用作抗病毒劑的防衛素的製作方法

2023-05-14 16:04:41 3

專利名稱：用作抗病毒劑的防衛素的製作方法
相關申請的交叉引用本申請涉及2002年9月20日提交的美國臨時專利申請60/412,414、2002年8月23日提交的60/405,595、以及2002年5月31日提交的60/384,428，出於所有目的，在此併入這些專利中的技術以供參考。
背景技術：
本發明涉及應用防衛素抑制病毒，如HIV。本發明還關於鑑定和應用所述試劑(如小型有機分子、抗體、肽、核酸(如反義核酸和核酶))的方法，其能提高天然存在的防衛素的表達或活性，從而抑制細胞中的HIV；同時，還關於將表達曲線和組合物用於診斷、預防和治療與HIV相關的感染以及相關的疾病狀態，如AIDS。
人免疫缺陷病毒(HIV)感染了全球成百上千萬的人，據報導，全球範圍內，幾乎每個國家都預計有4千萬成人和兒童生活在HIV/AIDS的陰影中。在2001年，5百萬人新感染上了HIV，並且有3百萬成人和兒童死於HIV/AIDS。這些患AIDS的人群中有三分之一的年齡在15-24歲(世界健康組織，2001)。然而，在HIV/AIDS的治療中，目前應用在治療療法中的藥物呈現出大量的副作用，包括從頭痛、腹瀉、疲勞、噁心、刺痛感、腹痛、食慾降低到升高腎功能和肝功能等。此外，現有的用於治療HIV/AIDS的藥物需要持久地進行治療，經常會誘導藥物抗性，不能從體內完全根除所述的病毒。
已知CD8+T淋巴細胞在免疫應答對抗HIV-1感染方面具有重要的作用。使用CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)直接殺死感染HIV的細胞在病毒抑制方面是重要的；由CD8+T淋巴細胞分泌的非細胞毒性、可溶性因子也能夠在體外抑制HIV的複製，這在15多年前就已經被發現了。這些非細胞毒性的可溶因子最初被Walker以及他的同事描述為抗病毒因子(CAF)，一種由來自於某些HIV-1感染個體的受激CD8+T細胞分泌的擴散性分子。已經證明，CTL依賴的和CAF相關的抗病毒活性都與高的CD8+T細胞數、增進的臨床狀態以及長期HIV感染後的長期非進展有關。然而，與CTL不同，CAF的抗病毒活性是非細胞毒性的，不受主要組織相關性複合物1分子或細胞-細胞接觸的限制。已證明，來自於感染HIV-1的人體內的受激CD8+T淋巴細胞可以分泌大量的CAF，所述感染HIV-1的人臨床狀態良好，特別是那些被描述為長期非進展的人(LTNP)(Levy等，Immunol.Today，17217，1996，Cao等，N.Engl.J.Med.，332201(1995)，Barker等，Blood，923105(1998)，以及Mackewicz等，J.Clin.Invest.，871462(1991))。相反，來自進展者(即帶有明顯免疫缺陷的患者)的受激CD8+T細胞不常分泌CAF。1999年有報導稱，當應用一種單克隆抗體來消除CD8+T細胞時，獼猴中SIV複製顯著增強(X.Jin等，J.Exp.Med.，189991(1999)和J.E.Schmitz等，Science，283857(1999))。CAF類似活性已經在來自SIV感染的恆河猴、非洲綠猴、HIV-1感染的黑猩猩以及一些非感染健康人類的受激CD8+T細胞的上清液中被檢測到了(Kannagi等，J.Immunol.1402237(1998)，Ennen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，917207(1994)，Castro等，Cell.Immunol.，132246(1991)，以及Hsueh等，Cell.Immunol.，159271(1994))。
雖然在過去20年付出了極大的努力，CAF的特性仍然是難以理解的(Levy等，Immunol.Today，17217(1996))。許多研究組試圖鑑定CAF，但都沒有成功。在1995年，Cocchi等指明，受激CD8+T淋巴細胞可以分泌β-趨化因子(RANTES，MIP-1α和MIP-1β)，其能在體外阻滯HIV-1感染(Science，2701811(1995))。然而，觀察到它們的抗病毒活性是對抗趨於感染巨噬細胞的病毒分離物，但不對抗趨於感染T細胞系的菌株。這種兩分現象後來因β-趨化因子受體CCR5的發現而被解釋，其也用作共同受體使HIV-1進入到CD4+T細胞(Deng等，Nature，381661(1996)，Dragic等，Nature，381667(1996)，Choe等，Cell，851135(1996)，Doranz等，Cell，851149(1996)，以及Alkhatib等，Science，2721955(1996))。因而，顯然β-趨化因子可以競爭性阻滯應用CCR5作為共同受體的所謂的R5病毒，而不是應用一種變更的共同抗體CXCR4的所謂的X4病毒(Feng等，Science，272872(1996))。從而一種抗病毒態勢清楚地將β-趨化因子從CAF中區分開。此外，某些研究繼續顯示，CAF的活性不會因移除β-趨化因子或基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)而消除，所述SDF-1α是CXCR4的配體，帶有特異的單克隆抗體(Barker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，951725(1998)，Moriuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9315341(1996)，以及Lacey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，949842(1997))。隨後其它的細胞因子呈現出可作為可能的CAF候選物，包括巨噬細胞衍生的趨化因子和白細胞介素-16，但是沒有一個經受住了時間的考驗(Pal等，Science，278695(1997)，以及Baier等，Nature，378563(1995))。
因而，CAF是一種體外抑制HIV複製的因子，並且由來自未進展到AIDS的感染HIV者的受激CD8細胞分泌的量遠遠高於進展到了AIDS的人。儘管約在1986年就發現了所述因子的存在，從那時起研究者們不斷地進行著研究，但沒有人能夠確定CAF的特性。因此，研究及醫學團體無法開發出依賴於個體自身病毒抑制機制(CAF分泌)的抗病毒療法。
前述可見，需要進行CAF的鑑定，需要開發出可應用於抑制HIV複製和/或感染的新的治療方法。本發明實現了這些目的，還實現了其它一些需要。
發明概述現在已經發現，防衛素即α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3，對於CAF的抗病毒活性是重要的。已知嗜中性粒細胞能生成α-防衛素，現在發現CD8+細胞也能生成α-防衛素1、2和3。同時也顯示，α-防衛素1、2和3能夠在體外抑制HIV在CD4+細胞中的複製。此外，已經發現，α-防衛素1與α-防衛素2或α-防衛素1與α-防衛素3的結合應用比單獨應用顯示出更高的HIV抑制活性。
本發明部分基於發現防衛素(如α-防衛素和β-防衛素)具有抗病毒活性，並且能夠用於治療患者的病毒性疾病。特別的，也發現防衛素(如α-防衛素)與CD8的抗病毒活性特別是抗HIV活性有關。並且，已經發現，兩種防衛素的結合(如α-防衛素1與α-防衛素2)與單一的應用相比具有顯著的活性增強作用。因此，本發明提供了藥物組合物、預防和治療方法、診斷和預後方法及試劑盒，以及利用防衛素的抗HIV活性的藥物篩選方法。
伴隨著防衛素被發現與CAF活性相關，本發明提供了防衛素在HIV治療療法中的應用。比如，將防衛素預防性或治療性地給予人體，用於預防或治療HIV感染。預防性的治療對於HIV感染高危人群是特別有用的。本發明提供了抑制HIV在人體複製的方法，通過給予人體藥物有效量的防衛素，如α-防衛素，優選地，施用至少兩種防衛素，如兩種α-防衛素。在某些實施方案中，所述防衛素可以是被修飾的形式，如作為融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含防衛素部分以及另一個多肽部分，所述多肽部分在體內可通過如靶向CD4+細胞、促進穩定性或生物利用度等來增強防衛素的效果。本發明還提供了藥物組合物，在一種藥學上可接受的載體中包含一種或多種防衛素或其修飾形式。在另一個實施方案中，抑制HIV複製的方法涉及向個體施用一種可激活CD8+細胞的組合物，當其被刺激時生成防衛素，如α-防衛素。
在另一個實施方案中，將CD8+細胞先體外後體內(ex vivo)擴展，並檢測防衛素的生成。然後，將能夠生成防衛素的細胞導入到人體用於預防或治療。
本發明也提供了涉及防衛素基因治療的方法。在一個實施方案中，一種包含可編碼防衛素或其修飾形式或至少兩種防衛素的核苷酸序列的核酸被給予人體。然後所述核酸進入到細胞並被轉錄和翻譯，生成防衛素多肽。此外，所述核苷酸序列可以編碼α-防衛素、β-防衛素或它們的修飾形式，或可施用至少編碼兩種防衛素的核酸。在另一個涉及基因治療應用的實施方案中，用編碼防衛素(如α-防衛素)的核酸先體外後體內轉染細胞(如CD8+細胞)，以使被轉染的細胞生成防衛素，並將被轉染的細胞導入到受試者。
前述以及這裡所描述的抑制HIV複製的方法可應用於體外培養的細胞。因此，本發明的方法同時包括體內和體外應用。
長期非進展者比那些AIDS進展者表達明顯多量的防衛素如α-防衛素，這可用於測定某人的HIV感染狀態。也就是說，通過檢測來自某人的樣品(如血清、尿液、血液或其它體液)中的防衛素量，測定其高於或低於某一量，可以確定該人的HIV感染狀態，確定其是否向AIDS進展。α-防衛素的量高於某一給定量(如，存在於大多數AIDS患者中的平均量)說明其可能保持沒有進展到AIDS，當低於所述量時說明其可能進展到了AIDS。可基於所獲得的信息制定治療方案，對於進展者給予更積極的抗HIV治療。在一個實施例中，從患者中分離CD8+細胞，體外刺激，測定防衛素分泌水平。可選擇地，可以檢測樣品中防衛素mRNA(或cDNA)的量，如α-防衛素mRNA，確定其高於或低於某一量。
在另一個實施方案中，本發明提供了用於檢測一種或多種防衛素的試劑盒。此外，所述試劑盒對於本發明的預後方法是有用的。所述試劑盒通常包含一種底物，含有用於捕獲一種或多種防衛素的物質，如衍生化或用抗防衛素抗體可衍生化的微量滴定板或SELDI質譜生物晶片探針；或帶有結合防衛素的色譜表面的SELDI質譜生物晶片探針(如，來自Ciphergen Biosystem公司的WCX或IMAC ProteinClip陣列，弗裡蒙特，CA)。所述試劑盒也可包括第二標記抗體，用於夾心免疫測定和/或指示，以檢測防衛素，將檢測到的防衛素量與可能的HIV感染狀態預後和/或AIDS發展相關聯。
對防衛素抑制HIV複製的認識為找尋調節防衛素活性的化合物提供了指導。因此，本發明提供了藥物篩選試驗。在這些試驗中，將可生成防衛素的細胞(如CD8+細胞)與被測化合物接觸，檢測該化合物對防衛素的mRNA、多肽生成的影響或生物活性的變化。通過該方法被發現的藥物可作為藥物施用，用於預防或治療HIV感染。
本發明還提供了檢測可結合到防衛素的多肽的方法。所述多肽可以是涉及防衛素活性機制的配體。所述方法包括將細胞與防衛素接觸。然後，將來自細胞的防衛素以及結合到其上的多肽捕獲在固相上，並進行檢測。在另一個實施方案中，防衛素被固定在固相上，將細胞內容物與之接觸，接著進行檢測。
在一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含一種防衛素多肽和一種藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，所述防衛素是一種α-防衛素多肽，選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含一種防衛素多肽和一種藥學上可接受的載體，其中，所述組合物包含至少兩種α-防衛素多肽，選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含一種防衛素多肽和一種藥學上可接受的載體，其中，所述組合物包含至少兩種α-防衛素，選自α-防衛素1和α-防衛素2。
在另一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含一種防衛素多肽和一種藥學上可接受的載體，其中，所述組合物是一種α-防衛素多肽，並且所述組合物包含α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種在人體內治療HIV感染的方法。所述方法包括給予人體一種防衛素多肽。在一個實施方案中，所述防衛素多肽是一種α-防衛素多肽，選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。在第二個實施方案中，治療HIV感染的方法還包含施用第二種α-防衛素多肽。所述第二種α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種在人體內治療HIV感染的方法，其中，所述方法包括給予人體治療有效量的α-防衛素1和α-防衛素2。
在另一個方面，本發明提供了一種方法，包含向HIV感染高危個體施用預防量的防衛素多肽。在一個實施方案中，所述防衛素多肽是一種α-防衛素多肽，選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。在第二個實施方案中，所述方法還包含向HIV感染高危個體施用第二種α-防衛素多肽。所述α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。在第三個實施方案中，所述α-防衛素多肽是α-防衛素1和α-防衛素2。
在另一個方面，本發明提供了一種在正在培養的CD4+細胞中抑制HIV感染的方法。所述方法包括將所述細胞與一種防衛素多肽接觸的步驟。在一個實施方案中，所述防衛素多肽是一種α-防衛素多肽，選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。在第二個實施方案中，所述方法還包含將細胞與第二種α-防衛素多肽接觸，所述α-防衛素選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種組合物，在一種藥學上可接受的載體中包含一種編碼第一防衛素多肽的第一核酸。
在另一個方面，本發明提供了一種組合物，在一種藥學上可接受的載體中包含一種編碼第一防衛素多肽的第一核酸，以及一種編碼第二防衛素多肽的第二核酸。在一個實施方案中，所述第一和第二防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。在第二個實施方案中，所述第一和第二防衛素多肽是α-防衛素1和α-防衛素2。
在另一個方面，本發明提供了一種在人體內抑制HIV感染的方法，包含用一種包含編碼防衛素多肽核苷酸序列的核酸轉染細胞。
在另一個方面，本發明提供了一種在人體內抑制HIV感染的方法，包含用一種包含編碼防衛素多肽核苷酸序列的核酸轉染細胞，其中，所述的防衛素多肽是一種α-防衛素多肽，選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。在一個實施方案中，所述細胞是肌細胞。在第二個實施方案中，所述細胞是AC133+或CD34+祖細胞。在第三個實施方案中，所述細胞是AC133+或CD34+祖細胞，且轉染先體外後體內進行。
在另一個方面，本發明提供了一種在人體內抑制HIV感染的方法，包含用一種包含編碼防衛素多肽核苷酸序列的核酸轉染細胞，其中，所述核酸包含一種可誘導性啟動子，操作性地連接到所述編碼防衛素的核苷酸序列上。
在另一個方面，本發明提供了一種測定個體HIV狀態的方法。所述方法包括檢測來自所述個體的樣品中的α-防衛素的量。在一個實施方案中，所述方法還包含將防衛素的量與至少一種其它指標相關聯，所述指標包括HIV感染狀態下的CD8+細胞計數、CD4+細胞計數、HIV病毒負載、總T細胞計數。在第二個實施方案中，所述α-防衛素通ELISA或質譜法(如MALDI或SELDI)來檢測。在第三個實施方案中，所述α-防衛素選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種測定個體HIV狀態的方法。所述方法包括檢測來自所述個體的樣品中的α-防衛素mRNA的量，並將該量與HIV感染狀態相關聯。
在一個實施方案中，所述α-防衛素mRNA選自α-防衛素1mRNA、α-防衛素2mRNA以及α-防衛素3mRNA。
在另一個方面，本發明提供了一種用於測定一種化合物是否在細胞中調節α-防衛素活性方法。所述方法包括將一種可生成α-防衛素的細胞與所述化合物接觸，測定所述化合物對於α-防衛素活性的功能性影響。在一個實施方案中，所述細胞選自嗜中性粒細胞、CD8+細胞和上皮細胞。在第二個實施方案中，通過測定防衛素表達水平、細胞增殖或HIV複製來確定所述的功能性影響。在第三個實施方案中，所述化合物是一種小型有機分子。在第四個實施方案中，所述α-防衛素選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種抑制HIV感染的方法，包含給予人體一種可在細胞中激活防衛素活性的化合物，所述細胞如CD8+細胞。在一個實施方案中，所述化合物通過這裡所描述的方法來鑑定，以確定一種化合物是否能夠在細胞中調節α-防衛素的活性。
在另一個方面，本發明提供了一種方法，包含將細胞與α-防衛素接觸，將固定的抗α-防衛素抗體與細胞溶解產物接觸，由此，來自細胞的α-防衛素被結合到固相上，並檢測結合到固定的α-防衛素上的蛋白。在一個實施方案中，所述細胞是CD4+細胞、HeLa細胞、HOS細胞或2B4細胞。在第二個實施方案中，所述α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種方法，包含將細胞與α-防衛素接觸，將固定的抗α-防衛素抗體與細胞溶解產物接觸，由此，結合到α-防衛素的蛋白被捕獲，並檢測結合到固定的α-防衛素的蛋白。在一個實施方案中，所述細胞是CD4+細胞、HeLa細胞或HOS細胞。在第二個實施方案中，所述α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。
在另一個方面，本發明提供了一種試劑盒。所述試劑盒包含一種底物，其中含有可結合抗體的物質；一種抗α-防衛素多肽的抗體；以及將在患者樣品中測得的α-防衛素的量與AIDS的預後相關聯的指導。在一個實施方案中，所述底物是一種質譜探針。在第二個實施方案中，所述底物是一種微量滴定板。在第三個實施方案中，所述試劑盒還包含一種第二抗體，可特異性抗α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3。在第四個實施方案中，所述第二抗體是被標記的。
在另一個方面，本發明提供了另一種試劑盒。所述試劑盒包含一種可結合α-防衛素多肽的底物，以及將在患者樣品中測得的α-防衛素的量與AIDS的預後相關聯的指導。
在另一個方面，本發明提供了另一種試劑盒，所述試劑盒包含可特異性結合到一種α-防衛素的第一抗體，以及可特異性結合到α-防衛素1、α-防衛素2或α-防衛素3的第二抗體。
在另一個方面，本發明提供了一種α-防衛素融合蛋白，包含第一α-防衛素多肽部分以及可結合CD4+細胞的第二部分。
在另一個方面，本發明提供了一種α-防衛素融合蛋白，包含第一α-防衛素多肽部分以及第二信號肽部分(如TPA信號肽)。
在另一個方面，本發明提供了一種包含編碼α-防衛素融合蛋白的核苷酸序列的核酸，所述融合蛋白包含第一α-防衛素部分以及第二信號肽部分(如TPA信號肽)。
在另一個方面，本發明提供了一種α-防衛素融合蛋白，包含第一α-防衛素多肽部分以及能提高體內穩定性或生物利用度的第二部分。
在另一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含一種PEG化的α-防衛素多肽和一種藥學上可接受的載體。
在另一個方面，本發明提供了一種α-防衛素，包含可刪除蛋白水解切割位點的胺基酸取代，或可提高防衛素生物利用度和/或生物活性的胺基酸取代。
在另一個方面，本發明提供了一種提高內源性α-防衛素生成的方法，包含給予一種可激活CD8+細胞的組合物。在一個實施方案中，所述組合物包含抗CD3和其它T細胞活化劑。
在另一個方面，本發明提供了一種方法，包括先體外後體內擴展CD8+細胞，檢測由CD8+細胞生成的α-防衛素，將所述CD8+細胞給予HLA匹配人群。
在另一個方面，本發明提供了一種方法，包含將一種疫苗以及一種α-防衛素多肽或一種編碼α-防衛素的核酸給予人體。
在另一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含一種疫苗以及一種α-防衛素多肽或一種編碼α-防衛素的核酸。
在另一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含一種α-防衛素和一種第二治療劑或試劑。在一個實施方案中，所述第二治療劑被用於預防或治療HIV感染。在另一個實施方案中，所述第二治療劑被用於治療與HIV感染相關的機會感染。在另一個實施方案中，所述第二治療劑是蛋白酶抑制劑、非核苷反轉錄酶抑制劑、核苷反轉錄酶抑制劑、融合抑制劑、抗逆轉錄病毒核苷、進入抑制劑、或任何其它對於抑制或治療HIV感染有效的抗病毒劑。在另一個實施方案中，所述第二治療劑選自齊多夫定、地達諾新、司他夫定、幹擾素、拉米呋啶、阿德福韋、奈韋拉平、地拉韋啶(delaviridine)、洛韋胺、沙奎那韋、茚地那韋、AZT、T20、T22以及T2。在另一個實施方案中，所述的第二治療劑是一種抗生素或無環鳥苷。在另一個實施方案中，所述的α-防衛素選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。在另一個實施方案中，所述組合物包含兩種或多種α-防衛素。在另一個實施方案中，所述的α-防衛素是α-防衛素1、2或3蛋白，編碼所述α-防衛素蛋白的核苷酸序列，融合蛋白，或編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。
在另一個方面，本發明提供了在人體內治療或預防HIV感染的方法，包含給予人體一種防衛素多肽以及一種第二治療劑。在一個實施方案中，所述第二治療劑被應用於預防或治療HIV感染。在另一個實施方案中，所述第二治療劑被應用於治療HIV感染相關的機會感染。在另一個實施方案中，所述第二治療劑是蛋白酶抑制劑、非核苷反轉錄抑制劑、核苷反轉錄抑制劑、融合抑制劑、抗逆轉錄病毒核苷、進入抑制劑、或任何其它對於抑制或治療HIV感染有效的抗病毒劑。在另一個實施方案中，所述第二抑制劑選自齊多夫定、地達諾新、司他夫定、幹擾素、拉米呋啶、阿德福韋、奈韋拉平、地拉韋啶(delaviridine)、洛韋胺、沙奎那韋、茚地那韋、AZT、T20、T22以及T2。在另一個實施方案中，所述的第二治療劑是一種抗生素或無環鳥苷。在另一個實施方案中，所述的α-防衛素選自α-防衛素1、α-防衛素2以及α-防衛素3。在另一個實施方案中，所述組合物包含兩種或多種α-防衛素。在另一個實施方案中，所述的α-防衛素是α-防衛素蛋白、編碼所述α-防衛素蛋白的核苷酸序列、融合蛋白、或編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。
在另一個方面，本發明提供了一種在正在培養的CD4+細胞中抑制HIV感染的方法，包含將所述細胞與一種防衛素多肽以及一種第二治療劑或其它治療劑的組合接觸的步驟。在一個實施方案中，所述治療劑或試劑被應用於治療或預防HIV感染，在第二個實施方案中，所述治療劑選自蛋白酶抑制劑、非核苷反轉錄抑制劑、融合抑制劑、核苷反轉錄抑制劑、抗逆轉錄病毒核苷、進入抑制劑、或任何其它對於抑制或治療HIV感染有效的抗病毒劑。在第三個實施方案中，所述治療劑選自齊多夫定、地達諾新、司他夫定、幹擾素、拉米呋啶、阿德福韋、奈韋拉平、地拉韋啶(delaviridine)、洛韋胺、沙奎那韋、茚地那韋、AZT、T20、T22以及T2。
附圖簡述

圖1來自受激和非受激的CD8T細胞的培養上清代表蛋白質譜圖，所述細胞獲自兩位LTNR，一位正常個體以及一位進展者。在刺激後蛋白峰的上調是明顯的，並且它們的質量是標示的。
圖22(a)應用包被了抗α-防衛素-1、2、3的抗體的珠，根據蛋白峰識別出人α-防衛素2、1和3的分子質量為3,371.9Da、3,342.5Da、以及3,486.5Da。2(b)應用非串聯質譜儀，在胰酶消化後，對獨特的1060.50Da的肽片斷進行測序(上右)。觀察到由撞擊誘導的1060.50Da母離子的解離。NCBI和SwissProt資料庫的ProteinProspector MS-Tag檢索顯示，來自α-防衛素-1、2、3的肽片斷YGTCIYQGR(突出顯示在上左)最匹配1060.50Da的母離子，具有49的Probability Based MowseScore(Matrix Science的Mascot軟體)。接下來的最接近匹配(β-半乳糖苷酶前體，76，091Da)的分數卻只有17。在該分析中，Mowse分數超過38可認為鑑定陽性或非常同源。
圖3(a)在從LTNP-3和LTNP-5培養上清中消除α-防衛素1、2和3之前(固態)和之後(孵育後)，抗X4和R5 HIV-1的抗病毒活性圖。病毒分離物的名稱如圖顯示，HIV-1的基因型顯示在圓括號中。誤差條圖指明兩個獨立實驗平均值的標準差。3(b)在不斷增加抗α-防衛素1、2和3(左圖)抗體的量、或抗α-防衛素1、2和3抗體與抗β-趨化因子抗體組合物(右圖)的量的情況下，來自LTNP-3和LTNP-5的受激CD8T細胞的培養上清的抗病毒活性。
圖4商業可用的α-防衛素1和2肽(左圖)和純化的α-防衛素1、2和3(右圖)的抗HIV-1活性。每張圖中位於右下角的非連接符號表示當也加入抗α-防衛素單克隆抗體時(25μg)，最高濃度的α-防衛素的抗病毒活性。
圖5在人嗜中性粒細胞以及非受激和受激的CD8T淋巴細胞中，α-防衛素1、2和3的免疫螢光印跡。按照所描述的步驟進行(33)，α-防衛素標記為綠色，CD8蛋白為紅色，細胞核為藍色。
圖6用二硫蘇糖醇(DTT)還原前和還原後，分子質量/電荷的變化。
圖7α-防衛素1和2商用製劑與來自正常個體-2的受激CD8 T細胞上清的α-防衛素的質譜圖的比較。
圖8從正常人嗜中性粒細胞中純化得到的α-防衛素1、2和3實際上與那些從受激的CD8T細胞釋放的α-防衛素是無法區分的。
圖9在受激後的0、1和2天，表達α-防衛素的αβCD8 T細胞的數量。Y軸顯示測得的事件數目。
圖10已知的來自人、小鼠、大鼠、豚鼠和兔的α-防衛素的比對。
發明詳述A.縱覽本發明提供了新的組合物、測定法、試劑盒，以及預防、治療、診斷和預測病毒感染(如HIV感染)、殺死病毒感染細胞(如被HIV感染的細胞)，以及一般地，抑制病毒特別是HIV病毒的複製的方法。本發明部分基於驚人地發現了天然的防衛素在感染HIV疾病的個體中以高的水平存在，所述個體的疾病狀態沒有進展到AIDS，儘管感染10年但與感染HIV並具有AIDS的人不同，並且天然存在的防衛素在那些雖然長期感染但沒有完全發展為AIDS的個體中可阻止HIV的複製。因此，本發明部分基於驚人地發現無論通過外源給藥的還是通過內源生成，當防衛素或其片斷的水平在個體中提高時，可抑制HIV感染，殺死被HIV感染的細胞和/或阻止HIV感染。
本發明提供了在個體中提高外源性防衛素水平的方法，通過向HIV感染者或HIV感染高危個體施用治療化合物，如防衛素蛋白(合成的、重組的或天然存在的)、防衛素核酸，以及包含一種或多種防衛素的藥物組合物。
本發明還提供了抑制HIV感染或複製的方法，通過提供提高內源防衛素活性的各種方法來實現。比如，本發明提供了用於識別防衛素活性的調節劑的試驗。所述防衛素活性的調節劑對於在體內提高內源防衛素以抑制HIV感染和複製是有用的。
本發明還提供了確定感染HIV個體的預後的方法。通過檢測個體中內源防衛素的水平(如嗜中性粒細胞中的防衛素水平)，可對個體中的HIV感染是否進展到AIDS作出結論。所述的結論有助於給予藥物、治療策略以及治療期限的選擇。
本發明還提供了包含一種防衛素多肽和一種藥學上可接受的載體的組合物，所述藥學上可接受的載體用於遞送到感染HIV或HIV感染高危的個體。所述組合物可應用於在個體中治療HIV感染。
本發明還提供了用於診斷和預後個體中HIV感染以及AIDS發展進程的試劑盒。
B.定義在這裡，短語「HIV感染相關的病症」或「HIV感染相關的疾病」是指一種具有HIV感染的特徵的疾病狀態。所述的病症與HIV感染相關，包括但不限於AIDS；Kaposi’s肉瘤；機會感染，如那些由卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)和結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的感染；口腔病害，包括鵝口瘡、黏膜白斑病和口腔潰瘍；非特異淋巴結病；帶狀皰疹；血小板減少症；非細菌性腦膜炎；神經疾病，如弓形體病、隱球菌病、CMV感染、原發性CNS淋巴瘤和HIV相關的痴呆；外周神經病發作；以及肌病。
短語「長期非進展者」是指已經感染HIV大約10年或更久的個體，他們具有正常和穩定水平的CD4+T細胞，並且他們沒有用抗逆轉錄病毒療法治療過。
如果某人屬於一個HIV感染危險性高於總體人群感染危險性的團體，則其屬於HIV感染「高危」者。
在測定可調節防衛素多肽活性的化合物的試驗中，短語「功能性影響」包括確定一個間接或直接在防衛素影響下的參數，如一種表型或化學的影響，例如提高或降低HIV感染、HIV複製的能力，通過HIV感染細胞顯示HIV標記，或細胞(如淋巴細胞，特別是CD4+淋巴細胞)的增殖、凋亡；或如一種物理影響，例如配體結合或配體結合抑制。因而，一種功能性影響包括配體結合活性、細胞增殖能力、HIV感染細胞能力和表達病毒蛋白能力、凋亡、以及酶活性。「功能性影響」包括體外(in vitro)、體內(in vivo)以及先體外後體內(ex vivo)活性。
短語「確定功能性影響」是指試驗一種化合物，看其提高還是降低某個間接或直接在防衛素蛋白影響下的參數，如測定物理和化學或表型影響。所述功能性影響可以通過任何本技術領域人員已知的技術進行測定，如測定分光特性的改變(如螢光、吸光率、折射率)；測定流體動力學(如外形)；色譜分析；或蛋白的溶解特性；測定可誘導的標記或蛋白的轉錄活性；測定結合活性或結合試驗，如結合到抗體的能力；測定配體或底物結合活性的改變；測定細胞增殖；測定凋亡；測定病毒蛋白表達；測定病毒複製；測定在血清中的病毒滴度或病毒RNA拷貝數；測定防衛素的蛋白水平或防衛素相關序列的變化；測定RNA穩定性；下遊或報導基因表達(CAT，螢光素酶，β-gal，GFP，以及類似物)的識別，如可通過化學發光、螢光、比色反應、抗體結合和可誘導標記來進行。
防衛素多核苷酸和多肽序列的「抑制劑」、「活化劑」和「調節劑」用於指使用防衛素多核苷酸和多肽序列進行體外和體內試驗所鑑定的活化、抑制或調節分子。抑制劑是那些部分或全部與阻滯活性、降低、阻止、延遲活性、失活、脫敏、下調活性或下調防衛素蛋白表達相關的化合物，如拮抗劑。活化劑是那些提高、打開、活化、促進、增強活性、敏化、激動、上調防衛素蛋白活性或防衛素表達的化合物，如激動劑。抑制劑、活化劑或調節劑也包括遺傳學修飾形式的防衛素蛋白，如改變活性的形式，以及天然存在和合成的配體、拮抗劑、激動劑、抗體、肽、環肽、核酸、反義分子、核酶、小型化學分子以及它們的類似物。所述用於抑制劑和活化劑的試驗包括如在體外、在細胞中或細胞膜上表達防衛素蛋白，應用推定的調節劑化合物，然後確定關於活性的功能性影響，如上所述。
經潛在的活化劑、抑制劑或調節劑處理的包含防衛素蛋白的樣品或試樣被用於與不含活化劑、抑制劑或調節劑的對照樣品作比較，檢測抑制程度。給予對照樣品(沒有用抑制劑處理)一個相對的蛋白活性值100％。相對於對照，當所述活性值約為80％、特別為50％、更特別為25-0％時，防衛素的抑制成立。相對於對照(沒有用抑制劑處理)，當所述活性值為110％，特別為150％，更特別為200-500％(即比對照高2倍至5倍)，更特別為1000-3000％或更高時，防衛素的活化成立。
這裡使用的術語「測試化合物」、「候選藥物」或「調節劑」描述任何分子，天然存在的或合成的，如蛋白、寡肽(如長度約5至25個胺基酸，優選長度約10至20個胺基酸或12至18個胺基酸，更優選長度為12、15或18個胺基酸)、小型有機分子、多糖、脂類、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等。可以測定所述分子直接或間接調節病毒感染(如HIV感染)的能力。所述測試化合物可以是測試化合物文庫的形式，如組合的或隨機的文庫，提供足夠的多樣性數據。可任選地，測試化合物可連接到一種融合配偶上，如靶向化合物、拯救(rescue)化合物、二聚化合物、穩定化化合物、定址化合物以及其它功能性結構。常規地，具有有用特性的新的化學實體通過鑑定具有某些所需特性或活性(如抑制活性)的測試化合物(稱為「先導化合物」)、創造先導化合物的變體、以及評估所述變體化合物的特性和活性而產生。一般可將高通量篩選(HTS)的方法應用於這種分析。
「小型有機分子」是指一種天然存在或合成的有機分子，其分子量高於約50道爾頓低於約2500道爾頓，優選低於2000道爾頓，更優選在約100至約1000道爾頓之間，更優選在約200至約500道爾頓之間。這裡所描述的「小型有機分子」與肽是不同的。
「生物樣品」包括組織部件如活組織部件和死組織部件樣品，以及為組織學目的而提取的冰凍樣品。所述樣品包括血液、唾液、組織、培養細胞如初級培養、外植體、轉化的細胞、糞便、尿液等。一種生物樣品通常獲自真核有機體，最優選哺乳動物如黑猩猩或人；牛；狗；貓；齧齒動物如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鳥類；爬蟲類；或魚。
在兩條或多條核酸或多肽序列中，術語「相同的」或百分數「相同的」是指兩條或多條序列或亞序列是相同的或具有一定百分比的胺基酸殘基或核苷酸是相同的(即當在一個比較窗口或指定區域對比及排列最大一致性時，在某一特定區域(如編碼這裡所描述的防衛素的核苷酸序列，或這裡所描述的防衛素的胺基酸序列)約60％相同，優選65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)，應用BLAST或BLAST2.0序列比較算法進行對比測定，默認參數將在下文描述，或通過人工排列和目視觀察(參見如NCBI網站站點)進行。然後，所述序列可稱為「實質上相同的」。所述定義也包括具有缺失子和/或插入子的序列，以及那些帶有取代物的序列。如下文所要描述的，優選的算法可以計算出缺口及其類似。優選地，相同存在於一段長度至少約25個胺基酸或核苷酸的區域，或更優選地，相同存在於一段長度至少約50-100胺基酸或核苷酸的區域。
在序列比較時，一般用一條序列作為參照序列，將測定序列與之比較。當使用一種序列比較算法時，測定和參考序列被輸入到一個計算機，接著指定同位體，在必要時，需要指定序列算法程序參數。優選地，可以應用默認的程序參數，或指定選擇性參數。然後，基於程序參數，所述的序列比較算法可計算出測定序列與參考序列相同的百分數。
這裡使用的「比較窗口」包括當兩條序列被最佳排列後，參照任一數目的臨近位置，測定序列與參考序列相比具有相同數目的臨近位置，所述數目選自20-600，通常約50-約200，更常見約100-約150。用於比較的序列的排列方法是本領域已知的。最佳的序列排列是可以導出的，如通過Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482(1981)的局部同源算法；通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443(1970)的同源排列算法；通過Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444(1988)的檢索相似點方法；通過這些算法的計算機化執行(Wisconsin Genetics SoftwarePackage中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science，Madison博士，WI)，或通過人工排列和目視觀察(參見如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等編，1995增刊))。
一種適於確定序列相同百分數和序列相似性的優選的算法是BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述在Altschul等，Nuc.Acids Res.，253389-3402(1977)以及Altschul等，J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。BLAST和BLAST2.0以及這裡所描述的參數被用於確定本發明的核酸和蛋白的序列相同百分數。用於進行BLAST分析的軟體是公眾通過國家生物信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到的。所述算法包括通過鑑定待查詢序列中的短詞長度W，初次鑑定高分數序列對(HSPs)，當與一個資料庫中一個相同長度的詞排列時，其匹配或滿足一些陽性值低限分數T。T作為臨近詞分數低限(Altschul等，同上)。這些初始臨近詞採樣數延伸入每一序列方向，直到累積排列分數被提高。用於核苷酸序列的累積分數使用參數M(一對匹配殘基的獎勵分；總是＞1)以及N(不匹配殘基的處罰分，總是＜1)來計算。對於胺基酸序列，使用記分矩陣來計算累積分數。當累積排列分數因數量X而從其最大可實現值下降、因一個或多個陰性分數殘基排列的積累使累積分數達到0或更低、或到達了每條序列的末尾時，在每一方向上詞採樣數的延伸停止。BLAST算法的參數W、T和X確定算法的敏感性和速度。BLASTN程序(用於核苷酸序列)默認的詞長(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，並且兩條鏈相似。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用的默認詞長為3，期望值(E)為10，並且BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915(1989))排列(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，並且兩條鏈相似。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白」在這裡可交替地用於指胺基酸殘基聚合體。所述術語也適用於一個或多個胺基酸殘基為天然胺基酸人工化學模擬物的胺基酸聚合體，以及天然存在的胺基酸聚合體和非天然存在的胺基酸聚合體。
術語「胺基酸」是指天然存在和合成的胺基酸，以及具有與天然存在的胺基酸相同功能的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是那些通過遺傳密碼子編碼的，以及那些後來經過修飾的胺基酸，如羥脯氨酸、γ-羧穀氨酸以及0-磷絲氨酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同的基本化學結構，即具有一個α碳結合到氫、一個羧基基團、一個氨基基團以及一個R基團的化合物，如高絲氨酸、正亮氨酸、亞碸蛋氨酸(methionine sulfoxide)、甲基鋶蛋氨酸。所述類似物具有經修飾的R基團(如正亮氨酸)或經修飾的肽骨架，但保留了與天然存在胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指化學化合物，其具有的結構與胺基酸通常的化學結構是不同的，但是其作用方式和功能與天然存在胺基酸相似。
這裡胺基酸可使用通常已知的三字母表示法，也可採用依據IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的一字母表示法。同樣的，核苷酸可使用通常被人們所接受的單字母代碼。
「保守性改變的變體」同時適用於胺基酸和核苷酸序列。針對特定的核酸序列，保守性改變的變體是指那些編碼相同或基本相同的胺基酸序列的核酸，或不編碼胺基酸序列的核酸。由於基因代碼的簡併性，很多功能性相同的核酸編碼任一給定的蛋白。比如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因而，在任何一個丙氨酸位置上具有一個指定的密碼子，該密碼子可以被任何其它相應的密碼子取代，而不會改變所編碼的多肽。所述核酸變異是「沉默變異」，其是保守性改變變異的一種。這裡每條編碼多肽的核酸序列也包括所述核酸的每條可能的沉默變異。技術人員可認識到，核酸中的每個密碼子(除了AUG，其通常是編碼蛋氨酸的唯一密碼子；以及TGG，其通常是編碼色氨酸的唯一密碼子)可以被改變，而獲得功能性相同的分子。
因此，每個編碼多肽的核酸的沉默變異隱含在每條與表達產物相應的序列中，而並非與實際的探針序列相應。
至於胺基酸序列，本領域技術人員可認識到，核酸、肽、多肽或蛋白序列中獨特的取代、缺失或插入將變更、增加或刪除編碼序列中一個胺基酸或低百分率的胺基酸，當用一個化學相似的胺基酸取代某個胺基酸，獲得的變更結果稱為「保守性改變變體」。提供了功能相似胺基酸的保守取代表格是本領域中公知的。所述保守性改變變體包括而不排除多態變體、種群同族體、以及等位基因。
以下八組中每組包含了互為保守取代物的胺基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天門冬氨酸(D)，穀氨酸(E)；3)天冬醯胺(N)，穀氨醯胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(參見如Creighton，Proteins(1984))。
大分子結構如多肽結構可以以不同水平的有機體的方式描述。如需全面討論有機體的結構，可參見如Alberts等，Molecular Biology of the Cell(第三版，1994)，以及Cantor和Schimmel，Biophysical Chemistry Part IThe Conformation ofBiological Macromolecules(1980)。「一級結構」是指特定的肽的胺基酸序列。「二級結構」是指在多肽中局部有規則的三維結構。這些結構通常被稱為區域，如酶區域、細胞外區域、跨膜區域、孔隙區域以及細胞質尾部區域。區域是多肽的一部分，形成多肽上一個緊湊的單位，長度一般為15至350個胺基酸。典型的區域包括具有酶活性的區域，如激酶區域。典型的區域由更少的有機體部分組成，如β-摺疊和α-螺旋。「三級結構」是指多肽單體完整的三維結構。「四級結構」是指由獨立的三維單位非共價結合形成的三維結構。非均質項也稱為能量項。
一種特定的核酸序列也隱含地包括「剪接變體」。類似地，由核酸編碼的特定蛋白隱含地包括任何由所述核酸的剪接變體所編碼的蛋白。如其名字所表示的，「剪接變體」是基因選擇性剪接的產物。在轉錄後，起始核酸轉錄子可被剪接，以使不同的(交替的)核酸剪接產物編碼不同的多肽。產生剪接變體的機制是不同的，但包括外顯子的交替剪接。通過通讀(read-through)轉錄衍生自同一核酸的變更的多肽也包含在本定義中。任何剪接反應的產物，包括所述剪接產物的重組形式都包含在本定義中。
「標記」或「可檢測的部分」是一種通過分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理手段可檢測到的組合物。比如，有用的標記包括32P、螢光燃料、電子密度試劑、酶(如在ELISA中一般應用的)、生物素、地高辛、或可檢測的半抗原和蛋白，如通過將一种放射標記加入到肽或用於檢測與所述肽特異性反應的抗體。
術語「重組體」當被應用於如細胞、核酸、蛋白或載體時，指通過導入異源核酸或蛋白或天然核酸或蛋白的變體而發生了改變，或所述細胞衍生自經過前述改變的細胞。因而，重組細胞可表達天然形式的細胞(沒有重組)中沒有的基因，或可表達天然基因異常表達、低表達或不表達的基因。重組細胞也可表達天然基因，通過插入調節DNA序列起始這種表達，所述調節序列如啟動子或增強子。
術語「異源的」當被應用於核酸相關的部分時，表示所述核酸包含兩種或多種在天然狀態下並非來自相同種屬的亞序列。例如，通常將兩條或多條來自不相關的基因的序列排列製成新的功能性核酸，重組地生產核酸，如啟動子來自一個來源，而編碼區域來自另一個來源。類似地，異源蛋白表示所述蛋白包含兩種或多種在天然狀態下並非來自相同種屬的亞序列(如融合蛋白)。
短語「嚴緊雜交條件」是指在核酸的混合物中，所述條件下探針將雜交到其靶序列上而不會雜交到其他序列。嚴緊條件是序列依賴的，並且在不同環境下是不同的。越長的序列在越高的溫度下進行雜交。關於核酸雜交更詳盡的指導可參考Tijssen，生物化學和分子生物學疫術-核酸探針雜交，「雜交原理概觀以及核酸試驗策略」(1993)。通常，嚴緊條件選擇在某一給定的離子強度pH下，低於特定序列的熱熔點(Tm)約5-10℃。Tm是一個溫度(在給定的離子強度、pH和核酸濃度下)，該溫度使得均衡狀態下50％的探針互補地結合到靶序列上(靶序列過量存在，在Tm，均衡狀態下50％的探針被佔用)。嚴緊條件也可通過加入破壞穩定劑如甲醯胺來實現。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號經過至少兩次背景雜交，優選進行10次背景雜交。可行的嚴緊雜交條件可以是50％甲醯胺，5×SSC，以及1％SDS，在42℃孵育，或5×SSC，1％SDS，在65℃孵育，在65℃、0.2×SSC以及0.1％SDS中洗滌。
如果它們編碼的多肽實質上相同的話，在嚴緊條件下沒有相互雜交的核酸仍然是實質上相同的。比如，這發生在當一個拷貝的核酸利用遺傳代碼所允許的最大密碼子簡併性被創造出來時。在這種情況下，所述核苷酸通常在中等嚴緊雜交條件下雜交。可行的「中等嚴緊雜交條件」包括在37℃，40％甲醯胺緩衝液，1M NaCl、1％SDS下雜交，在45℃、1×SSC下洗滌。陽性雜交經過至少兩次背景雜交。普通技術人員將認識到，選擇性的雜交和洗滌條件可被用於提供相似的嚴緊的條件。用於確定雜交參數的其它指導存在於大量的參考文獻，如分子生物學最新方案，Ausubel等編。
對於PCR，36℃的溫度典型用於低嚴緊擴增，儘管根據引物長度不同退火溫度可以在約32℃-48℃之間不等。對於高嚴緊PCR擴增，典型的溫度為62℃，儘管高嚴緊退火溫度在約50℃-約65℃的範圍內，根據引物長度和特異性而不同。高和低嚴緊擴增的典型的循環條件中包括在90℃-95℃退火30秒-2分鐘的階段，退火階段持續30秒-2分鐘，以及包括延伸階段，在72℃進行1-2分鐘。低和高嚴緊擴增反應的方案和指導是公開的(如Innis等(1990)，PCR方案，及其方法和應用指導，學術出版社，紐約)。
「抗體」是指包含來自免疫球蛋白基因或其片斷的框架區的多肽，特異性結合和識別抗原。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恆定區基因，以及許多免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，它們依次限定免疫球蛋白的類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型地，抗體中抗原結合區域的結合特異性和親和力是最關鍵的。
一種可行的免疫球蛋白(抗體)結構單位包含一種四聚體。每個四聚體有兩對相同的多肽鏈，每對具有一條「輕」鏈(約25kD)以及一條「重」鏈(約50-70kD)。每條鏈的N末端具有一段約100-110或更多個胺基酸的可變區，主要用於抗原的識別。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體的存在，如可作為完整的免疫球蛋白存在，或作為一些通過不同肽酶消化獲得的充分定性的片斷存在。因而，比如胃蛋白酶在鉸鏈區二硫鍵以下進行消化，生成F(ab)』2，自身是輕鏈的Fab二聚體通過二硫鍵連接到VH-CH1。在溫和條件下斷裂位於鉸鏈區的二硫鍵，可將F(ab)』2降解，從而將F(ab)』2二聚體轉變為Fab』單體。Fab』單體是帶有部分鉸鏈區的基本Fab(參見基礎免疫學(FundamentalImmunology)(Paul編，第三版，1993))。當不同抗體片斷以完整的抗體被消化的方式限定時，技術人員應理解，所述片斷可通過化學方法或重組DNA方法被重新合成。因此，這裡應用的術語抗體也包括通過對完整抗體進行修改、或通過重組DNA技術(如單鏈Fv)重新合成、或通過噬菌體展示文庫鑑定(參見如McCafferty等，Nature，348552-554(1990))所獲得的抗體片斷。
對於抗體(如重組的、單克隆的或多克隆的抗體)的製備，可應用許多本領域已知的技術(參見如Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today，472(1983)；Cole等，單克隆抗體和癌症治療(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，77-96頁，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual(1988)；以及Goding，Monoclonal AntibodiesLPriciples andPractice(第二版，1986))。編碼抗體的重和輕鏈的基因可以從細胞中克隆出，如編碼一種單克隆抗體的基因可以從雜交瘤中克隆出並用於生成重組單克隆抗體。編碼單克隆抗體重和輕鏈的基因文庫也可從雜交瘤或漿細胞中獲得。重和輕鏈基因產物的隨機結合生成大量具有不同抗原特異性的抗體(參見如Kuby，免疫學(第三版，1997))。用於製備單鏈抗體或重組抗體的技術(美國專利號4,946,778，美國專利號4,816,567)適合於生產本發明的抗體多肽。同樣，轉基因小鼠或其它有機體(如其它哺乳動物)可應用於表達人源化或人抗體(參見如美國專利號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature368812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev. Immunol.，1363-93(1995))。可選擇地，噬菌體展示技術可以應用於鑑定特異性結合到給定抗原的抗體以及異聚Fab片斷(參見如McCafferty等，Nature，348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology，10779-783(1992))。抗體也可製成雙特異的，即能夠識別兩種不同的抗原(參見如WO93/08829，Traunecker等，EMBOJ.，103655-3659(1991)；以及Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986))。抗體也可以是異源共軛物，如兩個共價結合的抗體，或免疫毒素(參見如美國專利號4,676,980，WO91/00360；WO92/200373；以及EP 03089)。
人源化或靈長類化(primatizing)非人抗體的方法是本領域已知的。通常，人源化的抗體被引入一個或多個非人來源的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基經常作為引入殘基，典型地被引入可變區域。人源化基本上可根據Winter及其同事的方法進行(參見如Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992))，通過用齧齒動物CDRs或CDR取代人抗體的相應序列。因此，所述人源化抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其本質上少於整個人可變區被來自非人種屬的相應序列取代。實際上，人源化抗體是人抗體，其中一些CDR殘基以及可能一些FR殘基被來自相似位點的齧齒動物抗體殘基所取代。
「嵌合抗體」是一種抗體分子，其中(a)恆定區或其部分被變更、取代或交換，使抗原結合位點(可變區)連接到不同或變更類型的恆定區，效應物和/或核素，或完全不同的分子，給予嵌合抗體新的特性，如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區或其部分被變更、取代或交換，使可變區具有不同或變更的抗原特異性。
在一個實施方案中，所述抗體結合到「效應物」結構上。所速效應物結構可以是任何數量的分子，包括標記結構如放射活性標記或螢光標記，或可以是治療結構域。在一個方面所述抗體調節蛋白的活性。
當涉及到蛋白或肽時，短語「特異性(或選擇性)結合」到抗體或「特異性(或選擇性)與…免疫反應」指確定蛋白是否存在的結合反應，經常用在蛋白和其它生物製劑的異質種群中。因而，在指定的免疫試驗條件下，特異的抗體以至少兩倍於背景結合到一種特定蛋白，更典型地為多於10-100倍背景。在這種條件下，特異結合到抗體要求該抗體經過針對特定蛋白的特異性選擇。比如，多克隆抗體提出了可結合防衛素蛋白、多態變體、等位基因、直向同源物，以及保守性改變變體，或剪接變體、或其部分，可進行選擇以獲得僅僅與防衛素蛋白特異性免疫反應而不與其它蛋白反應的多克隆抗體。所述選擇可通過減除與其它分子交叉反應的抗體來實現。可採用許多免疫測定方式來選擇可與特定蛋白發生免疫反應的抗體。比如，常規可使用固相ELISA免疫測定來選擇可與蛋白發生特異性免疫反應的抗體(參見如Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，描述了可用於確定特異免疫反應的免疫測定形式及條件)。
「治療有效劑量」這裡指一種劑量，能在給藥個體上產生所需的效應。精確的劑量根據治療目的而定，並且是本領域技術人員應用已有技術能夠確定的(參見如Lieberman，藥物劑量方式(1-3卷，1992)；Lloyd，藥物配製的技術、科學和工藝(1999)；以及Picker，劑量計算(1999))。在治療有效量的防衛素用於作為抗HIV劑的情況下，治療有效量是一個量，所述量必須達到任何表示成功治療HIV感染的標誌，包括任何客觀的或主觀的標準，如HIV病毒抑制，HIV感染和AIDS症狀消失，或患者身體或精神提高。比如，對於一些患者，治療有效量從1微克每千克體重至1克每千克體重。
C.防衛素製備和純化1.防衛素防衛素是本領域已知的抗細菌和抗真菌劑(參見美國專利號5,242,902，其授權於Murphy等)。防衛素已經在許多動物中被發現和描述，包括人、豚鼠、大鼠、兔、恆河猴以及小鼠，也存在於植物和昆蟲中。
有兩種結構類型的哺乳動物防衛素α、β被用於本發明的目的。本申請使用的術語「防衛素」同時包括α和β防衛素，特別是α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3。編碼所述人防衛素的基因位於單一的染色體區域，8p21-31(Kaiser等，Journalof Leukocyte Biology，68779-784(2000))。在結構上，防衛素是陽性分子，具有空間上分離的疏水和帶電區域。已知的防衛素都有一個β摺疊結構，6個或8個半胱氨酸殘基形成分子內半胱氨酸二硫鍵。
這裡使用的術語「α-防衛素」涉及一種多肽，根據HIV病毒抑制試驗(如這裡描述的病毒抑制試驗)的測定，其生物學活性被判定為具有抗-HIV活性。α-防衛素的長度通常少於100個胺基酸，一般約25-35個胺基酸，其結構中具有6個半胱氨酸，它們在種間是保守的。(所述保守的結構顯示在SEQ ID NO3至SEQ ID NO8中，也可參考Liu和Ganz，Genomics，43316-320(1997))；以及美國專利號4,705,777(Lehrer等))。α-防衛素在生理pH時具有淨陽電荷，通常這是帶陽性電荷的精氨酸產生的。因此，術語「α-防衛素」包含同時具有高半胱氨酸含量和高精氨酸含量的陽性蛋白。在一些實施方案中，α-防衛素被描述為具有六個半胱氨酸以及二至四個精氨酸，它們是基本保守的。半胱氨酸和精氨酸在整個寡肽上是分散的，使得半胱氨酸可進行分子內和分子外、共價和非共價的交聯，並且精氨酸在一個寬的pH範圍上給予整個分子陽性電荷，使分子高度陽性。例如，在一些實施方案中，α-防衛素包含3個由半胱氨酸形成的二硫鍵。本發明的α-防衛素也可形成一個二級結構，其中包含一個β髮夾構象，比如形成一個β摺疊，如三鏈反平行β摺疊(Mandal等，J.Peptide Researsh，5995-104(2002))。術語「α-防衛素」包含天然存在的α-防衛素，即從天然來源分離的多肽；合成的α-防衛素，即化學合成或通過重組DNA技術生產的多肽，具有與天然存在的α-防衛素相同的胺基酸序列；以及α-防衛素類似物，即具有α-防衛素的生物活性的多肽，具有的胺基酸序列並非是天然存在的。所述術語也包含α-防衛素的前-前體蛋白形式，在細胞內經過處理形成具有生物學活性的形式。
α-防衛素在體內多處位置上有表達。然而，發現α-防衛素1-4在多形核嗜中性粒細胞中有突出表達，而α-防衛素5-6在小腸Paneth細胞的分泌顆粒中高度表達。現在已經鑑定出，人α-防衛素1-3可由CD8+T細胞分泌。三種防衛素，即α-防衛素1-3的不同點僅僅在於N末端的一個胺基酸不同(Linzmeier等，FEBS LETT.，321(2-3)267-273(1993)；Palfree等，Mol.Endocrin.，7(2)199-205(1993)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；Mars等，J.Biol.Chem.，270(51)30371-30376；以及Quayle等，Am.J.Pathol.，152(5)1247-1258)。
在某些實施方案中，如前面所定義的，α-防衛素包括多肽、前-前體蛋白、加工蛋白、多態變體、等位基因、以及突變體，它們與如這裡所描述的由人α-防衛素核酸所編碼的胺基酸序列(如α-防衛素1-6，特別是α-防衛素1-3)相比，具有高於60％的胺基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，優選地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的胺基酸序列相同性，優選地，在一個至少約15、20、25、30或更多個胺基酸的區域上具有相同性。
在其它一些實施方案中，如前面所描述的，α-防衛素包括多肽、前-前體蛋白、加工蛋白、多態變體、等位基因、突變體、以及種間同源物，它們與如這裡所描述的由來自人或其他動物的α-防衛素核酸所編碼的胺基酸序列(如兔防衛素1-5，大鼠防衛素1-4和豚鼠)相比，具有高於60％的胺基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，優選地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的胺基酸序列相同性，優選地，在一個至少約15、20、25、30或更多個胺基酸的區域上具有相同性。
在其他一些實施方案中，如前面所描述的，α-防衛素包括多肽、前-前體蛋白、加工蛋白、多態變體、等位基因、突變體、以及種間同源物，它們與由在Paneth細胞中高度表達的α-防衛素核酸所編碼的胺基酸序列(如人α-防衛素5-6，小鼠α-防衛素1、2和1α，以及兔α-防衛素6)相比，具有高於60％的胺基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，優選地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的胺基酸序列相同性，優選地，在一個至少約15、20、25、30或更多個胺基酸的區域上具有相同性。
選擇性地，如前面所描述的，α-防衛素包括具有不多於35個胺基酸的陽性寡肽，具有以下通式的序列Z0-2-(aa1)a-(aa2)b-cys-aa4-cys-arg-aa7-aa8-aa9-cys-aa11-aa12-aa13-glu-arg-aa16-aa17-gly19-cys-aa21-aa22-aa23-gly-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-cys-cys-(aa32)c-w(SEQ ID NO1)，其中，Z(如果存在的話)化學偶聯到末端氨基上，它可以是具有1至6個碳原子的醯基(具有0至1個氨基取代基)、具有1至3個碳原子的烷基、或是一個保護基團；a、b和c是各自獨立的，它們可以是0或1；寫在aa上角的數字定義了所述胺基酸在多肽中的號碼，除了aa9，其傾向於存在兩個胺基酸，然後使所有後續的號碼均上升1號；胺基酸1、7、8、11、13、21、23、25、26和28是脂肪族胺基酸；胺基酸2、4、9、12、16、17、19、22、27、29和32可以是脂肪族胺基酸或芳香族胺基酸；w是末端羥基、氨基或是1至6個胺基酸的肽，在N末端具有一個鹼性胺基酸。在一些實施方案中aa1是val或gly；aa2是val、ile、arg、ser、phe、ala或asp；aa4是ala、val、thr或tyr；aa7是arg、lys、gly或ile；aa8是ala、arg、gln、phe或pro；aa9是兩個leu、phe、ser或ala；aa11是leu、pro、ser、gly或ile；aa12是pro、asn、lys、phe、ser或ala；aa13是arg、leu、ser或gly；aa16是arg、phe或ala；aa17是ala、ser、ile或tyr；aa19是phe、tyr、asp、ser或thr；aa21是arg、lys、thr或ile；aa22是ile、val或tyr；aa23是arg、asn或gln；aa25是arg、ala或val；aa26是ile、leu或arg；aa27是his、val、phe或trp；aa28是pro、tyr、ala或thr；aa29是leu、arg或phe；aa32是arg、ser、pro或trip；w是0至2個arg。在其它一些實施方案中，取代物如aa1、aa2和aa4是隱藏的，因此它們具有除了天然存在的序列以外的序列，這裡稱為類似物。
此外，如前面所描述的，α-防衛素包括具有不多於35個胺基酸的陽性寡肽，具有以下通式的序列Z』0-2-val-aa2-cys4-cys-arg-arg-aa8-aa9-cys-aa11-aa12-aa13-glu-arg-arg-aa17-gly-aa19-cys-arg-aa22-arg-gly-arg-aa26-his-aa28-leu-cys-cys-(arg)0-1(SEQ ID NO2)，並且其中，Z』是甲基、乙醯基或是一個胺基酸；胺基酸2、4、8、9、11、17和22是中性胺基酸；胺基酸12和28是雜環胺基酸或中性胺基酸；胺基酸19是芳香族胺基酸或羥基取代的脂肪族胺基酸；胺基酸13和26是脂肪族胺基酸或鹼性胺基酸；或具有以下通式的序列Z』0-2-val-aa2-cys-thr-cys-arg-aa7-phe-aa9-cys-gly-aa12-gly-glu-arg-ala-aa17-gly-aa19-cys-thr-aa22-asn-gly-val-arg-his-aa28-leu-cys-cys-arg-(arg)0-1，並且其中aa2和aa12是phe或ser；aa7是arg或gly；aa9是羥基取代或非取代的脂肪族胺基酸；aa17、aa19和aa28是羥基取代的胺基酸；aa22是5至6個碳原子的脂肪族胺基酸；或具有以下通式的序列ala-cys-tyr-cys-arg-ile-pro-ala-cys-ile-ala-asp-gly-glu-arg-arg-tyr-gly-thr-cys-ile-tyr-gln-gly-arg-leu-trp-ala-phe-cys-cys，其中ala和asp表示沒有胺基酸或一個所示的胺基酸。在另一個實施方案中，取代物，如aa2、aa7和aa9是隱藏的，因此它們具有除了天然存在的序列以外的序列，這裡稱為類似物。
已經發現α-防衛素存在於人、兔、豚鼠、大鼠、恆河猴和倉鼠的嗜中性粒細胞以及人和齧齒動物的小腸Paneth細胞中(Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857327-7331；Lehrer等，Infect.Immun.，111226-1234；Selsted等，Infect.Immun.，552181-2186；Eisenhauer等，Infect.Immun.，572021-2027；Tang等，Infect.Immun.，676139-6144；Mak等，Infect.Immun.，644444-4449；Ganz等，J.Immunol.，1431358-1365；Mallow等，J.Biol.Chem.，2714038-4045；Quellette等，J.Cell.Biol.，1081687-1695；以及Qu等，Infect.Immun.，645161-5165)。
如這裡所應用的，術語「人α-防衛素」是指一種多肽，其具有以下胺基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。人α-防衛素1-6的序列如下α-防衛素1(HNP1)ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO3)；α-防衛素2(HNP2)CYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO4)；α-防衛素3(HNP3)DCYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO5)；α-防衛素4(HNP4)VCSCRLVFCRRTELRVGNCLIGGVSFTYCCTRV(SEQ ID NO6)；α-防衛素5(HD5)ARATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(SEQ ID NO7)；α-防衛素6(HD6)TRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL(SEQ ID NO8)。α-防衛素被描述在美國專利號4,705,777(Lehrer等)中。
如這裡所應用的，術語「兔α-防衛素」是指一種多肽，其具有以下胺基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。兔α-防衛素1-6的序列如下α-防衛素1(NP1)VVCACRRALCLPR ERRAGFCRIRGRIHPLCCRR(SEQ ID NO9)；α-防衛素2(NP2)VVCACRRALCLPLERRAGFCRIRGRIH PLCCRR(SEQ ID NO10)；α-防衛素3a(NP3a)GICACRRRFCPNSERFSGYCRVNGARYVRCCSRR(SEQID NO11)；α-防衛素3b(NP3b)GRCVCRKQLLCSYRERRIGDCKIRGVRFPFCCPR(SEQ ID NO12)；α-防衛素4(NP4)VSCTCRRFSCGFGERASGSCTVNGVRHTLCCRR(SEQ ID NO1 3)；α-防衛素5(NP5)VFCTCRGFLCGSGERASGSCTINGVRHTLCCRR(SEQ ID NO14)；以及α-防衛素6(NP6)GICACRRRFCLNFEQFSGYCRVNGARYVRCCSRR(SEQ ID NO15)。
如這裡所應用的，術語「大鼠α-防衛素」是指一種多肽，其具有以下胺基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。大鼠α-防衛素的序列如下α-防衛素1(RtNP1)VTCYCRRTRCGFRERLSGACGYRGRIYRLCCR(SEQ ID NO16)；α-防衛素2(RtNP2)VTCYCRSTRCGF RERLSGACGYRGRIYRLCCR(SEQ ID NO17)；α-防衛素3(RtNP3)CSCRTSSCRFGERLSGACRLNGRIY RLCC(SEQ ID NO18)；以及α-防衛素4(RtNP4)ACYCRIGACVSGERLTGACGLNGRIYRLCCR(SEQ ID NO19)。
如這裡所應用的，術語「小鼠α-防衛素」是指一種多肽，其具有以下胺基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。小鼠α-防衛素的序列如下α-防衛素1(MuCr1)LRDLVCYCRT RGCKRRERMNGTCRKGHLMYTLCCR(SEQID NO20)；α-防衛素2(MuCr2)LRDLVCYCRARGCKGRE RMNGTCRKGHLLYMLCCR(SEQ ID NO21)；以及α-防衛素1α(MuCr1α)LRDLVCYCRTRGCKRRER MNGTCRKGHLMYTLCCR(SEQ ID NO22)。
如這裡所應用的，術語β-防衛素涉及一種多肽，根據HIV病毒抑制試驗(如這裡描述的病毒抑制試驗)的測定，被判定為具有抗-HIV活性。β-防衛素的長度通常少於100個胺基酸，一般約32-45個胺基酸，具有保守的半胱氨酸結構和陽性電荷(所述保守的結構顯示在SEQ ID NO23至SEQ ID NO24中)。β-防衛素與α-防衛素的不同在於它們特定的胺基酸模式、半胱氨酸間隔、以及二硫鍵連接(Kaiser等，Leukocyte Biology，68779-784(2000))。與α-防衛素相似，β-防衛素的半胱氨酸在整個寡肽上是分散的，使得半胱氨酸可進行分子內和分子外、共價和非共價的交聯。術語「β-防衛素」包含天然存在的β-防衛素，即從天然來源分離的多肽；合成的β-防衛素，即化學合成或通過重組DNA技術生產的多肽，具有與天然存在的β-防衛素相同的胺基酸序列；以及β-防衛素類似物，即具有β-防衛素的生物活性的多肽，具有的胺基酸序列並非是天然存在的。所述術語也包含β-防衛素的前-前體蛋白形式，在細胞內經過處理形成具有生物學活性的形式。
已經發現β-防衛素存在於人、牛、綿羊、小鼠、豬、家禽、昆蟲和植物中，尤其在牛氣管黏膜、牛嗜中性粒細胞、牛舌頭、人嗜中性粒細胞、陰道和腎組織、上皮細胞如皮膚、腎、以及氣管-支氣管內層(Diamond等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954596-4600；Selsted等，J.Biol.Chem.，2686641-6648；Singh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9514961-14966；Bensch等，FEBS.Lett.，368331-335；Schonwetter等，Science，3267 1645-1648；以及Lehrer等，Annals New York Academyof Science，228-239)。
在某些實施方案中，如前面所定義的，β-防衛素包括多肽、前-前體蛋白、加工蛋白、多態變體、等位基因、種間同源物、以及突變體，它們與如這裡所描述的由β-防衛素核酸所編碼的胺基酸序列(如人β-防衛素1或2)相比，具有高於60％的胺基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，優選地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的胺基酸序列相同性，優選地，在一個至少約15、20、25、30或更多個胺基酸的區域上具有相同性。
如這裡所應用的，術語「人β-防衛素」是指一種多肽，，其具有以下胺基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。人β-防衛素1和2的序列如下β-防衛素1(hBD-1)DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCC(SEQ ID NO23)；β-防衛素2(hBD-2)TCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCC(SEQ ID NO24)。β-防衛素序列描述於PCT公開號WO 02/22686和Kaiser等，Journal of Leukocyte Biology，68779-784(2000))。
本發明的防衛素可通過功能進行進一步的描述，所述功能包括(1)結合到抗體，如多克隆抗體，其可對應某個免疫原而升高，所述免疫原含有防衛素蛋白和其保守性改變變體的胺基酸序列；(2)在嚴緊雜交條件下，能與編碼防衛素蛋白和其保守性改變變體的核酸序列相應的反義鏈特異性雜交；或(3)與防衛素核酸具有高於95％，優選地高於96％、97％、98％、99％、或更高的胺基酸序列相同性，優選地，在一個含有至少約25、50、100、200、500、1000或更多個核苷酸序列的區域上具有相同性。如前所述，防衛素多核苷酸或多肽序列通常來自哺乳動物，包括但不限於靈長動物如人；齧齒動物如大鼠、小鼠、倉鼠、牛、豬、馬、羊或任何哺乳動物。在一個可行的實施方案中，所述防衛素是人α-防衛素1、2或3。本發明的核酸和蛋白包括天然存在的或重組的分子。本發明的防衛素蛋白具有抗病毒活性。可根據本領域技術人員已知的方法以及這裡所描述的方法進行抗病毒試驗。
在體內，防衛素以前體的方式被生成，並且從前肽經加工獲得成熟肽，通常帶有二硫鍵橋。防衛素前-前肽存在於GenBank登錄號NP_525128，AAH27917，CAC85520，CAC85511，AAG02237，CAC03097，AAF73853，NP_066290，NP_005208，NP_001917，NP_001916，NP_004075，CAB65126，AAG22030，AAC69554，AAC51728，AAC50382，AAC33549，AAB59357，AAB49758，AAA52303，AAA35754，以及AAM62424。前-前肽加工成成熟肽的方法描述在Garcia等，Cell Tissue Res.，306(2)257-264(2001)；Harder等，J.Biol.Chem.，276(8)5707-5713(2001)；Jia等，Gene，263(1-2)211-218(2001)；Am.J.Pathol.，152(5)1247-1258(1998)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(19)7327-7331(1998)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；Wilde等，J.Biol.Chem.，264(19)11200-11203(1989)；Gabay等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(14)5610-5614(1989)；Palfree等，Mol.Endocrinol.，7(2)199-205(1993)；Selsted等，J.Clin.Invest.，76(4)1436-1439(1985)；Mars等，Blood，71(6)1713-1719(1988)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(19)7327-7331(1988)；Sparkes等，Genomics，5(2)240-244(1989)；Bateman等，J.Biol.Chem.，266(12)7524-7530(1991)；Wagner等，Genomics，10(1)114-125(1991)；Valore等，Blood，79(6)1538-1544(1992)；Lehrer等，Annu.Rev.Immunol.，11105-128(1993)；Linzmeier等，FEBS Lett.，321(2-3)267-273(1993)；Harder等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，22(6)714-721(2000)；Infect.Immun.，68(1)113-119(2000)；Genomics，43(3)316-320(1997)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；FEBS Lett.，315(2)187-192(1993)；McCray等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，16343-349(1997)；Blood，71(6)1713-1719(1988)；Jones等，Biol.Chem.，267(32)23216-23225(1992)；Raj等，FEMS MicrobiologyLetters，2069-18(2002)；Schutte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2129-2133(2002)；Hoover等，J.Biol.Chem.，276(42)39021-39026；以及Ganz等，Eur.J.Haematol.，44(1)1-8。
在功能上，已知防衛素具有抗細菌和抗真菌的活性，可對抗許多的微生物(Raj等，FEMS Microbiology Letters，2069-18(2002))。帶陽性電荷的防衛素能夠與帶陰性電荷的微生物細胞膜組分發生反應，包括革蘭氏陰性菌中的脂多糖、革蘭氏陽性菌中的多糖、以及磷脂。已知防衛素可由噬菌白細胞分泌，對抗細菌和真菌。儘管α-防衛素是高度保守的，較小的變化也足以改變不同防衛素的微生物殺滅潛能以及特異性(Mandal等，J.Pept.Res.，59(3)95-104(2002)；Schibli等，J.Biol.Chem.，277(10)8279-89(2002)；Garcia等，Cell Tissue Res.，306(2)257-64；Fellermann等，Eur.J.Gastroentero Hepatol.，13(7)771-776；Kangan等，Toxicology，87(1-3)131-149(1994))。
研究也顯示，防衛素在對抗感染和刺激免疫應答方面具有重要的作用。例如，已經證明防衛素(特別是β-防衛素1和2)可以吸引涉及初級和二次免疫應答的未成熟樹突細胞以及記憶T細胞(Ganz，Science，286420-421(1999))；Lillard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96651-656(1999))。在本發明中，已經發現防衛素可作為抗病毒劑對抗HIV，並能應用於治療和/或預防HIV感染以及其它病毒感染。
如前面所解釋的，天然存在的、化學合成的、商業可用的以及重組生產的防衛素多肽可應用在本發明的組合物以及方法中。
已知的天然防衛素多肽被描述在本申請中。可以理解，將來可能會鑑定出其它對於本發明的方法有用的天然防衛素多肽，它們可以是與這裡所述的防衛素同種類的，也可以是其它種類的。
從天然存在的來源分離天然存在的防衛素可從任何防衛素來源純化獲得，比如來自骨髓、氣管和腸細胞，來自嗜中性粒細胞、多形核白細胞、PBMC或其它噬菌細胞；來自上皮組織和其它表達防衛素的組織(參見如van Wetering等，Am.J.Physiol.272L888(1997)；Chertov等，J.Biol.Chem.，2712935-2940(1996)；以及Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000))，以及來自其它表達防衛素的哺乳動物，如大鼠和豚鼠。在一個可行的實施方案中，天然存在的防衛素純化自嗜中性粒細胞和巨噬骨髓細胞。所述純化方法包括大規模純化，如從全血(如來自血庫，或從來自急性骨髓性白血病患者的藥用廢品如衝擊-釋放分離術中獲得)中分離嗜中性粒細胞，應用已知的肽純化方法進行純化。例如，多肽可應用色譜法(如反相HPLC)，凝膠滲透、離子交換(如陰離子交換)、尺寸排除、親和吸附、分隔或逆流分配來純化。純化防衛素的方法描述於Raj等，同上；以及Ganz等，J.Clin.Invest.，761427-1435(1985)。
防衛素也可應用已知的細胞培養技術來獲得，培養防衛素-生成細胞，並且使用這裡所描述的方法分離出防衛素分子。合適的防衛素-生成細胞系包括但不限於用於生成人α-防衛素1-3的CD8+T淋巴細胞、嗜中性粒細胞和骨髓細胞系；用於生成人α-防衛素5-6的腸細胞系；以及用於生成人β-防衛素1-2的內皮細胞系。普通的細胞培養技術可參見Freshney等，Culture of Animal Cells(第三版，1994)。
防衛素分子可能從商業來源獲得，如Peptides International、AmericanPeptides和NJ Research公司。
本發明部分依賴於常規的用於基因重組領域的技術。公開有適用於本發明的一般重組方法的基本書籍包括但不限於Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA LaboratoryManual(1990)；以及分子生物學最新方案(Ausubel等編，1994))。
實質上等同於這裡所述的胺基酸序列的防衛素核酸，多態變體、直向同源物以及等位基因可以用防衛素核酸探針和寡核苷酸在嚴緊雜交條件下進行分離。可選擇地，可應用表達文庫來克隆防衛素蛋白、前-前體蛋白、多態變體、直向同源物以及等位基因，通過檢測所表達的同源物與抗血清或純化的抗人防衛素抗體或其部分的免疫反應性來確定。
為了製備一個cDNA文庫，需要選擇一種富含防衛素RNA的製備來源，如PBMC、多形核白細胞、嗜中性粒細胞、淋巴母細胞系、以及其它噬菌細胞。所述細胞可以是初級細胞或細胞系。然後通過反轉錄酶將RNA轉換成cDNA，連接到一種重組載體上，並轉化入一種重組宿主，進行增殖、篩選核克隆。製備和篩選cDNA的方法是已知的(參見如Gubler等，Gene，25263-269(1983)；Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
在製備基因組文庫時，從組織中抽提DNA，用機械剪切或用酶消化，形成約12-20kb的片斷。然後通過梯度離心進行選擇，並重新構建入噬菌體λ載體。這些載體和噬菌體在體外(in vitro)組裝。通過如Benton和Davis，Science196180-182(1977)所描述的噬菌斑雜交方法來分析重組噬菌體。菌落雜交按照描述在Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965(1975)中的方法進行。
分離防衛素核酸、直向同源物、等位基因、突變體、多態變體以及保守性改變變體的一種可選擇的方法還結合應用合成的寡核苷酸引物，以及擴增RNA或DNA模板(參見美國專利號4,683,195和4,683,202；PCR方案方法和應用指導(Innis等編，1990))。諸如多聚酶鏈反應(PCR)和連接酶鏈反應(LCR)等方法可用於直接從人mRNA、cDNA、基因組文庫或cDNA文庫中擴增出人防衛素核酸序列。應用這裡所提供的序列，可設計變性寡核苷酸來擴增防衛素同源物。可將限制性核酸內切酶位點加入到引物上。例如，多聚酶鏈反應以及其它體外(in vitro)擴增方法可用於克隆編碼所需蛋白的核酸序列；可用於製備用作探針的核酸，在生理樣品中檢測編碼防衛素的mRNA是否存在；或用於其它目的。通過PCR反應擴增的基因可以用瓊脂糖凝膠純化，克隆入相應的載體。
典型地，在轉化入原核或真核細胞進行複製和/或表達之前，將用於編碼防衛素多肽的基因克隆入中間載體。好些中間載體通常是原核載體，如質粒或穿梭載體。可選擇地，可應用同源重組來激活原生的防衛素基因。
3.防衛素多肽的化學合成和純化由於本發明的防衛素多肽的長度是相對短的，它們可應用許多對於本領域技術人員來說熟悉的化學肽合成技術中的任何一種來製備，包括溶液方法和固相方法，固相合成是優選的方法。化學合成防衛素多肽的合適的方法公開在Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000)中，其中的指導引用在此作為參考。
特別地，固相合成中，肽序列的C末端胺基酸被吸附到一種不溶的支持物上，接著依次地將序列中剩餘的其它胺基酸添加上去，這是本發明優選的製備防衛素多肽的方法。固相合成技術描述於Barany和Merrifield，Solid-Phase Peptide Synthesis，in The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology(Gross和Meienhofer(編)，學術出版社，紐約，卷2，pp.3-284(1980))；Merrifield等，J.Am Chem.Soc.，852149-2156(1963)；以及Stweart等，Solid-Phase Peptide Synthesis(第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，I11.(1984))。
固相合成從肽的羧基末端(即C-末端)起始，通過偶連一個保護胺基酸，使該保護胺基酸的羧基固定於合適的固相支持物上。所用的固相支持物在本發明中不是關鍵所在，只要其能夠結合羧基基團，並對在肽合成步驟中所用的試劑惰性就可以了。比如，一種起始材料可連接一個氨基保護性胺基酸，通過苯甲基酯連接到氯甲基化或羥甲基化的樹脂上，或通過醯胺連接到二苯甲基氨(BHA)或p-甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂上。適用於作為固相支持物的材料對於本領域技術人員來說是熟悉的，包括但不限於以下材料滷甲基化樹脂，如氯甲基化樹脂或溴甲基化樹脂；羥甲基化樹脂；苯酚樹脂，如4-(α-[2，4-二甲氧基苯基]-Fmoc-氨甲基)苯氧基樹脂；第三-烷氧羰基-醯肼化的樹脂，以及類似物。所述的樹脂是商業可用的，它們的製備方法是本領域普通技術人員熟悉的。
本發明的肽的酸形式可以通過固相肽合成步驟來製備，應用苯甲基酯樹脂作為固體支持物。相應的醯胺可通過應用二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂作為固體支持物來製備。本領域技術人員將意識到，當應用BHA或MBHA樹脂時，用無水氫氟酸處理以使多肽從固相支持物上分離，生成具有一個末端氨基基團的多肽。
在偶連反應時，每個在合成中被用到的胺基酸的α-氨基基團都必須被保護，以防止發生涉及反應性α-氨基功能的副反應。某些胺基酸也包含反應性側鏈功能基團(如巰基、氨基、羧基、羥基等)，它們也必須用適當的保護基團進行保護，以防止在多肽合成過程中發生在這些位點上的化學反應。保護性基團對於本領域技術人員來說是熟知的，比如參見多肽分析、合成、生物學，卷3在肽合成中保護功能基團(Gross和Meienhofer(編)，學術出版社，紐約(1981))。
在苯甲醚和二甲基硫存在下，通過將不溶性載體或固相支持物在無水的、液體氟化氫(HF)中振蕩，從支持物上分離肽並移除保護性基團，該過程在約0℃進行約20至90分鐘，優選60分鐘；通過發泡溴化氫(HBr)，連續穿過以1mg/10mL懸浮在三氟醋酸(TFA)中的樹脂，在室溫下持續30至360分鐘，主要根據所選擇的保護性基團定時間；或，通過將反應柱中用於固相合成的固相支持物與90％三氟乙酸、5％水和5％三乙基矽烷共同孵育30至60秒。也可應用其它苯領域技術人員熟悉的去保護方法。
在已知的天然存在的α-防衛素中存在六個半胱氨酸殘基。由半胱氨酸產生的二硫鍵連接發生在第一個和第六個半胱氨酸之間、第二個和第四個半胱氨酸之間以及第三和第五個半胱氨酸之間。其中，所述的半胱氨酸從肽的N末端至C末端分別編號為一至六。此外，在大多數已知的β-防衛素中存在六個半胱氨酸殘基。β-防衛素的半胱氨酸連接發生在第一個和第五個半胱氨酸之間、第二個和第四個半胱氨酸之間以及第三個和第六個半胱氨酸之間，其中，所述的半胱氨酸從肽的N末端至C末端分別編號為一至六。
防衛素分子中半胱氨酸之間二硫鍵的形成可以用已知的方法實現。比如，在Raj等，同上中，三個分別的硫醇保護基團和一個三階段處理過程被用於生成二硫鍵，以最小化不必要的副反應。為了給鍵的形成提供適當的方向，首先在N末端和C末端的半胱氨酸之間生成一個二硫鍵橋(參見Hill等，Science，251481-1485，和Pardi等，Biochemistry，3111357-11364)。在其它方法中，六個硫醇基團同步氧化，或進行二階段處理，生成二硫鍵(參見Khan，Methods Enzymol.，61339-378和Lauth等，Insect Biochem.Mol.Biol.，281059-1066)。
陽性多肽(即本發明的防衛素多肽)可通過本領域技術人員熟知的肽純化方法從反應混合物中分離和純化，如前述的純化方法。
對本領域技術人員來說，顯然可以對本發明的組合物和方法中所用到的防衛素多肽作出很多種改變(如增加、刪除或取代)。比如，已經發現，額外的胺基酸可以加入到防衛素多肽的N末端和/或C末端，以提高它們的活性(參見Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000))。而且，可以修改防衛素多肽以去除蛋白酶裂解位點(如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶裂解位點)(參見如Selsted等，J.Clin.Invest.，761436-143991985)。典型地，可以用不能被蛋白酶識別的類似胺基酸來取代所述能被蛋白酶識別的胺基酸。由於這種經改變的防衛素多肽可應用於本發明的組合物和方法，因此這種改變(如添加、刪除和取代)也落入本發明的範圍。
對於本領域的技術人員來說很顯然，已知的改變方法也能用於生成活性防衛素多肽，它們中的一個或多個胺基酸與已知天然存在的防衛素多肽不同。可應用這裡描述的一種試驗方法來測定防衛素的活性。那些具有抗HIV活性的防衛素多肽可被應用於本發明的方法和組合物中。可行的改變方法是定點突變、點錯配修復、或寡核苷酸定向突變。
定點突變在本領域中是眾所周知的，描述在以下的參考文獻中，如Ling等，Anal，Biochem.，254(2)157-178(1997)；Dale等，Methods Mol.Biol.，57369-374(1996)；Smith，Ann.Rev.Genet.，19423-462(1985)；Botstein等，Science，2291193-1201(1985)；Carter，Biochem.J.，2371-7(1986)；以及Kunkel，NucleicAcids Molecular Biology(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.編，Springer Verlag，柏林(1987))；應用包含尿嘧啶的模板的突變(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154367-382(1987)；以及Bass等，Science，242240-245(1988))；寡核苷酸定向突變(Methods in Enzymol.，100468-500(1983)；Methods in Enzymol.，154329-350(1987)；Zoller等，NucleicAcids Res.，106487-6500；Zoller等，Methods in Enzymol.，100468-500；以及Zoller等，Methods in Enzymol.，154329-350；硫代磷酸酯-改變的DNA突變(Taylor等，Nucl.Acid.Res.，138749-8764(1985)；Taylor等，Nucl.Acid.Res.，138765-8787(1985)；Nakamaye等，Nucl.Acids Res.，149679-9698(1986)；Sayers等，Nucl.AcidsRes.，16791-802(1988)；以及Sayers等，Nucl.Acids Res.，16803-814(1988))；應用缺口的雙股DNA的突變(Kramer等，Nucl.Acids Res.，129441-9456(1984)；Kramer等，Methods in Enzymol.，154350-367(1987)；Kramer等，Nucl.Acids Res.，167207(1988)；以及Fritz等，Nucl.Acids Res.，166987-6999(1988))。
另一種本領域已知的改變方法是定點錯配修復，如(Kramer等，Cell，38879-887(1984))，應用修復缺陷宿主菌株的突變(Carter等，Nucl.Acids Res.，134431-4443(1985)；以及Carter，Methods in Enzymol.，154382-403(1987))，刪除突變(Eghtedarzadeh等，Nucl.Acids Res.，145115(1986))，限制-選擇和限制-純化(Wells等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，A317415-423(1986))，通過全基因合成的突變(Nambiar等，Science，2231299-1301(1984)；Sakamer等Nucl.AcidsRes.，146361-6372(1988)；Wells等，Gene，34315-323(1985)；以及Grundstrom等，Nucl.Acids Res.，133305-3316(1985))，雙鏈斷裂修復(Mandecki(1986)；Arnold，Current Opinion in Biotechnology，4450-455(1993)。「在大腸桿菌(Escherichia coli)質粒中寡核苷酸定向的雙鏈斷裂修復一種用於點特異性突變的方法」Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181)。上述許多方法的更詳細的資料可參照酶學方法，卷54，其中也描述了有用的對照標準，用於發現和解決不同突變方法中產生的問題。
寡核苷酸定向突變也可用於在核酸序列中引入位點-特異性突變。這方面技術的例子描述在前述的參考文獻中以及這裡，如Reihaar-Olson等，Science，24153-57(1988)。類似地，卡式突變也可用於將不同於天然序列的合成寡核苷酸卡替換小區域的雙鏈DNA分子的過程。所述寡核苷酸可包含如完全和/或部分隨機的天然序列。
4.重組防衛素的純化重組防衛素可從任何適當的表達系統中純化，如下面所描述的。防衛素蛋白可以通過標準技術純化至基本純，包括應用如硫酸銨等物質的選擇性沉澱法，柱層析法，免疫純化法以及其它方法(參見如Scopes，Protein PurificationPrinciples andPractice(1982)；美國專利號4,673,641；Ausubel等，同上；以及Sambrook等，同上)。
當進行重組防衛素純化時，可應用許多種方法。比如，可將具有分子黏附特性的蛋白可逆地融合到防衛素蛋白上；用適當的配體或底物(如抗防衛素抗體或帶陰性電荷的底物)將防衛素蛋白選擇性吸附到純化柱上，接著以相對純的形式從柱上洗下；然後通過酶的作用將融合的蛋白去除；最後，可應用免疫親和柱純化防衛素蛋白。重組防衛素蛋白可從任何合適的來源中純化獲得，包括酵母、昆蟲、細菌和哺乳動物細胞。
重組蛋白可通過轉化的細菌進行大量表達，通常在啟動子誘導後產生；但是表達可以是結構性的。用IPTG進行啟動子誘導是可誘導性啟動子系統的一個例子。根據本領域標準的方法生產細菌。新鮮的或冰凍的細菌細胞被用於分離蛋白。
在細菌中表達的蛋白可形成不溶性聚集體(包涵體)。有些方法適於純化防衛素蛋白的包涵體。比如，包涵體的純化包括通過破壞細菌細胞(如將細胞在含50mMTRIS/HCl、pH7.5、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DDT、0.1mM ATP，以及1mM PMSF的緩衝液中孵育)來抽提、分離和/或純化包涵體。可通過2-3次穿過French Press來溶解細胞懸浮，用Polytron(Brinkman Instruments)均質化，或在冰上超聲降解。溶解細菌的其它可替代方法對於本領域技術人員來說是顯而易見的(參見如Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
如必要，將所述包涵體溶解，將溶解的細胞懸浮液進行離心，去除不需要的不溶物質。通過用適當的緩衝液稀釋或透析，形成包涵體的蛋白可被復性。合適的溶劑包括但不限於尿素(約4M-約8M)、甲醯胺(至少約80％，體積/體積)、以及氫氯化胍(約4M-約8M)。一些能夠溶解聚集體-形成蛋白的溶劑(比如SDS(十二烷基磺酸鈉)、70％蟻酸)不適於應用在這裡，因為可能造成蛋白的不可逆變性，使其缺少免疫原性和/或活性。儘管氫氯化胍以及類似試劑是變性劑，其產生的蛋白變性並非是不可逆的，當將所述變性劑移走(比如通過透析)後，蛋白會復性，重新形成具有免疫活性和/或生物學活性的蛋白。其它合適的緩衝液對於本領域技術人員來說是已知的。人防衛素蛋白通過標準的分離技術從其它細菌蛋白中分離，如使用Ni-NTA瓊脂糖樹脂。
可選擇地，從細菌周質中純化防衛素蛋白也是可能的。在細菌溶解後，當防衛素蛋白被釋放到細菌的周質時，細菌的周質片斷可通過冷滲壓休克以及其它本領域技術人員已知的方法來分離。為了從周質中分離重組蛋白，將細菌細胞離心以形成沉澱。所述沉澱在包含20％蔗糖的緩衝液中重懸。為了溶約10解細胞，將細菌離心並將沉澱物重懸在冰冷的5mM MgSO4中，置於冰上分鐘。將細胞懸浮液離心，移出上清備用。通過本領域技術人員已知的標準分離技術，可將存在於上清中的重組蛋白從宿主蛋白中分離。
5.用於純化重組防衛素蛋白的標準蛋白分離技術a)溶解分離作為初始步驟，特別是當防衛素蛋白混合物很複雜時，初始的鹽分離可以從重組蛋白中分離出許多不需要的宿主細胞蛋白。優選的鹽是硫酸銨。硫酸銨通過有效地減少蛋白混合物中的水含量來沉澱蛋白。然後蛋白基於各自不同的溶解性而被沉澱，越是疏水的蛋白越容易在低的硫酸銨濃度下沉澱。常用的方法包括在蛋白溶液中加入飽和的硫酸銨，以使硫酸銨的終濃度為20-30％。在該濃度上將能沉澱最多量的疏水蛋白。然後棄去沉澱(除非所需的蛋白是疏水的)，在上清中加入硫酸銨至可沉澱所需蛋白的濃度。然後將沉澱溶解在緩衝液中，如需要可將過量的鹽通過透析或過濾移走。其它依賴於蛋白溶解性的方法(如冷乙醇沉澱)是本領域技術人員熟知的，可用於分離複雜的蛋白混合物。
b)尺寸差別過濾可利用防衛素蛋白的分子量來將其與更大的或更小的蛋白分離，在具有不同孔徑的膜(如Amicon或Millipore的膜)上超濾。如第一步，使蛋白混合物在具有一定孔徑的膜上超濾，所述孔徑可使分子量低於所需蛋白的蛋白去除。然後將滯留物在一定孔徑的膜上再次超濾，所述孔徑可使分子量高於所需蛋白的蛋白去除，重組防衛素蛋白將穿過該膜被濾出。然後可將濾出物進行層析，如下面所描述的。
c)柱層析防衛素蛋白也可基於其大小、淨表面電荷、疏水性以及配體親和力而與其它蛋白分離。此外，可將抗防衛素蛋白的抗體結合到柱基質上，使蛋白被免疫純化。所有這些方法都是本領域所熟知的。對於本領域人員來說，很顯然層析技術可在任何規模下進行，並可使用來自不同廠家的設備(如Pharmacia Biotech)。
D.抑制HIV和病毒感染和複製的方法一「治療HIV感染和AIDS」如這裡所描述的，防衛素蛋白、編碼防衛素蛋白的核酸、以及小型有機分子或其片斷，提高防衛素活性或表達可抑制HIV，如通過殺死被HIV感染的細胞或通過抑制HIV複製來實現。防衛素可在人體中用於治療或預防。比如，可應用防衛素來抑制受感染CD4+細胞生成HIV。所述防衛素蛋白、編碼防衛素蛋白的核酸、以及小型有機分子可用於使HIV感染者停止向AIDS進展。所述防衛素蛋白、編碼防衛素蛋白的核酸、以及小型有機分子也可用於預防，如在接觸過或疑為接觸過HIV後防止感染或殺死已感染細胞，或防止傳播，如通過母嬰途徑將病毒傳播給嬰兒。
在本發明的方法中，可應用本領域已知的用於向個體進行核酸和蛋白治療性給藥的方法，來治療或預防HIV感染，如細胞內轉染、基因治療、用給藥媒介物或藥學上可接受的載體直接給藥、或調節序列以提高內源蛋白的生成。比如，如前面所解釋的，本發明第一次證明了CD8+細胞能生成α-防衛素，其以前被認為是由CAF活性引起的。同樣地，可通過施用受激的能生成防衛素的CD8+細胞來將防衛素輸送到人體。在一種方法中，通過已知的擴展細胞的方法先體外後體內擴展CD8+細胞。然後測定所述細胞培養物能否生成防衛素。其後，將能夠生成一定量防衛素的細胞引入到人體。所述細胞可獲自所需治療的人體內，或可選擇地，所述細胞可來自其他個體。然而，優選施用的細胞是HLA-匹配的，以避免引起對抗細胞的免疫應答。
可使用檢測HIV感染及AIDS進展的標準試驗方法來測定受試者對於防衛素治療是否呈現陽性。比如，在施用防衛素後，監控受試者的T細胞數，T細胞數升高表明受試者是受益於防衛素治療的。此外，如Levy等，Immunology Today1 7，5223(1996)中所描述的「內源性試驗」或「急性感染試驗」可被用於檢測受試者體內CD8+細胞的抗HIV應答。比如，在急性感染試驗中，來自非感染個體的CD4+細胞被急性HIV感染，與來自感染個體的CD8+細胞以不同的CD8+/CD4+細胞比率一起培養。通過測定病毒生成的降低程度來確定抗病毒有效性。通過測定本發明的重組CD8+細胞所引起的病毒生成的降低程度，可進一步確定哪一種本發明的方法在抑制病毒生成方面是最有效的。
如前面所解釋的，已經發現防衛素多肽具有抗病毒活性。同樣地，可應用防衛素多肽抑制大量的不同病毒，因而，可治療人體內的許多種病毒感染。防衛素多肽可抑制的病毒包括但不限於DNA病毒、RNA病毒以及反轉錄病毒。防衛素多肽可抑制的病毒的例子包括但不限於皰疹病毒、肝炎(A、B和C)病毒、流感病毒、POX病毒、Rhino病毒以及HTLV(人T細胞白細胞)病毒(如HTLV 1和2)。基於其抗病毒活性，本領域技術人員可以意識到可被防衛素多肽所抑制的其它病毒)。
1.細胞內轉化和基因治療本發明提供了防衛素蛋白的核苷酸序列，可用於體外和體內轉染細胞。這些核酸可被插入到許多已知載體的任何一種中，用於轉染靶細胞和有機物，如下面所描述的。核酸在先體外後體內或體內通過載體與靶細胞的相互作用被轉染到細胞中。然後核酸在啟動子的控制下，表達本發明的蛋白，從而減輕因防衛素基因含量低、缺少、部分失活或不正常表達所造成的影響，由於當與病毒感染相關時，如HIV感染。所述組合物以足以在體內引起治療反應的量給予患者，一種足夠實現該目標的量被定義為「治療有效劑量或量」。
在另一方面，本發明提供了在人體內抑制HIV感染的方法，包括向細胞中轉染包含編碼防衛素多肽核苷酸序列的核酸，其中，所述核酸包含一個可誘導性啟動子，操作性連接到編碼防衛素的核苷酸序列上。在一個實施方案中，來自真核載體的防衛素的表達可應用誘導性啟動子來調節，由於是誘導性啟動子，表達水平依賴於誘導劑(如四環素或蛻化素)的濃度，通過在啟動子中結合入這些試劑的反應因子來調節。通常，僅僅當誘導劑存在時才能獲得高水平表達；基本表達水平是最低的。當所需蛋白不利於在真核細胞表達時，選擇可誘導性表達載體。其它調節結構，如增強子，可用於提高防衛素多肽的表達。
所述基因治療方法已經被用於糾正獲得性和遺傳性缺陷、癌症以及其它許多疾病。在人體表達人造基因的能力使本發明能夠預防和/或治療許多重要的人類疾病，包括許多對其它治療方法無反應的疾病(如需回顧基因治療方法，可參見Aderson，Science，256808-813(1992)；Nabel等，TIBTECH，11 211-217(1993)；Mitani等，TIBTECH，11162-166(1993)；Mulligan，Science，926-932(1993)；Dillon，TIBTECH，11167-175(1993)；Miller，Nature，357455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology，6(10)1149-1154(1998)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience，835-36(1995)；Kremer等，British Medical Bulletin，51(1)31-44(1995)；Haddada等，在微生物學和免疫性近期熱點(Doerfler和Bohm編，1995)中；以及Yu等，GeneTherapy，113-26(1994))。
在本發明的另一個方面，防衛素核酸沒有通過轉染被引入到細胞，取而代之的是一個內源性調節子序列，如啟動子或增強子、一種編碼或非編碼的外源外顯子、一種接合供體位點被引入基因組中預先選擇的位置，用於與防衛素基因同源重組。應用這些方法，外源提供的表達序列與基因組DNA進行重組，使防衛素能在人的細胞中生成，應用天然存在的內源外顯子編碼這些蛋白。所述方法描述於美國專利號5,733,746中，該專利已授權於Treco等。
2.藥物組合物以及給藥藥學上可接受的載體部分由所需給藥的特定組合物(如核酸、蛋白、調節化合物如小型有機分子或轉導細胞)，以及用於該組合物的特定給藥方法來決定。本發明所需給藥的藥物組合物包含蛋白、核酸小型分子、以及類似物。因此，有許多合適的配方都可用於本發明的藥物組合物(參見如Remington’s Pharmaceutical，第17版，1989)。可以用任何便利的方式進行給藥，如注射、口服、吸入、透皮或直腸給藥。
適用於口服給藥的製劑可包括(a)液體溶液，如有效量的經包裝的核酸懸浮在稀釋液中，如水、鹽水或PEG 400；(b)膠囊、軟囊或片劑，各自包含給定量的活性組分，如液體、固體、顆粒或明膠；(c)選用合適液體的懸浮液；以及(d)合適的乳劑。片劑形式可包括一種或多種乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米澱粉、土豆澱粉、微晶纖維素、明膠、膠質二氧化矽、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸、以及其他賦形劑、著色劑、填充劑、粘合劑、稀釋劑、緩衝劑、溼潤劑、防腐劑、調味劑、染料、分解劑、以及藥學相容性載體。錠劑形式可包含具有一種味道的活性組分，如蔗糖，並且，錠劑包含在惰性基質上的活性組分，惰性基質如明膠和甘油和阿拉伯樹膠乳劑、凝膠、以及類似物，以及本領域已知的活性成分、載體。
所選擇的化合物可以單獨或與其他適當組分組合的方式製成氣霧劑(即它們可被「氣霧化」)，以通過吸入的方式給藥。氣霧劑中可加入加壓可接受的推進物，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮以及它們的類似物。
適於腸胃外給藥(如通過關節內(在關節中)、靜脈內、肌肉、皮內、腹膜內和皮下途徑給藥)的製劑包括水溶液和非水溶液的等滲無菌注射溶液，其中可包含抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑以及使製劑與接受者血液等滲的溶質；以及水溶液和非水溶液的無菌懸浮液，其中可包含懸浮劑、增溶劑、增厚劑、穩定劑和防腐劑。在本發明的實踐中，比如，組合物可通過靜脈灌輸、口服、局部、腹膜內、膀胱內或胸內給藥。腸胃外給藥和靜脈內給藥是優選的給藥方式。製劑可以以單位劑量或多劑量存在於密封的容器中，如安瓿瓶和小瓶。
注射溶液和懸浮液可從前述形式的無菌粉末、顆粒和片劑來製備。用於體內治療的轉導了核酸的細胞也可採用如前所述的靜脈內或腸胃外給藥。
在多肽化合物的施用中，一個重要因素是確保所述多肽能夠穿透細胞質膜或細胞內組件(如細胞核)的膜。細胞膜包含脂蛋白雙層膜，其允許小的非離子親脂性化合物自由穿透，本能地不允許極性化合物、大分子和治療或診斷劑穿透。然而，蛋白和其他化合物如脂質體具有轉運多肽使其穿過細胞膜的能力。
此外，改變多肽的特性是重要的，使多肽降低「粘性」而不形成聚集體或不結合到其它蛋白，或使多肽提高藥效(如具有長的半衰期)並更穩定(如在血清中更穩定或便於儲存)，如可通過PEG化所述蛋白或將所述蛋白與脂質體或其它結構域偶連。給予蛋白信號肽、前導序列或用於在體內或體外分泌的分泌肽也是重要的。應用一個靶向結構也可使本發明的防衛素多肽特異性靶向到細胞上，比如應用可結合到CD4+細胞的細胞表面分子上的配體，如抗體、配體、受體等。因此，本發明提供了所述防衛素的輸送載體，以及帶有異源結構域的融合蛋白，所述異源結構域具有穩定化、特異輸送或靶向、分泌、提供檢測標記等能力。在一個實施方案中，所述融合蛋白包含一個白蛋白結構域和一個防衛素結構域。所述白蛋白結構域至少是白蛋白的一部分(如人白蛋白)，足以延長防衛素的生存期。這種結構在國際PCT公開號WO01/79480，2001年10月5日(Rosen等，「白蛋白融合蛋白」)中有更詳細的描述。
例如，「膜置換多肽」具有兩性的或疏水的胺基酸亞序列，具有作為膜轉運載體的能力。在一個實施方案中，同源結構域蛋白具有穿過細胞膜轉運的能力。已發現，最短的同源結構域蛋白Antennapedia的可內化肽是所述蛋白的第三個螺旋，從胺基酸位置43至58(參見如Prochiantz，Current Opinion in neurobiology，6629-634(1996))。發現另一條亞序列，即信號肽的h(疏水)區域，具有相似的細胞膜轉運特性(參見如Lin等，J.Biol.Chem.，270(1)14255-14258(1995))。
肽序列的例子包括但不限於HIV轉移活化蛋白的11個胺基酸的肽；一20個殘基的肽序列，其相應於p16蛋白的胺基酸84-103(參見Fahraeus等，Current Biology，684(1996))；Antennapedia的60胺基酸長同源結構域的第三個螺旋(Derossi等，J.Biol.Chem.，26910444(1994))；信號肽的h區域，如Kaposi成纖維細胞生長因子(K-FGF)的h區域(Lin等，同上)；或來自HSV的VP22轉運區域(Elliot等，Cell，88223-233(1997))。其它可提高細胞吸收的合適的化學部分也可化學性連接到本發明的防衛素上。
毒素分子也具有運輸多肽穿過細胞膜的能力。這種分子(稱為「雙體毒素」)經常由至少兩部分組成(1)一個轉運或結合區域或多肽，以及(2)一個分離的毒素區域或多肽。典型地，轉運區域或多肽結合到細胞受體上，然後所述毒素被運輸進入細胞。一些細菌毒素，包括產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringen.s)ι毒素、白喉毒素(DT)、假單胞菌(pseudomonas)外毒素A(PE)、百日咳毒素(PT)、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)毒素、以及百日咳腺苷環化酶(CYA)，已經被嘗試用於遞送肽到細胞質中，作為內部或氨基末端融合物(Arora等，J.Biol.Chem.，2683334-3341(1993)；Perelle等，Infect.Immun.，615147-5156(1993)；Stenmark等，J.Cell.Biol.，1131025-1032(1991)；Donnelly等，PBAS，903530-3534(1993)；Carbonetti等，Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.，95295(1995)；Sebo等，Infect Innum.，633851-3857(1995)；Klimpel等，PNAS U.S.A.，8910277-10281(1992)；Novak等，J.Biol.Chem.，26717186-17193(1992)；以及美國專利號5,602,095、4,892,827和5,608,039)。
所述亞序列可被用於轉運防衛素穿過細胞。防衛素可方便地與所述序列融合或衍生化。典型地，轉運序列以融合蛋白的一部分來提供。可選擇地，可用連接序列來連接防衛素和轉運蛋白。可應用任何合適的連接序列，如肽連接序列或其它化學連接序列。
防衛素也可被導入到動物細胞中，優選哺乳動物細胞，通過微粒和脂質體以及脂質體衍生物如免疫脂質體導入。術語「脂質體」是指包含一個或多個共中心排列的脂質雙層的運輸載體，其中封裝了一個水相，水相中通常包含需要輸送到細胞的化合物。
脂質體與質膜融合，從而將藥物釋放到細胞質中。可選擇地，脂質體被細胞吞噬或吸收。一旦在內涵體或吞噬體中，脂質體或者被降解或者與細胞膜融合，釋放出其內容物。
在現在的藉助脂質體的藥物遞送方法中，脂質體最終變成為可滲透的並釋放出封裝在內的化合物至靶組織或細胞。對於系統性或組織特異性遞送，這可以通過被動的方式來完成，脂質體雙層通過體內的不同試劑的作用發生降解。可選擇地，活性藥物的釋放包括應用一種試劑來誘導脂質體運載體中的滲透性改變。可構建脂質體膜，使它們在脂質體膜周圍的環境變成酸性後變得不穩定(參見如PNAS，847851(1987)；Biochemistry，28908(1989))。比如，當脂質體被靶細胞內吞時，它們變得不穩定並釋放出內容物。所述不穩定化被稱為融合。二硫醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)是許多「融合」系統的基礎。
所述脂質體通常包含一種被選擇的防衛素以及一種脂質組分，如中性和/或陽性脂質，可選擇地，包括一種受體識別分子如抗體，結合到預先確定的細胞表面受體或配體(如抗原)上。許多方法可用於製備脂質體，如以下所描述的Szoka等，Ann.Rev.Biophys.bioeng.，9467(1980)；美國專利號4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,744,085、4,837028、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,744,085、4,837,028、4,946,787；PCT公開號WO91/17424；Deamer等，Biochem.Biophys.Acta.，443629-634(1976)；Fraley等，PNAS，763348-3352(1979)；Hope等，Biochem.Biophys.Acta.，81255-65(1985)；Mayer等，Biochem.Biophys.Acta.，858161-168(1986)；Willians等，PNAS，85242-246(1988)；脂質體(Ostro(編)，1983，第一章)；Hope等，Chem.Phys.Lip.，4089(1986)；Gregoriadis，脂質體技術(1984)以及Lasic，脂質體從物理學到應用(1993))。合適的方法包括比如超聲波降解法、擠壓法、高壓/均質化、微流化、去垢劑透析、鈣誘導的小脂質體運載體融合和醚融合，所有這些都是本領域熟知的。
在本發明的某些實施方案中，可以靶向本發明的脂質體，應用對特定細胞型、組織和類似物特異的靶向結構域。引用不同靶向結構域(如配體、受體和單克隆抗體)的脂質體的靶向在以前已經被描述過了(參見如美國專利號4,957,773和4,603,044)。
可應用標準的方法將靶向試劑偶連到脂質體。這些方法通常包括在脂質體中合併入脂質組分，如磷脂醯乙醇胺，其能被活化，用於附著到靶向試劑；或衍生化的親脂性化合物，如脂質衍生化的博萊黴素。也可構建抗體靶向的脂質體，比如應用合併入蛋白A的脂質體(參見Renneisen等，J.Biol.Chem.，26516337-16342(1990)以及Leonetti等，PNAS，872448-2451(1990))。
在另一個實施方案中，本發明的防衛素多肽可被用作佐劑。更特別地，防衛素多肽可被用作佐劑來推進免疫原性。同樣的，防衛素多肽或編碼所述防衛素多肽的核酸可被用於與疫苗或其它抗原結合，以提高抗原性應答。
本發明的方法能在受試者中治療或預防HIV感染。足夠實現所述目的防衛素的量定義為「治療有效量」。防衛素或防衛素製劑的單次或多次給藥依賴於所需的劑量和頻率以及患者的耐藥能力。所述製劑中應含有足夠量的活性試劑，即防衛素，以有效地治療或預防HIV感染和AIDS。
在本發明的上下文中，給予患者的劑量應在一段時間內在患者體內產生足夠有益的治療反應。劑量將由所使用的特定給藥方法的效力，施用的組合物如核酸、多肽或小型分子，患者的狀況，以及患者的體重和表面面積來決定。劑量的大小也將由存在狀態，特徵，伴隨特定防衛素組合物的給藥所產生的任何有害副作用的程度，或特定患者中轉導的細胞類型來決定。
在給藥時，本發明的組合物以由候選化合物的LD-50、以及在不同濃度上候選化合物的副作用所確定的給藥率給藥，以施用於體質整體健康的患者來計算。通常，所述劑量的範圍為從1μg至100mg每kg體重，從1μg至1mg每kg體重，或從10μg至10mg每kg體重。普通技術人員將理解，其它劑量範圍也可能是合適的並可能被發現。比如，一種特定的組合物可能在更高或更低的劑量時更有效。通過應用這裡描述的方法來評估受試者，一個熟練的從業者將能夠確定受試者是否對治療產生反應，並將得知如何調節相應的劑量水平。
聯合治療在眾多實施方案中，本發明的防衛素蛋白可與其它一種或多種附加化合物或療法結合給藥。比如，可共同施用多種防衛素多肽，或者一種或多種防衛素多肽可與一種或多種治療化合物連接。在一種實施方案中，其它治療劑是一種用於預防或治療HIV感染的治療劑。在另一種實施方案中，其它治療劑是一種用於治療與HIV感染相關的機會感染和/或用於治療或預防HIV感染的試劑。
用於與本發明的防衛素多肽結合的合適的治療試劑包括但不限於蛋白酶抑制劑、非核苷反轉錄酶抑制劑、核苷反轉錄酶抑制劑、抗逆轉錄病毒核苷、融合抑制劑、進入抑制劑以及其它對抑制或治療HIV感染有效的抗病毒劑。合適的治療劑的進一步的例子包括但不限於齊多夫定、地達諾新、司他夫定、幹擾素、拉米呋啶、阿德福韋、奈韋拉平、地拉韋啶(delaviridine)、洛韋胺、沙奎那韋、茚地那韋、AZT、T20、T22以及T2。其它合適的治療劑包括但不限於抗體或其它抗病毒劑，如阿昔洛韋。在另一個實施方案中，防衛素多肽與可溶形式的HIV共同受體共同給藥，如CCR5的CXCR4。自然地，所述共同受體是膜蛋白，包含一個胞外部分、一個跨膜部分和一個胞內部分。它們可通過去除跨膜和胞內部分而製成可溶形式。這些部分可以被重組排除，從而細胞外部分可表達為重組蛋白，單獨或融合蛋白的一部分。
其它本領域已知的結合療法可被用於與本發明的方法相結合。
E.診斷和預後應用本發明的防衛素分子，如核酸和蛋白對於診斷和預後也是有用的。比如，在生物樣品(如組織或血清樣品)中防衛素水平的提高預示了延遲或非進展到AIDS，或T細胞數低於一定水平，如200。在一個實施方案中，將CD8+細胞分離出來，在體外激活，測量防衛素水平。提高的防衛素水平(如在人組織如嗜中性粒細胞中)與HIV感染的受試者的長期存活有關。因此，通過檢測個體中的防衛素水平，可對個體的疾病狀態作出判斷。如這裡所解釋的，現在已經發現，與具有低防衛素水平的個體相比，具有提高的防衛素水平的個體不易於進展到AIDS。防衛素水平也可被用於選擇和確定抗病毒藥物、劑量以及治療周期。因此，本領域技術人員已知的用於檢測核酸和蛋白的方法可用於診斷和預後HIV感染以及向AIDS進展的情況，如PCR、northern和southern印跡，反轉錄和mRNA擴增、總RNA或多聚A+RNA的分離、點印跡、核酸陣列、western印跡、原位雜交、免疫試驗如免疫沉澱、ELISA、蛋白質體學測定、多核苷酸試驗技術，以及類似方法。
例如，應用核苷酸探針陣列來檢測mRNA分布表達的方法被描述在美國專利號6,040,138、歐洲專利號853,679以及PCT公開號WO97/27317中。所述方法應用可互補到所需mRNA靶系列的探針組。一種mRNA分布或其擴增產物與所述陣列相應，則所需的靶點被鑑定出，並且可任選地，從特異性結合到互補探針的程度進行量化。可任選地，已知與靶點錯配的結合可用於測量背景非特異結合，並從與互補探針特異的結合中減除。
因此，在本發明中，編碼防衛素蛋白的核酸可與寡核苷酸點陣技術(高密度或低密度(如GeneClipTM))結合應用，來鑑定編碼防衛素蛋白的cDNA、直向同源物、等位基因、保守性改變變體、以及多態變體。當被鑑定的同源物被連接到病毒感染的調節劑上時，它們可與GeneClipTM陣列結合應用，作為診斷工具測定生物樣品中的疾病，參見如Gunthand等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 14869-876(1998)；Kozal等，Nat.Med.2753-759(1996)；Motson等，Anal.Biochem.，224110-106(1995)；Lockhart等，Nat.Biotechnol.141675-1680(1996)；Gingeras等，Genome Res.，8435-448(1998)；Hacia等，Nucleic Aicds Res.，263865-3866(1998)。
1.防衛素多肽的免疫檢測在本發明中，除了應用核酸雜交技術來檢測防衛素基因和基因表達，免疫測定也可用於檢測防衛素蛋白。所述測定對於篩選防衛素的調節劑是有用的，同時也具有治療和診斷應用。免疫測定可被用於定性地或定量地分析防衛素蛋白。通常可適用的技術的概括可參見Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)。
可與防衛素蛋白特異性反應的多克隆和單克隆抗體的製備方法是本領域技術人員已知的(參見如Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow和Lane，同上；Goding，Monoclonal AntibodiesLPriciples and Practice(第二版，1986)；以及Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975))。所述技術包括從存在於噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫中選擇抗體，製備出抗體；以及通過免疫兔或小鼠，製備多克隆和單克隆抗體(參見如Huse等，Science，2461275-1281(1989)；Ward等，Nature，341544-546(1989))。
許多包含防衛素蛋白的一部分的免疫原可被用於製備與防衛素蛋白特異性反應的抗體。比如，如這裡所描述的，重組或化學合成的防衛素蛋白或其抗原片斷可被分離。如前所述，重組蛋白可在真核或原核細胞中表達，並按照常規的方法純化。可選擇地，從這裡所公開的序列獲得合成的肽，並偶連到載體蛋白上，可被用作免疫原。天然存在的蛋白也可以純的或不純的方式被應用。然後將所述產物注入一種能生成抗體的動物中。既可生成單克隆抗體，也可以生成多克隆抗體，它們可後續用於免疫測定，檢測所述的蛋白。
多克隆抗體的製備方法是本領域技術人員已知的。一種小鼠近交系(如BALB/C小鼠)或兔用所述蛋白以及標準的佐劑(如弗氏佐劑)進行免疫，並使用一種標準的免疫方案。動物對免疫原的免疫應答通過提取測定血液來監測，確定與β亞基的反應效價。當獲得適當高的抗體效價時，從動物中採集血液，製備抗血清。如果需要，可進一步分離抗血清，使之富含對蛋白有反應性的抗體。
可通過本領域技術人員熟悉的很多技術來獲得單克隆抗體。簡要地說，從經特定抗原免疫的動物中獲得脾細胞，進行永生化，與骨髓瘤細胞融合(參見kohler等，Eur.J.Innunol.，6511-519(1976))。可選擇的永生化方法包括用Esptein Barr病毒、致癌基因或逆轉錄病毒轉化，或採用其它本領域已知的方法。篩選從單個永生化細胞生長起來的集落，找出對所述抗原具有所需特異性和親和力的抗體產物，並且可通過很多技術來提高從所述細胞中生產單克隆抗體的水平，包括注射入脊椎動物的腹膜腔中。可選擇地，可根據Huse等，Science，2461275-1281(1989)中所論述的大致方案，通過篩選來自人B細胞的DNA文庫，分離出編碼單克隆抗體或其結合片段的DNA序列。
收集單克隆抗體和多克隆血清，並在免疫測定中確定其對抗抗原蛋白的效價，例如，可採用固相免疫測定，免疫原被固定在一種固體支持物上。典型地，選擇具有104或更高效價的多克隆抗體，應用競爭結合免疫測定，測定其與非防衛素蛋白的交叉反應能力。特定的多克隆抗血清和單克隆抗體通常以至少約0.1mM的Kd結合，更特別地至少約1μM，更優選至少約0.1μM或更佳。也可通過減除其它交叉反應的來自某些物種(如非人哺乳動物)的直向同源物，製備僅對特定防衛素直向同源物(如人防衛素蛋白)特異的抗體。在這種方式下，獲得僅僅結合到防衛素蛋白的抗體。
一旦獲得了可用的抗防衛素蛋白特異抗體，所述蛋白可以通過許多免疫測定方法來檢測。並且，所述抗體可作為防衛素調節劑發揮治療作用。免疫學和免疫測定方法可參見Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr編，第7版，1991)。此外，本發明中的免疫測定方法可在任何以下配置方案中進行，詳盡地概括在酶學免疫測定(Maggio編，1980)；以及Harlow和Lane，同上(參見如美國專利號4,366,241；4,376,110；4,517,288；以及4,837,168)。如需參考普通免疫測定方法，也可參見細胞生物學方法細胞生物學中的抗體，第37卷(Asai編，1993)；Basic andClinical Immunology(Stites和Terr編，第7版，1991)。經典的免疫結合測定(或免疫測定)應用一種特異性結合到所選蛋白或抗原(在本發明中指防衛素蛋白或其抗原性亞序列)的抗體。所述抗體(如抗防衛素)可通過任何本領域技術人員熟知的手段來製備，如前面所描述的。
在測定試驗中採用的特定標記或檢測基團不是本發明的重要方面，只要其不會明顯幹擾測定所用抗體的特異結合即可。所述檢測基團可以是任何具有可檢測性物理或化學特性的材料。在免疫測定領域，所述檢測標記已經得到了很好的發展，一般情況下，任何在所述方法中有用的標記可被應用於本發明。因此，標記是任何可被分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段檢測到的組合物。在本發明中有用的標記包括磁珠(如DYNABEADSTM)、螢光染料(如異硫氰酸螢光素、Texas紅、若丹明以及類似物)、放射標記(如3H、125I、35S、14C以及32P)、酶(如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶和其它在ELISA中常用的試劑)、以及比色標記如膠體金、有色氣體或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙烯、橡膠等)。
根據本領域熟知的方法，所述標記可直接或間接偶連到所需的免疫測定組分上。如前面所指明的，可以應用許多種標記，標記的選擇取決於靈敏度要求、與化合物結合難易程度、穩定性要求、可用的儀器設備、以及處理措施。
非放射性標記經常通過間接的方式附著連接。通常，配體分子(如生物素)共價地結合到所述分子上，然後再結合到另一種分子(如鏈黴親和素)上，其本身可被檢測或共價地結合到一種信號系統上，如可檢測的酶、螢光化合物或化學發光化合物。所述配體以及它們的靶點可被用於與任何合適的識別防衛素蛋白的抗體或識別抗-防衛素的第二抗體結合使用。
所述分子也可直接偶連到信號生成化合物上，如與酶或螢光團。可作為標記的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶；或氧化物酶，特別是過氧化物酶。螢光化合物包括螢光素以及它的衍生物、若丹明以及它的衍生物、丹磺醯、7-羥基香豆素等。化學發光化合物包括蟲螢光素、2，3-二氫酞嗪二酮，如魯米諾(luminal)。如需參考可用的標記或信號生成系統，可參見美國專利號4,391,904。
檢測標記的方式是本領域技術人員熟知的。比如，當所述標記是一种放射活性標記，檢測的方式包括閃光計數或進行自動射線照相獲得攝影膠片。當標記是一種螢光標記，可通過用合適的波長激活螢光染料進行檢測，並檢測獲得的螢光。所述螢光可通過視覺觀測，或應用電子探測器如電荷耦合裝置(CCD)或光電倍增器以及類似儀器來檢測。類似地，酶標記可通過應用合適的酶底物，並檢測結果獲得的反應產物。比色或化學發光標記可簡單地通過觀察與標記相關的顏色來檢測。因此，在很多不同的測定試驗中，偶連的金經常呈現粉紅色，而很多偶連的珠呈現珠本身的顏色。
一些測定被設計成無需應用經標記的化合物的形式。比如，凝集試驗可被用於檢測靶抗體的存在。在這種狀況下，當試樣中包含靶抗體時，抗原包被的顆粒就會發生凝集。應用這種方式，沒有組分需要進行標記，靶抗體的存在僅通過簡單的目測就可確定。
2.防衛素多肽的SELDI檢測除了應用核酸雜交技術和免疫學技術檢測防衛素基因表達，表面-增強的雷射解吸/電離(SELDI)也可用於檢測本發明的防衛素，或用於檢測調節或結合到防衛素的化合物。SELDI是指一種解吸/電離氣體相離子光譜法(如質譜法)，其中，被分析物被捕獲到SELDI探針的表面上，使探針與氣相離子光譜儀接觸。在「SELDI MS」中，氣相離子光譜儀是質譜儀。在一些實施方案中，SELDI包括將被分析物捕獲到固相支持物上，如質譜探針表面，用一種可從混合物中捕獲靶分析物的吸附劑衍生化。經典地，一種基質材料被應用於所述的被分析物，並且用雷射解吸質譜儀來檢測被分析物。應用的吸附劑可以是色譜的或生物特異的。SELDI技術描述在美國專利號5,719,060(Hutchens和Yip)以及美國專利號6,225,047(Hutchens和Yip)中。基於SELDI的生物晶片和儀器可獲自Ciphergen生物系統公司，CA。
「表面-增強的親和捕獲」或「SEAC」是SELDI的改變形式，涉及應用包含一種吸附表面的探針(一種「SEAC探針」)。「吸附表面」是指一種結合了吸附劑(也稱為「捕獲試劑」或「親和試劑」)的表面。吸附劑可以是任何能夠結合分析物(如靶多肽或核酸)的材料。「色譜吸附劑」是指一種通常用於色譜分析的材料。色譜吸附劑包括比如離子交換材料、金屬鰲合劑(如乙酸腈或乙醯乙酸亞氨)、固定的金屬鰲合物、疏水反應吸附劑、親水反應吸附劑、染料、單生物分子(如核苷酸、胺基酸、單糖和脂肪酸)以及混合形式吸附劑(如疏水吸引/靜電排斥吸附劑)。「生物特異吸附劑」是指一種包含生物分子的吸附劑，如包含核酸分子(如適配體)、多肽、多糖、脂質、類固醇或它們的偶連體(如糖蛋白、脂蛋白、醣脂、核酸(如DNA)-蛋白偶連體)。在某些例子中，生物特異吸附劑可以具有大分子結構，如多蛋白複合體、生物膜或病毒。生物特異吸附劑通常具有比色譜吸附劑更高的靶分析物特異性。應用於SELDI的吸附劑的其它例子可參見美國專利6,225,047(Hutchens和Yip，「應用滯留色譜法來生成不同的圖譜」，2001年5月1日)。
在一些實施方案中，SEAC探針被給予一種預-活化的表面，其可被改變以獲得所需的吸附劑。比如，某些探針被給予一種反應性結構域，能夠通過共價鍵結合生物分子。環氧化物和carbodiimidizole是有用的反應性結構域，可共價連接生物特異性吸附劑，如抗體或細胞受體。
「表面-增強潔淨解吸」或「SEND」是SELDI的一種改變形式。涉及應用包含化學結合到探針表面的能量吸附分子的探針(SEND探針)。「能量吸附分子」(EAM)是指能夠從一種雷射解吸/電離來源吸附能量，然後將能量用於與其接觸的分析物分子的解吸/電離分子。所述短語包括應用於MALDI的分子，經常被稱為「基質」，並且明顯地包括苯乙烯酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基羥基苯乙烯(CHCA)和二羥苯甲酸、阿魏酸、氫苯乙酮衍生物，以及其它。其也包括應用於SELDI的EAM。在某些實施方案中，能量吸附分子被加入一種線性或交叉聚合體，如聚甲基丙烯酸酯。例如，所述組合物可以是α-氰基-4-異丁烯醯氧基肉桂酸(α-cyano-4-methacryloyloxycinnamic acid)和丙烯酸鹽共-聚體。在另一個實施方案中，所述組合物是α-氰基-4-異丁烯醯氧基肉桂酸、丙烯酸鹽和3-(三甲氧基)甲矽烷基甲基丙烯酸丙脂共聚體。在另一個方面，所述組合物是α-氰基-4-異丁烯醯氧基肉桂酸和十八烷基甲基丙烯酸的共聚體(C18 SEND)。SEND還描述在美國專利號5,719,060以及提交於2002年9月4日的美國專利申請號60/408,225(Kitagawa，「具有能量吸附結構域的單體和多聚體在分析物的解吸/電離中的應用」)中。
「表面-增強的光不穩定附著和釋放」或「SEPAR」是SELDI的一種改變形式，涉及具有可附著到表面的結構域的探針的應用，其可共價地結合分析物，然後通過與光接觸(如雷射)，斷裂結構域中的光不穩定鍵，釋放出所述分析物。SPEAR還描述在美國專利號5,719,060中。
「吸附」是指分析物與吸附劑或捕獲劑的非共價結合。「洗脫液」或「洗滌溶液」是指一種通常是溶液的試劑，其可用於影響或改變分析物與吸附表面的吸附和/或從表面上移走未吸附的材料。洗脫液的洗脫性質可取決於如pH、離子強度、疏水性、離液程度、洗滌劑強度和溫度。「固相支持物」是指一種固體材料，其能與化學結構域如捕獲劑、反應結構域或能量吸附類物質衍生化，或附著到其上。可用的固相支持物包括晶片(如探針)、微量滴定板和層析樹脂。「晶片」是指一種固相支持物，具有一個平坦的表面，化學結構可附著其上。適用於形成探針接觸的晶片也稱為「探針」。「生物晶片」是指一種附著了化學結構的探針。經常地，探針的表面包含一種較多的定址位點，每個位點上附著了化學結構。「蛋白晶片」是指一種適用於捕獲蛋白的生物晶片。本領域已經報導了許多種蛋白晶片，包括比如由Ciphergen生物系統公司(弗裡蒙特，CA)、Packsrd生物科學公司(Meriden CT)、Zyomyx(海達德，CA)以及Phylos(萊剋星頓，MA)所生產的蛋白晶片。這些蛋白晶片的例子描述在以下的專利或專利申請中美國專利號6,225,047(Huntchens和Yip，「應用滯留色譜法生成不同圖譜」，2001年5月1日)；國際PCT公開號W099/51773(Kuimelis和Wagner等，「可定址的蛋白測定」，1999年10月14日)；美國專利號6,329,209(Wagner等，「蛋白捕獲劑及其應用方法的試驗」，2001年12月11日)；以及國際PCT公開號WO 00/56934(Englert等，「多孔基質試驗」，2000年9月28日)。
在本發明的一個方面，防衛素可以在色譜的或生物特異的SELDI生物晶片上進行檢測。已經發現，防衛素在具有陽離子交換表面的SELDI生物晶片(WCX2 ProteinChip點陣，Ciphergen生物系統公司)上可很好地被分辨。所述樣品被應用於晶片並可進行孵育以促進吸收。然後將生物晶片在100mM乙酸鈉、pH4.5、以及含0.2％Triton-X100的PBS緩衝液中洗滌。蛋白通過質譜儀來檢測。α-防衛素呈現三組峰，約在3371D、3443D以及3484D。
可選擇地，防衛素可在具有防衛素特異性抗體的SELDI生物晶片上檢測。在一個實施方案中，SELDI生物晶片包含一些功能基團，如通過將抗體在生物晶片表面上與反應緩衝液孵育，將carboxodiimizole或環氧化物(如PS10或PS20 ProteinClip點陣，Clihergen Biosystems公司)與抗體衍生化。然後將所述樣品施加於晶片表面，孵育以促進結合，並且洗滌。蛋白通過質譜儀來檢測。
在被生物晶片捕獲後，防衛素(或防衛素調節劑以及結合防衛素的化合物)可應用質譜儀來檢測，特別是應用如前所述的SELDI進行檢測。在質譜儀中生成的數據起始於由離子檢測器檢測到離子。典型的雷射解吸質譜儀可應用一種在337.1nm的氮雷射。一種有用的脈衝寬度約在4毫微秒。通常地，使用的能量輸出約為1-25μJ。撞擊到檢測器的離子生成一種電潛能，然後被一種數字捕獲類似物信號的高速時間-點陣記錄儀器數位化。Ciphergen的ProteinClip系統提供了一種類似物-到-數字的變換器(ADC)來實現上述功能。所述ADC在規律性分布的間隔時間裡將檢測器的輸出整合為時間-依賴的數據。所述時間間隔通常為一至四毫微秒。此外，最終分析的飛行時間光譜並非代表來自電離能量的單脈衝的信號，而是綜合了來自一定數量脈衝的信號，這降低了噪音並且提高了動態範圍。然後將所述的飛行時間數據進行數據處理。在Ciphergen的ProteinClip軟體中，數據處理通常包括TOF-to-M/Z轉化、基線減除、高頻率噪音過濾。
TOF-to-M/Z轉化包括應用一種算法，將飛行時間轉化為質荷比(M/Z)。在該步驟中，信號被從時域轉換成質域。也就是說，每個飛行時間被轉換為質荷比或M/Z。校準可在內部或外部進行。在內部校準中，被分析的樣品中包含一種或多種已知M/Z的分析物。飛行時間的信號峰代表那些測量過的分析物給定的已知的M/Z，基於這些給定的M/Z比率，可計算出參數，獲得將飛行時間轉換為M/Z的數學函數。在外部校準中，一種將飛行時間轉換為M/Z的函數(如通過先前的內部校準中所創造的)被應用於飛行時間光譜，而不使用內部校準。
基線減除通過消除人為的、擾亂光譜的可再生的儀器偏差，提高了數據的質量。其包括應用一種算法計算光譜基線，所述算法考慮了如峰寬等參數。然後從質譜中減除基線。
高頻率噪音信號通過應用濾波函數來消除。典型的濾波函數將移動平均函數運用到每個時間-依賴的數據中。在一種改進的方式中，移動平均過濾器是一種可變寬度數字過濾器，其中過濾器的頻帶寬度作為一個函數而改變，如峰的頻帶寬度，當飛行時間提高時其也變寬。參見如WO 00/70648，2001年11月23日(Gavin等，「用於飛行時間質譜的寬度可變的數字過濾器」)。
一種計算機可以將結果產生的光譜轉化為不同的格式來顯示。一種格式被稱為「質譜觀察或滯留圖譜」，可顯示一種標準的光譜圖，其中所述圖譜描述了在任何特定分子量上到達檢測器的分析物的量。另一種格式被成為「峰圖譜」，僅能從光譜觀察中獲得峰高和質量信息，生成一種清潔圖譜，使幾乎相同分子量的分析物可更容易識別。還有另一種格式被稱為「電泳樣圖譜」，基於每一個峰的高度，每一種來自峰的物質可被轉化為亮度色標圖象，形成一種類似於電泳凝膠的外觀。還有另一種格式被稱為「3-D覆蓋圖」，一些光譜可被覆蓋，以研究相對峰高度的細微變化。還有另一種格式被稱為「差別圖譜」，可比較兩種或多種光譜，方便地區分出獨特的分析物以及在樣品間上調或下調的分析物。
分析通常涉及在圖譜中進行峰的鑑別，找出一種分析物的代表信號。當然，峰的選擇可通過視覺。然而，也可用軟體，如用Ciphergen的ProteinClip軟體的一部分自動檢測峰。通常，所述軟體通過鑑定具有高於所選閥值的信號-至-噪音比率的信號、並在峰信號的矩心標記出峰而發揮作用。在一個有用的應用中，比較許多光譜，鑑定出存在於一些所選百分數質譜中相同的峰。所述軟體的一種版本集成了所有存在於不同質譜中具有一定質量範圍的峰，並且向所有接近質量(M/Z)集群中點的峰指定一種質量(M/Z)。
來自一種或多種光譜的峰數據可被用於進一步的分析，如創建一種電子數據表，每行代表一種特定質量的光譜，每列代表光譜中由質量限定的一種峰，並且每格中包括在特定光譜中的峰的強度。不同的統計或圖樣識別方法可被應用於所述數據。
F.檢測HIV感染的試驗在細胞培養物、細胞或整個有機體中病毒的水平可通過本領域已知的手段進行檢測。典型地，病毒水平用western印跡或其他免疫測定方法(如ELISA)來測定，或通過進行定量PCR測定。在免疫測定方式中，病毒水平通過檢測病毒蛋白(或病毒衣殼)的量來測定，通過確定蛋白結合到免疫反應性試劑(如一種抗體)上的量來定量。在定量PCR中，通過檢測PCR擴增產物測得病毒核酸的水平，並將所獲的擴增核酸的量與已知參考核酸經擴增獲得的擴增產物相比較。
生產多克隆和單克隆抗體的方法是本領域技術人員已知的，並且許多抗病毒抗體是商業可利用的。參見如Coligan(1991)，Current Protocols in Immunology，Wiley/Greene，NY；以及Harlow和Lane(1989)，AntibodiesA Labora tory Manual，冷泉港實驗室出版社NY；Stites等(編)，Basic and Clinical Immunology(第4版)，Lange Medical Publications，Los Altos，CA，以及其中引用的參考文獻；Goding(1986)，Monoclonal AntibodiesLPriciples and Practice(第二版)，學術出版社，紐約，NY；以及Kohler和Milstein(1975)，Nature 256495-497。所述技術包括通過從噬菌體或類似載體重組抗體文庫中選擇抗體，製備抗體。參見Huse等(1989)，Science 2461275-1281；以及Ward等(1989)，Nature 341544-546。特異的單克隆抗體和多克隆抗體以及抗血清通常以KD小於約0.1mM結合，更特別地低於約1μM，更優選地低於約0.01μM或更佳。
經常地，多肽以及它們的相應抗體通過共價地或非共價地連接一種可提供檢測信號的底物來標記。許多標記和偶連技術是已知，並被報導在許多科學和專利文獻中。合適的標記包括放射核苷酸、酶、底物、輔助因子、抑制劑、螢光結構、化學發光結構、磁性顆粒，以及它們的類似物。指導應用這些標記的專利包括美國專利號3,817,837、3,850,753、3,939,350、3,996345、4,277437、4,275149和4,366,241。
在一個優選類型的實施方案中，當定量本發明中的病毒抑制時測定病毒蛋白，用於檢測患者中的病毒(如HIV)。比如，HIV多肽被常規地用於western印跡，以檢測在患者血液中的抗HIV抗體，並且相反的實驗(用於檢測患者血液中的HIV)適合於檢測患者血液中含有的HIV病毒。所述試驗是已知的，並且存在一種標準的方法，通過該方法測定患者中的HIV-1和HIV-2感染。許多免疫測定方式是已知的並且是可實施的。
一種特定的蛋白可通過許多免疫測定方法來定量，如需參考一般的免疫學和免疫測定方法，可參見Stites和Terr(編)1991，Basic and Clinical Immunology(第7版)。此外，本發明中的免疫測定方法可在任何以下方案中進行，所述方案論述在Maggio編，(1980)，酶學免疫測定，CRC Press，Bica Raton，Florida；Tijan(1985)，「酶免疫測定的實踐與原理」，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam；Haelow和Lane，同上；Chan(編)(1987)，ImmunoassayAPractical Guide Academic Press，Orlando，FL；Price和Newman(編)(1991)，Principles and Practice ofImmunoassays，Stockton Press，NY；以及Ngo(編)(1988)，Non isotopicImmunoassays，Plenum Press，NY.。
一種HIV轉錄子、抗體或多肽優選在生物樣品中定量，如患者的細胞或組織樣品。在一個優選的實施方案中，HIV多肽抗血清在血清中定量。在另一個優選的實施方案中，HIV核酸在感染的患者中定量，應用衍生自本發明的核酸的基因探針。比如，在一個實施方案中，在生物樣品中的HIV核酸通過體外擴增技術(如PCR或LCR)擴增，應用經標記的互補核酸進行檢測。
如需要，樣品可進行預處理，稀釋在適當的緩衝溶液中或進行濃縮。存在許多標準的水性緩衝液，應用許多緩衝液的一種，如磷酸、Tris或類似物，在生理pH值是合適的。細胞分類技術如FACS可選擇性地應用於分離特定的細胞，如CD4+細胞，從而定量其中的病毒。
本發明的HIV抗體、多肽和核酸通過任何本領域技術人員熟知的手段進行檢測。這些手段包括分析生物化學方法如螢光分光光度法、放射照相術、電泳、毛細電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散色譜，以及類似方法。並且，還有許多免疫學方法如液體或凝膠沉澱反應、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酶連接的免疫吸收劑試驗(ELISA)、免疫螢光試驗，以及類似方法。通過已知方法的核酸檢測如Southern印跡、northern分析、凝膠電泳、PCR、放射標記、閃光計數，以及親和層析。
本領域技術人員應認識到，在免疫測定和核酸試驗中以及在純化分析物期間，應該降低非特異性結合。當所述測定涉及一種病毒抗體或其他捕獲劑被固定在固體底物上時，需要把非特異性結合到底物上的量降到最低。降低這種非特異性結合的手段是本領域技術人員熟知的。典型地，所述手段包括用蛋白組合物包被底物。特別地，蛋白組合物如牛血清白蛋白(BSA)、脫脂粉狀牛奶、以及明膠被廣泛地應用.Wesrern印跡分析也可應用於檢測和定量樣品中多肽或蛋白(包括肽、轉錄子或酶消化產物)的存在。所述技術通常包含通過凝膠電泳，基於分子量的不同分離樣品產物，轉移分離的產物至合適的固相支持物上(如硝化纖維素、尼龍或衍生的尼龍)，將樣品與標記的可特異性結合到分析物蛋白(抗體或HIV-2多肽)的抗體共同孵育。標記抗體特異地結合到位於固相支持物上的分析物上。這些抗體可直接進行標記，或可選擇地，後續應用標記試劑如特異性結合到標記抗體的抗體(如標記的羊抗鼠抗體，該抗體結合的分析物是一種鼠抗體)進行檢測。
其他測定方法包括脂質體免疫測定(LIAs)，應用設計成可結合特異分子(如抗體)的脂質體，釋放出封裝在內的試劑或標記，然後根據標準的技術檢測釋放的化學物(參見Monroe等，(1986)，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41)。
G.本發明的多肽的調節劑的鑑定本發明的多肽的調節劑，即多肽活性、多肽或多核苷酸表達的激動劑或拮抗劑，其對於治療與HIV感染相關的疾病是有用的，如這裡所描述。例如，給藥調節劑可用於治療AIDS患者或防止HIV感染的個體向AIDS進展，以及治療HIV或AIDS相關的症狀。
本發明中優選的調節劑是那些可在蛋白水平上提高防衛素活性的，如通過提高防衛素的半衰期，或通過使前-前防衛素分子獲得增強的加工能力，更高效或促進翻譯，通過螯合細胞內防衛素的抑制劑，通過防止防衛素降解，提高防衛素的分泌和轉運，以及提供防衛素通路中重要的分子。優選的調節劑包括那些在核酸水平上提高防衛素表達的，如防衛素啟動子活化物、提高防衛素基因的染色體可接近性的化合物、提高防衛素RNA穩定性和加工性的化合物、以及提高在細胞質或細胞核中防衛素RNA水平的化合物。
1.調節本發明的多肽的試劑可作為防衛素蛋白的調節劑的測試化合物可以是任何小型有機分子、或生物實體，比如一種蛋白(如抗體或肽)、一種糖、一種核酸(如反義寡核苷酸或核酶)或脂質。可選擇地，調節劑可以是遺傳學改變方式的防衛素蛋白。典型地，測試化合物將是小型有機分子、肽、RNA、反義分子、核酶以及脂質。
儘管最多的是應用那些可溶解在水溶液或有機(特別是基於DMSO的)溶液中的化合物，但在本發明的試驗中，本質上任何化學化合物可被作為潛在的調節劑或配體。所述試驗被設計成通過自動進行的試驗步驟篩選巨大的化學文庫，並提供來自任何便利來源的化合物進行試驗，其通常是平行運行的(如在自動試驗中，在微量滴定板上採取微量滴定的形式)。可以理解，存在許多化學化合物的供給來源，包括Sigma(聖路易斯，MO)、Aldrich(聖路易斯，MO)，Sigma-Aldrich(聖路易斯，MO)，FlukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)，以及類似來源。
2.篩選本發明的多肽的調節劑的方法許多不同的體外和體內篩選方案可被用於在細胞中，特別是在人細胞中，鑑定可調節本發明的多肽的多核苷酸的表達水平或活性的試劑。在普通的方式中，所述篩選方法包括篩選許多試劑，來鑑定出一種可調節本發明的多肽的活性的試劑，如通過結合到多肽、阻止一種抑制劑或活化劑結合到多肽、促進抑制劑或活化劑與多肽的結合、或者活化或抑制多肽的表達。
任何表達本發明的全長多肽或其片段的細胞可被用於鑑定調節劑。在一些實施方案中，所述細胞是真核細胞系(如CHO)，被轉化以表達一種異源的本發明的多肽。在一些實施方案中，應用一種表達內源性多肽的細胞(CD4)篩選。在另外的實施方案中，根據抑制HIV複製的能力篩選調節劑。
a)多肽結合試驗初步篩選通過篩選能夠結合到本發明的多肽的試劑來進行，因為至少一些如此鑑定的試劑很可能是本發明的多肽的調節劑。結合試驗對於鑑定內源性可與本發明的多肽反應的蛋白也是有用的。例如，抗體、受體或其他結合本發明的多肽的分子可在結合試驗中被鑑定出。
結合試驗通常涉及將一種或多種測定試劑與本發明的多肽接觸，給予足夠的時間使蛋白和測定試劑形成結合複合物。任何形成的複合物可通過應用任何已建立的分析技術被檢測到。蛋白結合試驗包括但不限於在非變性SDS聚丙烯醯胺凝膠上檢測共沉澱或共遷移的方法，以及在Western印跡上檢測的共遷移(參見如Bennet J.P.以及Yamamura，H.I.(1985)，在Neurotransmitter Receptor Binding(Yamamura，H.I.等編)中，第61-89頁，「神經傳遞素、激素或藥物受體結合方法」)。其他結合試驗包括應用質譜儀或NMR技術來鑑定結合到本發明的多肽的分子，或置換標記的底物的方法。利用在這些試驗中的本發明的多肽是可被天然表達、克隆或合成的。
在一個實施方案中，運用一種高通量結合試驗來鑑定結合到防衛素的分子，其中所述防衛素蛋白或其片段與一種潛在的調節劑接觸，孵育適當量的時間，檢測和/或定量防衛素和所述分子的結合。在一個實施方案中，所述潛在的調節劑被結合到固相支持物上，然後加上防衛素蛋白。在另一個實施方案中，防衛素蛋白結合到固相支持物上。可應用大量的調節劑，如前所述，包括小型有機分子、肽、抗體和防衛素配體類似物。可應用大量的測定試驗來鑑定防衛素調節劑的結合，包括標記的蛋白-蛋白結合試驗、電泳淌度移動、免疫測定、酶測定如激酶測定，以及類似方法。在一些情況下，侯選調節劑的結合通過應用競爭結合試驗來測定，在潛在的調節劑存在下測定已知配體或底物的結合幹擾。調節劑或已知配體或底物都可先進行結合，然後加入競爭物。洗滌防衛素蛋白後，測定調節劑或已知配體或底物的結合幹擾。經常地，潛在調節劑或已知配體或底物是經過標記的。在一個實施方案中，所述測定是基於SELDI的測定，採用如前面「2.防衛素多肽的SELDI檢測」中所描述的方法，在所述測定中，防衛素/測試化合物對中的一員被結合到一個基於SELDI的晶片(如一種預活化的ProteiClip點陣，獲自Ciphergen生物系統公司)的表面，其他成員與生物晶片的表面接觸。所述防衛素/測試化合物對之間的結合通過SELDI檢測。例如，一種防衛素蛋白可以結合到生物晶片的表面，然後可將測試化合物文庫與之接觸。洗掉沒有結合的分子。然後發生結合的分子通過SELDI檢測。
高通量篩選包括提供一種組合的小型有機分子或肽文庫，其中包含大量的潛在治療性化合物(潛在的調節劑或配體化合物)。然後如這裡所描述的，用一種或多種測定方法篩選所述「組合的化學文庫」或「配體文庫」，鑑定那些顯示所需特徵活性的文庫成員(特別是化學類型或小類)。這樣鑑定出來的化合物可作為傳統的「先導化合物」或自身可用作潛在的或實際的治療物質。
一種組合的化學文庫是不同的化學合成或生物合成的化學物質的集合，通過集合許多化學的「積木」來實現，如試劑。例如，一種線性組合化學文庫如多肽文庫是通過在任何可能的途徑中根據給定的化合物長度(即在多肽化合物中的胺基酸數目)集合一組化學「積木」(胺基酸)來形成的。通過這種化學「積木」的組合，可以合成成百上千萬個化學組合物。
製備和篩選組合的化學文庫是本領域技術人員熟知的技術。所述的組合的化學文庫包括但不限於肽文庫(參見如美國專利號5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Res.，37487-493(1991)；以及Houghton等，Nature，35484-88(1991))。也可應用其他可生成化學多樣性文庫的化學物質。所述的化學物質包括但不限於類肽(如PCT公開號WO 91/19735)、編碼的肽(如PCT公開號WO93/20242)、隨機生物低聚體(如PCT公開號WO92/00091)、苯並二氮(如美國專利號5,288,514)、異化體(diversomer)如乙內醯脲、苯並二氮和二肽(Hobbs等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，906909-6913(1993))、插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))、具有葡萄糖框架的非肽的肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1991))、小化合物文庫的類似有機綜合體(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.，1162662(1994)、寡氨基甲酸酯(Cho等，Science，2611303(1993))，和/或肽醯磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))、核酸文庫(參見Ausubel，Berger和Sambrook，all同上)、肽核酸文庫(參見如美國專利號5,393,083)、抗體文庫(參見如Vaughn等，Nature Biotechnolog，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文庫(參見如Liang等，Science，2741520-1522(1996)和美國專利號5,593,853)、小型有機分子文庫(參見如苯並二氮，Baum CEN，1月18日，第33頁(1993)；類異戊二烯，美國專利號5,569,588；噻唑丁酮和metathiazanone，美國專利號5,549,974；吡咯烷，美國專利號5,525,735和5,519,134；嗎啉化合物，美國專利號5,506,337；苯並二氮，美國專利號5,288,514等)。
製備組合的文庫的設備是商業可購買的(參見如357 MPS，390 MPS，Advanced ChemTech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。並且，許多組合的文庫是自身商業可購買的(參見如ComCenex，普林斯頓，N.J.，Asinex，PA，MartekBiosciences，哥倫比亞，MD等)。
此外，哺乳動物或酵母雙雜交方法(參見如Bartel，P.L.等，Methods Enzymol，254241(1995))可被用於鑑定當在同一宿主細胞中時發生反應或結合的多肽或其他分子。
b)多肽活性本發明的多肽的活性可應用許多體外和體內測定來評估，以確定功能、化學和物理影響，如酶活性、細胞增殖(如CD4+淋巴細胞增殖)、HIV複製、HIV蛋白表達、或者配體或底物結合。此外，所述測定可被用於測定本發明的多肽的抑制劑或活化劑。調節劑也可以是本發明的多肽的遺傳學改變形式。
所述測定的多肽選自一種具有由這裡所描述的登錄號或SEQ ID NO1-24所編碼的序列的多肽，或其保守性改變變體。可選擇地，所述防衛素多肽獲自一種真核細胞，並包括胺基酸亞序列，其具有與這裡所描述的登錄號的胺基酸序列基本相同的序列。通常，胺基酸序列相同性為至少60％，優選至少65％、70％、75％、80％、85％或90％，最優選至少95％。可選擇地，所述測定的多肽包含本發明的多肽的一個片段，如細胞外區域、跨膜區域、細胞質區域、配體結合區域、亞基相關區域、活性位點，以及類似結構。本發明的多肽或其一個區域都可共價地連接到一種異源蛋白上，創建一種嵌合蛋白，應用在這裡所描述的測定中。
應用本發明的重組或天然存在的多肽可測定多肽的調節劑的活性。所述蛋白可被分離，在細胞中表達，在來自某個細胞的細胞膜上表達，在組織或一種動物中表達，重組的或天然存在的。比如，可應用組織切片、游離細胞如來自表達本發明的多肽的組織的細胞、轉化細胞或細胞膜。應用一種這裡所述的體外或體內測定來測定調節劑。
結合到本發明的多肽的調節劑、一個區域或嵌合蛋白可在溶液中、在雙分子層膜中、附著到固相支持物上、在脂質單體中或在囊泡中進行測定。可應用如分光特性(如螢光、吸光率、折射率)、流體動力學(如外形)、色譜或溶解特性的改變來測定調節劑的結合。
將用潛在的調節劑(如一種「測試化合物」)處理的樣品或試驗與沒有測試化合物的對照樣品進行比較，檢測調節劑的效力。指定對照樣品(未用活化劑或抑制劑處理的)的相對活性值為100。當活性值相對於對照樣品約90％，特別為50％、更特別為25-0％時，本發明的多肽的抑制作用成立。當活性值相對於對照為110％，可選擇地為150％、200％、300％、400％、500％，或1000-2000％時，防衛素的活化作用成立。
c)表達測定也提供了篩選調節本發明的多核苷酸和多肽表達的化合物的篩選。篩選方法通常包括進行基於細胞的測定，測試化合物與一種或多種表達本發明的多核苷酸或多肽的細胞結合，然後檢測表達(轉錄產物或翻譯產物)的提高或降低。測定可以在任何本發明的多核苷酸和多肽的細胞中進行。可以通過許多不同的途徑來檢測表達。如下文所描述的，本發明的多核苷酸在細胞中的表達水平可通過探測細胞中mRNA的表達來確定，應用一種可特異性與本發明的多核苷酸的轉錄產物雜交的探針(或其互補核酸)。可通過溶解細胞來進行探測，進行Northern印跡；也可不溶解細胞，應用原位雜交技術進行。可選擇地，本發明的多肽可應用免疫性方法來檢測，用能夠特異性結合到多肽上的抗體來探測細胞溶解產物。
本發明的多核苷酸或多肽的表達或活性的水平可與基線值相比較。基線值可以是對照樣品值或是統計值，代表了針對特定群體(如AIDS進展者)或細胞(如沒有與調節劑接觸的組織培養細胞)，本發明的多核苷酸或多肽的表達水平。合適的用於所述基於細胞的測定的細胞包括初級細胞如PBMCs、淋巴細胞(如CD4+)、嗜中性粒細胞、多形核白細胞，以及其它噬菌細胞核細胞系，如Jurkat細胞、BJAB細胞等。所述防衛素蛋白可以是天然存在的、化學合成的或重組的。
d)動物模型本發明還發現，HIV感染的動物模型也可用於篩選防衛素的調節劑。同樣地，也可應用包括基因敲除技術的轉基因動物技術，比如，與一種合適的基因靶向載體同源重組，或基因超表達，將引起防衛素蛋白的不表達或提高表達。類似的技術也可應用於製造敲除細胞。
可通過同源重組技術，在小鼠基因組的內源防衛素基因位點插入標記基因或其他異源基因，製備敲除細胞和基因小鼠。所述小鼠也可通過用突變型防衛素基因取代內源防衛素來製備；或通過對內源防衛素進行突變，如將其與致癌物質接觸。
將一種DNA結構導入到胚胎幹細胞的核中。將包含所述新遺傳型的細胞注入宿主小鼠胚胎中，再移植進入受體雌鼠中，一些胚胎發展成嵌合的小鼠，擁有部分來自突變細胞系的生殖細胞。因此，通過繁殖這種嵌合小鼠，可能獲得一種包含有導入基因型的新的小鼠(參見如Capecchi等，Science，2441288(1989))。嵌合型打靶小鼠可根據以下文獻中的方法製備Hogan等，小鼠胚胎的操作實驗指南，冷泉港實驗室(1988)；以及畸胎癌核胚胎幹細胞實踐方法，Robertson編，IRL Press，華盛頓(1987)。
e)固相和溶液高通量測定在本發明的高通量測定中，在一天中可能篩選高達數千的不同調節劑或配體。特別地，可應用微量滴定板的每個孔來進行分離的針對一個潛在調節劑的測定；或者，如果需要觀察濃度或孵育時間，可用5-10個孔測定一種調節劑。因此，單塊標準的微量滴定板可以測定約100(如96)個調節劑。如果應用了含1536個孔的板，則單塊板可以方便地測定從約100至約1500個不同的化合物。每天測定幾塊不同的板也是可能的；應用本發明的完整的系統，可能篩選高達約6,000-20,000或更多的不同化合物。此外，可應用微流方法進行試劑處理。
特定的分子(如本發明的多肽或多核苷酸，或其調節劑)可直接或間接地結合到固態組合物上，通過共價或非共價的連接方式，如通過一種標籤(tag)。所述的標籤可以是許多組合物中的任意一種。通常，一種結合到標籤的分子(一種標籤結合物)被固定在一種固相支持物上，通過標籤和標籤結合物的相互作用，所述標籤分子被附著到固相支持物上。
基於已知的分子相互作用，許多的標籤和標籤結合物可被應用，這在許多文獻中有描述。例如，當標籤具有天然的結合物時，如生物素、蛋白A、或蛋白G可被用於連接到適當的標籤結合物上(抗生物素蛋白、鏈黴親和素、中性鏈親和素、免疫球蛋白的Fc區、多聚組氨酸等)上。具有天然結合物的分子(如生物素)以及適當的標記結合物的抗體也被廣泛地應用，(參見SIGMA免疫化學1998目錄，SIGMA，聖路易斯MO)。
同樣地，任何半抗原或抗原性化合物可被用於結合適當的抗體，形成標籤/標籤結合物對。數千種特定抗體是商業可用的，並且有許多另外的抗體被描述在文獻中。例如，在一種普通配置方案中，所述標籤是一種第一抗體，標籤結合物是一種結合第一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原反應，受體-配體反應也適合於作為標籤和標籤結合物對，如作為細胞膜受體的激動劑和拮抗劑(如細胞受體-配體反應，如c-kit、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白細胞介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘素家族、整合素家族、選擇素家族，以及類似物。參見如Pigott和Power，The Adhesion Molecule Facts Book I(1993))。同樣地，毒素和毒物、病毒決定簇、激素(如鴉片劑、類固醇)、細胞內受體(如其能介導不同小配體的作用，包括類固醇、甲狀腺激素、類維生素A和維生素D；以及肽)、藥物、凝集素、糖、核酸(線性和環狀聚合結構)、低聚糖、蛋白、磷脂以及可與不同細胞受體反應的抗體。
合成的聚合體，如聚氨酯橡膠、聚酯、聚碳酸酯、聚亞安酯、聚醯胺、聚乙烯亞胺、聚芳基硫、聚矽氧烷、聚醯亞胺和聚醋酸酯也可用於形成一種適當的標籤或標籤結合物。在參考了這裡所公開的內容後，本領域技術人員顯然清楚，許多其他標籤/標籤結合物對也是對本發明的測定系統有用的。
普通的連接物如肽、聚醚以及類似物也能用作標籤，包括多肽序列，如約5-200個胺基酸的聚-苷氨酸(gly)序列。所述靈活的連接物對於本領域技術人員是已知的。比如，Shearwater Polymers公司(Huntsville，阿拉巴馬州)提供的聚(乙烯乙二醇)連接物。可任選地，這些連接物具有醯胺連接、巰基連接或異功能連接。
應用任何可用的現有方法將標籤結合物固定到固相底物上。通常通過把底物的所有或部分與一種化學試劑接觸，將可與標籤結合物反應的化學基團固定到表面，獲得衍生化的或功能化的固相底物。比如，適合於附著到長鏈部分的基團包括胺、羥基、硫醇以及羧基基團。氨烷基矽烷和羥烷基矽烷可被用於功能化許多的表面，如玻璃表面。所述固相生物聚合體陣列在文獻中多有描述(參見如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963)(描述肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102259-274(1987)(描述固相組分的合成)；Frank和Doring，Tetrahedron4460316040(1988)(描述在纖維素板上不同肽序列的合成)；Fodor等，Science，251767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)718-719(1993)；以及Kozal等，Mature Medicine 2(7)753-759(1996)(都描述生物聚合體固定到固相底物的陣列)。用於將標籤結合物固定到底物的非化學途徑包括其他常規方法，如加熱、用UV輻射進行交聯，以及類似方法。
本發明提供了體外測定方法，用於在高通量方式下鑑定可調節本發明的多肽的表達或活性的化合物，如免疫測定方法，如ELISA。因為測定是高度一致的，在一個孔進行選擇性對照反應，進行不包括潛在調節劑的反應，對比測定本發明的多肽活性。所述選擇性對照反應是合適的，並能提高測定的可靠性。因此，在一些實施方案中，本發明的方法包括所述的對照反應。對於每一種已描述的測定方式，不包括調節劑的「無調節劑」對照反應提供了結合活性的背景水平。
在一些測定中，需要陽性對照。至少兩種類型的陽性對照是合適的。首先，將一種已知的本發明的多肽或多核苷酸的活化物與所述測定的樣品孵育，結果信號提高，說明本發明的多肽或多核苷酸的表達水平或活性提高了。第二，可加入一種已知的本發明的多肽或多核苷酸的抑制物，結果信號降低，說明本發明的多肽或多核苷酸的表達水平或活性降低了。可以理解，調節劑也可與活化物或抑制物結合，尋找抑制所述提高或降低(由已知的本發明的多肽或多核苷酸的調節劑引起的)的調節劑。
H.與防衛素多肽反應的分子的測定除了提供可用於鑑定防衛素調節劑的測定以外，本發明還提供了用於與防衛素多肽反應的分子的測定。與α-防衛素反應的來自CD4+細胞的分子在α-防衛素的抗病毒活性方面可能是重要的，從而其可能是藥物調節的靶點。因此，本發明提供了檢測這些分子的試驗。所述方法包括將CD4+細胞與α-防衛素接觸足夠的時間，誘導抗病毒反應，然後從CD4+細胞中或從培養所述細胞的培養介質中捕獲可結合α-防衛素的分子。結合到α-防衛素的分子的捕獲可以通過間接或直接的方式進行。
在一種直接的方法中，在與α-防衛素接觸後，將來自細胞的材料與一種固定的α-防衛素接觸，如衍生化的珠或親和生物晶片(如PtoteinClip陣列)。任何結合α-防衛素的分子將被捕獲在固相上。然後，可洗滌固相，移走未結合的材料，將結合到α-防衛素的分子洗脫，通過任何已知的方式進行檢測。
在一種間接的方法中，在與α-防衛素接觸後，將來自細胞的材料與一種可結合α-防衛素的捕獲試劑接觸。所述試劑可以是固定的抗α-防衛素抗體或溶液狀的抗α-防衛素抗體(其自身可被捕獲在固相上)。在這種方式中，任何結合α-防衛素的分子將與α-防衛素一起被捕獲。然後，可洗滌固相，移走未結合的材料，將結合到α-防衛素的分子洗脫和檢測。
I.試劑盒本發明也提供了檢測防衛素的試劑盒。所述試劑盒是有用的，比如可用於診斷或預後測定。試劑盒通常包括一種用於捕獲防衛素的固相，適合於固相上捕獲的分子的檢測。因此，所述固相可以用抗防衛素的抗體衍生化；或者所述試劑盒中包括一種抗體，可通過它來將底物衍生化。所述固相包括微量滴定板、珠，或適於質譜檢測的生物晶片，如Ciphergen生物系統公司提供的ProteinClip陣列(如PS1ProteinClip陣列或PS2 ProteinClip陣列。特別有用的試劑盒是包含捕獲試劑或檢測定劑的試劑盒，用於至少兩種不同的防衛素或至少三種不同的防衛素。當用於α-防衛素時，由於序列相同性，可用單種抗體捕獲α-防衛素1、2和3。可採用質譜來區別這些α-防衛素，它們可因質量不同而被區分開；或可採用三明治免疫測定，應用特異性結合到α-防衛素的氨基末端的抗體。所述試劑盒也可包括用於在樣品中檢測和定量防衛素的使用指導，以及將檢測到的量與預後或HIV感染狀態相關聯的指導。
實施例提供以下的實施例用於舉例證明，而並非限制本發明所要求的權項。
實施例I材料和方法製備CD8+T細胞以及受激的培養上清。從2個長期生存者中採集靜脈血樣，所述長期生存者儘管感染HIV-1超過13年(攜帶CD4和病毒)，但仍然保持健康。也從4個HIV-1感染進展者(抗病毒治療前)中採集血樣(攜帶CD4和病毒)，以及從15個未感染的正常個體中採集血樣。然後通過標準Ficoll/Hypaque梯度離心分離外周血單核細胞(PBMC)。應用包被了抗CD8單克隆抗體(Dynal，Lake Success，NY)的磁珠，通過陽性選擇將CD8+T細胞從PBMC細胞中分離。然後通過Detach-a-Bead(Dynal)將磁珠從細胞中移走。通過所述步驟獲得的細胞的純度＞99.5％，由FACS來判定純度。將CD8+T細胞置於潮溼的CO2培養箱中，37℃下刺激3天，與0.1μg/ml的抗CD3抗體(12F6)(由MIT的Johnson饋贈)和5μl/ml的抗CD28抗體(Becton Dickinson)共同孵育，同時還有等量的異源照射的PBMC置於無血清的RPMI1640培養基中(Cellgro)，添加重組IL-2(20U/ml)、青黴素(100U/ml)和鏈黴素(100μg/ml)。收集培養上清，在3000rpm下離心5分鐘除去雜質，並存放在-80℃備用。
細胞培養上清的ProtenClip陣列分析。每種ProteinClip陣列具有獨特的化學(離子的、疏水的、親水的等)或生物(抗體、受體、DNA等)特性，用於從複合混合物中選擇性捕獲蛋白/肽。最初被用於我們的實驗的很多類型的ProteinClip陣列，包括弱陽離子交換(WCX2)、強陰離子交換(SAX2)、固定化金屬親和捕獲(IMAC-3)和反相H4(Ciphergen)。WCX2陣列最後被選擇用於整個研究，因為它在從培養上清中檢測蛋白/肽類型時具有高的再現性。特別地，將100μl的培養上清與等體積的結合緩衝液(100mM NaAc，PH4.5；0.2％Triton X-100溶於PBS中)混合。然後將混合物通過一種生物處理器(Ciphergen)施用於WCX2，並在4℃孵育過夜，並進行恆定的水平搖動。通過用結合緩衝液(50mM NaAc，PH4.5；0.1％Triton X-100溶於PBS中)洗滌3次，將沒有結合的蛋白/肽移走，這些都在相同的溫度和搖動條件下進行。然後將WCX2陣列從生物處理器上解下，在1mM HEPES(pH4.5)中衝洗30秒，風乾。在乾燥後，在晶片表面加上3，5-二甲氧-4-羥基苯乙烯酸(SPA)溶於50％乙腈和0.5％三氟乙酸的飽和溶液。SPA作為一種能量吸收分子，用於由表面-增強的雷射解吸/電離(SELDI)飛行時間質譜(Ciphergen)的檢測的蛋白/肽的捕獲。然後所述陣列被置於Ciphergen Protein Biological System II(PBSII)，從氮雷射(337nm)生成和激發毫微秒雷射脈衝，衝擊在SPA和蛋白/肽混合物中。應用在雷射強度220-240上平均80個雷射射擊點(laser shots)生成蛋白/肽的質譜。根據由精氨酸8-血管加壓素(ARG-8-Vasopressin)(1,084,3Da)、生長激素抑制素(Somatostatin)(1,637.9)、牛胰島素β鏈(3,495.9Da)、人胰島素(5,807.7)、以及水蛭素(7,033.6Da)(Ciphergen)校準的客觀蛋白/肽標準，確定每種被捕獲在陣列表面的蛋白/肽的質荷率(M/Z)。
應用抗體-包被的珠的蛋白鑑定伴隨著SELDI ProteinClip分析。根據製造方的說明，將Dynal珠用人嗜中性粒細胞(α)防衛素特異的抗體或人噬菌體炎症蛋白(MIP)1α特異的抗體包被。簡要地說，將人嗜中性粒細胞防衛素1-3(D21，HyCult生物技術)特異的生物素化的抗體與溶解在PBS(包含0.1％Tween 20)中的Biotin-Binder Dynabeads(Dynal)混合，在室溫下旋轉30分鐘。用包含0.1％Tween 20的PBS洗滌3次，去除沒有結合的抗體。並且，通過在4℃旋轉過夜，人MIP-1α特異的抗體(RD系統)被直接偶連到存在於0.1M Borate緩衝液(pH7.0-7.5)中的Dynabeads M-450 Epoxy(Dynal)上。在孵育15-30分鐘後，加入0.5％BSA，確保抗體的最佳定位。然後將抗體-包被的珠用包含0.1％BSA(pH7.4)的PBS洗滌3次。每107個珠，需要約2-5μg的每種抗體。然後將抗體-包被的珠(約4×107)單獨地與200μl來自受激CD8+T細胞的培養上清混合，其中還存在0.01％溴化十六碳烷基三甲銨(CETAB，Sigma，聖路易斯，MO)，並且在4℃旋轉過夜。然後通過磁鐵，將抗原-抗體複合物包被的珠從上清中移走，將剩餘的上清施用於WCX2陣列，通過如前所述的SELDI進行分析。
製備用於抗病毒測定的來自受激CD8+T細胞的富含的和缺失的細胞培養上清，通過Qq-TQF進行蛋白鑑定。將BioSepra Q-HyperD柱(Ciphergen)平衡處理，用包含10％乙腈(CAN)和0.1％三氟乙酸(TFA)的50mM Tris HCl(pH8.0)洗滌。為了富集推定的α-防衛素肽，將培養上清與含50％乙腈的50mM Tris HCl(pH8.0)混合，施加到柱上。收集流出液，在相同的緩衝液中稀釋5倍，直接施加到BioSepra Reverse PhaseC18柱上。用含0.1％TFA和逐步升高量的ACN(從30％、40％、50％、60％以及最後到80％)的50mM Tris HCl(pH8.0)洗脫結合的蛋白/肽。
應用Micromass Q-TQF II進行蛋白鑑定。從BioSepra Reverse Phase C18柱上洗脫的部分中含有50％CAN和0.1％TFA。通過加入10％v/v的100mM重碳酸銨緩衝液(pH8.0)中和TFA，然後通過真空離心抽氣機濃縮中性的洗出液，在室溫下進行30分鐘，直至溶液達到約25毫微微摩爾蛋白/肽每微升。然後經濃縮的材料用含5mM DDT的50mM Tris HCl(pH8.6-9)在90℃還原5分鐘，但不進行烷化。經還原的混合物冷卻到室溫，用0.6μg/μl的胰蛋白酶在40℃消化2小時，然後在冰上終止。所有的上述反應在惰性氬的存在下進行。然後將胰蛋白酶消化的產物直接施加到CiphergenNP-20陣列上，通過Ciphergen PCI-1000 ProteinClipInterface，用MicromassQ-TQF II進行蛋白鑑定。
病毒抑制試驗。同時應用假型單環病毒和可複製型HIV-1病毒菌株進行病毒抑制試驗，所述菌株分離自感染HIV-1的患者的CEM174細胞系和/或PBMC。CEM174細胞系已經被構建成可同時表達HIV-1共同受體CXCR4和CCR5的形式。通過共轉染螢光素酶-受體病毒骨架PNL4-3 LucR-E-和JR-FL或HXB2外殼表達載體進入人胚胎腎細胞系293T，生成假型病毒。2天後收集包含病毒的上清，應用標準的方案(ref)定量上清中的p24抗原水平。然後將上清取出，並儲存在-80℃備用。對於應用假型單環病毒的病毒抑制試驗，感染前，在96孔板的每個孔中放置2×105CEM174細胞。在人嗜中性粒細胞防衛素1或2(American Peptide公司，桑尼維爾，CA)之一或同時存在下，在每孔中加入5毫微克的p24單環JR-FL或HXB2報告病毒。為了研究可能的抑制機制，加入人嗜中性粒細胞防衛素或來自受激LTNP CD8+T細胞的培養上清，可與病毒同時加入或在感染一段時間後加入。本實驗中還包括加入病毒進入抑制劑T-20和非核苷反轉錄酶抑制劑UC-781，用於評估在病毒生命周期中每個階段的時間。在感染起始後3天，用PBS洗滌細胞，在50μl螢光素酶細胞溶解緩衝液(Promega)中溶解，進行一次冰凍-解凍過程來提高檢測靈敏度。在3,000rpm簡單離心10分鐘，應用Promega Luciferase Assay System和光度計(Dynex Technologic公司)測定25μl細胞溶解產物的螢光素酶活性。
對於應用可複製型病毒的病毒抑制試驗，先將PBMC用濃度為20μg/ml的PHA刺激3天。96孔板上，在存在人嗜中性粒細胞防衛素1或2之一或全部下，每孔加入約2×105個細胞，每種病毒具有100組織培養感染劑量(TCID50)。在一些實驗中，也包括來自受激LTNP CD8+T細胞的培養上清。在37℃感染2小時後，通過PBS洗滌，移走上清中剩餘的病毒。加入包含相同濃度的人嗜中性粒細胞防衛素或來自受激LTNP CD8+T細胞的培養上清的新鮮介質。在感染後第0、3和7天，用標準的方案測定上清中的p24抗原水平。在病毒生產尖峰時間，一般在起始感染後第7天，通過對比有或沒有抑制劑的上清中的p24水平計算抑制百分數。
結果一系列由LTNP和正常人的CD8+細胞分泌的小型蛋白的鑑定。從來自3個LTNP、4個AIDS進展者以及15個正常對照的受激和非受激的CD8T淋巴細胞培養物中收集上清溶液。每種樣品在PriteinClipSystem(Ciphergen生物系統公司，費瑞蒙，CA)上進行分析，其是基於化學改變的陣列表面的集成，採用表面-增強的雷射解吸/電離(SELDI)飛行時間(TOF)質譜(MS)檢測。選擇所述技術是因為其具有高分辨能力、高再現性、易於使用，以及毫微微摩爾水平的敏感性。如圖1a所示，2個LTNP和1個正常對照的代表蛋白的質譜顯示，受激和非受激的CD8上清相比，峰的方式明顯不同。在受激的培養中，發現一簇兩個或三個峰的情況，在3,371.9Da、3,442.5Da和3,486.5Da上。該簇分子在來自3個LNTP和(15個中的)11個正常個體的受激的CD8 T淋巴細胞培養物中被檢測到，但在來自4個進展者的受激的培養物中都沒有找到(圖1a)。一個獨特的峰在7,815.0Da上，後來鑑定為MIP-1α，也在來自2個LTNP的受激的樣品中被檢測到。儘管觀察到許多8,000-200,000Da的峰，但沒有在三類受試者的受激或非受激CD8培養物中發現明顯的差異(數據未顯示)。特別地，沒有高於8,000Da的峰保持與CAF活性的存在相關聯。
為了進一步定性在3,300和3,500Da之間的峰，從來自LTNP受試者-3(LTNP-3)和正常對照受試者-2(正常個體-2)的受激CD8 T細胞的培養上清中富集所述的蛋白。然後所述富集的材料用二硫蘇糖醇(DTT)、丙烯醯胺或碘代乙醯胺處理，探測在該簇峰的每種蛋白中二硫鍵的存在。然後將處理後的材料直接施加到Ciphergen NP-20陣列上，用SELDI-TOF-MS測定。下表1中顯示了在正常個體-2的經DTT還原的材料中發現的三個峰的分子質量的改變。在還原後每個峰增加了～6Da(圖6)，證明在該簇中的每種蛋白包含三個內部二硫鍵橋，由於每個二硫鍵斷裂後，DTT還原可加上兩個氫原子，形成兩個自由的巰基基團。此外，對於在來自LTNP-3的培養上清中檢測到的峰，用丙烯醯胺或碘代乙醯胺還原和烷化可分別增加～434Da或349Da。根據丙烯醯胺(m.w.71)和碘代乙醯胺(m.w.57)的分子質量，觀察到的質量增加是由6個丙烯醯胺或碘代乙醯胺分子通過6個自由巰基基團添加到每個蛋白上而構成的。該結果進一步證明了每個蛋白中有三個分子內二硫鍵橋。
表1.在還原±烷化之前[-]和之後[+]分子質量(m/z)的變化
n/d未檢測鑑定作為人α-防衛素1、2和3的蛋白簇。通過檢索蛋白資料庫(NCBI和Swiss-Pro)，尋找與刺激後上調的峰具有相似分子質量的蛋白，發現分別與人嗜中性粒細胞(α)防衛素相對應的具有平均分子質量3,371.9Da、3,442.5Da和3,486.5Da的成對的或三個一對的峰主要是由人嗜中性粒細胞製造的肽抗生素(Ganz等，J.Clin.Invest.，761427(1985)，Selsted等，J.Clin.Invest.，761436(1985)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857327(1988))。此外，已知所述每一種多肽包含三個內在二硫鍵(Lehrer等，Curr.Opin.Immun.，1496(2002))。7,815.ODa的峰相應於人MIP-1α。並且，以前已經證明，約10％的種群會缺少防衛素3(Mars等，J.Bio.Chem.，27030371(1995))，這就恰恰證明了為什麼一些研究受試者顯示兩個峰，而其它一些顯示三個峰，這種現象同時存在於LTNP和正常個體(圖1)。為了測定這種假設，用人α-防衛素1、2和3特異的抗體包被Dynal珠，與來自受激CD8+細胞的上清共同孵育，然後移走磁珠。簡要地，將生物素化的人α-防衛素1、2和3特異的單克隆抗體(克隆D21，HyCult Biotechnology，Norwood，MA)與Biotin-Binder Dynabeads(Dynal)在包含0.1％Tween 20的PBS中混合，在室溫下旋轉30分鐘。用包含0.1％Tween 20的PBS洗滌3次，移走未結合的抗體。分離地，在0.1M硼酸緩衝液(pH7.0-7.5)中，將人-MIP-1α特異的單克隆抗體(RD系統，明尼阿波利斯，MN)直接連接到Dynabeads M-450 Epoxy(Dynal)上，在4℃旋轉過夜。在孵育後15-30分鐘，加入0.5％BSA，以確保抗體達到最佳的定位。然後將抗體包被的磁珠用包含0.1％BSA的PBS(pH7.4)洗滌3次。每107個珠使用2-5μg每種抗體。接著在0.01％十六烷基三甲基溴化銨(Sigma，聖路易斯，MO)存在下，將抗體包被的珠(約4×107)與200μl的來自受激CD8+T細胞的培養上清混合，在4℃旋轉過夜。然後用Detach-a-Bead磁鐵(Dynal)，將所述抗原-抗體複合物包被的珠從上清中移出，將剩餘的上清施加到WCX2陣列上，如前所述用SELDI-TOF-MS分析。通過與那些來自上清的抗體包被的磁珠孵育並最後移走，同時從上清中去除兩個或三個峰，可以解釋成對的或三個一對的峰是否真正屬於人α-防衛素家族。用一種抗防衛素1、2、3抗體預處理消除了在3,300至3,500Da(圖2a)範圍內的蛋白簇，而不會明顯影響其它有用的峰。與抗MIP-1α預孵育沒有影響有用的峰，但卻導致在7815.0Da的峰的移動。這些實驗清楚地證明，在來自LTNP和正常個體的CD8+T細胞受激後發生上調的二或三峰蛋白簇是人α-防衛素家族的成員。β-趨化因子MIP-1α在刺激後也發生上調，這與以前的報導相一致。
應用Micromass Qq-TOF MS-MS進行蛋白峰的低MW簇的蛋白測序。為了進一步證明所述結論，前面用於還原和烷化實驗的富集的材料用胰蛋白酶消化，並通過串聯質譜進行分析。與沒有所述蛋白簇的對照比較，來自LTNP-3和正常個體-2的胰蛋白酶消化的材料獲得一條獨特的1060.50Da(圖2b，上右插入圖)片段。通過在MS-MS撞擊細胞中撞擊-誘導的離解，所述獨特的片段被進一步選擇和片段化成更小的離子。然後，七個通過所述方式(圖2b)形成的離子被用在蛋白搜尋引擎(參見圖2b的插圖說明)中，尋找所述1060.50Da母離子的假設片段。所述檢索獲得了一個與人α-防衛素1、2和3的胰蛋白酶消化片段理想的且明確的匹配。實際上，所述的肽在這三種分子中是保守的，精確地與來自胺基酸位點16-24位的序列YGTCIYQGR相符(圖2b)。蛋白測序證明在來自LTNP和正常個體的CD8 T細胞受激後發生上調的蛋白簇是人α-防衛素家族的成員。
人α-防衛素1、2和3引起了CAF的HIV-1抑制活性，而並非因為β趨化因子。為了評估α-防衛素1、2和3對於總體CAF活性的相對作用，用前面所述的特異性抗體包被的珠或親和柱(來自克隆21的生物素化的單克隆抗體(HyCultBiotechnology)被用於從培養上清中去除α-防衛素1、2和3，根據生產方的指導，應用HiTrap親和柱進行(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ))，選擇性去除來自LTNP-3和LTNP-5的受激CD8+T細胞的培養上清中的所述分子。圖3a對比了在α-防衛素1、2和3去除前和去除後，對抗X4和R5 HIV的抗病毒活性(兩次實驗的平均)，包括來自不同基因型的菌株。如前面所描述的方法進行病毒抑制測定。在去除前，培養上清能夠抑制所有被測定X4病毒的約50-60％的複製，不考慮基因型。然而在去除後，抗X4病毒的抑制作用完全消失了，表明α-防衛素1、2和3引起了幾乎所有(如果不是全部的話)的CAF抗X4病毒抑制活性。對於R5病毒，在移走了α-防衛素以後，抗HIV-1活性平均降低了約40％(圖3a)。
同時也發現，在濃度為10μM時，α-防衛素1和2能夠抑制約15-30％的每種病毒的複製。然而，當以類似的濃度同時加入α-防衛素1和2時，抑制百分數升高到70％，證明這兩種防衛素之間存在著增效效應。此外，通過α-防衛素的每種病毒的抑制都是劑量依賴的。
然後，通過向上清液中加入一種抗α-防衛素1、2和3的抗體，檢測CAF活性是否能夠以劑量依賴的方式被中和，並且，共同加入或不加入β趨化因子抗體。隨著抗α-防衛素抗體濃度的提高，來自LTNP-3和LTNP-5的CD8上清的抗HIV-1活性降低(圖3b)。當抗體濃度達到25μg/ml時，對於所有被測定的X4病毒，CAF的抑制活性實際上消失了，而類似量的對照抗體沒有影響(數據未顯示)。通過加入增加量的α-防衛素抗體，抗R5病毒的抑制活性也降低了，儘管影響沒有如在X4病毒中所觀察到的那樣強烈(圖3b)。為了研究剩餘的對抗R5病毒的活性是否由β趨化因子所引起，將來自LTNP-3和LTNP-5的培養上清用增加量的抗MIP-1α、MIP-1β和RANTES抗體混合物(1∶1∶1)處理，同時用固定濃度(25μg/ml)的α-防衛素抗體處理。在使用最高抗體濃度時，抗三種R5分離物的剩餘抗病毒活性幾乎完全被中和(圖3b，右邊圖)，而一種對照抗體的加入具有最小的影響(數據未顯示)。總體來說，這些結果證明α-防衛素1、2和3引起了受激CD8+T淋巴細胞培養上清中將近所有的抗HIV-1活性，而並非是因為β趨化因子。
合成和純化的人α-防衛素可以在體外抑制HIV-1的複製。接著我們將把注意點集中到檢測合成或純化形式的α-防衛素的體外抗HIV-1活性。兩種產物是商業可購買的α-防衛素1和2(American Peptide公司，桑尼維爾，CA)。隨著兩種合成α-防衛素混合物(1∶1)濃度的增加，觀察到對抗HIV-1的6個分離物的提高程度的抑制(圖4)，不管病毒的顯型和基因型。混合物的50％抑制濃度在約11-24μM。當混合物的抗病毒能力不高時，應該注意這些商業產品是不純的，如SELDI-TOF-MS(圖7)所示的。與由受激的CD8+T細胞生成的α-防衛素相比，除了正確的分子質量的峰以外，商業產品還包含一些蛋白峰。而且，即使是具有接近正確的分子質量的峰，仍然不能保證形成正確的二硫鍵橋。因而，為了確認商業α-防衛素製品的抗HIV-1活性的特異性，重複用這些肽進行病毒抑制試驗，並在一種抗α-防衛素抗體存在下進行。圖4(左邊圖)顯示所述抗體真正充分地中和了商業肽的抗-HIV-1活性。所述結果證明抗病毒作用並非由商業製品中非特異的雜質介導的；取而代之的，在成分中的活性部分是由抗α-防衛素抗體識別的。也檢測了從正常人(36，39)嗜中性粒細胞純化獲得的α-防衛素1、2和3的抗HIV-1活性。所述製品包含α-防衛素峰，其本質上不能被質譜儀與那些從來自LTNP-5的CD8 T細胞上清中發現的α-防衛素區分開來(圖8)。在體外也能抑制HIV-1的複製，但是具有的IC50為約0.5-2.2μM(圖4，右邊圖)，證明純化的α-防衛素的抗HIV-1能力高於商業產品的10-20倍。純化的人嗜中性粒細胞α-防衛素的抗病毒活性也會因加入α-防衛素特異的抗體而降低或消除。
小部分CD8 T細胞表達α-防衛素1、2和3。從一些正常的血供體純化得到的嗜中性粒細胞和CD8 T細胞通過免疫螢光進行研究，研究α-防衛素1、2和3在細胞內的表達。一部分未受刺激的CD8 T淋巴細胞的細胞質小顆粒中攜帶這些分子，但是在量上明顯少於在嗜中性粒細胞中的含量(圖5)。一旦刺激，一些CD8 T細胞似乎失去了所述α-防衛素陽性顆粒，可能是因為分泌到培養上清中去了。非常小的一部分CD8 T細胞被活化，表達更高量的α-防衛素(圖5；位於最右邊的細胞)。
通過流式細胞術分析，約2.3％的未刺激αβCD8 T淋巴細胞表達可評估水平的α-防衛素(圖9)。在刺激1天後，一些所述包含α-防衛素的細胞中不能再檢測到α-防衛素。然而，與免疫螢光結果相一致，在刺激後兩天，相當多的表達更高量α-防衛素的CD8 T細胞(21.1％)出現了。所述α-防衛素陽性的CD8細胞主要為沒有γδ或NK標記的αβCD8 T細胞。這些發現還證明，CD8 T細胞真正攜帶和分泌α-防衛素1、2和3，在先天和後天的免疫系統之間建立了另一個聯繫。
實施例II該實施例證明，在感染HIV的患者血清中α-防衛素水平可作為預後的標記。
採取一種研究，來確定在感染HIV患者的血漿中α-防衛素的表達水平是否是不同的。收集患者的血漿，通過SELDI和標準ELISA(HNP1-3 ELISA，Cell Science)來測定防衛素，來自正常個體的血漿(匯集的，定購自Sigma)被用作陽性對照。對21位患者中的每一位，在兩個時間點上測定防衛素在起始HAART治療之前以及在起始HAART治療後正好一年。所有患者的病毒負載在剛開始時是可測量的，在HAART治療一年後無法測出。在HAART治療之前和之後，他們的T細胞數(CD4和CD8)是已知的。表2總結了所述結果。
所述研究發現，防衛素在未感染的對照人血漿中以6.2-7ng/ml的濃度存在，在21位感染HIV的個體中只有33％(7/21)可檢測到。在7位可檢測到防衛素的患者中，3位具有低的起始病毒負載，暗示了隨著病毒負載的提高，防衛素的生產受到影響。儘管事實上他們的病毒負載在一年後無法檢測到並且他們的CD4和CD8數是正常的，7位患者中的4位在研究起始時具有可檢測到的防衛素水平，在起始HAART治療一年後部分或全部地失去了表達。
1位患者在研究起始時無法檢測到防衛素水平，但在HAART治療期間，當他的CD4數增加3倍後，可檢測到正常人的約1/3水平的防衛素。另有2位患者在HAART治療之前和之後都具有低的防衛素水平(也是未感染個體的約1/3水平)。
這些結果證明，在感染HIV的個體中，α-防衛素水平在血漿中的水平比未感染的個體低。這確證了體外發現的防衛素可終止病毒複製、並由正常對照和長期非進展者(LTNP)的CD8 T細胞分泌，而不是由來自AIDS患者的CD8細胞分泌的。
表2
應理解，這裡描述的實施例和實施方案都只用於舉例證明的目的，對於本領域的技術人員來說，根據這些內容可以作出不同的修改和變化，它們都包括在本申請的意願和範圍內，以及包括在附加的權利要求範圍內。這裡引用的所有出版物、專利和專利申請以它們的全部作為參考加入本文，用於所有目的。
權利要求
1.一種組合物，所述組合物包含防衛素多肽和藥學上可接受的載體。
2.如權利要求1所述的組合物，其中，所述防衛素多肽是α-防衛素多肽。
3.如權利要求2所述的組合物，其中，所述的α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3。
4.如權利要求1所述的組合物，包含至少兩種α-防衛素多肽。
5.如權利要求4所述的組合物，包含α-防衛素1和α-防衛素2。
6.如權利要求4所述的組合物，包含α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3。
7.一種在人體內治療HIV感染的方法，所述方法包括給予人體一種防衛素多肽。
8.如權利要求7所述的方法，還包括給予人體一種防衛素多肽和一種第二治療劑。
9.如權利要求7所述的方法，其中，所述防衛素多肽是一種選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3的α-防衛素多肽。
10.如權利要求7所述的方法，還包括施用一種選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3的第二α-防衛素多肽。
11.如權利要求9所述的方法，其中，所述α-防衛素多肽是α-防衛素1和α-防衛素2。
12.一種向HIV感染高危人體施用預防量的防衛素多肽的方法。
13.如權利要求11所述的方法，其中，所述防衛素多肽是一種選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3的α-防衛素。
14.如權利要求11所述的方法，還包括施用一種選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3的第二α-防衛素多肽。
15.如權利要求13所述的方法，其中，所述α-防衛素多肽是α-防衛素1和α-防衛素2。
16.一種抑制HIV感染培養中的CD4+細胞的方法，所述方法包括將所述細胞與一種防衛素多肽接觸的步驟。
17.如權利要求15所述的方法，其中，所述防衛素多肽是一種選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3的α-防衛素多肽。
18.如權利要求15所述的方法，還包括施用一種選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3的第二α-防衛素多肽。
19.一種組合物，所述組合物含有包含於藥學上可接受的載體中的編碼第一防衛素多肽的第一核酸。
20.如權利要求18所述的組合物，還包含編碼第二防衛素多肽的第二核酸。
21.如權利要求19所述的組合物，其中，所述防衛素多肽是一種選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3的α-防衛素多肽。
22.如權利要求20所述的方法，其中，所述α-防衛素多肽是α-防衛素1和α-防衛素2。
23.一種在人體內抑制HIV感染的方法，所述方法包括在體內用一種包含編碼防衛素多肽核苷酸序列的核酸轉染細胞；或者，在體外用一種包含編碼防衛素多肽核苷酸序列的核酸轉染細胞，並將細胞給予所述的人。
24.如權利要求22所述的方法，其中，所述防衛素多肽是選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3的α-防衛素多肽。
25.如權利要求22所述的方法，其中，所述細胞是肌細胞。
26.如權利要求22所述的方法，其中，所述細胞是AC133+或CD34+祖細胞。
27.如權利要求22所述的方法，其中，所述轉染在先體外後體內進行。
28.如權利要求22所述的方法，其中，所述核酸包含一種操作性連接到編碼防衛素多肽核苷酸序列的可誘導的啟動子。
29.一種確定個體的HIV感染狀態的方法，所述方法包括a)在來自個體的樣品中檢測α-防衛素的量；以及b)將獲得的量與HIV感染狀態相關聯。
30.如權利要求28所述的方法，還包括將防衛素的量和至少一種其他指標與HIV感染狀態相關聯，所述計數器選自CD8+細胞計數、CD4+細胞計數、HIV病毒負載和總T細胞計數。
31.如權利要求28所述的方法，其中，所述α-防衛素通過ELISA或SELDI檢測。
32.如權利要求28所述的方法，其中，所述α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3。
33.一種確定個體HIV感染狀態的方法，所述方法包括a)在來自個體的樣品中檢測α-防衛素mRNA的量；以及b)將獲得的量與HIV感染狀態相關聯。
34.如權利要求32所述的方法，其中，所述α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3。
35.一種用於確定一種化合物是否能夠調節細胞中α-防衛素活性的方法，所述方法包括a)將α-防衛素-生成細胞與所述化合物接觸；以及b)確定所述化合物對於α-防衛素活性的功能性影響。
36.如權利要求34所述的方法，其中，所述細胞選自嗜中性粒細胞、CD8+細胞和上皮細胞。
37.如權利要求34所述的方法，其中，所述功能性影響通過檢測防衛素的表達水平、細胞增殖或HIV複製來確定。
38.如權利要求34所述的方法，其中，所述化合物是一種小型有機分子。
39.如權利要求34所述的方法，其中，所述α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3。
40.一種在人體內抑制HIV感染的方法，所述方法包括給予所述人體一種用權利要求35所述方法鑑定的化合物以增加α-防衛素的活性。
41.一種方法，所述方法包含a)將一種細胞與α-防衛素接觸；b)將一種抗-α-防衛素抗體與所述細胞的溶解產物接觸；c)在b)步驟之前或之後，將抗-α-防衛素抗體固定到固相上，以使來自細胞的α-防衛素結合到固相上；以及d)檢測結合到固定的α-防衛素上的蛋白。
42.一種方法，所述包含a)將一種細胞與α-防衛素接觸；b)將一種α-防衛素與所述細胞的溶解產物接觸；c)在b)步驟之前或之後，將所述α-防衛素固定到固相上，以使結合到α-防衛素的蛋白被捕獲；以及d)檢測結合到固定的α-防衛素上的蛋白。
43.如權利要求40或41所述的方法，其中，所述細胞是CD4+細胞、Hela細胞或HOS細胞。
44.如權利要求40或41所述的方法，其中，所述α-防衛素多肽選自α-防衛素1、α-防衛素2和α-防衛素3。
45.一種試劑盒，其包含(a)一種可結合抗體的底物；(b)一種抗α-防衛素多肽的抗體；以及(c)將在患者樣品中檢測到的α-防衛素的量與預後AIDS發展相關聯的指導。
46.如權利要求44所述的試劑盒，其中，所述底物是一種質譜探針。
47.如權利要求44所述的試劑盒，其中，所述底物是一種微量滴定板。
48.如權利要求44所述的試劑盒，還包含一種特異性抗α-防衛素1、α-防衛素2或α-防衛素3的第二抗體。
49.如權利要求44所述的試劑盒，其中，所述第二抗體是標記的。
50.一種試劑盒，其包含(a)一種可結合α-防衛素多肽的底物；以及(b)將在患者樣品中檢測到的α-防衛素的量與預後AIDS發展相關聯的指導。
51.一種試劑盒，其包含一種可特異性結合一種α-防衛素的第一抗體，以及一種可特異性結合α-防衛素1、α-防衛素2或α-防衛素3的第二抗體。
52.一種α-防衛素融合蛋白，其包含一個第一α-防衛素多肽部分和一個結合CD4的第二部分。
53.一種α-防衛素融合蛋白，其包含一個第一α-防衛素多肽部分和一個第二信號肽部分。
54.如權利要求53所述的α-防衛素融合蛋白，其中，所述第二信號肽部分是TPA信號肽。
55.一種核酸，其包含編碼權利要求52所述多肽的核苷酸序列。
56.一種α-防衛素融合蛋白，其包含一個第一α-防衛素多肽部分和一個可在體內提高蛋白質穩定性或生物利用度的第二部分。
57.一種藥物組合物，其包含PEG化的α-防衛素和藥學上可接受的載體。
58.一種α-防衛素類似物，其包含可刪除蛋白水解切割位點的胺基酸取代。
59.一種提高內源性α-防衛素生產的方法，所述方法包括施用一種可激活CD8+細胞的組合物。
60.如權利要求59所述的方法，其中，所述組合物包含抗-CD3。
61.一種方法，所述方法包括a)先體外後體內擴展CD8+細胞；b)檢測CD8+細胞的α-防衛素生產；以及c)向HLA匹配人群施用所述擴展的CD8+細胞。
62.一種方法，所述方法包括給予人體一種疫苗以及一種α-防衛素多肽或編碼α-防衛素的核酸。
63.一種組合物，其包含一種疫苗和一種α-防衛素多肽或編碼α-防衛素的核酸。
64.一種組合物，其包含一種α-防衛素多肽以及一種第二治療劑。
全文摘要
本發明涉及用防衛素抑制病毒，如HIV。本發明還涉及鑑定和使用試劑的方法，包括小分子化學組合物、抗體、肽、核酸、反義核酸和核酶，其能提高天然存在的防衛素的表達或活性，從而抑制細胞中的HIV；同時，還涉及將表達曲線和組合物應用於診斷和預防，並且治療與HIV相關的感染以及相關的疾病狀態如AIDS。
文檔編號A61K35/14GK1688324SQ03818321
公開日2005年10月26日 申請日期2003年5月30日 優先權日2002年5月31日
發明者L·張, D·D·何, R·E·卡弗裡, E·A·戴爾馬索, J·梅 申請人:賽弗根生物系統股份有限公司, 亞倫戴蒙愛滋病研究中心