能(比如溶細胞T細胞的活力和促有絲分裂反應)的下降而說明的免疫系統缺陷，可以從老年時期免疫缺陷、自身免疫以及腫瘤(tumor load)的發病升高得到反映(Hirokawa，1998)。
胸腺萎縮的影響可反映在外周中，隨著胸腺對T細胞庫的輸入減少致使T細胞受體(TCR)免疫細胞庫的多樣性減少。還觀察到細胞因子改變(Hobbs等，1993；Kurashima等，1995)、CD4+和CD8+亞群的變化、和傾向於記憶細胞(與純真T細胞相對)(Mackall等，1995)。進一步而言，胸腺生成(thymopoiesis)的效率隨著年齡下降，以致在T細胞耗竭後免疫系統重新生成正常數量T細胞的能力最終喪失(Mackall等，1995)。然而，最近的研究表明(Douek等，1998)，即使在老年人中胸腺輸出仍然存在。TCR基因重組後的DNA酶切產物顯示在HIV感染的老年患者中存在新生的循環純真T細胞。因為接受化療的青春期後的患者與青春期前的患者相比T細胞庫(尤其是CD4+T細胞)的再生速率明顯降低，所以這種輸出和其後的外周T細胞庫再生的速率有待進一步研究(Mackall等，1995)。Timm和Thoman的最近研究進一步證明了這一點(1999)，研究表明，對老年小鼠進行骨髓移植(BMT)後，儘管CD4+T細胞得到再生，但由於外周微環境的老化，它們似乎對記憶細胞表現出偏離(bias)，這與胸腺貧乏產生純真T細胞相關。
胸腺基本上由分散在多樣化的基質細胞(主要是上皮細胞亞群)中的正在發育的胸腺細胞組成，這些基質細胞構成微環境並提供T細胞的最佳發育所必要的生長因子和細胞相互作用。胸腺細胞和上皮細胞亞群之間的共生發育關係(其控制它們的分化和成熟)(Boyd等，1993)，意味著在任何細胞類型的水平都會出現性類固醇抑制，一種類型細胞會影響另一種類型細胞的狀態。胸腺細胞自身有內在缺陷的可能性比較小，因為以往的利用輻射嵌合體進行的研究表明骨髓(BM)幹細胞不受年齡的影響(Hirokawa，1998；Mackall and Gress，1997)並且老年骨髓細胞胸腺再生能力與新生骨髓細胞相似。進一步而言，老年動物中的胸腺細胞保持一定的分化能力(Mackall and Gress，1997；George and Ritter，1996；Hirokawa etal.，1994)。然而，Aspinall最近研究(1997)發現，在前體CD3-CD4-CD8-三陰性(TN)群體中的缺陷發生於TCRγ鏈基因重組時期。
發明簡述本發明涉及利用遺傳修飾的HSC、淋巴或骨髓性祖細胞、上皮幹細胞、或其組合(該組和其中每個成員在本文稱為「GM細胞」)，其給予正激活的胸腺，從而進行基因治療的方法。在優選的具體實施例中，年齡較大(青春期後)患者的萎縮胸腺被激活。經激活後的胸腺能夠從血液中吸收HSC和骨髓細胞(優選為經遺傳修飾和/或外源的細胞)並在胸腺中將它們轉化成新的T細胞和DC。
本發明的一個方面提供治療患者T細胞紊亂的方法，該方法包括對患者體內傳向胸腺的性類固醇介導的信號進行阻斷並對患者進行骨髓或HSC移植。
在一個具體實施例中，T細胞紊亂具有已定義的基因基礎。
在優選的具體實施例中，T細胞紊亂是選自由病毒感染(如由人免疫缺陷病毒(HIV)所感染)、T細胞功能紊亂、和任何其他直接或間接減低T細胞數量或功能的疾病或情況組成的組。
在優選的具體實施例中，HSC經遺傳修飾，從而在胸腺激活期間和以後形成的T細胞中對HIV產生抗性。例如，HSC經修飾以包括其產物能在T細胞中幹擾HIV感染、功能、和/或複製的基因。
在另一個方面，本發明提供了防止感染物質如HIV進行感染的方法。在胸腺激活的同時，給患者注射GM，其中GM已經過遺傳修飾從而抵抗或防止感染物的感染、活性、複製等、和其組合。
在另一個方面，本發明提供了通過阻斷性類固醇介導的信號來實現胸腺的再激活。在一個具體實施例中，用閹割的方法來阻斷性類固醇介導的信號。在優選的具體實施例中，採用化學閹割。在另一個具體實施例中，採用手術閹割。閹割使胸腺的狀態恢復到青春期前，由此使胸腺重新激活。
在特定的具體實施例中，對傳向胸腺的性類固醇介導的信號的阻斷是通過給予LHRH的激動劑或拮抗劑、抗雌激素抗體、抗雄激素抗體、或被動的(抗體)或主動的(抗原)抗LHRH接種疫苗、或其組合(「阻滯劑」)。
在優選的具體實施例中，阻滯劑以肽緩釋劑型施用。在WO98/08533中提供了肽緩釋劑型的例子，其內容結合於此作為參考。
在本發明的優選具體實施例中，經遺傳修飾的HSC在胸腺重新激活前、同時或隨後移植到患者體內，產生新的遺傳修飾的T細胞群。
附圖簡要描述

圖1A和B閹割前後淋巴細胞數量的變化。胸腺萎縮導致隨年齡增長淋巴細胞數量顯著下降。到閹割後2周時，細胞數量已達到年輕成體的水平。在閹割後3周，淋巴細胞的數量又有所上升並在閹割後第4周穩定下來。***＝與年輕成年(2個月)的胸腺顯著不同，p＜0.001。
圖2A-C(A)脾細胞數量不受年齡和閹割的影響。B∶T細胞比率在外周中也保持恆定(B)，然而，CD4∶CD8比率隨年齡增長而顯著下降(p＜0.001)，並在閹割後4周恢復到正常年輕時的水平。
圖3利用螢光激活細胞分類器(FACS)測定年齡和閹割後對CD4與CD8淋巴細胞群的影響的結果。每個象限的百分數在圖上給出。淋巴細胞亞群不隨年齡發生變化並且在閹割後淋巴細胞同步擴充。
圖4胸腺細胞的增殖，如通過結合BrdU脈衝所探測的。正在增殖的淋巴細胞比率不隨年齡和閹割發生變化。
圖5A-D年齡和閹割對淋巴細胞亞群增殖的影響。(A)每個亞群在整個增殖細胞群中的比率—在增殖細胞群中CD8+T細胞比率明顯增加。(B)每個正在增殖亞群的百分比-TN和CD8亞群在2年時與2個月時相比增殖顯著減弱。在閹割後兩周，TN群恢復到正常年輕細胞的增殖水平而CD8群的增殖表現出明顯的增加。該水平與閹割後4周的正常年輕時的水平相似。(C)TN的總增殖不隨年齡和閹割變化。然而(D)TN1亞群隨年齡增長增殖顯著下降，並且在閹割後4周都不能恢復到正常水平。***＝很顯著，p＜0.001，**＝顯著，p＜0.01。
圖6小鼠胸腺內注射異硫氰酸螢光素(FITC)。在24h後對外周中的FITC+細胞數目進行計數。儘管胸腺新轉移細胞(RTE)的比率保持在胸腺細胞數量的1％左右，但是在閹割後兩周明顯減少，RTE細胞數量隨年齡明顯降低(p＜0.01)。在閹割後，這些值雖然有所上升但在閹割後兩周仍顯著低於年輕小鼠。隨年齡增長，CD4+與CD8+RTE比率顯著增長，在閹割後一周恢復正常。
圖7A-C用化療藥物環磷醯胺治療後胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(C)細胞數量的變化。結果表明在治療後1周和2周，閹割組動物與未閹割組動物(僅採用環磷醯胺治療)相比胸腺發生快速擴充。此外，與僅採用環磷醯胺治療組相比，閹割組脾細胞和淋巴結細胞數目增長較快。到4周時，細胞數量達到正常。(n＝3-4每個治療組和時間點)。
圖8A-C手術閹割後及經一周放射治療(625拉德)後，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(C)細胞數量的變化。注意在治療後1周和2周，閹割組動物與未閹割組動物(僅採用放射治療)相比胸腺發生快速擴充。(n＝3-4每個治療組和時間點)。
圖9A-C在同一天進行閹割和放射治療後，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(C)細胞數量的變化。結果表明在治療後2周，閹割組動物與未閹割組動物相比胸腺發生快速擴充。然而，所觀察到的差異不如在治療前1周對小鼠進行閹割效果明顯(圖7)。(n＝3-4每個治療組和時間點)。
圖10在同一天進行手術或化學閹割和化療藥物環磷醯胺治療後胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(C)細胞數量的變化。結果表明在治療後1周和2周，閹割組動物與未閹割組動物(僅採用環磷醯胺治療)相比胸腺發生快速擴充。此外，與僅採用環磷醯胺治療組相比，閹割組脾細胞和淋巴結細胞數量增長較快。(n＝3-4每個治療組和時間點)。化學閹割對環磷醯胺治療後的免疫系統再生效果與手術閹割相當。
圖11用I型單純性皰疹病毒(HSV-I)足蹠免疫(foot-padimmunization)後的淋巴結細胞數量(cellularity)。注意老年閹割組與老年未閹割組相比細胞數量上升。下圖說明通過FACS就CD25對CD8細胞進行門化的總的激活的細胞數。
圖12A-C接種HSV-1後，在激活的淋巴結(LN)中，Vβ10在細胞毒T淋巴細胞(CTL)上的表達。顯示年老小鼠中克隆應答的減少和閹割後所期待應答的復原。
圖13A-C閹割恢復對HSV-1免疫接種的應答。(a)與年輕小鼠和閹割後小鼠相比較老年小鼠在感染後淋巴結總細胞數量明顯減少。(b)HSV-1感染小鼠的LN中活化的(CD8+CD25+)細胞的典型FACS圖。活化CTL的比例不隨年齡或閹割發生明顯變化。(c)老年小鼠淋巴結中細胞數量的減少反映在活化CTL數量的顯著減少上。老年小鼠閹割後對HSV-1的免疫應答恢復正常並且CTL數量與年輕小鼠相當。結果用8-12隻小鼠的均值±1標準偏差表示。**＝與年輕小鼠(2個月)相比p≤0.01；^＝與年老的(非閹割)小鼠相比p≤0.01。
圖14膕淋巴結取自經HSV-1免疫的小鼠，並培養3天。用未經免疫的小鼠作為對照來消除背景因素(通過51Cr的釋放來判定)，進行CTL檢測。結果用8隻小鼠的平均值表示，重複三次，±1標準偏差。在10∶1和3∶1的E∶T比值下年老的小鼠均表現出CTL活性的明顯降低(p≤0.01，*)，這顯示淋巴結中存在的特異性CTL的百分數的降低。閹割後老年小鼠的CTL反應性恢復到年輕成體水平。
圖15A和BCD4+T輔助細胞(Tcell help)和對HSV-1感染的VβTCR應答分析結果。在HSV-1感染後5天摘除膕淋巴結並在體外分析(a)CD25、CD8和特定的VβTCR標記和(b)CD4/CD8T細胞的表達。(a)活化的(CD25+)CD8+T細胞表達Vβ10或Vβ8.1的百分率用每組8隻小鼠的平均值±1標準偏差表示。沒有觀察到隨年齡和閹割後的變化。(b)靜止(resting)LN群中CD4/CD8比率隨年齡下降。該現象在閹割後復原。結果用每組8隻小鼠的平均值±1標準偏差表示。***＝與年輕和閹割小鼠相比p≤0.001。
圖16A-D在Ly5同類(congenic)小鼠骨髓移植後，胸腺(A)、脾(B)、淋巴結(C)、和骨髓(D)細胞數量的變化。注意在治療後所有時間點閹割後的動物與非閹割組相比較胸腺快速擴充。此外，閹割組脾和淋巴結數量與僅用環磷醯胺組相比較明顯增加。(每個治療組和時間點的n＝3-4)。與非閹割動物相比，閹割小鼠具有顯著增加的同類(Ly5.2)細胞(數據沒有列出)。
圖17A和B在胎兒肝臟重建之後閹割和非閹割小鼠中胸腺細胞數量的變化。(每個測試組的n＝3-4)。(A)在兩周時，閹割小鼠的胸腺細胞數量處於正常水平並且明顯高於非閹割小鼠(*p≤0.05)。閹割小鼠4周後觀察發現胸腺肥大。非閹割的細胞數量保持在對照水平以下。(B)CD45.2+細胞-CD45.2+是供體來源的標記。在重組後兩周，供體來源細胞在閹割和非閹割小鼠中均存在。在治療後4周閹割胸腺中約85％的細胞是供體來源的。在非閹割胸腺中沒有任何供體來源細胞。
圖18在致死輻照和胎兒肝臟重建、以及其後的手術閹割後，來源於供體的淋巴細胞群的CD4對CD8的FACS圖。每個象限的百分比在圖的右邊給出。年齡匹配的對照圖是8個月大的Ly5.1同類小鼠胸腺。閹割和非閹割小鼠的圖是在CD45.2+細胞上進行門化，只顯示供體來源的細胞。在重建後兩周胸腺細胞亞群在閹割小鼠和非閹割小鼠間沒有不同。
圖19A和B致死輻照、胎兒肝臟重建、和閹割後，骨髓性和淋巴樹突狀細胞(DC)的數量。(n＝3-4，每個測試組)。下面圖中的對照(其上標斜線)條圖是基於未治療的年齡匹配的小鼠中發現的DC的正常數量。(A)供體來源的骨髓性樹突狀細胞-重建兩周後在非閹割小鼠中DC細胞處於正常水平。同一時間點閹割小鼠中DC明顯更多(*p≤0.05)。在4周時閹割小鼠中DC數量維持在對照水平之上。(B)供體來源的淋巴樣樹突狀細胞-重建後兩周在閹割小鼠中的DC數量是非閹割小鼠的兩倍。治療後4周DC數量保持在對照水平之上。
圖20A和B在胎兒肝臟重建後，閹割和非閹割小鼠中總骨髓細胞數量和CD45.2+骨髓細胞數量的變化。n＝3-4，每個測試組。(A)總細胞數量-重建後兩周骨髓細胞數量恢復正常並且在閹割和非閹割小鼠之間的細胞數量沒有明顯差異。重建後4周閹割和非閹割小鼠之間的細胞數量明顯不同(*p≤0.05)。(B)CD45.2+細胞數量。重建後兩周，相對於骨髓中的CD45.2+細胞數在閹割和非閹割小鼠之間沒有任何顯著差異。在四周時，閹割小鼠中的CD45.2+細胞數量仍然較高。同一時間點，在非閹割小鼠體內沒有任何供體來源的細胞。
圖21A-C胎兒肝臟重建後，閹割和非閹割小鼠骨髓中T細胞、骨髓和淋巴來源的樹突狀細胞(DC)的變化。(n＝3-4小鼠，每個測試組)。下圖中的對照(其上標斜線)條圖是基於在未治療的年齡匹配的小鼠中發現的T細胞和DC的正常數量。(A)T細胞數量-重建後兩周和四周，在閹割和非閹割小鼠中的細胞數量均減少。(B)供體來源的骨髓性樹突狀細胞—重建後兩周，在閹割和非閹割小鼠中DC細胞數量均正常。在此時間點，閹割和非閹割小鼠的細胞數量之間沒有任何明顯差異。(C)供體來源的淋巴樣樹突狀細胞-重建後兩周和四周細胞數量處於正常水平。兩周時，閹割和非閹割小鼠的細胞數量之間沒有任何明顯差異。
圖22A和B在胎兒肝臟重建後，在閹割和非閹割小鼠中總的和供體(CD45.2+)脾細胞數量的變化。(n＝3-4小鼠，每個測試組)。(A)總細胞數-重建後兩周細胞數量下降並且在閹割和非閹割小鼠的細胞數量之間沒有任何明顯差異。重建四周後，閹割小鼠中的細胞數接近正常水平。(B)CD45.2+細胞數量—重建後兩周，閹割和非閹割小鼠脾中CD45.2+細胞數量沒有明顯區別。在4周時閹割小鼠中的CD45.2+細胞數量仍保持高水平。在同一時間點，非閹割小鼠體內沒有任何供體來源的細胞。
圖23A-C胎兒肝臟重建後的脾T細胞以及來源於髓骨和淋巴的樹突狀細胞(DC)。(n＝3-4小鼠，每個測試組)。下圖中的對照(在其上標斜線)條圖是基於在未治療的年齡匹配的小鼠中發現的T細胞和樹突狀細胞的正常數量。(A)T細胞數量-重建後兩周和四周，在閹割和非閹割小鼠中的細胞數量均減少。(B)供體來源的(CD45.2+)的骨髓性樹突狀細胞—重建後兩周和四周，在閹割和非閹割小鼠中的DC數量均正常。在兩周時，在閹割和非閹割小鼠的細胞數之間沒有任何顯著差異。(C)供體來源的(CD45.2+)淋巴樣樹突狀細胞-重建後兩周和四周細胞數量處於正常水平。兩周時，在閹割和非閹割小鼠的細胞數之間沒有任何顯著差異。
圖24A和B胎兒肝臟重建後，閹割和非閹割小鼠中總的和供體(CD45.2+)淋巴結細胞數量的變化。(n＝3-4，每個測試組)。(A)總細胞數-重建後兩周，細胞數量處於正常水平並且在閹割和非閹割小鼠的細胞數之間沒有任何顯著差異。重建後4周，閹割小鼠中細胞數量處於正常水平。(B)CD45.2+細胞數量-重建後兩周，閹割和非閹割小鼠淋巴結中供體CD45.2+細胞數量沒有明顯區別。在4周時閹割小鼠中的CD45.2細胞數量仍保持高水平。在同一時間點，非閹割小鼠體內沒有任何供體來源的細胞。
圖25A-C胎兒肝臟重建後，在閹割和非閹割小鼠腸繫膜淋巴結中，T細胞、來源於骨髓以及淋巴的樹突狀細胞(DC)的變化。(n＝3-4小鼠，每個測試組)。對照(在其上標斜線)條圖是在未治療的年齡匹配的小鼠中發現的T細胞和樹突狀細胞的數量。(A)重建後兩周和四周，在閹割和非閹割小鼠中的T細胞數量均減少。(B)在閹割和非閹割小鼠中，供體來源的骨髓性樹突狀細胞數量均正常。4周時，它們都減少。兩周時，在閹割和非閹割小鼠的細胞數之間沒有任何顯著差異。(C)供體來源的淋巴樣樹突狀細胞-重建後兩周和四周細胞數量處於正常水平。兩周時，在閹割和非閹割小鼠的細胞數之間沒有任何顯著差異。
圖26經LHRH激動劑治療前列腺癌後，對患者(所有患者大於60歲)外周血淋巴細胞的表型組成進行了分析。治療前和開始LHRH激動劑治療4個月後，分析了患者樣品。治療前，所有患者的每毫升血液的總淋巴細胞數量是在對照值的較低端。在治療之後，6/9的患者體內總淋巴細胞計數顯著上升(在某些情況下總細胞數加倍)。與此相關的是6/9的患者的總T細胞數增加。在CD4+亞群中，這種增加更加明顯，8/9的患者的CD4+T細胞水平增加。而在CD8+亞群中，趨勢不是很明顯，有4/9的患者的水平升高，雖然一般來說升高的程度也小於CD4+T細胞。
圖27LHRH激動劑治療前後患者血分析顯示T細胞、CD4或CD8T細胞的總比例沒有任何明顯變化，但CD4∶CD8比率在治療後有不定的變化。這說明對T細胞亞群的內環境穩定的維持具有最小的治療作用，雖然治療後總T細胞數顯著升高。所有的值與對照值相比較。
圖28經LHRH激動劑治療後，患者外周血內的B細胞和骨髓性細胞(NK、NKT、和巨噬細胞)的比例分析顯示在亞群中具有不同程度的變化。雖然治療後NK、NKT、和巨噬細胞的比例相對不變，但在4/9的患者中B細胞比例下降。
圖29治療後，患者外周血內的B細胞和骨髓性細胞的總細胞數分析清楚表明，治療後5/9的患者NK水平、4/9的患者NKT、和3/9的患者巨噬細胞明顯增加。B細胞的數量變化沒有明顯趨勢2/9的患者水平增加、4/9的患者沒有變化、和3/9的患者水平下降。
圖30A和BLHRH激動劑治療後所見到的主要變化是在外周血的T細胞群內。尤其是純真(CD45RA+)CD4+細胞的比例選擇性升高，同時在6/9的患者中，CD4+T細胞亞群中純真(CD45RA+)∶記憶(CD45RO+)的比例升高。
圖31用各種雷射脈衝能量降低皮膚的阻礙作用。用低至10mJ的能量輻照皮膚就能降低皮膚的阻礙作用，利用擬合曲線來內推數值。
圖32藥物通過皮膚的滲透。通過雷射輻照，以胰島素為例，皮膚滲透性大大增加。
圖33給皮膚施加5-氨基乙醯丙酸(ALA)和單個短暫脈衝後，皮膚螢光隨時間的變化。強度的峰值出現在大約640nm並且在治療後210min最高(虛線)。
圖34不加短暫脈衝，只施加5-氨基乙醯丙酸(ALA)後，皮膚螢光隨時間的變化。不同時間點的強度幾乎沒有變化。
圖35給皮膚施加5-氨基乙醯丙酸(ALA)和在不同峰值應力(peak stress)下的單次短暫脈衝後，皮膚螢光變化的比較。角質層的滲透程度取決於峰值應力。
發明詳述本發明包括利用遺傳修飾的造血幹細胞、淋巴祖細胞、骨髓性祖細胞、上皮幹細胞、或其組合(GM細胞)進行基因治療的方法。以前其他人用這類細胞進行基因治療所做的嘗試並沒有成功，得到的修飾細胞的水平很低，幾乎可以忽略。本發明提供傳送這些細胞的新方法，該方法可以提高細胞的吸收和分化成所需的T細胞。經修飾的細胞注射到正用本發明的方法進行胸腺重新激活的患者體內。經修飾的幹細胞和祖細胞由胸腺吸收並轉化成為T細胞、樹突狀細胞、和其它在胸腺中產生的細胞。所有的這些新細胞中均含有母體幹/祖細胞的遺傳修飾。
可以通過阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號來激活受者的胸腺。這種阻斷逆轉受者的激素狀態。產生阻斷的優選方法是通過閹割。閹割的方法包括但不限於化學閹割和手術閹割。在閹割期間或之後，GM細胞移植到患者體內。這些細胞經胸腺吸收進入患者體內並成為胸腺產生的新T細胞和DC的一部分。獲得的T細胞群含有遺傳修飾，其已插入幹/祖細胞中。
重新激活胸腺的優選方法是通過阻斷LHRH對垂體的直接和/或間接的刺激作用，所述阻斷導致促性腺激素FSH和LH的水平降低。這些促性腺激素通常作用於性腺從而釋放性類固醇，特別是在女性和男性中分別為雌激素和睪酮；FSH和LH水平的降低阻斷所述釋放。其直接結果是血漿中性類固醇水平立即降低，從而導致對胸腺不斷釋放抑制信號。注射CD34+造血細胞(最好是自體的)可以增強胸腺再生的程度和動力學。
本發明適用於任何由性類固醇驅動成熟並具有免疫系統的動物(包括人類)，如哺乳動物和有袋類動物、更好為大型哺乳動物、優選為人類。
術語「再生」、「重新激活」、和「重建」及它們的衍生詞在本文可以相互替換使用，並且都是指使萎縮胸腺恢復到活性狀態。
如本文所使用的，「閹割」是指性類固醇在體內的產生和分布明顯減少或消除。當胸腺的功能完全恢復時，就可以有效地使患者恢復到青春期前的狀態。手術閹割去除患者的性腺。
一種持續時間不長的閹割方式，是在一段時間內施用某種化合物，這裡稱為「化學閹割」。多種化學藥物能夠以這種方式起作用。在施用化學藥物期間，以及其後的一段時間內，患者的激素產生停止。優選地，在施藥停止後，患者恢復到正常狀態。
在優選的具體實施例中，患者用HIV感染。治療該患者的優選過程包括下述步驟，其將在下面進行詳細描述1)用高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)治療以降低病毒濃度，該治療在整個治療過程中持續以防止或減少新T細胞的感染；2)T細胞消融(免疫抑制)；3)阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號，優選通過給予LHRH類似物；4)在胸腺開始重新激活時，施用經修飾含有能表達蛋白的基因的GM細胞，其能防止HIV感染、阻止HIV複製、使HIV病毒喪失活性，或其它能防止HIV感染T細胞的作用；5)如果GM細胞不是自體同源的，在胸腺重新激活的同時施用供體細胞可以使免疫系統準備好(prime)以將供體細胞識別為自身細胞；以及6)當胸腺嵌合體已經建立並且新的成熟T細胞群開始從胸腺中排出時，降低並最終消除免疫抑制。
阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號很易理解，傳向胸腺的性類固醇介導的信號能用本領域技術人員所熟知的多種方法進行阻斷，其中一些方法在本文進行描述。例如，抑制性類固醇的產生或阻斷胸腺中一個或多個性類固醇受體就可以達到阻斷的目的，如施用性類固醇激動劑或拮抗劑、或主動的(抗原)或被動的(抗體)抗性類固醇接種疫苗就可以完成所希望的切斷。也可以通過施用一種或多種性類固醇類似物來抑制性類固醇產生。在一些臨床實例中，通過物理閹割永久切除性腺可能是適合的。
在優選具體實施例中，傳向胸腺的性類固醇介導的信號是通過給予性類固醇同源物、優選為促黃體激素釋放激素(LHRH)的類似物加以切斷。性類固醇類似物以及在治療和化學閹割中的應用已為大家熟知。此類類似物包括但不限於下面的LHRH受體(LHRH-R)的激動劑布舍瑞林(Hoechst公司)、Cystorelin(Hoechst公司)、達必佳(Decapetyl)(商品名Debiopharm；Ipsen/Beaufour公司)、地洛瑞林(Balance Pharmaceuticals公司)、戈那瑞林(Ayerst公司)、戈舍瑞林(商品名Zoladex；Zeneca公司)、組氨瑞林(Ortho公司)、亮丙立德(商品名Lupron；Abbott/TAP公司)、亮丙瑞林(Plosker等公司)、黃體瑞林(Wyeth公司)、美替瑞林(Meterelin)(WO 9118016)、那法瑞林(Syntex公司)、和曲普瑞林(美國專利第4,010,125號)。LHRH類似物還包括但不限於下面的LHRH-R的拮抗劑阿巴瑞克(Abarelix)(商品名Plenaxis；Praecis公司)和西曲瑞克(商品名；Zentaris公司)。激動劑的組合、拮抗劑的組合、以及激動劑和拮抗劑的組合也包括在內。上述參考文獻所披露的內容結合於此作為參考。目前優選的類似物為地洛瑞林(Deslorelin)(描述於美國專利第4,218,439號)。更多的目錄可參見Vickery等，1984。
在優選具體實施例中，先對患者施用LHRH-R受體(LHRH-R)拮抗劑，然後施用LHRH-R激動劑。這種方法可以在性類固醇產量降低之前，阻止或限制任何由於施用激動劑而可能誘導的性類固醇產生高峰。在另一個具體實施例中，採用只引起很少或不引起性類固醇生產高峰的LHRH-R激動劑，之前可給予或不給予LHRH-R拮抗劑。
雖然刺激胸腺重新激活主要基於對性類固醇的效應和/或LHRH同源物的直接效果的抑制，但包括其它一些增強胸腺功能的物質也是有用的。這類化合物包括但不限於白介素2(IL2)、白介素7(IL7)、白介素15(IL15)、上皮和成纖維細胞生長因子家族成員、幹細胞因子、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、和角質形成細胞生長因子(KGF)。可以想像這些附加的化合物只能在LHRH同源物初次應用時使用一次。然而，這些物質中的一種或其組合可以在任何時侯增加使用，來進一步刺激胸腺。此外，可開發和應用基於類固醇受體的調節劑，其可以是靶向於胸腺特異性的。
藥物組合物本發明所用的化合物可載於任何藥用載體或不使用載體。具體例子包括生理性兼容的膠囊、溶劑、和稀釋劑。用於胃腸道外、皮下、靜脈、和肌肉注射等途徑的藥物應被保護起來，比如採用膠囊。可替換地，這些藥物組合物可採用能保護有效成分的載體形式給予，同時允許這些成分的緩慢釋放。本技術領域內已知有多種多聚體和共聚物可用於製備定時釋放製劑，比如多種形式的乳酸/羥乙酸共聚物。例見美國專利第5,410,016號，其利用聚乙二醇(PEG)的改性多聚體作為生物可降解的膠囊。
口服劑型可以製備成液體製劑、膠囊、片劑等。這些組合物可以包括，例如，賦形劑、稀釋劑、和/或保護活性成分不被分解的包被物(coverings)。這些劑型為大家所熟知。
在任何劑型中，可以包括不對LHRH類似物活性產生負面影響的其它化合物。具體例子是本文所描述的各種生長因子和其它細胞因子。
劑量LHRH類似物可一次性給予，其效果會持續一段時間。優選地，該劑型在1-2個月內有效。標準劑量隨使用的不同類似物發生變化。一般來說，劑量是在約0.01μg/kg和約10mg/kg之間，優選在大約0.01mg/kg和大約5mg/kg之間。劑量隨所用LHRH類似物或疫苗發生變化。優選具體實施例中，一次劑量可維持一個流行病的周期。例如，「流感季節」一般發生在冬季的幾個月。可製備LHRH類似物劑型並用本文所描述的方法施用，以便能在流感季節開始後的兩個或更多月內保護患者不受感染，每兩個或更多月追加劑量直到感染的危險降低或消失。
可以用該劑型來增強免疫系統。可替換地，該製劑可製備成在特別地防止流感病毒感染的同時增強免疫系統。後一種劑型可包括經基因改造並能對病毒產生抗性(參見下面內容)的GM細胞。該GM細胞可與LHRH類似物劑型一起施用或分別施用(包括空間上和/或時間上)。正如非GM細胞的情況一樣，根據流感季的長短，可向患者給予多次劑量，以產生保護並避免流感病毒的感染。
化學閹割劑的施用可採用許多本領域技術人員所熟知的方法施用本發明的化合物。一種施用化學抑制劑來抑制傳向胸腺的性類固醇介導的信號的標準方法是利用單劑三個月有效的LHRH激動劑。對此，簡單的一次性靜脈注射或肌肉注射是不夠的，因為這種激動劑在三個月結束之前就會從患者體內清除掉。作為替代，可以採用長效製劑注射或移植物，或其他任何能夠緩慢釋放抑制劑的施藥方法。同樣地，可採用延長抑制劑在體內的半衰期的方法，例如通過對化合物進行修飾而同時保持此處所需的功能。
更有用的施藥機制實例包括但不限於皮膚的雷射輻照、和在皮膚上產生高壓短暫脈衝(也稱為應力波或短暫脈衝)，在每種方法實施的同時或在其實施之後，在同樣的皮膚區域放置帶有或不帶有載體的化合物。優選的放置方法是採用貼劑並在治療過程中一直貼於皮膚上。
給藥的一種方式是採用雷射束(特殊地聚焦的並在合適的波長產生雷射)，以在患者的皮膚上產生小的穿孔或蝕變(alteration)。參見美國專利第4,775,361號、美國專利第5,643,252號、美國專利第5,839,446號、和美國專利第6,056,738號，所有這些結合於此作為參考文獻。在優選的具體實施例中，雷射束的波長是在0.2-10微米之間。更好地，波長是在大約1.5-3.0微米之間。最好地，波長是大約2.94微米。在一個具體實施例中，雷射束是用透鏡進行聚焦，以通過皮膚表皮在皮膚上產生輻照斑。在另一個具體實施例中，對雷射束進行聚焦，從而只通過皮膚的角質層產生輻照斑。
如本文所使用的，「消融」或「打孔」是指在皮膚上產生的孔。這樣的孔可具有不同的深度；例如它可以只穿透角質層，也可以一直穿透到皮膚的毛細血管層，或可以終止於這兩層之間的任何地方。如本文所使用的，「蝕變」指在不產生孔的情況下皮膚結構的改變，其使得皮膚的滲透性增加。用打孔的方法可以改變皮膚蝕變到任意厚度。
在規定雷射束的時候可考慮幾種因素，包括波長、能注量、脈衝時間(pulse temporal width)、和輻照斑的大小。在優選的具體實施例中，能注量的範圍是0.03-100,000J/cm2。更優選地，能注量的範圍是0.03-9.6J/cm2。雷射束波長部分取決於雷射材料，如鉺釔鋁石榴石。脈衝時域是脈衝寬度的結果，該脈衝寬度由例如一系列電容器、閃光燈、和雷射棒材料(laser rod material)所產生。脈衝寬度最優是在1fs(塵秒)和1000μs之間。
根據此方法，由雷射產生的穿孔或蝕變不必由來自雷射的單脈衝實現。在優選的具體實施例中，透過角質層的打孔或使皮膚發生改變是利用多個雷射脈衝所產生，每個脈衝只打孔或蝕變靶組織深度的一部分。
如此，用單脈衝的能量除以所希望的脈衝數，就能粗略估計用多個脈衝在角質層上形成打孔或蝕變所需要的能量。例如，如果特定大小的斑需要1J的能量來產生穿過整個角質層的穿孔或蝕變，那麼可用10個脈衝來產生定性上相似的穿孔或蝕變，每個脈衝的能量為1/10。因為期望在輻照過程中患者不移動靶組織(人的反應時間在100ms左右)，並且希望每個脈衝產生的熱量不發生明顯擴散，所以，在優選的具體實施例中，來自雷射的脈衝重複率應該能使整個打孔過程在不到100ms內完成。可替換地，靶組織和雷射的定位可機械地固定，從而在更長的輻照時間內，不會發生靶位置的改變。
為了在穿透皮膚的過程的少出血或不流血，可通過外表面對皮膚進行打孔或蝕變，如角質層，但不能達到毛細血管層。雷射束在皮膚上精確聚焦，在皮膚上產生直徑為約0.5μm-5.0cm的光束。可選地，光斑可以是狹縫形狀，寬度大約為0.05-0.5mm，長可達到2.5mm。寬度可為任意大小，決定於輻照區域的解剖特點和所需要的有待被移除液體或將要施予的藥物的滲透速率。聚焦透鏡的焦距可為任意長度，但在一個具體實施例中為30mm。
通過改變波長、脈衝寬度、能注量(其是雷射輸出能量(J)和焦點光束大小(cm2)的函數)、和輻照斑大小，可以將對角質層的影響控制在消融(穿孔)和非消融改變(蝕變)之間。角質層的消融和非消融蝕變都可提高隨後施用藥物的滲透性。
例如，通過減少脈衝能量而保持其他參數不變，可以使對皮膚的改變處於消融和非消融組織效應之間。利用脈衝寬度在300μs左右的鉺釔鋁石榴石雷射器，採用單脈衝或輻射能並在皮膚上輻照2mm大的斑點，超過大約100mJ的脈衝能量引起角質層的部分或全部消融，而約100mJ以下的任何脈衝能量則引起角質層的部分消融或非消融改變。可選地，通過採用多脈衝方式，增強體液或所給藥物的滲透性所需的閾脈衝能量則下降，下降的係數大約等於脈衝數目。
可替換地，保持其他參數不變的情況下，通過減少光斑尺寸，也可以使對皮膚的改變處於消融和非消融組織效應之間。例如，減半光斑面積將導致產生同樣效應所需的能量減半。可獲得小至0.5微米的輻照，例如，通過將雷射器的輻射輸出(radiant output)耦合於顯微鏡物鏡的多個物鏡中(例如，可購自Nikon公司，Melville，紐約)。在這種情況下，雷射束聚焦形成的光斑可能會小至顯微鏡的解析度限制的數量級，後者大約為0.5微米的數量級。實際上，如果雷射束呈高斯分布，受輻照影響的區域尺寸可以小於測量的雷射束的尺寸並且可超過顯微鏡的成像解析度。在這種情況下，為非消融性地蝕變組織，採用3.2J/cm2的能注量可能比較合適，其對於半微米大的光斑將需要大約5nJ的脈衝能量。這麼低的脈衝能量可容易地由二極體雷射器獲得，也可以，例如，將鉺釔鋁石榴石雷射器產生的雷射束經吸收濾光器(如玻璃)衰減後獲得。
可選地，保持其他參數不變，通過改變輻射能的波長，就可以使對皮膚的改變處於消融和非消融性組織效應之間。例如，用鈥∶釔鋁石榴石(Ho∶YAG；2.127微米)代替鉺釔鋁石榴石(Er∶YAG；2.94微米)雷射器，可以減少組織對能量的吸收，產生較輕的消融或蝕變。
雷射器產生的皮秒和塵秒脈衝也可以用於產生皮膚的消融或蝕變。這可用調製的二極體或相關的微片雷射器來完成，其輸出時間寬度(temporal widths)在1塵秒至1ms之間的單脈衝。(參見D.Stern等，「用在532和625nm處的納秒、皮秒、和塵秒雷射進行角膜消融」，(「Corneal Ablation by Nanosecond，Picosecond，andFemtosecond Lasers at 532 and 625nm，」)《角膜雷射消融》(CornealLaser Ablation)，第107卷，587-592頁，(1989)，其結合於此作為參考文獻，該參考文獻披露了低至1塵秒的脈衝寬度的應用)。
另一種遞藥方法採用高壓脈衝瞬變在皮膚上產生通透性。參見美國專利第5,614,502號和美國專利第5,658,892號，兩者結合於此作為參考文獻。高壓短暫脈衝，例如具有特定上升時間和峰值應力(或壓力)的應力波(例如，雷射器產生的雷射應力波(LSW))，能夠安全和有效地影響化合物(比如本發明中所披露的那些化合物)通過上皮組織層(例如角質層和黏膜)的轉運。這些方法可以用於很大尺寸範圍的化合物的給藥，與其淨電荷無關。此外，本方法中所用短暫脈衝可避免組織損傷。
在暴露於短暫脈衝之前，上皮組織層，例如，角質層，對外來化合物可能是不通透的；這阻止該化合物向上皮層下面的細胞擴散。將上皮層暴露於短暫脈衝可以使化合物通過上皮層進行擴散。擴散的速率通常取決於短暫脈衝的特性和被施予的化合物的大小。
通過特定上皮組織層(例如皮膚的角質層)的穿透速率，還取決於其他因素，包括pH值、皮膚基質組織(cutaneous substrate tissue)的代謝、角質層內外區域的壓力差、以及皮膚的結構部位和生理條件。皮膚物理條件又依賴於健康狀況、年齡、性別、種族、皮膚保健、和接觸史。例如，之前接觸過有機溶劑或表面活性劑就會影響皮膚的物理條件。
通過上皮組織層給予的化合物的數量也取決於上皮層保持通透的時間長短、以及變得可通透的上皮層表面積的大小。
脈衝的性質和特徵可用產生它們的能源來控制。參見WO98/23325，其結合於此作為參考文獻。然而，它們的特點因其傳播所經過的偶聯介質的線性和非線性性質而改變。偶聯介質引起的線性衰減主要衰減短暫脈衝的高頻成分。這使得短暫脈衝的帶寬變窄，並且上升時間延長。另一方面，偶聯介質的非線性性質使上升時間縮短。上升時間的縮短是聲速和質點速度依賴於應力(壓力)的結果。當應力增加時，聲速和質點速度也增加。這使得短暫脈衝的前沿變得更陡。線性衰減的相對強度、非線性係數、和峰值應力，決定了該波必須傳播多長才使上升時間陡度的增加變得顯著。
對短暫脈衝的上升時間、幅度、和持續時間進行選擇，從而產生非破壞性的(即，非衝擊波)短暫脈衝，其可以暫時增加上皮組織層的通透性。一般上升時間至少為1ns，優選為大約10ns。
短暫脈衝的峰值應力或壓力隨不同的上皮組織或細胞層發生變化。例如，為通過角質層轉運化合物，短暫脈衝的峰值應力或壓力應設為至少400巴，優選至少為1,000巴，但不超過約2,000巴。對上皮黏膜層而言，峰值壓力應設在300巴和800巴之間，優選在300巴和600巴之間。短暫脈衝優選為持續幾十ns，這樣與上皮組織的作用時間很短。與短暫脈衝相互作用後，上皮組織並未受到永久破壞，但保持通透性最長達約3分鐘。
此外，這些方法涉及對患者應用很少的離散的高振幅脈衝。對患者施用的短暫脈衝數量一般小於100，更好小於50，最好小於10。當應用多次光脈衝來產生短暫脈衝時，連續脈衝間的間隔為10-120秒，這對避免上皮組織的永久損傷是足夠長的。
短暫脈衝的性質可以用本領域中的標準方法進行測量。例如，峰值應力或壓力、和上升時間可以用聚偏氟乙烯(PVDF)傳感器的方法進行測量，該方法描述於Doukas等，《超聲醫學生物學》(Ultrasound Med.Biol.)，21961(1995)。
短暫脈衝可由多種能源產生。能發射短暫脈衝的物理現象一般有如下三種機理(1)熱彈性產生；(2)光學擊穿；或(3)消融。
例如，短暫脈衝可用高能雷射源消融靶材料進行引發，然後短暫脈衝通過偶聯介質偶聯於上皮組織或細胞層。該偶聯介質可以為，例如，液體或膠體，只要是非線性的。因此，水、油如蓖麻油、等滲介質例如磷酸緩衝鹽水(PBS)、或膠體如膠原凝膠，都可以用作偶聯介質。
此外，偶聯介質可包括能增強轉運的表面活性劑，例如，在短暫脈衝發生之後，通過延長角質層對化合物保持通透的時間。該表面活性劑可為，例如，離子型去汙劑或非離子型去汙劑，因而可包括，如月桂基硫酸鈉(十二烷基磺酸鈉)、十六烷基三甲基溴化銨、和N，N-二甲基-N-十二烷胺氧化物。
吸收靶材料的作用相當於光學引發換能器。在吸收光以後，靶材料快速熱膨脹或發生消融，從而發射短暫脈衝。通常，金屬和聚合物膜在可見光和紫外光譜區具有較高的吸收係數。
許多類型的材料可作為靶材料與雷射束一起使用，它們在所用雷射器的波長能充分吸收光。靶材料的成分可以是金屬(如鋁或銅)、塑料(如聚苯乙烯，例如黑色聚苯乙烯)、陶瓷、或高濃度染料溶液。靶材料的尺寸必須大於所施加的雷射能量的橫截面積。此外，靶材料必須比雷射的光穿透深度要厚，以免光直接作用於皮膚表面。靶材料還必須足夠厚，以提供機械支撐。當靶材料由金屬製成時，典型厚度是1/32英寸(0.79375mm)-1/16英寸(1.5875mm)。對塑料靶材料，厚度是1/16英寸(1.5875mm)-1/8英寸(3.175mm)。
短暫脈衝也可用限制性消融來加強。在限制性消融中，將雷射束透明材料，如石英光學窗，與靶材料緊貼放置。等離子體的限制(通過採用該透明材料來消融靶材料而產生)在數量級上提高了偶連繫數(Fabro等，《應用物理學雜誌》(J.Appl.Phys.)，68775，1990)。該透明材料可以是石英、玻璃、或透明塑料。
由於靶材料和限制性透明材料間的空隙允許使等離子體進行膨脹，並因此降低傳給靶向物的動量(momentum)，所以透明材料最好用起初為液態的粘合劑(例如含碳的環氧樹脂)和靶材料粘在一起，以免產生這類空隙。
雷射束可用本領域所熟知的標準光調製技術(如應用Q開關或鎖模雷射器，利用如電光裝置或聲光裝置)產生。標準的商業上可購的能夠在紅外線、可見光、和/或紅外線光譜區採用脈衝形式的雷射器包括，Nd:YAG雷射器、Nd:YLF雷射器、CO2雷射器、激基分子雷射器、染料雷射器、Ti:蘭寶石雷射器、二極體雷射器、鈥(及其它稀土材料)雷射器、和金屬蒸氣雷射器。這些光源的脈衝寬度可調，並且可以從幾十ps到幾百微秒。對在本發明中的應用而言，光脈衝寬度範圍可為100ps至約200ns，優選為約500ps至40ns。
也可以用體外碎石器產生短暫脈衝(一個實例描述於Coleman等，《超聲醫學生物學》(Ultrasound Med.Biol.)，15213-227，1989)。這些短暫脈衝的上升時間為30-450ns，其長於雷射產生的短暫脈衝。為了採用體外碎石器產生具有合適上升時間的短暫脈衝，短暫脈衝可在非線性偶聯介質中(例如水)傳播一段距離，該距離由前述的方程(1)決定。例如，當用碎石器產生上升時間為100ns和峰值壓力為500巴的短暫脈衝，短暫脈衝在接觸上皮細胞層之前在偶聯基質中應穿行的距離約為5mm。
對由碎石器產生的短暫脈衝進行修整(shaping)的方法的另一個好處是，作為在非線性偶聯介質中傳播的結果，波的拉伸分量(tensile component)將變寬並衰減。這個傳播距離應該進行調整來產生這樣的短暫脈衝，其拉伸分量的壓力僅為波的壓縮分量的峰值壓力的5％至10％左右。這樣，修整過的短暫脈衝就不會損傷組織。
所用碎石器的類型沒有嚴格要求。電動液壓、電磁、或壓電碎石器都可以使用。
短暫脈衝也可以用換能器產生，例如壓電換能器。優選地，該換能器與偶聯介質直接接觸，並在應用光場、熱場、或電場之後發生迅速的移位從而產生短暫脈衝。例如，可利用電介質擊穿，該擊穿通常採用高壓火花或壓電換能器誘導產生(與某些體外碎石器中使用的一樣，Coleman等，《超聲醫學生物學》(Ultrasound Med.Biol.)，15213-227，1989)。在採用壓電換能器的情況下，在應用電場後換能器迅速膨脹並在偶聯介質中引發快速移位。
此外，短暫脈衝可在纖維光學的幫助下產生。光纖傳導系統容易操作並且可以用來輻照與上皮組織層相鄰的靶材料從而在難以達到的區域產生短暫脈衝。這些類型的傳送系統(當可選地與雷射器偶聯時)是優選的，因為它們可結合於導管及相應的柔軟裝置中，並用於輻照人體內大部分器官。此外，為了發射具有所需上升時間和峰值應力的短暫脈衝，光源波長可以容易調節，從而在特定的靶材料中產生合適的吸收。
可選擇地，響應爆炸脈衝(detonating impulse)，高能材料可產生短暫脈衝。引爆物通過引起放電或電火花可以引爆高能材料。
流體靜壓力可與短暫脈衝聯合用於增強化合物通過上皮組織層的轉運。因為由短暫脈衝產生的效果能維持幾分鐘，應用短暫脈衝之後，在上皮組織層(例如皮膚角質層)的表面施加流體靜壓力就可以加快藥物順濃度梯度被動擴散進入上皮細胞層的轉運速度。
幹細胞或祖細胞的遺傳修飾基因本發明有用的基因和基因片段(多核苷酸)包括對以基因為基礎的疾病和T細胞條件能發揮作用的基因。這類疾病和條件包括但不限於HIV感染/AIDS、T細胞白血病病毒感染、和其他淋巴組織增生疾病。就HIV/AIDS而言，許多基因和基因片段都可以使用，包括但不限於船形盆轉錄因子(nef transcription factor)；編碼特異性剪切HIV基因的核酶的基因，例如tat和rev(Bauer G.等，1997)；HIV-1 rev基因的反顯性突變株，RevM10，其抑制HIV複製(Bonyhadi等，1997)；HIV-1 rev應答元件(RRE)的過表達結構(construct)(Kohn等，1999)；編碼RNA或蛋白的任何基因，其表達能抑制細胞HIV感染或複製；和其片段和組合。
這些基因或基因片段以穩定表達的形式應用。如在本文所使用的，術語「穩定表達形式」是指，將基因或基因片段轉入細胞後，基因或基因片段(功能片段)的表達產物(RNA和/或蛋白)至少能夠在宿主細胞中半持久表達，在分裂和/或分化後也能在細胞後代中表達。這需要基因或基因片段(不管是否有載體)具有適當的將DNA轉錄成RNA的信號序列。此外，當基因或基因片段編碼的蛋白是影響患者狀態的活性分子時，該DNA也將編碼翻譯信號。
大多數情況下基因或基因片段包含在載體中。本領域的一般技術人員熟知可用於表達所需RNA或蛋白的表達載體。表達載體是能夠引導轉錄其中所含DNA序列並能引導翻譯目標RNA(resultingRNA)的載體。表達載體能夠在基因重組的細胞中進行複製，並包括質粒、噬菌體、病毒、和微小染色體。可替換地，該基因或基因片段可以成為細胞染色體DNA的整合部分。重組載體和方法學為大家所熟知。
本發明中用來表達蛋白的有用的表達載體含有複製起點。適當構建的表達載體含有能在細胞中自主複製的複製起點，或能夠整合到宿主細胞染色體中。這類載體還可包含選擇性標記、有限數目的有用的限制性內酶切位點、高拷貝數、和強啟動子。啟動子是DNA序列，其引導RNA聚合酶結合到DNA並引發RNA合成的；強啟動子可以高頻引發這種合成。本發明的表達載體是可操作連接於編碼RNA或蛋白(用於本發明)的DNA，即，該載體能引導附著DNA分子的複製，又能引導DNA分子編碼的RNA或蛋白的表達。於是，對蛋白而言，該表達載體必須有附著DNA分子的適當的轉錄起始信號上遊片段，保持正確的閱讀框架，從而允許在調控序列的調控下表達DNA分子以及產生所預期的由DNA分子編碼的蛋白。表達載體可包括但不限於克隆載體、修飾克隆載體、和特定設計的質粒或病毒。優選地，使用誘導啟動子，從而可以控制插入基因或多核苷酸表達的數量和時間。
細胞遺傳修飾的優選細胞是造血幹細胞。這些細胞可來源於骨髓、外周血、或臍帶、或任何其他造血幹細胞來源，並且可以是自體的或非自體的。淋巴和骨髓性祖細胞和上皮幹細胞也是有用的，並且也可以是自體的或非自體的。
使用非自體(供體)細胞時，在胸腺激活步驟中要產生對這些細胞的耐受性。在阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號的起始過程中或之後，將有關的遺傳修飾的供體細胞移植入受體體內。這些細胞經胸腺識別認為是自體細胞並成為胸腺產生的新T細胞和DC的一部分。產生的T細胞群將受體和供體細胞都識別為自體細胞，由此對供體的移植產生耐受性。參見共同提出的未決專利申請U.S.S.N.09/________，其結合於此作為參考文獻。
遺傳修飾的方法用於基因治療的細胞可用標準重組方法進行遺傳修飾。例如，培養HSC的反轉錄病毒載體轉導是一種成功的方法(Belmont andJurecic，1997，Bahnson，A.B.等，1997)。其他載體包括但不限於腺病毒衍生或慢病毒衍生的載體和莫洛尼鼠白血病病毒衍生的載體。
同樣可用的有如下方法顆粒介導(particle-mediated)的基因轉移如用基因槍(Yang and Ziegelhoffer，1994)、脂質體介導的基因轉移(Nabel等，1992)、磷酸鈣和遺傳修飾載體的共沉澱(Grahamand Van Der Eb，1973)、電打孔(Potter等，1984)、和微注射(Capecchi，1980)、以及任何其他能夠穩定轉移基因或寡核苷酸(優選在載體中)進入HSC內以致基因至少在部分時間內表達的方法。
基因治療本發明提供通過患者胸腺的重新激活來進行基因治療的方法。這是通過對受體施用GM細胞來完成。遺傳修飾細胞可以是HSC、上皮幹細胞、或骨髓性或淋巴樣祖細胞。較好地，該遺傳修飾細胞是CD34+HSC、淋巴樣祖細胞、或骨髓性祖細胞。更好地，該遺傳修飾細胞是CD34+HSC。對患者施用遺傳修飾細胞並且這些細胞通過外周血系統轉移到胸腺。在缺少性類固醇的情況下，胸腺對這些造血前體細胞的吸收顯著增加。這些細胞整合到胸腺中並且產生樹突狀細胞和T細胞，其攜帶有來自已改變細胞的遺傳修飾。其結果是含有所需基因改變的T細胞群在受體外周血中循環，並且伴隨由患者胸腺重新激活引起的細胞群、組織、和器官的增加。
小動物研究材料和方法動物CBA/CAH和C57B16/J雄性小鼠是獲自Monash大學動物服務中心(Central Animal Service)，並在常規條件下飼養。小鼠年齡從4-6周到26個月，並在相關處標明。
閹割向動物腹膜內注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(鹽酸賽拉嗪；BayerAustralia公司，Botany NSW，澳大利亞)和1.5mg鹽酸氯胺酮(氯胺酮針劑，Parke-Davis公司，Caringbah，NSW，澳大利亞)的生理鹽水進行麻醉。手術閹割是將陰囊切開，露出睪丸，接著將睪丸用縫合線打結並沿脂肪組織除去。
5-溴脫氧尿苷(BrdU)引入小鼠以4h的間隔兩次腹膜內注射BrdU(Sigma Chemical公司，St.Louis，密蘇裡州)(以100mg/每kg體重的劑量，在100μL PBS中)。對照組小鼠只注射賦形劑。在第二次注射1小時後，對胸腺進行解剖，並且製成懸液供FACS分析或立即在Tissue Tek(O.C.T.化合物，Miles INC公司，印第安納州)中進行包埋，在液氮中速凍並在-70℃下保存直至使用。
流式細胞分析用CO2窒息處死小鼠並將胸腺、脾和腸繫膜淋巴結摘除。器官在冷的PBS/1％FCS/0.02％疊氮化物的溶液中輕柔地通過孔徑200μm的篩子，離心(650g，5min，4℃)，並重新懸浮在任何一種PBS/FCS/疊氮化物中。脾細胞在紅細胞裂解緩衝液(氯化銨為8.9g/L)中4℃培養10min，洗滌並重新懸浮在PBS/FCS/疊氮化物中。細胞的濃度和生活力可用血細胞計數器和溴乙錠/吖啶橙染色後在螢光顯微鏡下觀察確定(雙份)(Axioskop公司；Carl Zeiss，Oberkochen，德國)。
為進行三色免疫螢光檢測，胸腺細胞例行用抗αβTCR-FITC或抗γδTCR-FITC、抗CD4-PE、和抗CD8-APC(均獲自Pharmingen公司，聖地牙哥，加利福尼亞)進行標記，然後進行流式細胞分析。脾和淋巴結懸液用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或B220-B(Sigma公司)連同CD4-PE和CD8-APC進行標記。B220-B用抗生蛋白鏈菌素-三-色結合物(購自Caltag實驗室公司，伯林蓋姆，加利福尼亞)顯色。
對BrdU檢測而言，細胞用CD4-PE和CD8-APC進行表面標記，接著進行固定和滲透化，如先前所描述的(Carayon and Bord，1989)。簡而言之，染色後細胞4℃下在1％PFA/0.01％吐溫-20中進行O/N固定。洗滌過的細胞在37℃下置於500μl DNA酶(100孔尼茲單位，Boehringer Mannheim公司，西德)中孵育30分鐘，以使DNA變性。最後，細胞用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson公司)進行孵育。
為進行四色免疫螢光檢測，胸腺細胞用CD3、CD4、CD8、B220、和Mac-1標記，用抗鼠Cy5免疫球蛋白(Ig-Cy5)(Amersham公司，英國)集中檢測，門化的負細胞(TN)進行分析。它們進一步用CD25-PE(Pharmingen公司)和CD44-B(Pharmingen公司)染色並接著用抗生蛋白鏈菌素-三-色(Caltag公司，加利福尼亞)顯色，如先前所描述的(Godfrey and Zlotnik，1993)。然後，如上述進行BrdU檢測。
樣品在FacsCalibur(Becton-Dickinson公司)上進行分析。活的淋巴細胞根據0°和90°光散射圖進行門化，並且用細胞探索軟體(Cell quest software)(Becton-Dickinson公司)進行數據分析。
免疫組化用低溫保持器(Leica公司)將冷凍的胸腺切片(4μm)並立即放在100％的丙酮中固定。
對二色免疫螢光而言，胸腺切片用如下單克隆抗體的平板進行雙標記，這些單抗有產生於本實驗室的MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35、和44(Godfrey等，1990；表1)，然後用多價兔抗細胞角蛋白抗體(Dako公司，Carpinteria，加利福尼亞)對上皮細胞決定蔟共同表達進行評價。用FITC結合的綿羊抗鼠Ig(Silenus實驗室)對結合的單克隆抗體(mAb)進行顯色，並且用異硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)結合的山羊抗兔Ig(Silenus實驗室)對抗細胞角蛋白進行顯色。
為進行BrdU檢測，切片用抗細胞角蛋白並接著用抗兔TRITC、或用特定的單克隆抗體染色，然後用抗鼠Ig-Cγ3(Amersham公司)顯色。然後用如前所述的方法(Penit等，1996)進行BrdU檢測。簡而言之，切片在70％的乙醇中固定30min。半乾後在4M鹽酸中孵育，接著用硼酸鹽緩衝液(Sigma公司)洗至中性，然後用PBS洗兩次。採用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson公司)檢測BrdU。
對三色免疫螢光而言，切片用特定的多腫瘤抑制基因(MTS)單克隆抗體和抗細胞角蛋白一起標記。然後用如前所述的方法檢測BrdU。
切片用Leica螢光顯微鏡和Nikon共焦顯微鏡進行分析。
遷移研究向動物腹膜內注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(鹽酸賽拉嗪；BayerAustralia公司，Botany NSW，澳大利亞)和1.5mg鹽酸氯胺酮(氯胺酮針劑；Parke-Davis公司，Caringbah，NSW，澳大利亞)於生理鹽水進行麻醉。
用FITC標記胸腺細胞的技術與其他文獻中所描述的一樣(Scollay等，1980；Berzins等，1998)。簡而言之，先暴露胸腺葉並且每葉注射約10μm(μl)的350μg/ml FITC(在PBS中)。傷口用手術U形針縫合併且給小鼠取暖使其從麻醉狀態中完全恢復。小鼠在注射後大約24h用CO2窒息處死並將淋巴器官取出進行分析。
在細胞計數之後，樣品用抗CD4-PE和抗CD8-APC染色，接著用流式細胞儀分析。遷移細胞被確定為活的門化的(live-gated)FITC+細胞，其表達CD4或CD8(忽略自身螢光細胞和雙聯體)。FITC+CD4和CD8細胞的百分比加起來分別得到淋巴結和脾的總遷移百分比。用Berzins等(1998)描述的方法計算每天的輸出速率。
數據採用非配對的t檢驗或非參數的曼-惠特尼檢驗進行分析，並用來對至少重複三次的試驗結果進行分析，以確定對照組和測試組結果之間的統計顯著性。試驗數據同對照數據相比的顯著性差異用下列方式表示*p≤0.05、**p≤0.01以及***p≤0.001。
結果年齡對胸腺細胞群的影響(i)胸腺重量和胸腺細胞數量隨年齡的增長，胸腺重量(圖1A)和總胸腺細胞數量(圖1B)均明顯下降(p≤0.0001)。在年輕成體中的相對胸腺重量(mg胸腺/g體重)的平均值為3.34，在18-24個月大的時候相對胸腺重量降至0.66(脂肪沉積限制了計算的準確性)。胸腺重量的降低可歸因於淋巴細胞總數的降低1-2個月時胸腺含有約6.7×107個胸腺細胞，在24個月時降低至約4.5×106個細胞。通過閹割消除性類固醇對胸腺的影響，胸腺發生再生，並且在閹割後4周，胸腺與年輕成體的胸腺重量和細胞結構(cellularity)相當(圖1A和1B)。有趣的是，在閹割後兩周胸腺細胞數量有顯著上升(p≤0.001)(約1.2×108)，在閹割後4周恢復到正常年輕成體的水平(圖1B)。
隨年齡變化胸腺產生的T細胞數量減少並不反映在外周中，並且脾細胞數量保持不變(圖2A)。外周的內環境穩定(homeostatic)機制非常明顯，因為在脾和淋巴結中的B細胞和T細胞數的比率不隨年齡和隨後進入外周中的T細胞數量減少而發生變化(圖2B)。然而，CD4+和CD8+T細胞數的比率隨年齡顯著降低(p≤0.001)，從2月時的2∶1降至2歲時的1∶1(圖2C)。在閹割和隨之發生的進入外周的T細胞數量上升之後，外周中的T細胞數量沒有變化脾T細胞數和在脾和淋巴結中的B∶T細胞比率在閹割後沒有改變(圖2A和2B)。外周中隨年齡變化CD4∶CD8比率降低在閹割後兩周仍然很明顯，但在閹割後4周完全逆轉(圖2C)。
(ii)αβTCR、γδTCR、CD4和CD8的表達為了確定胸腺細胞數量隨年齡增長而降低是否是特定的細胞群耗盡所致，我們對胸腺細胞進行特定標記，以便對各個亞群進行分析。此外，還可以分析閹割後胸腺再生的動力學。將主要胸腺細胞亞群的比例與正常年輕個體的胸腺相比較(圖3)，結果表明不隨年齡變化。此外，通過αβTCR和γδTCR的表達對胸腺細胞的進一步細分顯示這些細胞群的比例不隨年齡發生變化(數據沒有列出)。在閹割後2和4周，胸腺細胞亞群保持相同比例，並且因為胸腺細胞數量在閹割後增加至100倍，這表明所有胸腺細胞亞群同時擴充，不是進行式的逐步擴增(developmental progression ofexpansion)。
因而在年老動物胸腺中細胞數量的減少是所有細胞表型的平衡減少的結果，T細胞群沒有發生明顯的變化。胸腺以同步的方式再生，同時補足所有的T細胞亞群而不是依次補足。
胸腺細胞的增殖如圖4所示，15-20％的胸腺細胞在4-6周時進行增殖。這些胸腺細胞的大部分(約80％)是DP，TN亞群次之(～6％)(圖5A)。因此，利用免疫組化，可以看到大部分分裂(division)是在被膜下(subcapsule)和皮質(數據沒有列出)。在髓質區域也可以看到一些分裂，用FACS分析顯示正在分裂的SP細胞的比例(9％的CD4T細胞和25％的CD8 T細胞)(圖5B)。
儘管細胞數量在老年胸腺中顯著降低，但胸腺細胞的增殖保持恆定，在2年時降至12-15％(圖4)，而增殖細胞群的表型與兩個月大的胸腺類似(圖5A)。免疫組織學研究顯示在1年時的分裂與年輕成體中所見相同；然而，在兩年時，觀察到的增殖主要發生在外皮質和維管結構(vasculature)周圍(數據沒有列出)。在閹割後兩周，儘管胸腺細胞數量顯著增加，但正在繁殖的胸腺細胞的比例並沒有變化，再一次顯示細胞擴充的同步性(圖4)。免疫組織學顯示閹割兩周後，胸腺細胞增殖的定位化(localization)和分裂細胞的程度與兩個月大的胸腺類似(數據沒有列出)。當分析代表細胞增殖群的每個亞群的比例時，CD8 T細胞的百分比顯著增加(p＜0.001)，該T細胞是在增殖群內(在兩個月和兩年大的時候為1％，在閹割後兩周增至約6％)(圖5A)。
圖5B說明在年輕的、老的、和閹割過的小鼠中每個亞類增殖的程度。DN亞類的增殖有顯著的下降(p≤0.001)(兩個月時為35％，2年時為4％)。CD8+T細胞的增殖也顯著下降(p≤0.001)，同時說明了免疫組化發現(數據沒有列出)，其中在年老胸腺的髓質中沒有明顯的分裂。在閹割後4周DN增殖的下降沒有恢復到正常年輕胸腺的水平。然而，CD8+T細胞亞類的增殖在閹割後兩周明顯增加(p≤0.001)並在閹割後四周恢復到正常年輕胸腺的水平。
DN亞類的增殖下降可用CD44和CD25兩個標記物進行進一步分析。DN亞群，除了胸腺細胞前體之外，還包括αβTCR+CD4-CD8-胸腺細胞，認為其在轉變成SP細胞時具有下遊調節共同受體的功能(Godfrey Zlotnik，1993)。通過選擇性控制這些成熟細胞，能夠分析真正的TN區域(compartment)(CD3-CD4-CD8-)，結果顯示細胞的增殖速率不隨年齡或閹割發生變化(圖5C)。然而，對表達CD44和CD25的亞群進行的分析顯示，TN1亞類(CD44+CD25-)的增殖明顯降低(p≤0.001)，從年輕正常狀態的20％到18個月時的6％左右(圖5D)，閹割後4周其得到恢復。TN1亞類的增殖降低可由TN2亞群(CD44+CD25+)增殖的顯著增加(p≤0.001)進行補償，該細胞亞群在閹割後兩周恢復到年輕正常狀態(圖5D)。
年齡對胸腺微環境的影響通過免疫螢光法檢測了胸腺微環境隨年齡的變化，其中利用來自MTS系列的單克隆抗體(MAbs)延伸板，經多克隆抗細胞角蛋白抗體雙標記。
由這些單克隆抗體識別的抗原可分為三組胸腺上皮亞類、血管相關抗原、和在基質細胞和胸腺細胞上均存在的那些抗原。
(i)上皮細胞抗原對兩年大的小鼠胸腺進行抗角蛋白(泛上皮)染色顯示胸腺的正常結構遭到破壞，伴隨嚴重的上皮細胞結構破壞和缺乏明顯的皮質-髓質連接。使用單克隆抗體、MTS10(髓質)、和MTS44(皮質)進行的進一步分析顯示，皮質大小隨年齡明顯減小，伴有不很明顯的髓質上皮的減小(數據沒有列出)。在年老的胸腺中，無上皮細胞區域或角蛋白陰性區域(KNA’s，van Ewijk等，1980；Godfrey等，1990；Bruijnties等，1993)更明顯並且尺寸變大，與用抗細胞角蛋白標記一樣明顯。在老年胸腺中還出現胸腺上皮「囊泡狀」結構，尤其是在髓質區域特別明顯(數據沒有列出)。用抗細胞角蛋白染色確實顯示脂肪沉積、胸腺尺寸的嚴重減小、和皮質-髓質連接完整性的下降(數據沒有列出)。在閹割後兩周胸腺開始再生。明顯表現在胸腺葉的大小、皮質上皮的增加(如通過MTS44所顯示的)、以及髓質上皮的定位化。用MTS10檢測髓質上皮，在兩周時，仍然有MTS10染色的副囊(subpockets)分散在整個皮質中。在閹割後4周，有明顯的髓質和皮質以及明顯的皮質-髓質連接(數據沒有列出)。
MTS20和24標記可用於檢測原始上皮細胞(Godfrey等，1990)，並且進一步說明老年胸腺的退化情況。退化表現為在E14時的豐度，在4-6周可檢測到單獨的髓質上皮細胞簇，但年老的胸腺中強度再次增加(數據沒有列出)。在閹割後，所有這些抗原在與年輕成體胸腺相當的水平上進行表達(數據沒有列出)，並且MTS20和24恢復到在皮質-髓質連接處的散在的副囊。
(ii)血管相關抗原認為血-胸腺屏障與T細胞前體向胸腺遷移和成熟T細胞從胸腺遷移到外周相關。
單克隆抗體MTS15是胸腺血管內皮特異性的，顯示粒狀、分散的染色圖(pattern)(Godfrey等，1990)。在老年胸腺中，MTS15表達顯著增加，並反映血管及其血管周圍空間的頻率和尺寸的增加(數據沒有列出)。
胸腺細胞外基質，包括重要的結構和細胞粘連分子，例如膠原、層粘連蛋白、和纖維蛋白原，可用單克隆抗體MTS16檢測。MTS16表達在正常年輕胸腺中較為分散，在老年胸腺中表達則更廣泛並且存在內在聯繫。在閹割後2周，MTS16的表達進一步增加，而閹割後4周，該表達表現為2月胸腺的典型的狀態(數據沒有列出)。
(iii)共享抗體正常年輕胸腺中的MHCII表達(用單克隆抗體MTS6檢測)在皮質上皮為強陽性(粒狀)(Godfrey等，1990)，在髓質上皮染色較弱。老年胸腺中MHCII表達下降並在閹割後兩周表達顯著上升。在閹割後4周，表達再次降低並且和2個月大的胸腺類似(數據沒有列出)。
胸腺細胞遷移在年輕小鼠中，每天大約有1％的T細胞從胸腺中排出(Scollay等，1980)。我們發現T細胞遷移速率在14個月和甚至2年大時與正常年輕小鼠相當(圖5)，儘管細胞數量明顯減少(p≤0.0001)。胸腺最近排出物的CD4∶CD8比率從2個月時的約3∶1增至26個月時的7∶1。閹割後1周，遷移的總速率保持在1-1.5％，但遷移到外周中的細胞數量顯著增加。
實施例如下實施例提供本發明的方法的特定實施例，但並非對本發明內容進行限制。為了方便起見，這些實施例描述用於防治HIV感染的基因治療。
實施例1T細胞清除進行T細胞消除以儘可能多的除去HIV感染細胞。同時也除去識別非自身抗原的T細胞，以便使用非自體的、遺傳修飾的細胞。該步驟的一種標準程序如下。患者接受抗T細胞抗體的方式如下以每天15mg/kg的劑量注射抗胸腺細胞丙種(Atgam)(異種抗T細胞球蛋白，Pharmacia Upjohn公司)10天，與T細胞活性抑制劑環孢菌素A(3mg/kg)聯合用藥，連續注射3-4周，之後(如果需要的話)以每天9mg/kg的劑量服用片劑。這種治療並不影響患者胸腺的早期T細胞發育，因為由於人類胸腺的大小和結構，不能給予具有此種效果所需的抗體劑量。治療持續約4-6周，使性類固醇水平降低和胸腺的重組有充分的時間。T細胞反應活性的抑制可與第二水平信號抑制劑(如白介素或細胞粘連分子)一起施用，以增強T細胞消融。
這種外周T細胞的清除能夠最大程度降低移植排斥的危險，因為它非特異性地清除所有T細胞，包括與外來供體有潛在反應性的T細胞。與此同時，然而，由於缺乏T細胞，該程序會誘導全身性(generalized)免疫缺陷狀態，這意味著患者對感染、尤其是病毒感染高度敏感。在缺乏適當的T細胞幫助的條件下，甚至B細胞應答也不能正常進行。
此外，在治療前和整個過程中採用HAART治療以降低病毒效價。
實施例2性類固醇消融治療採用對患者施用LHRH激動劑的形式進行性類固醇消融治療。以Leucrin(長效製劑；22.5mg)或醋酸性瑞林(灌輸；10.8mg)形式給藥，任何一種單劑藥效持續3個月。這可有效降低性類固醇的水平，從而足以重新激活胸腺。在某些情況下，也需要在整個性類固醇消融治療過程中施用抑制腎上腺產生性類固醇的抑制劑，如每天服用一片Cosudex(5mg/day)。腎上腺產生的性類固醇佔人體類固醇的約10-15％。
將血液中的性類固醇降到最低值約需1-3周；與之相對應的是胸腺的重新激活。在某些情況下，需要將治療延長，進行第二個三個月的注射/灌輸療程。
實施例3其他給藥方法可採用其它方法來代替這種3個月的長效製劑注射或移植注入LHRH激動劑的方法。在一個實施例中，患者的皮膚可用雷射器(如鉺釔鋁石榴石雷射器)進行輻照，來消融或蝕變皮膚，從而減少角質層的阻礙效應(impeding effect)。
A.雷射消融或改變紅外雷射輻射脈衝是由固態的、脈衝鉺釔鋁石榴石雷射器產生，該雷射器由如下部分組成兩個平面共振腔反射鏡(flat resonator mirrors)、作為激活介質的鉺釔鋁石榴石晶體、電源、和聚焦雷射束的方式。雷射束的波長為2.94微米。使用單脈衝。
操作參數如下每個脈衝能量為40、80、或120mJ，焦點位置的光束大小為2mm，產生的能注量為1.27、2.55、或3.82J/cm2。脈衝時域為300μs，產生的能注量率(energy fluence rate)為0.42、0.85、或1.27×104W/cm2。
接著，一定劑量的LHRH激動劑施用在皮膚上並且分散在輻照部位。該LHRH激動劑的形式可為軟膏，以便保持在輻照部位。可選地，封閉貼片(occlusive patch)可置於激動劑上，使其保持於輻照部位上。
可選地，使用分束器來分裂雷射束，從而產生多部位的消融或蝕變。該方法使LHRH激動劑快速通過皮膚進入血流中。部位數量可以提前決定，使激動劑在患者體內保持需要的約30天時間。
B.壓力波一定劑量的LHRH激動劑被置於適合的容器(如可變形的塑料墊圈(washer)(直徑大約1英寸(25.4mm)，厚度大約1/16英寸(1.5875mm))內，並放於要產生壓力波的皮膚處。該部位的皮膚用靶材料(如大約1mm厚的黑色聚苯乙烯片)覆蓋。Q開關固態紅寶石雷射器(脈衝持續20ns，每個脈衝能夠產生達2J的能量)用於產生雷射束，該雷射束擊中靶材料並產生單個短暫脈衝。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收雷射輻射以至於皮膚只暴露於短暫脈衝，而不會暴露於雷射輻射。該過程不產生疼痛。這種操作可每天重複，或根據需要進行，以維持循環血液中的激動劑的水平。
實施例4HSC的遺傳修飾因為大多數HIV感染患者的HSC細胞濃度很低，所以優選採用供體來供應細胞。實際應用中，在收集細胞之前，通過以10μg/kg的劑量給供體注射粒細胞集落刺激因子(G-CSF)2-5天，來增強供體血液中的HSC水平。CD34+供體細胞從供體血液或骨髓中純化得到，優選利用流式細胞計(flow cytometer)或免疫磁珠(immunomagnetic beading)。來自供體的HSC經流式細胞計分析被確定是CD34+。可選地，這些HSC可以採用幹細胞因子在體外擴增。
反轉錄病毒載體含有HIV-1 rev基因的反顯性突變株，RevM10，其抑制HIV複製(Bonyhadi等，1997)。含有上清液的兩性(Amphotropic)載體由經載體轉染的嗜同生產者細胞(ecotropicproducer cells)的過濾上清液感染得到。收集的CD34+細胞在加有IL-3、IL-6和幹細胞因子(SCF)(每種10ng/ml)的LCTM培養基中預激活24h，以誘導細胞進入細胞周期。含有載體的上清液重複加入到細胞中2-3天，以完成載體進入細胞的轉導過程。
在施用LHRH激動劑約1-3周後，剛好在胸腺重新激活之前或在胸腺重新激活的時候，患者用基因重組的HSC感染，優選劑量為約2-4×106個細胞/kg。可選地，在受體體內也可注射G-CSF來幫助HSC的擴充。
重新激活的胸腺吸收遺傳修飾的HSC，並在將受體的HSC轉化為受體型T細胞和樹突狀細胞的同時，將它們轉化為供體型T細胞和樹突狀細胞。通過細胞凋亡清除細胞或通過免疫調節細胞誘導耐受性，供體樹突狀細胞使任何與受體具有潛在反應性的T細胞耐受性。
實施例5其它方法在縮短供體遺傳修飾細胞的移植時間的情況下，實施例1-4中的時限(timeline)可以修改。T細胞消融和性類固醇消除可以同時開始。T細胞消融持續約10天，而性類固醇消除持續約3個月。
實施例6免疫抑制的終結當胸腺嵌合體已經建立並且新的成熟T細胞群開始從胸腺中排出時，從患者體內取血，並且用標準淋巴細胞混合反應體外檢測T細胞對供體細胞的免疫應答的缺乏性。如果沒有應答，就將免疫抑制治療逐漸減少以允許抗感染的自我防禦產生。如果沒有排斥現象，如由血液中存在活化T細胞所部分地表明的，則最終完全停止免疫抑制治療。因為HSC有很強的自我更新能力，如此形成的造血嵌合體(chimera)在理論上在患者一生中都是穩定的(如對於正常、沒有耐受化、和非移植人群而言)。
實施例7利用LHRH激動劑重新激活人類的胸腺為了說明本發明的方法可以重新激活人類胸腺，這些方法用於已經接受化療的前列腺癌患者。在性類固醇消融治療前和治療後4月，對前列腺癌症患者進行評估。結果總結在圖23-27中。總的來講，數據說明許多患者體內T細胞狀態在質量和數量上都有改善。
LHRH治療對總淋巴細胞數目及其T細胞亞類的影響採用LHRH激動劑治療前列腺癌患者(所有患者大於60歲)，對外周血淋巴細胞的表型組成進行分析(圖23)。在開始LHRH激動劑治療之前和4個月後進行患者樣品分析。所有患者的每ml血液的總淋巴細胞數量在治療前是位於對照值的較低端。在治療之後，6/9的患者體內淋巴細胞總數明顯上升(在某些情況下總細胞數加倍)。與此相關的是6/9的患者總T細胞數增加。就CD4+亞類而言，這種增長更加明顯，8/9的患者CD4+T細胞水平增加。而在CD8+亞類中，趨勢不是很明顯，有4/9的患者的水平升高，雖然一般來說升高的程度也小於CD4+T細胞。
LHRH治療對T細胞亞類比例的影響對LHRH激動劑治療前後患者血液的分析表明T細胞、CD4+或CD8+T細胞的總比例沒有明顯變化，但CD4+∶CD8+比率在治療後有不同的變化(圖24)。這顯示，儘管治療後總T細胞數明顯增加，但治療對各T細胞亞類的內環境穩定的維持幾乎沒有影響。所有的值與對照值相比較。
LHRH治療對B細胞和骨髓性細胞比例的影響對LHRH激動劑治療的患者外周血中的B細胞和骨髓性細胞(NK、NKT、和巨噬細胞)的比例進行分析，結果表明各亞類有不同程度的變化(圖25)。雖然治療後NK、NKT、和巨噬細胞的比例相對不變，但在4/9的患者中B細胞比例下降。
LHRH激動劑治療對B細胞和骨髓性細胞總數的影響對治療後的外周血內的B細胞和骨髓性細胞總數進行分析，分析結果清楚顯示治療後NK(5/9患者)、NKT(4/9患者)、和巨噬細胞(3/9患者)的細胞數目明顯增加(圖26)(圖29)。B細胞的數量變化沒有明顯趨勢2/9的患者水平增加，4/9的患者沒有明顯變化、以及3/9的患者水平下降。
LHRH治療對相對於記憶細胞的純真細胞水平的影響在LHRH激動劑治療後所見到的主要變化是在外周血T細胞群內。尤其是，純真(CD45RA+)CD4+細胞比例選擇性增加，同時CD4+T細胞亞類中的純真細胞(CD45RA+)對記憶細胞(CD45RO+)的比率在6/9的患者中增加(圖27)。
結論因此可得出這樣的結論，採用LHRH激動劑治療動物(如具有萎縮胸腺的人類)，可以誘導胸腺的重新激活。接受性類固醇消融治療的前列腺癌患者，其血液T淋巴細胞的狀態顯示出總體的改善。然而要精確確定這些細胞是否僅來自於胸腺是非常困難的，因為還沒有關於其他的T細胞主要來源(CD8αβ鏈)的描述，我們可以從邏輯上得出上述結論。胃腸道T細胞主要是TCRγδ或CD8αα鏈。
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權利要求
1.對患者進行基因改造的方法，包括以下步驟基因修飾細胞，其中所述細胞是選自HSC、淋巴祖細胞、骨髓性祖細胞、上皮幹細胞、及其組合；以及將它們輸送到所述患者體內，同時所述患者的胸腺處於重新激活狀態。
2.根據權利要求1所述的方法，進一步包括在施用細胞之前進行T細胞消融。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述患者的胸腺已至少部分失活。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述患者處於青春期後。
5.根據權利要求3所述的方法，其中所述患者患有或曾經患有疾病或得到疾病治療，其至少部分使所述患者胸腺失活。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞是來自所述患者。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞不是來自所述患者。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述患者患有T細胞紊亂。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述T細胞紊亂由選自由T細胞功能紊亂、HIV感染、和T細胞白血病病毒感染的疾病所組成的組所引起。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述細胞經遺傳修飾抑制病毒對所述細胞的感染。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述細胞經遺傳修飾以抑制病毒在T細胞內複製。
12.根據權利要求9所述的方法，其中所述T細胞紊亂由HIV感染引起。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述細胞經遺傳修飾以包括穩定表達的多核苷酸，所述多核苷酸選自由船形盆轉錄因子基因、編碼剪切HIV tat和/或rev基因的核酶的基因、HIV-1 rev基因的反顯性突變株(RevM10)、HIV-1 rev應答元件(RRE)的過表達結構、及其功能片段組成的組。
14.根據權利要求1所述的方法，其中所述HSC是CD34+。
15.根據權利要求1所述的方法，其中所述遺傳修飾細胞大約在所述胸腺開始重新激活時或稍後對所述患者施用。
16.根據權利要求1所述的方法，其中阻斷傳向所述胸腺的所述性類固醇介導的信號的所述方法是通過施用一種或多種藥物。
17.根據權利要求11所述的方法，其中所述藥物是選自由LHRH激動劑、LHRH拮抗劑、抗LHRH疫苗、及其組合組成的組。
18.根據權利要求12所述的方法，其中所述LHRH激動劑是選自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、組氨瑞林、那法瑞林、黃體瑞林、亮丙瑞林、和地洛瑞林組成的組。
19.一種防止患者受到HIV感染的方法，包括下述步驟T細胞消融、阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號、以及給予遺傳修飾細胞，其中所述遺傳修飾細胞是選自遺傳修飾的HSC、淋巴樣祖細胞、骨髓性祖細胞、及其組合。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述遺傳修飾細胞含有能阻止T細胞受HIV感染的穩定表達的多核苷酸。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述穩定表達的多核苷酸是選自由船形盆轉錄因子基因、編碼剪切HIV tat和/或rev基因的核酶的基因、HIV-1 rev基因的反顯性突變株(RevM10)、HIV-1 rev應答元件(RRE)的過表達結構、及其功能片段組成的組。
22.根據權利要求19所述的方法，其中所述HSC是CD34+。
23.根據權利要求19所述的方法，其中所述遺傳修飾細胞大約在所述胸腺開始重新激活或稍後對所述患者施用。
24.根據權利要求19所述的方法，其中阻斷傳向所述胸腺的所述性類固醇介導的信號的所述方法是通過施用一種或多種藥物。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述藥物是選自由LHRH激動劑、LHRH拮抗劑、抗LHRH疫苗、及其組合組成的組。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述LHRH激動劑是選自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、組氨瑞林、那法瑞林、黃體瑞林、亮丙瑞林、和地洛瑞林組成的組。
全文摘要
本發明提供利用造血幹細胞(HSC)、淋巴祖細胞、和/或骨髓性祖細胞進行基因治療的方法。這些細胞通過基因重組產生能夠在這些細胞及其分化後的後代細胞中表達的基因。在優選的具體實施例中，這些細胞含有能抵抗HIV感染和/或複製的基因或基因片段。這些細胞與重新激活患者胸腺的治療聯合用藥。因為患者在胸腺重新活化過程中產生外來細胞抗性，因而這些細胞可以是自體的、同種同基因的、同種異基因的、或異種異基因的。在優選的具體實施例中，造血幹細胞是CD3文檔編號A61K48/00GK1582178SQ01820138
公開日2005年2月16日 申請日期2001年10月12日 優先權日2000年10月13日
發明者理察·博伊德 申請人:莫納什大學