治療免疫介導的神經疾病的方法

2023-05-03 07:06:31

專利名稱：：治療免疫介導的神經疾病的方法
技術領域：
：本申請涉及免疫複合物形成的抑制，並且更具體地涉及通過多肽和其它小分子對免疫複合物形成的抑制。背景當抗原特異性結合於抗體時，促發體液免疫應答。抗體分子與抗原的結合形成小的、相對可溶的免疫複合物。抗原可以是外來物質，諸如病毒或細菌多肽，或者可以是"自身抗原"，諸如通常在人體中發現的多肽。免疫系統通常將外來抗原與自身抗原區別開來。然而，當這一系統破壞時，以致免疫系統攻擊機體並且破壞組織或器官系統，好像它們是外來物質一樣，可以發生"自體免疫"疾病。更大的免疫複合物比小的、更可溶的免疫複合物更有致病性。大的、相對不溶的免疫複合物的形成可以由抗體分子與抗原的相互作用和抗體分子彼此之間的相互作用而導致。這樣的免疫複合物還可以由在不存在抗原時抗體分子之間的相互作用而導致。抗體可以通過包被病毒或細菌來預防感染，但是它們本身是相對無害的。相反，當抗體與抗原結合併且由此導致的免疫複合物結合於機體中某些效應器分子時，可以發生器官特異性組織損害。效應器分子被如此命名是由於它們實現免疫複合物的致病作用。通過抑制大的、不可溶的免疫複合物的形成，或者通過抑制免疫複合物與效應器分子的結合，可以防止免疫複合物的組織損害作用。概述本發明基於這樣的發現具有諸如在SEQIDNOS:2和16中提出的胺基酸序列的多肽可以特異性並且高親和力地結合於免疫球蛋白分子的5CH2-CH3結構域，因此抑制含有抗體和抗原的不溶性免疫複合物的形成，並且防止所述複合物與效應器分子的結合。本發明提供這樣的多肽，以及應用所述多肽和化合物抑制免疫複合物的形成和治療諸如肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)、帕金森病(PD)或阿爾茨海默病(AD)的自體免疫綜合疾病的方法。io—方面，本發明的特徵在於用於抑制受試者中免疫複合物形成的方法。所述方法可以包括給受試者施用含有純化的多肽的組合物，其中所述多肽包括胺基酸序列(Xaai)n-Cys-Ala-XaarHis-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO:35)，其中Xaa,為任意胺基酸，Xaa2為Arg,Trp,5-HTP,Tyr,或Phe,Xaa3為任意胺基酸，和n為0,1，2，3,4,或5。免疫復15合物形成可以與肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)相關。所述多肽可以抑制ALSIgGFc與Fc丫I,FcyIIa,FcyIIb，FcyIIIa,Fqdllb,FcRn,mClq，sClq，野生型SOD1,或突變型S0D1結合。所述方法還可以包括對於ALS的臨床或分子特徵對所述受試者進行監測的步驟。監測可以包括肌電圖或測量CNSMCP-1水平，運動神經元免疫球蛋白介導的鈣增加，神經遞質釋放，20或神經元細胞損傷或細胞死亡。免疫複合物形成可以與帕金森病(PD)相關。所述多肽可以抑制PDIgGFc與Fcyl，FcYlIa,FcyIIb,Fc^IIIa,Fqlllb,FcRn,mClq,sClq，a-突觸核蛋白，或a-突觸核蛋白與微管聚集體的結合。所述方法還可以包括對於PD的臨床或分子特徵對受試者進行監測的步驟。PD的臨床或分子特徵可以是黑質區域中MCP-1的減少或黑質中TH十25細胞的增加的存活。免疫複合物形成可以與阿爾茨海默病(AD)相關。所述多肽可以抑制ADIgGFc與FcyI,FcyIIa,FcyIIb,FcyIIIa,FcyIIIb，FcRn,mClq,sClq,P-澱粉樣肽，tau蛋白，微管，或tau蛋白與微管的聚集體的結合。所述方法還可以包括對於AD的臨床或分子特徵對所述受試者進行監測的步驟。30所述多肽還可以含有末端穩定基團。末端穩定基團可以是在所述多肽的氨基端，並且可以是具有胺基酸序列Xaa-Pro-Pro的三肽，其中Xaa是任何胺基酸(例如，Ala)。末端穩定基團可以是在所述多肽的羧基端，並且可以是具有胺基酸序列Pro-Pro-Xaa的三肽，其中Xaa是任何胺基酸(例如，Ala)。所述多肽還可以包括在所述氮基酸序列氨基端的Asp。5所述多肽可以具有約10-約50個胺基酸的長度。多肽可以具有胺基酸序歹ijAsp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:2)，或胺基酸序列Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val匿Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:16)。在另一個方面，本發明著重描述純化的多肽，其氮基酸序列由(Xaa,)nio-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO:35)組成，其中Xaa!為任何胺基酸，Xaa2為Arg、Trp、5-HTP、Tyr或Phe，Xaa3為任意胺基酸，和n為0,1，2,3,4，或5。本發明還著重描述設計對具有結合的抗原的免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口具有特異的結合親和力的配體的方法。所述方法可以包括isa)為計算機提供數據，所述數據包括在CH2-CH3裂口內的位置252，253，435和436的胺基酸殘基的原子坐標，並且計算機具有能夠從原子坐標數據生成分子的原子模的計算程序；b)使用計算機生成CH2-CH3裂口的原子模型；c)給計算機提供包括候選化合物的原子坐標的數據；d)使用計算機生成最佳地位於CH2-CH3裂口內的候選化合物的原子模型；e)確定20最佳地定位的候選化合物是否與在CH2-CH3裂口內胺基酸殘基相互作用；和f)如果所述候選化合物與所述胺基酸殘基相互作用，鑑定所述候選化合物作為具有針對CH2-CH3裂口的特異性結合親和力的配體。所述配體可以具有針對CH2CH3裂口的至少1^M(例如，至少100nM或至少10nM)的結合親和力。所述配體可以能夠抑制Fc-介導的免疫複合物形成。所述25配體可以能夠抑制FcR與CH2CH3裂口的結合。所述配體可以能夠抑制Clq與所述CH2CH3裂口的結合。所述配體可以能夠治療ALS，、PD、或AD。在另一個方面中，本發明著重描述多肽在製備用於治療ALS,、PD、或AD的藥物中的應用，其中所述多肽包括胺基酸序列30(Xaa,)n-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO:35)，其中Xaa,為任意胺基酸，Xaa2為Arg,Trp，5-HTP,Tyr,或Phe,Xaa3為任意胺基酸，和n為0,1,2,3,4，或5。在另一個方面中，本發明著重描述包含純化的多肽的組合物，所述多肽包括胺基酸序列(Xaa))n-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-5Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO:35)，其中Xaa,為任意胺基酸，Xaa2為Arg,Trp，5-HTP,Tyr,或Phe,Xaa3為任意胺基酸，和n為0,1,2，3，4，或5。除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬的
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的普通技術人員通常所理解的相同的意思。儘管與本文所述的方法io和材料相似或等價的方法和材料可以用來實施本發明，但是下文描述適當的方法和材料。本文提及的所有公布、專利申請、專利和其它參考文獻都通過引用完全結合於此。在衝突的情形中，本說明書，包括定義，將控制。另外，材料、方法和實例只是舉例說明，並不意欲限制。本發明的一個或多個實施方案的詳情在附圖和下文描述中闡述。通過15所述描述和通過權利要求，本發明的其它特徵、目的和優點將更加清楚。詳述本申請提供能夠與免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口相互作用的多肽和其它化合物，以致免疫球蛋白與其它分子(例如，效應器或其它免疫球20蛋白)的相互作用得到阻滯。還提供用於鑑定這樣的多肽和其它化合物的方法，以及含有所述多肽和化合物的組合物和製品。另外，本發明提供應用所述多肽和化合物抑制免疫複合物形成和治療其中IgG免疫複合物與效應器分子結合的疾病的方法，所述效應器分子諸如膜結合的Clq(mClq)，可溶的Clq(sClq)，SODl，tau蛋白，cc-突觸核蛋白和FcyRs25(包括，但不限於FcyRI,FcyRIIa,FcyRIIb,Fc^RIIIa,FcyRIIIb,FcRn和FcyRs的同種型)，其已經表現出是ALS、PD和AD的主要調控子。免疫球蛋白組成在血漿和其它體液中發現的一類蛋白，其表現出抗體30活性並且以高度的特異性與其它分子(例如，抗原和某些細胞表面受體)結合。基於它們的結構和生物活性，免疫球蛋白可以分成5類IgM,IgG,IgA，IgD,和IgE。IgG是機體中最豐富的抗體種類。除了IgMs之外，免疫球蛋白主要由4條肽鏈組成，所述肽鏈通過一些鏈內和鏈間二硫鍵連接。例如，IgGs由2條多肽重鏈(H鏈)和2條多肽輕鏈(L鏈)組成，其通5過二硫鍵和非共價鍵偶聯形成具有扭曲的"Y"型構型和大約160,000道爾頓的分子量的蛋白分子。一般IgG分子含有大約4.5個鏈間二硫鍵和大約12個鏈內二硫鍵(Frangione和Milstein(1968)/Mo/.所o/.f分f主^學染力33:893-906)。免疫球蛋白分子的輕鏈和重鏈由恆定區和可變區組成(參見，例如，ioPadlan(1994)Mo/./mm麗o/.f分f，疫學J31:169-217)。例如，IgGl分子的每一條輕鏈含有可變結構域(VL)和恆定結構域(co。每一條重鏈具有4個結構域氨基端可變結構域(VH)，接著是3個恆定結構域(CHl，CH2，和幾基端Ch3)。鉸鏈區對應在CHl和CH2結構域之間的柔性結合。用木瓜蛋白酶消化完整的IgG分子導致在鉸鏈區的蛋白水解斷裂，並且產生含15有CH2和CH3結構域的Fc片段，和2條相同的Fab片段，其中每一條Fab片段含有CH1、Cl、Vh和Vl結枸域。Fc片段具有補體-和組織-結合活性，而Fab片段具有抗原-結合活性。免疫球蛋白分子可以通過可變區與其它多肽相互作用。大多數的抗原結合，例如，通過Fab片段的V!7VH區發生。由於免疫學教義闡述用於20Fc受體(FcR)的結合位點發現於IgG分子的鉸鏈區(參見，例如，Raghavan禾口Bjorkman(1996)^朋m.Tev.Dev.說o/丫發,生激學祭述年付」12:181-200)，所以還認為鉸鏈區是重要的。然而，更近的證據表明當免疫球蛋白是單體(即，非免疫複合的)時，FcR主要與鉸鏈區相互作用。這樣的相互作用典型地包括Ig分子的位置234-237的胺基酸(Wiens等.(2000)25J/mmw"o/.f免疫學i^D1^:5313-5318)。免疫球蛋白分子還可以通過CH2-CH3結構域內的裂口與其它多肽相互作用。"CH2-CH3裂口"典型地包括CH2結構域內位置251-255的胺基酸和Ch3結構域內位置424-436的胺基酸。如此處所用，編號方式關於完整的IgG分子，如在Kabat等中那樣(SequencesofProteinsof30ImmunologicalInterest(免疫目的蛋白質的序列)，第5版，PublicHealthService(公共衛生月艮務),U.S.DepartmentofHealthandHumanServices(美國健康與人類服務部)，貝塞斯達，麻薩諸塞)。本領域的那些普通技術人員可以容易地確定在其它免疫球蛋白種類中相對應的胺基酸。CH2-CH3裂口是不尋常的，原因在於其特徵在於高度的溶劑可及性和5突出的疏水特徵，這表明暴露的疏水表面的包埋是在這一位點的結合之後的重要驅動力。一旦抗原結合，在lgGCH2-CH3裂口發生三維變化，這允許某些殘基(例如，位置435的組氨酸)變成暴露的並且可用於結合。使用對人IgG的Fc區的構象變化敏感的單克隆抗體，在研究中發現在抗原結合時發生的三維結構變化的直接證據。5個IgG表位通過抗原結合而改io變2個在鉸鏈區之內和3個在CH2-CH3裂口內(Girkontraite等.(1996)Ca"cer歷oAer.7aAo//zflrm.f^"i^生激治;^^Z^"i/洽^911:87-96)。因此，抗原結合對於確定免疫球蛋白是通過鉸鏈區還是FcCH2-CH3區結合於其它分子可以是重要的。Fc區可以結合於許多的效應器分子和其它蛋白，其包括下列各項15(1)j^Sn-新生的Fc受體決定抗體分子在基本循環中的半衰期(Leach等，(1996)J./mm柳o/.f身疫學^^志J157:3317-3322;Gheti和Ward(2000;U朋.iev./mmzmo/.f^資學—祭述年T^18:739-766)。由於自體抗體的縮短的半衰期，遺傳上缺少FcRn的小鼠免於受到致病性自體抗體的有害作用(Liu等.(1997)/E平Medr實驗度,染,^V186:777-783)。FcRn20與IgGFc的唯一結合位點是IgGFcCh2-Ch3裂口，並且已經通過3D結構和丙氨酸掃描表明HIS435對於FcRn與IgGFc結合是重要的(Shields等.(2001)JBC(生物的化學雜誌)276:6591-6604和Martin等，(2001),MolCelK分子細胞學)，7:867-877)。由於本文提供的肽以高親和力與CH2-CH3裂口和HIS435結合，所以所述肽是(免疫複合的)IgGFc與FcRn結合25的直接抑制劑。結合免疫複合物或結合致病性自體抗體的FcRn的抑制劑將用於治療涉及致病性自體抗體和/或免疫複合物的疾病。(2)M-細胞Fc受體提供在體液免疫應答和細胞介導的效應器系統之間的聯繫(Hamano等.(2000)/mmzwo/.f免,學^^吝J164:6113-6119;Coxon等.(2001)/mmwwXy14:693-704;Fossati等.(2001)￡欲J!30C//"./"ve化f欲,/遊^",究雜,^V31:821-831)。Fey受體對IgG分子特異，並且包括FqRI、FcYRIIa、FcyRIIb和FcyRIIL這些同種型以不同的親和力與單體的和免疫複合的IgG結合。(3)Clq-經典補體路徑的第一個成分是C1，其作為3個蛋白，Clq、Clr和Cls的複合體存在於血清中。當Clq結合於抗原結合的IgG或IgM5的Fc區時，激活經典補體路徑。儘管Clq與單個Fc區的結合是微弱的，Clq仍可以形成與Fc區的簇的牢固鍵合。在這一點上CI變得具有蛋白水解活性。通過免疫球蛋白Fc區與其它抗體或其它因子(例如，上文所描述的那些)之間的相互作用的免疫複合物的形成在本文稱為"Fc-介導的免疫復io合物形成(Fc-mediatedinmmunecomplexformation)"或者"免疫複合物的Fc-介導的形成(Fc-mediatedformationofanimmunecomplex)"。含有這樣的相互作用的免疫複合物被稱為"Fc-介導的免疫複合物"。Fc-介導的免疫複合物可以包括帶有或不帶有結合的抗原的免疫球蛋白分子，和典型地包括CH2-CH3裂口-特異性配體，其具有的對於免疫複合的抗體的結15合親和力比對於單體抗體的更高。2,辨儲多嚴如此處所用，"多肽"是胺基酸殘基的任何鏈，不管翻譯後修飾(例如，磷酸化或糖基化)。本文提供的多肽典型地為10-50個胺基酸的長度(例20如，長度為10，11,12,13,14,15,20,25,30,35，40,45或50個胺基酸)。長度為10-20個胺基酸的多肽(例如，長度為10,11,12，13,14,15,16,17,18,19或20個胺基酸)可以是特別有用的。術語"胺基酸"指天然胺基酸、非天然胺基酸和胺基酸類似物，全都以它們的D和L立體異構體形式存在，只要它們的結構允許。天然氨基25酸包括丙氨酸(Ala),精氨酸(Arg)，天冬醯胺(Asn)，天冬氨酸(Asp),半胱氨酸(Cys)，穀氨醯胺(Gln)，穀氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，組氨酸(His)，異亮氨酸(Ile),亮氨酸(Leu),賴氨酸(Lys)，甲硫氨酸(Met),苯丙氨酸(Phe),脯氨酸(Pro)，絲氨酸(Ser),蘇氨酸(Thr),色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr),和纈氨酸(Val)。非天然胺基酸包括，但不限於，鈴蘭氨酸(azetidinecarboxylicacid)、302-氨基己二酸、3-氨基己二酸、(3-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基異丁酸、鎖鏈賴氨素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬醯胺、羥基賴氨酸、別-羥基賴氨酸，3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈賴氨素、別-異亮氨酸、N-甲基甘氨5酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸和六氫吡啶羧酸。"類似物"是一種化學化合物，其彼此結構上相似，但在組成上稍微不同(如在用不同元素的原子替代一個原子上或者在特定官能團的存在上)。因此，"胺基酸類似物"與在天然多肽中典型發現的天然存在的氨基io酸分子結構相似，但是在組成上不同，以致C端羧基、N端氨基、或側鏈官能團已經被化學修飾成另一種官能團。胺基酸類似物包括天然和非天然胺基酸，其在它們的N端氨基或它們的側鏈基團進行可逆或不可逆地化學封閉、或修飾，並且包括，例如，甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸碸、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亞碸和S-傻甲基)-半胱氨酸碸。氨15基酸類似物可以是天然存在的，或可以是合成製備的。胺基酸類似物非限制性的實例包括5-羥色氨酸(5-HTP)，天冬氨酸-((3-甲酯)，天冬氨酸的類似物；N-乙基甘氨酸，甘氨酸的類似物；以及丙氨酸羧醯胺(carboxamide)，丙氨酸的類似物。胺基酸和胺基酸類似物的其它實例在Gross和Meienhofer，ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology(肽分析，合成，20生物學)，AcademicPress,Inc.(學院出版公司)，紐約(1983)中列出。根據多肽主鏈附近的胺基酸殘基側鏈的拓撲化學排列可以描述多肽的立體化學，其通過胺基酸殘基之間的肽鍵和鍵合的殘基的ot-碳原子而定義。另外，多肽主鏈具有不同的末端和這樣的方向。大多數天然存在的胺基酸為L-胺基酸。天然存在的多肽主要包括L-胺基酸。25D-胺基酸是L-胺基酸的對映異構體，並且可以形成本文稱為"反轉(irwerso)"多肽的肽(即，對應天然肽但由D-胺基酸而非L-胺基酸組成的肽)。"反(retro)"多肽由L-胺基酸組成，但是具有其中胺基酸殘基按天然肽序列的反方向組裝的胺基酸序列.天然存在的多肽的"反-反轉(retro-inverso)"修飾包括將具有與對應30的L-胺基酸相反的a-碳立體化學的胺基酸(即，D-或D-別-胺基酸)按照與天然多肽序列相反的順序合成組裝。因此，反-反轉類似物具有反轉的末端和反轉的肽鍵方向，然而其近似地保留了如在天然肽序列中的側鏈的拓撲結構。術語"天然(native)"是指對於製備部分或完全的反、反轉或反-反轉類似物用作起始序列的L-胺基酸的任何序列。5部分反-反轉多肽類似物是其中只有部分序列反轉並且用對映異構胺基酸殘基替代的多肽。由於這樣的類似物的反向反轉部分具有反轉的氨基和羧基末端，側連在反向-反轉部分的胺基酸殘基可以分別用側鏈類似的a-取代的雙-二氨基甲垸和丙二酸替代。備選地，多肽可以為完全的反-反轉類似物，其中全部序列反轉並且用D-胺基酸替代。io本文提供的多肽的胺基酸序列是稍微限定的，但是可以有一些變化。例如，本文所提供的多肽典型地包括胺基酸序列Xaa]-Cys-Ala-Xaa2-His-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Leu-Val-Trp-Cys陽Xaa6(SEQIDNO:l)，其中由Xaan表示的殘基可以表現出可變性。例如，Xaa,可以不存在或可以為任何胺基酸(例如，Arg或Asp)。Xaa2可以為任何胺基酸，15諸如Phe、Tyr、Trp、Arg、5-羥色氨酸(5-HTP)或任何其它的胺基酸衍生物。Xaa3可以為任何胺基酸。Xaa4可以為Gly或Ala，而Xaas可以為Glu或Ala。與Xaa,相同，Xaa6也可以不存在或可以為任何胺基酸。在一些實施方案中，多肽可以包含胺基酸序列Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu隱Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:2)。備20選地，多肽可以包含胺基酸序列Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:3)或Asp-Cys-Ak-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:4)。在一些實施方案中，多肽可以包含胺基酸序列Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:5),25Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:6),或Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:7)。在一些實施方案中，多肽可以包含胺基酸序列Cys-Ala-Xaa-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys(SEQIDNO:8),其中Xaa可以是Phe,Tyr，Trp,Arg,或5-HTP。例如，多肽可以包含下述胺基酸序30列Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:9),Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:10),和Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:11)。為了體內應用，可以通過在氨基端或羧基端添加穩定劑，對本文提供的多肽進行修飾，以促進多肽在體內的存活。這可以用於這樣的情形在5細胞吸收前，肽末端趨向於被蛋白酶降解。這樣的封閉試劑可以包括，但不限於，添加的相關的或不相關的肽序列，其可以附著於多肽的氨基端和/或羧基端殘基上(例如，附著於N-端胺基酸的乙醯基或者附著於C-端胺基酸的醯胺基)。應用本領域的普通技術人員熟悉的方法，可以在多肽合成過程中通過化學方法或者通過重組DNA技術獲得這樣的附著。備選地，io封閉試劑，諸如焦穀氨酸或其它本領域已知的分子，可以附著於氨基端和/或羧基端殘基，或者氨基端的氨基或羧基端的羧基可以用不同的部分替代。在氨基端的脯氨酸或Xaa-Pro-Pro(例如，Ala-Pro-Pro)序列可以是特別有用的(參見，例如，WO00/22112)。例如，多肽可以包含胺基酸序列15Xaa廣Pro-Pro-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu陽Leu-Val-Trp-Cys隱Thr(SEQIDNO:12),其中Xaa,為任何胺基酸(例如，Ala),和Xaa2是Trp,Tyr,Phe,Arg,或5-HTP。因此，例如，多肽可以包含胺基酸序列Xaa,-Pro-Pro-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:13),Xaa廣Pro-Pro-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:14),20或Xaa,-Pro-Pro-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu醫Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:15)。備選地，多肽可以包含胺基酸序列Xaa廣Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:16),Xaa廣Pro-Pro隱Asp-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu畫Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:17)，Xaa廠Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-25Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:18),Xaa廣Pro隱Pro-Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:19),Xaa廣Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu陽Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:20)，或Xaa-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:21)。30本文提供的多肽可以在它們的羧基端具有Pro-Pm-Xaa(例如，Pro-Pro-Ala)序歹ij。例如，多肽可以包含胺基酸序列Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu扁Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO:22),Cys-Ala-Arg匿His-Leu-Gly-Glu陽Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO:23),Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-5Pro-Pro扁Xaa(SEQIDNO:24),Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO:25)，Asp-Cys-Ala-Arg陽His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO:26)，Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO:27),Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-10Pro-Xaa(SEQIDNO:28),Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO:29),或Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu層Val-Trp-Cys腸Thr-Pro-Pro-Xaa(SEQIDNO:30)，其中Xaa可以是任何胺基酸。在一些實施方案中，本文提供的多肽可以包含添加的胺基酸序列，其15在SEQIDNO:l描述的序列的氨基端、SEQIDNO:l描述的序列的羧基端，或兩端。例如，多肽可以包含胺基酸序列Trp-Glu-Ala-XaarCys-Ala-Xaaz-His-XaarXaarXaas-Leu-Val-Trp-Cys-XaarLys-Val-Glu-Glu(SEQIDNO:31),其中Xaan所示的殘基可以表現出可變性。對於SEQIDNO:l描述的胺基酸序列，Xaa,可以不存在或可以為任20何胺基酸(例如，Arg或Asp);Xaa2可以為Phe，Tyr，5-HTP，Trp,或Arg;Xaa3可以為任何胺基酸；Xaa4可以為Gly或Ala;Xaa;可以為Glu或Ala;和Xaa6可以不存在或為任何胺基酸。在一個實施方案中，多肽可以包含胺基酸序歹UTrp-Glu-Ala-Asp-Cys-Ala-Xaa-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Lys-Val-Glu-Glu(SEQIDNO:32),其中Xaa為Arg,Trp,255-HTP,Tyr,或Phe。例如，多肽可以包含胺基酸序列Trp-Glu-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Lys-Val-Glu-Glu(SEQIDNO:33)。在一些實施方案中，多肽可以由胺基酸序列(Xaa0n-Xaa2-Cys-Ala-Xaa3-His-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Leu-Val-Trp-Cys-(Xaa7)n30(SEQIDNO:34)組成，其中Xaa所示的殘基可以表現出可變性，以及n可以是從0到10的整數(例如，0,1，2，3,4,5,6，7,8,9或10)。例如，Xaa,可以為任何胺基酸；Xaa2可以不存在或為任何胺基酸(例如，Arg或Asp);Xaa3可以為Phe,Tyr,Trp,Arg,或5-HTP;Xaa4可以為任何胺基酸；Xa&可以為Gly或Ala;Xaa6可以為Glu或Ala;Xaa7可以為任何胺基酸；以及n5可以從0到5(例如，0,1,2，3,4或5)。備選地，多肽可以由胺基酸序列(Xaa))n-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO:35)組成，其中Xaa,為任何胺基酸，Xaa2為Phe,Tip,Tyr，Arg，或5-HTP,Xaa3為任何胺基酸，以及n是從0到5的整數(例如，0,1,2,3,4或5)。在這些實施方案內的多肽的實例包括，但不限於，由胺基酸序列ioAla-Ala-Ala-Ala-Ala-Asp-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala(SEQIDNO:36),Ala-Ala-Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-AIa-Ala(SEQIDNO:37),或Ala-Ala-Ala-Asp-Cys-Ala-Phe-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Ala-Ala(SEQIDNO:38)組成的多肽。15在SEQIDNOs:1-38中描述的胺基酸序列典型地包含2個半胱氨酸殘基。由於這2個半胱氮酸殘基之間的二硫鍵的形成，含有這些胺基酸序列的多肽可以環化。例如，本領域的普通技術人員可以應用Ellman's試劑(Ellman，sReagent)來確定含有多個半胱氨酸殘基的肽是否環化。在一些實施方案中，這些半胱氨酸殘基可以用可以形成內醯胺鍵而不是二硫鍵的20其它天然或非天然的胺基酸殘基取代。例如，一個半胱氨酸殘基可以用天冬氨酸或穀氨酸取代，而另外一個可以用鳥氨酸或賴氨酸取代。這些組合的任一種都可以產生內醯胺鍵。通過改變形成內醯胺鍵的胺基酸，可以生成本文提供的多肽，其包含與二硫鍵長度近似相等的鍵，如果多肽中存在2個半胱氨酸殘基就可能形成所述二硫鍵。25本文提供的多肽可以包含胺基酸標記。"標記(tag)"通常為短的胺基酸序列，其通過與抗所述標記的抗體的相互作用或者通過識別所述標記的其它化合物或分子而提供檢測或純化的便捷方法。例如，可以應用諸如c-myc、血凝素、多組氨酸或FLAG⑧的標記來輔助多肽的純化和檢測。例如，基於組氨酸殘基對鎳離子的親和力(例如，在Ni-NTA柱上)，可以30純化帶有多組氨酸標記的多肽，並且可以通過抗多組氨酸的抗體(例如，5-組氨酸抗體；快而精公司(Qiagen),Valencia,CA)在蛋白質印跡上檢湖ij。儘管在氨基端或羧基端插入是特別有用的，但是標記可以插入在多肽序列內的任何位置。本發明還提供基於多肽的胺基酸序列基礎設計的擬肽5(peptidomimetic)化合物。擬肽化合物是合成的、非肽化合物，其具有基本上與選擇的肽的三維構象相同的三維構象(即"肽模體，")，並且因此可以賦予與選擇的肽相同或相似的功能。本文提供的擬肽化合物可以設計成模擬本文所述的任何多肽。蛋白酶抗性的擬肽化合物特別有用。並且，擬肽化合物可以具有增加io治療效用的附加特徵，諸如增加的細胞滲透性和延長的生物半衰期。這樣的化合物典型地具有部分或完全是非肽的主鏈，但是具有與在擬肽化合物依據的肽中存在的胺基酸殘基的側鏈基團相同或相似的側鏈基團。一些類型的化學鍵(例如，酯、硫代酸酯、硫代醯胺、逆醯胺、還原羰基、二亞甲基和酮亞甲基)是本領域己知的在擬肽化合物構建中用於肽鍵的有效取15代。本文所述的多肽和免疫球蛋白分子之間的相互作用典型地通過免疫球蛋白的CH2-CH3裂口發生。這樣的相互作用通過物理接近發生，並且例如，通過疏水相互作用調控。多肽對於免疫球蛋白分子的"結合親和力"是指多肽和免疫球蛋白之間相互作用的強度。結合親和力典型地表示為平20衡解離常數(Kd)，其以Kd^koff/k^進行計算，此處k。ff=反應的動力學解離常數，和k。,反應的動力學締合常數。Kd表示為濃度，其低Kd值(例如，低於IOOnM)表示高親和力。可以與免疫球蛋白分子相互作用的多肽典型地具有對於免疫球蛋白的CH2-CH3裂口至少1pM的結合親和力(例如，至少500nM，至少100nM，至少50nM或至少10nM)。25本文提供的多肽可以以基本相等的親和力結合於和抗原結合的免疫球蛋白分子，以及結合於單體免疫球蛋白。備選地，對於與抗原結合的免疫球蛋白分子，多肽可以具有比對於單體免疫球蛋白更高的結合親和力(例如，至少10倍，至少100倍，或至少1000倍更高的結合親和力)。當抗原結合於Fab區時在免疫球蛋白分子的Fc區內發生的構象變化可能30參與親和力的差異。結合和非結合的NC6.8Fab(來自鼠單克隆抗體)的晶體結構表明，與其在非結合的Fab中的位置相比，Fab重鏈尾在抗原/抗體複合物的晶體中移動了19埃(Guddat等.(1994)7Mo/.所o/.f分7生激學^^V236-247-274)。由於在完整的抗體中Fab區的C端尾與Fc區連接，這一移動(shift)預計將影響CH2-CH3裂口的構象。並且，完整免5疫球蛋白的一些三維結構檢驗揭示Fab重鏈和FcCH2-CH3裂口之間的直接的物理聯繫(Harris等.(1997)歷oc/^w^;^C生激眾學J36:1581-1597;Saphire等.(2001)Sc/e"ce(W學9293:1155-1159)。單體(即，不結合的)和免疫複合的IgG的CH2-CH3裂口的分子模型揭示單體的FcCH2-CH3裂口具有封閉的構型(closedconfiguration),其io可以防止與關鍵(critical)胺基酸殘基結合(例如，His435;參見，例如，O'Brien等.(1994)^ra^.所0c/2e附.所o//z".f生激眾學/〃f激激湮學/l案J310:25-31;Jefferies等.(1984)/wmM"o/.f免瘦學遺識J7:191-194;和West等.(2000)所oc/zemW^f生激眾學J39:9698-9708)。然而，免疫複合的(抗原結合的)IgG具有更加開放的構型，並且因此更加利於配體結合。15例如，RF對於免疫複合的IgG的結合親和力比RF對於單體IgG的結合親和力大得多(Corper等.(1997)A^.所o/.f^然翁溝主激學；4:374;Sohi等.(1996)/wm麗o/.^疫學J88:636)。典型地，相同的結果對於本文提供的多肽也是正確的。由於本文提供的多肽可以結合於免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口，它20們可有效用於阻滯其它因子(例如，FcRn、FcR、Clq、組蛋白、MBP、SOD1和其它免疫球蛋白)與免疫球蛋白的Fc區的相互作用，並且因此可以抑制Fc-介導的免疫複合物形成。"抑制"意指當與不存在多肽時免疫複合物形成的水平相比較時，在多肽的存在下，Fc介導的免疫複合物形成減少。這樣的抑制可以在體外(例如，在測試試管中)或在體內(例如，25在個體中)發生。可以應用任何適當的方法評估免疫複合物形成的水平。在本領域內已知許多這樣的方法，並且本文描述了這些方法中的一些。本文提供的多肽典型地以具有1:2的IgGFc與肽的化學計量的單體方式與免疫球蛋白分子的Ch2-Ch3裂口相互作用(即，只與一個免疫球蛋白分子相互作用，並且因此不會將2個或更多的免疫球蛋白分子結合在一30起)。因此，多肽的存在排除了通過Fc區與其它免疫球蛋白分子的相互作用。可以在體外評估Fc-介導的免疫複合物形成的抑制，例如，通過在本文所述的多肽存在和不存在時，將IgG分子與標記的免疫球蛋白分子(例如，螢光或酶(ELISA)標記的Fc受體或Clq)—起溫育，並且測量接合到免疫複合物中的標記的免疫球蛋白的量進行評估。如下文所討論，還5可以應用適於檢測免疫複合物形成的其它方法。丄多it遊煮y備,錄眾本文提供的多肽可以通過許多方法生產，其中的許多方法為本領域所公知。通過實例的方式，但不限於此，多肽可以通過從天然來源中(例如，io從分離的細胞、組織或體液中)提取，通過編碼所述多肽的重組核酸的表達(例如，下文所描述的)，或通過化學合成(例如，通過固相合成或本領域公知的其它方法，包括用ABI肽合成器(應用生物系統(AppliedBiosystems)，FosterCity,CA))合成而獲得。還描述了用於合成反-反轉多肽類似物的方法(Bonelli等.(1984)JP印/cfe6#歪^15質^"充嵐/^雜誌J24:553-556;禾口Verdini和Viscomi(1985)J.C/zem.Soc.屍enb力rrara.r眾學學會-屍eWU"學叛染,吉」1:697-701)，以及用於部分反-反轉肽類似物的固相合成的一些方法(參見，例如，歐洲專利號EP0097994)。本發明提供此處所描述的編碼多肽的分離的核酸分子。如此處所用，20"核酸"是指RNA和DNA，包括cDNA、基因組DNA和合成的(例如，化學合成的)DNA。核酸可以是雙鏈的或單鏈的(即，有義或反義單鏈)。如此處所用涉及核酸的術語"分離的(isolated)"是指天然存在的核酸，其不會直接毗連這樣的2個序列在其衍生的生物體的天然存在的基因組中，其直接與所述序列毗連(1個在5'端和1個在3'端)。由於所述25非天然存在的序列沒有在自然中發現，並且在天然存在的基因組中沒有直接毗連的序列，所以如此處所用涉及核酸的術語"分離的"還包括任何非天然存在的核酸序列。分離的核酸可以是，例如，DNA分子，條件是在天然存在的基因組中通常與DNA分子直接毗連的一條核酸序列被移除或不存在。因此，分30離的核酸包括，但不限於，不依賴其它序列作為獨立的分子存在的DNA分子(例如，化學合成的核酸、或通過PCR或限制性核酸內切酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)，以及整合到載體、自主複製的質粒、病毒(例如，逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒或皰疹病毒)、或整合到原核或真核生物的基因組DNA中的DNA。另外，分離的核酸可以包括工程化5核酸，諸如重組DNA分子，其為雜化物或融合核酸的一部分。例如，存在於在cDNA文庫或基因組文庫、或含有基因組DNA限制性消化物的凝膠切片內的數百到數百萬其它核酸中的核酸不被認為是分離的核酸。本發明還提供含有本文所描述的核酸的載體。如此處所用，"載體(vector)"是一種複製子，諸如質粒、噬菌體、或黏端質粒，其中可以插m入另一種DNA片段，以使所插入的片段得以複製。本文提供的載體優選為表達載體，其中核苷酸編碼帶有起始密碼子甲硫氨酸的多肽，其可操作地連接於表達控制序列。如此處所用，"可操作地連接(operablylinked)"意指組合到遺傳構建體中以便表達控制序列有效地控制目的編碼序列的表達。"表達控制序列"為控制和調節另一種DNA序列的轉錄和翻譯的isDNA序列，以及"表達載體"是包括表達控制序列的載體，以便轉錄和翻譯整合到載體中的相關的DNA片段。當RNA聚合酶將所述編碼序列轉錄成mRNA時，該mRNA然後翻譯成由所述編碼序列編碼的蛋白，所述編碼序列"可操作地連接"並且受到細胞中轉錄和翻譯控制序列的"控制"。20可以應用本領域的技術人員公知的方法將分離的編碼目的多肽的核酸分子亞克隆到表達載體中，所述表達載體包含相關編碼序列和適當的轉錄/翻譯控制信號。參見，例如，Sambrook等.，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)〖第二版),冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory),紐約(1989);禾口Ausubel等.，CurrentProtocolsin25MolecularBiology(分子生物學現代方法),格林出版協會和wiley相互科學(GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience),紐約(1989)。如本文所述，表達載體可以用於各種系統(例如，細菌、酵母菌、昆蟲細胞和哺乳動物細胞)。適宜的表達載體的實例包括，但不限於，質粒和衍生於，例如，皰疹病毒、反轉錄病毒、痘苗病毒、腺病毒以及腺伴隨病毒的30病毒載體。廣泛種類的適宜的表達載體和系統可以商購獲得，包括pET系列的細菌表達載體(Novagen,Madison,WI)、腺-X表達系統(克隆技術(Clontech))、Baculogold杆狀病毒表達系統(BD生物科學Pharmingen，聖地牙哥(SanDiego)，CA)和pCMV-Tag載體(Stratagene，拉霍亞(LaJolla),CA)。5編碼本文所述的多肽的表達載體可以用於生產多肽。可以用於多肽的小量或大量生產的表達系統包括，但不限於，微生物，諸如細菌(例如，大腸桿菌(￡.co/0和枯草芽孢桿菌(及m^/fo)，其轉化了含有本文所述的核酸分子的重組噬菌體DNA、質粒DNA、或黏端質粒DNA表達載體；酵母(例如，釀酒酵母(X"mv/w'm))，其轉化了含有本文所述的核酸分io子的重組酵母表達載體；昆蟲細胞系統，其感染了含有本文所述的核酸分子的重組病毒表達載體(例如，杆狀病毒)；植物細胞系統，其感染了含有本文所述的核酸分子的重組病毒表達載體(例如，菸草花葉病毒)或轉化了含有本文所述的核酸分子的重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)；或哺乳動物細胞系統(例如，原代細胞或無限增殖的細胞系，諸如COS細15胞、CHO細胞、HeLa細胞、HEK293細胞和3T3Ll細胞)，其攜帶含有衍生於哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或衍生於哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒後期啟動子和巨細胞啟動子)，以及本文所述的核酸的重組表達構建體。如此處所用，術語"純化的多肽"是指這樣的多肽其沒有天然存在20的負體(例如，擬肽)，或是化學合成的並且因此不被其它多肽汙染，或者是從其天然伴隨的其它細胞成分中(例如，其它細胞蛋白、多聚核苷酸或細胞成分)分離或純化出來的。典型地，當其為至少70乾重％，沒有與其天然締合的蛋白和天然存在的有機分子時，認為所述多肽是"純化的"。因此，純化的多肽的製劑可以是，例如，至少80乾重％、至少9025乾重％或至少99乾重％的所述多肽。用於純化本文提供的多肽的適合的方法可以包括，例如，親和層析、免疫沉澱法、大小排阻層析以及離子交換層析。可以通過任何適當的方法測量純化的程度，這些方法包括，但不限於柱層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜。4.模擬，設計和鑑別化合物得方法本發明還提供用於設計、模擬和鑑別化合物的方法，其中所述化合物可以結合於免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口，並且因此作用為Fc-介導的免疫複合物形成的抑制劑。此處，這樣的化合物還叫作"配體"。通過本發明提供的方法設計、模擬和鑑別的化合物典型地可以通過CH2-CH3裂口5與免疫球蛋白分子相互作用，並且典型地對於免疫球蛋白的CH2-CH3裂口具有至少lpM的結合親和力(例如，至少500nM，至少100nM，至少50nM，或至少10nM)。對於免疫複合的免疫球蛋白分子，所述化合物通常具有比對於單體免疫球蛋白分子更高的結合親和力(例如，至少10倍，至少100倍，或至少IOOO倍更高的結合親和力)。io本發明提供的化合物典型地以單體方式與免疫球蛋白分子的Ch2-Ch3裂口相互作用(即，只與一個免疫球蛋白分子相互作用，並且因此不會將兩個或更多的免疫球蛋白分子結合在一起)。化合物分子和免疫球蛋白分子之間的相互作用典型地包括免疫球蛋白的位置252、253、435和436的胺基酸殘基(按照Kabat編號，如前所述)。本發明所述的化合15物和CH2-CH3裂口之間的相互作用使得所述化合物能夠通過阻滯其它因子(例如，FcRs、FcRn、組蛋白、MBP、RF、tau蛋白、a-突觸核蛋白、S0D1和Clq)與CH2-CH3裂口的結合而抑制Fc-介導的免疫複合物的形成。通過本發明提供的方法鑑別的化合物可以是多肽，諸如，例如，本文20所描述的那些。備選地，化合物可以是能夠特異性結合於免疫球蛋白分子CH2-CH3裂口的任何適宜類型的分子。"模擬(modeling)"意指基於三維結構信息和受體-配體相互作用模型對受體-配體結構/功能進行的定量和/或定性的分析。這包括常規的基於數字的分子動力學和能量最小化模型、交互式計算機立體圖、修飾的分子25力學模型、距離幾何學和其它基於結構的限制模型。模擬典型地使用計算機進行，並且可以使用己知方法進一步最優化。設計與已經結合抗原的免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口特異性結合(即，以高親和力)的配體的方法典型地是基於計算機的，並且包括使用具有能夠產生原子模型的程序的計算機。對於設計可以與FcCh2-Ch3裂30口相互作用的配體，應用X-射線結晶學數據的電腦程式是特別有用的。例如，諸如RasMol的程序可以用於產生CH2-CH3裂口的三維模型和/或確定參與配體結合的結構。諸如INSIGHT(Accelrys,伯靈頓(Burlington),麻薩諸塞)，GRASP(AnthonyNicholls,哥倫比亞大學)，Dock(分子設計研究所(MolecularDesignInstitute),加利福尼亞舊金山大學(Universityof5CaliforniaatSanFrancisco)),和Auto-Dock(Accelrys)的電腦程式允許進一步的處理和弓I入新結構的能力。方法可以包括，例如，給計算機提供位於Fc-介導的免疫複合物中免疫球蛋白分子CH2-CH3裂口內的胺基酸殘基(例如，在裂口的位置252,253,435和436的胺基酸殘基)的原子結構坐標，使用計算機來產生CH2-CH3io裂口的原子模型，進一步提供候選化合物的原子結構坐標，並且生成最優化位於Ch2-Ch3裂口內的化合物的原子模型，並且，如果所述化合物與裂口位置252,253,435和436的胺基酸殘基相互作用，那麼鑑定所述候選化合物為目的配體。提供給計算機的數據還可以包括除了在位置252,253,435和436之外的位置的胺基酸殘基的原子坐標。"最優化位於(optimally]5positioned)"意指進行放置以最優化候選化合物和CH2-CH3裂口的位置252,253,435和436的胺基酸殘基之間的疏水性相互作用。備選地，用於設計具有對於免疫球蛋白分子CH2-CH3裂口的特異結合親和力的配體的方法可以利用在其內存中存儲裂口的原子模型的計算機。然後，可以將候選化合物的原子坐標提供給計算機，並且可以生成最優化20放置的候選化合物的原子模型。如本文所描述，例如，如果所述化合物與裂口位置252,253,435和436的胺基酸殘基相互作用，那麼可以鑑定所述候選化合物為具有對於免疫球蛋白分子CH2-CH3裂口的特異結合親和力的配體。單體(非抗原結合的)IgGFc在不同於IgGFcCH2-CH3裂口的位點結合，諸如在更低的鉸鏈區結合(Wines等，2000,164:5313-5318)，而25免疫複合的(抗原結合的)IgGFc與Fqdla的結合被IgM類風溼因子(RF-AN)抑制，3D結構己經表明其只與IgGFcCH2-CH3界面裂口結合(Sohi等，(1996)，Immunology(免疫學),88:636-641和Corper等，(1997),NatureStructuralBiology(自然結構生物學)，4(5):374-381)。可溶的FcYlIa抑制免疫複合的(而不是單體的、非免疫複合的)IgGFc與RF-AN的結合30(Wines等，(2003),Immunology(免疫學)，109:246-254)，然後結合IgGFcCh2-Ch3裂口的抑制剤，諸如本文所述的肽，抑制免疫複合的(抗原結合的)IgGFc與Fc,s的結合。還可以應用其它基於結構的設計/模擬技術(參見，例如，Jackson(1997)^而'"flraOco/ogyC^^學,Z/會J24:L164-172;和Jones等.(1996)MedC/2em.(醫學生物化學雜誌)39:904-917)，從本文所述的化合物的結構信息交互式地設計本發明提供的化合物。化合物和多肽還可以通過，例如，通過計算機模擬將候選化合物特徵性描述為在空間上並優選地適配(即，具有高親和力)免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口，然後在體外或體內篩選那些具有抑制Fc-介導的免疫複合io物形成的能力的化合物而進行鑑定。用於所述體外和體內篩選的適用的方法包括本文所描述的那些。5.蘊合激浙劍^本發明提供用於治療由異常Fc-介導的免疫複合物形成(例如，Fc-介導的免疫複合物過量生產)引起的疾病的方法。在這些方法中，將本發明所述的多肽和化合物施用給受試者(例如，人或其它哺乳動物)，所述受試者患有可以通過調節Fc-介導的免疫複合物形成而減輕的疾病或病症(例如，ALS,PD,或AD)，並且本發明所述的多肽和化合物可以抑制免疫複合的IgGFc與，例如，mClq，sClq,Fc丫Rs,組蛋白，MBP,tau蛋白，a-突觸核蛋白，S0D1和FcRn的結合。典型地，可以給懷疑患有、診斷患有或有危險患有與免疫複合物形成相關的疾病或病況的受試者施用一種或多種多肽或者化合物。組合物可以包含一種或多種本文所述的多肽和化合物。例如，CH2-CH3結合多肽可以組合藥用載體或稀釋劑，並且可以按量和時間周期施用，所述的量和時間周期將取決於具體疾病的性質、其嚴重度和受試者的總體情況而變化。典型地，所述多肽以抑制量(即，以有效抑制多肽接觸的細胞或組織中免疫複合物的產生的量)施用。本發明所述的多肽和方法還可以預防性地應用，例如，將處於免疫複合物異常或超量生產的危險中的受試者(例如，移植物受者)中的免疫反應性減小到最低。多肽抑制Fc-介導的免疫複合物形成的能力可以通過，例如，在治療之前和之後測量受試者中免疫複合物的水平進行評估。許多方法可以用於測量組織或生物樣品中免疫複合物水平，其包括本領域公知的那些方法。例如，如果受試者是研究動物，那麼可以通過在安樂處死後免疫染色而評估關節處的免疫複合物水平。還可以通過直接方法，諸如測量血清樣品中的循環免疫複合物的水平，來評估抑制性多肽的效用。備選地，可以應用5間接方法來評估多肽在活的受試者中的效用。例如，可以從免疫介導的神經變性疾病或者ALS、PD或AD的體外或體內模型的臨床改善而推斷減少的免疫複合物形成。用於配製和後續施用治療組合物的方法是為本領域的技術人員公知的。劑量定量通常取決於要治療的疾病狀態的嚴重度和反應性，治療的療10程持續幾天到幾個月，或者持續到實現治癒或獲得疾病狀態的減輕。本領域的普通技術人員常規確定最適劑量、定量方法和重複率。最適劑量可以取決於個體多肽的相對強度(potency)而變化，並且通常可以基於在體外和體內動物模型中發現有效的EC50進行估算。典型地，劑量為每kg體重O.Ol嗎-100g，並且可以給藥每天1次或多次、每兩周1次、每周115次、每月1次或甚至更不經常給藥。成功治療後，可以理想地讓患者經受維持治療，以防止所述疾病狀態的復發。本發明提供包含本發明所述的多肽和/或化合物的藥用組合物和制齊U。本發明還提供將本發明所述的多肽用於製備減少免疫複合物形成(例如，與ALS、PD或AD相關的免疫複合物形成)的藥物的方法。本發明20提供的多肽可以與其它分子，分子結構，或化合物的混合物，諸如，例如，脂質體、聚乙二醇、受體靶向的分子、或者口服、直腸、局部或其它製劑，進行混合、包封、綴合或另外締合，用於輔助攝入、分布和/或吸收。"藥用載體"(本文也叫作"賦形劑")是用於運送一種或多種治療化合物(例如，CH2-CH3結合多肽)到受試者的藥用溶劑、混懸劑或任何其25它藥用惰性賦形劑。藥用載體可以是液體或固體，並且，當其與一種或多種治療化合物和給出的藥用組合物的任何其它成分組合時，可以考慮計劃的施用方式而進行選擇，以便提供需要的大小、稠度和其它相關的轉運和化學特性。不與胺基酸有有害反應的典型的藥用載體包括，通過實例方式，但不限於水；鹽溶液；粘合劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖30維素)；填料(例如，乳糖和其它糖，明膠，或硫酸鈣)；滑潤劑(例如，澱粉，聚乙二醇或乙酸鈉)；崩解劑(例如，澱粉或澱粉羥乙酸鈉)；以及溼潤劑(例如，月桂硫酸鈉)。本發明提供的藥物組合物可以通過許多方法施用，其取決於需要的是局部還是全身性的治療，以及要治療的面積。例如，施用可以是局部的(例5如，透皮的、舌下的、眼的、或鼻內的)；肺部的(例如，通過散劑或氣霧劑的吸入或吹入)；口服的；或腸胃外的(例如，通過皮下、鞘內、心室內、肌內、或腹膜內注射，或者通過靜脈內點滴)。施用可以是快速的(例如，通過注射)或者可以在一段時間內發生(例如，通過緩慢輸注或施用緩釋製劑)。對於治療中樞神經系統內的組織，可以通過注射或輸注10將CH2-CH3結合多肽施用到腦脊髓液中，優選地和一種或多種能夠促進所述多肽穿過血腦屏障滲透的藥劑一起施用。用於Ch2-Ch3結合多肽局部施用的製劑包括，例如，無菌的和未滅菌的水性溶液，在諸如醇類的常規溶劑中的非水性溶液，或者在液態或固態油基質(oilbases)中的溶液。這樣的溶液還可以含有緩衝劑、稀釋劑以15及其它適宜的添加劑。用於局部施用的藥用組合物和製劑可以包括透皮貼片(transdermalpatches)、油膏、洗液、膏劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧齊U、液體和散劑。鼻部噴霧劑特別有用，並且可以通過，例如，噴霧器或其它鼻部噴霧裝置進行施用。通過吸入器的施用也是特別有用的。常規藥用載體、水、散劑或油基質、增稠劑等可以是必需的或是需要的。20用於口服施用的組合物和製劑包括，例如，散劑或顆粒劑、或者在水或非水性介質中的混懸液或溶液、膠囊、香囊或片劑。這樣的組合物還可以結合增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散輔劑或結合劑。用於腸胃外、鞘內或心室內施用的組合物和製劑可以包括無菌的水溶液，其還可以含有緩衝劑、稀釋劑和其它適當的添加劑(例如，滲透增強25齊U、載體化合物和其它藥用載體)。藥物組合物可以包括，但不限於，溶液、乳狀液、水性混懸液和含脂質體製劑。這些組合物可以從各種成分產生，其中所述成分包括，例如，預製的液體、自身乳化固體和自身乳化半固體。乳狀液通常為兩相系統，其包括密切混合併且分散在彼此之中的兩個不相溶的液相；通常，乳狀液30是油包7乂(water-in-oil，(w/o))或zK包油(oil-in-water,(o/w))禾中類。由於其配製的容易度和溶解、吸收以及生物利用度的功效，乳狀液製劑己經廣泛地用於口服遞送治療劑。脂質體是具有由親脂性材料形成的膜的和可以包含要遞送的組合物的水性內核的囊泡。由於其從藥物遞送的觀點上提供的特異性和作用的持5續性，脂質體可以是特別有用的。脂質體組合物可以由，例如，磷脂醯膽鹼，二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼，二肉豆蔻醯磷脂醯甘油，或二油醯基磷脂醯乙醯胺形成。許多親脂性試劑可以商購獲得，包括LIPOFECTIN(體外基因(Invitrogen)/生命技術，Carlsbad,CA)和EFFECTENE(快而精公司(Qiagen)，Valencia,CA)。io本發明提供的多肽還包含任何藥用鹽、酯或者所述酯的鹽、或任何其它化合物，所述化合物在施用給包括人在內的動物時，能夠提供(直接地或間接地)生物活性代謝物或其殘基。因此，例如，本發明提供多肽的藥用鹽、藥物前體(prodrug)以及所述藥物前體的藥用鹽、和其它生物等價物。術語"藥物前體"是指一種治療藥劑，其以無活性形式製備，並且15通過內生酶或其它化學劑和/或條件的作用在機體或其細胞內轉化成活性形式(即，藥物)。術語"藥用鹽"是指本發明所述的多肽在生理學上和製藥學上可用的鹽(即，保留母體多肽(parentpolypeptide)的需要的生物活性而沒有給予不理想的毒性作用的鹽)。藥用鹽的實例包括，但不限於，與陽離子(例如，鈉、鉀、鈣或多胺，諸如精胺)形成的鹽；與無機20酸(例如，鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或硝酸)形成的酸式加成鹽；以及與有機酸(例如，乙酸、擰檬酸、草酸、棕櫚酸或延胡索酸)形成的鹽。含有本發明所述的多肽的藥用組合物還可以結合促進多肽向動物皮膚有效運送的滲透增強劑。滲透增強劑可以增強親脂性和非親脂性藥物穿過細胞膜的擴散。滲透增強劑可以分類為屬於五大類中的一種，即，表面25活性劑(例如，月桂硫酸鈉、聚氧化乙烯-9-十二烷基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚)；脂肪酸(例如，油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸)；膽酸鹽(例如，膽酸、脫氫膽酸和脫氧膽酸)；螯合劑(例如，乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸和水楊酸鹽)；以及非螯合非表面活性劑(例如，不飽和環狀脲)。備選地，抑制性多肽可以通過離子電滲療法運送，其包括帶有電荷30的透皮貼片以"驅動"多肽通過真皮。在一些實施方案中，藥物組合物可以包含(a)—種或多種多肽，和(b)一種或多種通過不同機製作用的其它試劑。例如，在本發明提供的組合物中可以包含消炎藥物，其包括但不限於非類固醇消炎藥物和皮質甾類，以及抗病毒藥物，其包括但不限於利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛5韋和更昔洛韋。其它非多肽試劑(例如，化學治療藥劑)也在本發明提供的組合物的範圍內。所述組合的化合物可以一同或先後使用。組合物另外可以包含常規在藥物組合物中發現的其它輔助成分。因此，所述組合物還可以包括相容的、藥用活性材料，諸如例如，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎藥物、或者用於在物理配製本發明提供的組合io物的不同劑量形式的添加材料，諸如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩定劑。並且，所述組合物可以與輔劑混合，例如，滑潤劑、防腐劑、穩定劑、溼潤劑、乳化劑、用於影響滲透壓的鹽、緩衝劑、染料、調味劑以及芳香物質。然而，當添加時，這樣的材料不應該不適當地妨礙本發明提供的組合物內的多肽成分的生物活性。如果需要，可以將15所述製劑滅菌。可以按照製藥工業中公知的常規技術製備藥用製劑，其可以便利地以單位劑型存在。所述技術可以包括使活性組分(例如，本發明提供的CH2-CH3結合多肽)與需要的藥用載體或賦形劑締合的步驟。典型地，所述製劑可以通過這樣的方式製備均一地並且使活性組分與液態載體或細20碎的固體載體或者兩者緊密締合，然後，如果必要，將產品定型。如果需要，可以將製劑滅菌，條件是滅菌方法不妨礙製劑中包含的多肽的效力。本發明提供的組合物可以配製成許多可能的劑型中的任何一種，諸如，但不限於，片劑、膠囊、液態糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。所述組合物還可以配製成在水性、非水性或混合介質中的混懸液。水性混懸液還25可以包含增加所述混懸液黏度的物質，其包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。混懸液還可以包含穩定劑。本發明提供的CH2-CH3結合多肽可以與包裝材料組合，並且作為用於減少Fc-介導的免疫複合物形成的試劑盒出售。用於生產製品的成分和方法是公知的。製品可以與前述部分描述的一種或多種多肽和化合物組合。30另外，製品還可以包括，例如，緩衝劑或其它用於減少或監測減少的免疫複合物形成的控制試劑。描述所述多肽怎樣有效用於減少Fc-介導的免疫複合物形成的用法說明可以包含在這樣的試劑盒中。6.應^CC^3茲合多嚴來辨劍Fc-分導遊免疫複合激形成遊方法5CH2-CH3結合多肽可以用於Fc-介導的免疫複合物形成的體外測定。例如，所述方法有效用於評估CH2-CH3裂口-結合多肽阻滯Fc-介導的免疫複合物形成的能力。體外方法可以包括，例如，在本發明提供的多肽存在和不存在的情況下，將免疫球蛋白分子(例如，抗原結合的免疫球蛋白分子)和效應器分子(例如，mClq,sClq，FcR，FcRn，或其它抗體)接觸，io並且確定每種樣品中免疫複合物形成的水平。免疫複合物形成的水平可以通過，例如，用考馬斯亮藍或銀染的聚丙烯醯胺凝膠電泳，或者通過共免疫沉澱進行評估。這樣的方法包括本領域的普通技術人員公知的那些。本文提供的方法還可用來抑制受試者中的免疫複合物形成，和通過抑制體內Fc-介導的免疫複合物形成來治療受試者中的自體免疫疾病。這樣的方法15可包括，例如，給受試者施用任何本文提供的多肽，或含有任何本文提供的多肽的組合物。例如，一種方法可包括給個體施用含有包括胺基酸序列Cys-Ala-Trp陽His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:10)的多肽的組合物。備選地，一種方法可包括給受試者施用包含下列胺基酸序列的多肽Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu隱Val-Trp-Cys-Thr(SEQID20NO:2)，或Ala-Pro-Pro-Asp-Cys陽Ala隱Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:16)。本發明提供的方法可用於治療患有，例如，PD、ALS或AD的受試者。此處描述這些病況和Fc-介導的免疫複合物形成的涉及。所有這些神經變性疾病特徵在於，胞內蛋白質/包涵體的聚集，異常的微管和活化的25小膠質細胞(CNS巨噬細胞)，其通常在選擇性神經元丟失發作和每種這些疾病臨床症狀的發作之前。ALS特徵在於，免疫複合的IgGFc與叫作超氧化物歧化酶-l(SODl)的酶的結合，細胞蛋白質的聚集，異常的微管，小膠質細胞的活化，和最終運動神經元的死亡。PD特徵在於，免疫複合的IgGFc與a-突觸核蛋白的結合，細胞蛋白質的聚集，異常的微管，小30膠質細胞的活化，和最終SNTH+細胞的死亡。AD特徵在於，免疫複合的lgGFc與tau蛋白/微管的結合，異常的微管形成凍集，小膠質細胞的活化，和膽鹼能皮質神經元的選擇性死亡。參見，例如，Henkel等(2004)臉謡/.f辨經學年，55:221-235;Morrison等(2000)E平G^邀/廬經學J165:207-220;Orr等(2005)Brain(大腦)128:2665-2674;禾口5Bouras等(2005)5ra,'"/仏Sra/"W"Aev.Ot^^f^^〃;t,^^l^祭述J48:477-487。這表明，儘管特異的神經元受到影響，並且不同的蛋白質參與這三種疾病，但是基本的神經免疫病理可能是相似的(Couillard等(1998)Ato/.JcW.S".t/Wf夷房嵐,辨,/^,叛J95:9626-9630;和Trojanowski等(1993)Bra/"P^/zo/.Ot^盧i^謬學J3:45-54)。io方法還可包括鑑定需要所述治療的受試者和/或監測受治療的個體在症狀或免疫複合物形成水平中的減少的步驟。例如，ALS可以通過測量CNS中的MCP-1水平，通過肌電圖，或者通過用於測量診斷患有ALS的個體的進展或減少的任何其它的客觀或主觀檢測(例如，通過神經學家或其他醫生評估)而進行監測。15裕:會^^-PD的臨床症狀由在叫作黑質(SN)的大腦部分中的多巴胺能神經元的死亡引起。過度應答的免疫系統可能在延長PD存在中起作用，其通過生成細胞因子(例如，白介素-l和腫瘤壞死因子)應答初始損傷，其可以進一步損傷大腦中的細胞。已經表明來自PD個體的免疫球蛋白對SN細胞的發病機理有貢獻(Chen等(1998)^r/2.iVewra/.0￥經學/-20案"5:1075-1080)。由於敲除FcyRs可以防止小鼠小膠質細胞活化和多巴胺細胞死亡(He等(2002)五A:p.WeMra/.f實驗摔經學J176:322-327;和Le等(2001)/.A^wmy"'.0^經搏學^^吉J21:8447-8455)，所以在由人PDIgG的被動轉運誘導的PD小鼠模型中FcYRs似乎是重要的。體液(抗體)介導的免疫性己經涉及PD的免疫發病機理。活化的小膠質細胞在遺傳的和25自發性(偶發性)PD中都表達激活的FcyR，與通過神經元IgG、支配性IgGl激活小膠質細胞FcYR—致(Orr等，如前所述)。此外，由於a-突觸核蛋白聚集物的積聚，其引起微管病理學，在患有PD的受試者中SN細胞選擇性地死亡。a-突觸核蛋白與SN-特異的IgGl共局部化(colocalize)，這表明a-突觸核蛋白可以與免疫複合的IgG相互作用。30觀#"一銀絲勞#盧:賽^眾-ALS是具有上部和下部運動神經元(MN)變性的破壞性疾病，由於呼吸衰竭其最終在1到5年內導致死亡。來自ALS患者的IgG免疫複合物可以在小鼠中誘導ALS樣的損傷。IgGFqRs似乎在ALS的免疫發病機理中是重要的(Mohamed等(2002)JA^"ra"人0￥經辨學^^^^孟^69:110-116;禾口Engelhardt等(2005)爿ctaA^wra/.5S園d112:126-133;和Zhao等(2003)臉wr—五平臉wra/.(7廬經^^遵^^7^r邀/廬經學^^^V63:964-977)。不到10%的ALS病例具有家族性(遺傳的)"fALS"基礎。大約2%的全部人類ALS病例是由於在編碼S0D1的基因中的多於一百個的已知突變引起的(Alexianu等(2001)A^wra/.0^經學957:1282-1289)。轉基因人類SOD1突變諸如SODlG93Aio的小鼠，表現出與在同人ALS臨床和組織病理發展一致的運動神經元(MN)丟失和臨床跡象發作之前出現的增加的IgG、FcYR和活化的小膠質細胞的免疫反應性。超過90%的全部ALS病例具有偶發性"sALS"基礎，沒有已知的遺傳基礎或任何關於SOD1或微管的己知的突變(Valentine等(2005)Ann.Rev.Biochem.(生物化學綜述年刊)74:563-593;禾BGarcia等(2006)15Neurobiol.Dis.(神經生物學發現)21:102-109)。已經在fALS和sALS的脊髓中發現樹突細胞、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-l)和活化的小膠質細胞/巨噬細胞(Henkel等，如前所述)。免疫複合的IgG(而不是單體的、非免疫複合的IgG，或lgG的F(ab')2片段)通過結合併且激活免疫複合的IgGFcYR而使MCP-1mRNA的表達增加10倍20(Hora等(1992)7Va".Jcad>SW.t/Wf夷嵐凰^"闢學腐學叛)89:1745-1749)，表明在fALS和sALS病例中，免疫複合的IgG通過Fc怵(最可能在周圍的小膠質細胞上)而激活MCP-1。斧7汆茨獰ff癆-傳統的科學觀點認為，由於大腦通過血腦屏障(BBB)而排斥IgG，所以免疫球蛋白，包括IgG，不能到達大腦。然而，25患有炎性神經疾病或作為正常大腦衰老的結果，IgG可以穿過有功能障礙的BBB而進入大腦。IgGFc可以激活小膠質細胞，其已經通過細胞FcyRs(例如，FcyRI和FcyRIII)參與AD的免疫發病機理。免疫細胞化學實驗已經表明FcYRI存在於在衰老的大腦中是IgG-免疫反應性的相同的錐形神經元中，表明這些受體在IgGFc神經元內部滲透中的作用。已經表明神30經元內部的IgGFc結合tau蛋白。由於已經表明tau蛋白在微管的正確聚合中是重要的，所以IgGFc(而不是IgGFab片段)與tau蛋白和與微管本身的結合可以引起微管的異常聚合。因此，IgGFc神經元內部滲透可能參與皮層神經元的易受攻擊的子集中的神經變性的早期階段(Reiderer等(2003)A^wraiepoWG^經學/《告J14:117-121;Bouras等，如前所述；和5Engelhardt等(2000)爿rc/z.iVewra/.G^經學教案J57:681-686)。FcyR在AD免疫病理學中的作用可以在AD老年斑中的FwR+小膠質細胞的活化中發現(Peress等1993/A^wraz'/W7ww/.O^^1,^^^^^^^48:71-79)。將在下述實施例中進一步描述本發明，所述實施例不限制在權利要求中描述的本發明的範圍。10實施例實施例1-用於測量結合於Ch2-C^3裂口的配體的體外測定法包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)和雙免疫擴散技術的體外測定用來證明本發明提供的多肽和化合物對免疫複合的IgGFc與因子如FcRs、FcRn、15Clq、a-突觸核蛋白、S0D1、禾口tau蛋白的結合的競爭性抑制。在標準ELISA中，抗原被免疫吸附到塑料微孔上。在封閉和洗滌後，將具有針對所述抗原的特異性的一級抗體加入到微孔中。再一次洗滌階段之後，將針對所述一級抗體並且與酶標記諸如辣根過氧化物酶(HRP)綴合的二級抗體加入到所述微孔中。再一次洗滌循環之後，加入適當的酶底物。20如果形成抗原/一級抗體/二級抗體/HRP綴合物，那麼所綴合的酶催化與底物的比色化學反應，其在微量板讀數儀或分光光度計上讀取。通過將抗原和二級抗體/HRP綴合物的水平標準化，確定一級抗體的滴度(變量)。在標準ELISA系統中，一級抗體通過其位於Fab臂的互補決定區(CDR)與抗原結合。同樣地，二級抗體/HRP綴合物通過其CDRFab區與一級抗25體結合。由於HRP綴合到二級抗體的Fc區，所以直接的Fc結合非常有限或者被消除了。由於這一原因，應用"反式ELISA"技術來評估Fc區與結合於免疫複合的IgGFc的配體的結合。在這些測定中，所述酶(HRP)沒有共價綴合到二級抗體的Fc部分。相反地，應用預製的過氧化物酶-兔(或小鼠)30抗-過氧化物酶IgG的免疫複合物("PAP"複合物)。因此，HRP作為抗原和酶標記，但是不封閉Fc區。在反式ELISA系統中，FcCh2-Ch3裂口結合配體(例如，純化的人Clq)結合於微孔板上。在不存在競爭劑時，PAP複合物與固定的配體結合，並且HRP和其底物之間的反應產生信號。抑制PAP與固定的配體結合的多肽和化合物，如本發明提供的那些，減5少這種信號。實施例2-Clq結合的抑制通過將2pi兔抗-過氧化物酶(西格瑪化學(SigmaChemicals),St.LouisMO)與50(il過氧化物酶(西格瑪-奧德裡奇(SigmaAldrich),St.Louis,MO)io在1ml蒸餾水中混合而形成PAP複合物。將PAP(100Jul)與100fil肽或人Clq(快得標(Quidel)公司，SanDiego，CA)預溫育1小時。然後將Clq/PAP和肽/PAP混合物(100pi)用Clq包被的板溫育30分鐘。在洗滌之後，將板用2-2'-連氮雙-3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸(ATBS;快得標(Quidel)公司)溫育15分鐘，並且在405nm讀數。結果在表1中顯示。15表1肽SEQIDNO:OD405謂DCAWHLGELVWCT2l.層APPCARHLGELVWCT140.567DCAFHLGELVWCT0.859APPDCAWHEGELVWCT160.389APPCAFHLGELVWCT150.983APPCAWHLGELVWCT131.148Clq(陰性對照)-0.337陽性對照-2.355APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:16)導致最大的Clq結合的抑制，幾乎等於ciq自身。肽APPCARHLGELVWCT(SEQIDNO:14)給出次好的結果。實施例3-FcR結合的抑制一旦應用Clq測定法建立起反式ELISA方法，就應用Fqdla、FcyIIb和Fcylll替代Clq重新設計測定法。將高度純化的Fc^IIa、Fcyllb和Fcylll免疫吸附到塑料微孔上。在將FcyR反式ELISA系統最優化之後，應用本發明所述的多肽進行競爭性抑制實驗，以研究它們對於免疫複合物與純化5的FqR結合的抑制能力。將Falcon微量滴定板用高度純化的FcyIIa、Fqdlb和Fcylll的1:10稀釋液包被，並且溫育24小時。洗滌板，然後用5XBSA封閉溶液(阿爾法診斷國際公司(AlphaDiagnosticInternational),SanAntonio,德克薩斯)封閉24小時。PAP免疫複合物按照實施例2所述形成。將PAP(100^1)io與100^的肽預先溫育1小時。將PAP/肽混合物加入到FcYR包被的板中，並且溫育1小時。洗滌後，將板與ABTS底物溫育15分鐘，並且在405nm讀數。結果在表2中顯示。表2tableseeoriginaldocumentpage3515肽APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:16)導致最大的FcR與PAP結合的抑制，其次是肽DCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:2)。實施例4-免疫複合的IgG與野生型(wf)和突變型SOD1的結合的抑制PAP複合物按照實施例2所述形成。將PAP(100與100|_U肽預20溫育1小時，並且對照(200PAP)也溫育1小時。將100|ilPAP或PAP/肽加入到Falcon微量滴定板上，所述板已經用0.8嗎/ml人wtSODl(西格瑪-奧德裡奇(Sigma-Aldrich))或apo(不含Cu、Zn)單體突變型SOD1C57S(mSODlC57S)包被24小時。1小時後將PAP或肽/PAP混合物(100pl)加入到wtSODl或mSODlC57S包被的板中60分鐘。洗滌後，將板用ATBS溫育15分鐘，並且在405nm讀數。結果顯示在表3中。表3tableseeoriginaldocumentpage36肽APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:16)導致最大的wtSOD1或mSODlC57S與PAP結合的抑制，其次是肽DCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:2)。由於SOD1在特定條件下可以利用過氧化氫和ABTS作為底物(Elamio等(2003)/歷o/.Oze附.r^^^遊化學J^吉J278:21032-21039;禾QYim等(1993)J.所o/.C/zem.f生激遊眾學染,^)268:4099-4105)，將0.05mg/mlwtSOD1或0.050mg/ml過氧化物酶(西格瑪-奧德裡奇(Sigma-Aldrich))加入到用於上述所述的SOD免疫複合物結合測定的ABTS底物中。在溫育5分鐘之後將板在405nm讀數。結果在表4中顯示。表4tableseeoriginaldocumentpage36綜合來看，這些數據表明，免疫複合的IgFc與wtSODl和mSODlC57S的結合受到肽2和16的抑制，其中肽16給出最好的抑制。由於肽2和2016隻與IgGFcCH2-CH3裂口結合，所以它在免疫複合的IgGFcCH2-CH3裂口與wtSODl和mSODlS57S結合之後。如在表4中所示，100X的wtSOD對在表3總結的實驗中實施例5-免疫複合的IgG與野生型CC-突觸核蛋白的結合的抑制通過將2pi兔抗-過氧化物酶(西格瑪)與50^tl過氧化物酶(西格瑪)在1ml蒸餾水中混合而形成PAP複合物。將PAP(100pl)與100|^1肽預溫育1小時。對照PAP(200pl)也溫育1小時。將100|ulPAP或PAP/肽加入到Falcon微量滴定板中，所述板己經用167嗎/ml的人wta-突觸核蛋白(西格瑪-奧德裡奇)包被24或48小時，並且將板溫育60分鐘。洗滌後，將板用ATBS溫育30分鐘，然後在405nm讀數。結果顯示在表5中。表5肽SEQIDNO:wtot-突觸核蛋白DCAWHLGELVWCT(24小時)20.111APPDCAWHLGELVWCT(24小時)160.088陽性對照-1.433隻有ABTS底物0.061DCAWHLGELVWCT(48小時)20,152APPDCAWHLGELVWCT(48小時)160.136(x-突觸核蛋白陽性對照(48小時)-2.934肽APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:16)導致最大的a-突觸核蛋白與PAP結合的抑制，其次是肽DCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:2)。實施例6-在體外系統中抑制ALS抗體15為了確定用本發明所述的抑制劑阻滯FcRs和Clq是否可以減少與ALS相關的MN細胞損傷和MN細胞死亡，按照Zhao等A^wrapa仇A^ewro/.0^經錄湮學浙實邀#經學染,志9(2004)63:964-977)所述製備含有小膠質細胞和運動神經元(MN)的細胞培養物。將ALSIgG(1或2嗎/ml)加入到有或無本文所述的FcR和Clq結合抑制劑(例如，具有在SEQID20NOS:2和16中描述的胺基酸序列的多肽)的小膠質細胞/MN細胞培養物中。通過測量促炎性細胞因子，TNF-(x的量而進行小膠質細胞激活測定。使用抗-p75和/或抗-CFAp抗體進行免疫細胞化學MN染色，以確定有和無免疫複合的IgG抑制劑時MN的存活。使用高效液相色譜測量穀氨酸，已知其對MN是細胞毒性的。實施例7-在體內模型中抑制ALS免疫複合的IgGFc5在有和無本發明所述的多肽抑制劑的i.p.注射時，將從ALS患者製備的IgG(40mg)(Mohamed等.(2002)/A^wmsc/.C廬經棄學^^^^,志J69:110-116)腹膜內(i.p.)注射到13-17周齡的C57Bl/6X129SvEv小鼠中。MN中ALSIgG的超微結構檢測，細胞內鈣的釋放，和在神經肌肉結合處的醯基膽鹼(actylcholine)釋放用來監測在對照和治療的小鼠中的ALS-io樣症狀。備選地，使用FcyRIIb敲除小鼠。使用這些小鼠的實驗已經表明，類風溼性關節炎(RA)或系統紅斑狼瘡(SLE)的臨床跡象可以通過被動施用人RA或SLE血清而誘導(Petkova等.(2006)J.iWedC^驗,學i^志J203(2):275-280)。因此，在用和不用本發明所述的抑制劑時，給FcyRIIbR敲除小鼠施用ALS陽性血清用來被動誘導ALS。15實施例8-在體外模型中抑制PD免疫複合的IgGFc進行實驗以確定本發明所述的抑制劑是否可以防止與PD臨床免疫病理相關的多巴胺能細胞的細胞破壞。用純化的小鼠小膠質細胞製備多巴胺能細胞系MES23.5(Le等(2001)JiVewras"'.C7伊經矜學/雜,吉J2021:8447-8455)。製備純化的PD免疫複合的IgG，並且在用和不用本發明所述的FcR抑制劑時加入到所述細胞培養物中。按照實施例5中所述的方法還測量對(x-突觸核蛋白與免疫複合的IgGFc結合的抑制。實施例9-在體內模型中抑制PD免疫複合的IgGFc25進行體內實驗，以確定本發明所述的抑制劑是否可以防止PDIgG與小膠質細胞FcYR的結合，並且因此防止SN多巴胺能細胞的破壞，其是與PD相關的主要病理性損害。PDIgG如所述(He等，如前所述)純化，並且將20iul立體定位地(stereotactically)注射到小鼠SN中。在用和不用所述抑制劑時，FcYIIb敲除的小鼠還用作被動轉移PD的體內模型。實施例10-在體內模型中使用FcyR抑制劑抑制ADIgG介導的對膽鹼能神經元的損傷AD是一種發展性神經變性疾病，其特徵在於在基底前腦中的膽鹼能神經元(CN)的失去。將ADIgG立體定位注射到成年雌性Sprague-Dawley大鼠的基底前腦中導致ChAT-免疫染色的CN細胞的顯著減少，所述ChAT-免疫染色的CN細胞是在人AD患者中CN退化的特徵(Engelhardt等(2000)如前所述)。因此，進行體內實驗以確定本發明所述的FcYR抑制劑是否可以防止FcYR小膠質細胞的激活和IgGFc對CN細胞的內在化，其導致在AD中觀察到的退化性的免疫病理。在用和不用所述抑制劑時，FcyIIb敲除小鼠還用作被動轉移AD的體內模型。實施例11-免疫複合的IgG與野生型tau結合的抑制通過將2pi兔抗-過氧化物酶與50^過氧化物酶在1ml蒸餾水中混合而形成PAP複合物。將PAP(100pi)與100pi肽預溫育1小時。對照PAP(200pi)也溫育1小時。將100^PAP或PAP/肽加入到Falcon微量滴定板中，所述板已經用16.7嗎/ml的人野生型tau蛋白(441個殘基；西格瑪-奧德裡奇)包被24小時。1小時後，將PAP或肽/PAP混合物(lOOpl)加入到tau包被的板中，並且溫育60分鐘。洗滌後，將板用ATBS溫育15分鐘，並且在405nm讀數。結果顯示在表6中。表6tableseeoriginaldocumentpage39肽APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:16)導致對人野生型tau蛋白與PAP結合的最大抑制，其次是肽DCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:2)。實施例12-免疫複合的IgG與野生型B-澱粉樣肽結合的抑制A卩肽的不同片段構成AD的澱粉狀蛋白斑特殊病徵，並且這些A|3片段似乎刺激小膠質細胞激活和隨後的AD神經病理。因此，進行實驗，以檢測AP1-40與免疫複合物的結合，並且確定本發明所述的抑制劑是否可以抑制PAP免疫複合物與A(3肽的結合。PAP複合物通過2pl兔抗-過氧化物酶與50^過氧化物酶在1ml蒸餾水中混合而製備。將PAP(100^d)與100^肽預溫育1小時。對照PAP(200也溫育1小時，並將100)ulPAP或PAP/肽加入到Falcon微量滴定板中，所述板已經用33嗎/ml的人野生型(3澱粉樣肽1-40(澱粉狀前體蛋白(APP)片段1-40;西格瑪-奧德裡奇)包被24小時，所述人野生型p澱粉樣肽1-40具有序列Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Ans-Lys-Gly-Ale-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val(SEQIDNO:39)。將PAP或肽/PAP混合物在(3-澱粉樣肽包被的板上溫育60分鐘。洗滌後，將板用ATBS溫育15分鐘，並且在405nm讀數。結果顯示在表7中。表7tableseeoriginaldocumentpage40肽DCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:2)導致對人野生型f3澱粉樣肽與PAP結合的最大抑制，其次是肽APPDCAWHLGELVWCT(SEQIDNO:2016)。其它實施方案應該理解，儘管本發明已經結合其詳細內容進行了描述，但是前述內容只是舉例說明，並不限制本發明的範圍，本發明的範圍通過後附的權利要求的範圍而限定。其它方面、優點和改進在下述權利要求的範圍內。權利要求1.抑制受試者中免疫複合物形成的方法，所述方法包括給所述受試者施用包含純化的多肽的組合物，所述多肽包含胺基酸序列(Xaa1)n-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO35)，其中Xaa1為任何胺基酸，Xaa2為Arg，Trp，5-HTP，Tyr，或Phe，Xaa3為任何胺基酸，和n為0，1，2，3，4，或5。2.權利要求1的方法，其中所述免疫複合物形成與肌萎縮性脊髓側io索硬化(ALS)相關。3.權利要求2的方法，其中所述多肽抑制ALSIgGFc與Fcyl,FcyIIa,FcyIIb,FcyIIIa,FcyIIIb,FcRn，mClq,或sClq的結合。4.權利要求2的方法，其中所述多肽抑制ALSIgGFc與野生型SOD1或突變型SOD1的結合。5.權利要求2的方法，其還包括監測所述受試者的ALS的臨床或分子特徵的步驟。6.權利要求5的方法，其中所述監測包括肌電圖或測量CNSMCP-1水平、運動神經元免疫球蛋白介導的鈣增加、神經遞質釋放或神經元細胞損傷或細胞死亡。7.權利要求l的方法，其中所述多肽還包含末端-穩定基團。8.權利要求7的方法，其中所述末端穩定基團在所述多肽的氨基端，並且是具有胺基酸序列Xaa-Pro-Pro的三肽，其中Xaa是任何胺基酸。9.權利要求8的方法，其中Xaa是Ala。10.權利要求7的方法，其中所述末端穩定基團是在所述多肽的羧基25端，並且是具有胺基酸序列Pro-Pro-Xaa的三肽，其中Xaa是任何胺基酸。11.權利要求10的方法，其中Xaa是Ala.12.權利要求1的方法，其中所述免疫複合物形成與帕金森病(PD)相關。13.權利要求12的方法，其中所述多肽抑制PDIgGFc與Fc化FcyIIa,30FcYnb，FcYlIIa,FcYlIIb，FcRn,mClq,sClq，a-突觸核蛋白，或a-突觸核蛋白與微管的聚集物的結合。14.權利要求12的方法，其還包括監測所述受試者的PD的臨床或分子特徵的步驟。15.權利要求14的方法，其中所述PD的臨床或分子特徵是黑質區5MC.P-1的減少或黑質中增加的TH+細胞存活。16.權利要求1的方法，其中所述免疫複合物形成與阿爾茨海默病(AD)相關。17.權利要求16的方法，其中所述多肽抑制ADIgGFc與Fqd,Fqdla，FcyIIb,Fc丫nia,FcYlIIb,FcRn,mClq，或sClq的結合。18.權利要求16的方法，其中所述多肽抑制ADIgGFc與tau蛋白，卩-澱粉樣肽、微管或tau蛋白與微管的聚集物的結合。19.權利要求16的方法，其還包括監測所述受試者的AD的臨床或分子特徵的步驟。20.權利要求1的方法，其中所述多肽還包含在所述胺基酸序列氨基15端的Asp。21.權利要求1的方法，其中所述多肽具有約10個到約50個胺基酸的長度。22.權利要求1的方法，其中所述多肽包含胺基酸序列Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu陽Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:2)。23.權利要求1的方法，其中所述多肽包含胺基酸序列Ala-Pro-Pro陽Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu誦Leu-Val-Trp-Cys-Thr(SEQIDNO:16)。24.純化的多肽，其胺基酸序列由下述組成(Xaa,)n-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQ25IDNO:35),其中Xaai為任何胺基酸，Xaa2是Arg,Tip,5-HTP，Tyr，或Phe,Xaa3為任何胺基酸，和n是0,1,2,3,4，或5。25.設計對具有結合的抗原的免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口具有特異的結合親和力的配體的方法，所述方法包括a)為計算機提供數據，所述數據包括在所述Ch2-Ch3裂口的位置252，253，435和436的胺基酸30殘基的原子坐標，並且所述計算機具有能夠從所述原子坐標數據生成分子的原子模型的電腦程式；b)使用所述計算機生成所述CH2-CH3裂口的原子模型;c)向所述計算機提供包括候選化合物的原子坐標的數據;d)使用所述計算機生成最優化位於所述CH2-CH3裂口內的所述候選化合物的原子模型；e)確定所述最優化定位的候選化合物是否與在所述CH2-CH35裂口內的所述胺基酸殘基相互作用；和f)如果所述候選化合物與所述胺基酸殘基相互作用，鑑定所述候選化合物作為具有針對所述CH2-CH3裂口的特異性結合親和力的配體。26.權利要求25的方法，其中所述配體具有針對所述CH2CH3裂口的至少1)iM的結合親和力。27.權利要求25的方法，其中所述結合親和力為至少100nM。28.權利要求25的方法，其中所述結合親和力為至少10nM。29.權利要求25的方法，其中所述配體能夠抑制Fc-介導的免疫複合物的形成。30.權利要求25的方法，其中所述配體能夠抑制FcR與所述CH2CH315裂口的結合。31.權利要求25的方法，其中所述配體能夠抑制Clq與所述CH2CH3裂口的結合。32.權利要求25的方法，其中所述配體能夠治療ALS。33.權利要求25的方法，其中所述配體能夠治療PD。34.權利要求25的方法，其中所述配體能夠治療AD。35.多肽在製備治療ALS的藥物中的應用，其中所述多肽包含胺基酸序歹ij(Xaa,)n-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr隱(Xaa3)n(SEQIDNO:35),其中Xaa,是任何胺基酸，Xaa2是Arg，Trp,5-HTP,Tyr,或Phe,Xaa3是任何胺基酸，和n是0，1,2，3,4,或5。36.多肽在製備治療PD的藥物中的應用，其中所述多肽包含氮基酸序列(Xaa,)n-Cys-Ala-XaarHis-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO:35),其中Xaa,是任何胺基酸，Xaa2是Arg，Trp,5-HTP,Tyr,或Phe,Xaa3是任何胺基酸，和n是0,1,2，3,4,或5。37.多肽在製備治療AD的藥物中的應用，其中所述多肽包含胺基酸序歹U(Xaa,)n-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQIDNO:35),其中Xaa,是任何胺基酸，Xaa2是Arg,Trp,5-HTP,Tyr，或Phe，Xaa3是任何胺基酸，和n是0,1，2,3,4，或5。38.包含純化的多肽的組合物，所述多肽包含胺基酸序列(Xaa0n-Cys-Ala-XaarHis-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n(SEQ5IDNO:35),其中Xaa,是任何胺基酸，Xaa2是Arg，Trp，5-HTP,Tyr,或Phe,Xaa3是任何胺基酸，和n是0,1,2,3,4,或5。全文摘要本發明提供可以特異性與免疫球蛋白分子的CH2-CH3裂口結合的多肽和其它化合物，和使用所述多肽和化合物抑制Fc-介導的免疫複合物形成、免疫複合的IgG與IgGFγR結合、和免疫複合的IgGmC1q(膜C1q)或可溶的C1q結合的方法。所述化合物可以在治療肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)、帕金森病(PD)和阿爾茨海默病(AD)中具有治療應用。文檔編號A61K38/00GK101277714SQ200680036622公開日2008年10月1日申請日期2006年9月6日優先權日2005年9月6日發明者勒妮·博迪,埃利奧特·奧爾特曼,尼爾·M·博迪申請人:三一治療公司