篩查16SrI組植原體的晶片及其應用的製作方法
2023-05-03 03:52:41
專利名稱：篩查16SrI組植原體的晶片及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物信息學及生物檢疫鑑定技術領域，尤其涉及篩查16SrI組植原體的晶片及其應用。
背景技術：
16SrI組為翠菊黃化組(Ca. Phytoplasma asteris)，組下分為11個亞組，目前 16SrI組是含有植原體種類最多的組，含有二百餘個植原體株系，主要包括翠菊黃化植原體、洋蔥黃化植原體、馬鈴薯紫頂病植原體、苜蓿矮化植原體、草莓矮化植原體、泡桐叢枝植原體等。危害症狀主要包括葉片黃化(yellowing)或變紅(reddening of leaves)、節間縮短(shortening of internodes), (stunt) ,/JnBf (little leaves)、|^^1貞±曾1胃帛致的叢枝(excessive proliferation of shoots resulting in a witches'broom)、變葉 (phyllody, leaf-like petals and sepals)、參錄變(virescence, excess ive greening of floral tissue)、花不育(sterile flowers)，韌皮部組織壞死(necrosis)、木本植物的枯梢(diehck)以及植株的生長衰退(decline)和死亡等。與其它16SrI組植原體相比，泡桐叢枝植原體在我國發生與分布範圍相對較廣。 六十年代之後，大規模泡桐人工造林運動的開展和全國規模的種苗調運，泡桐叢枝病的發生和危害逐漸加重，目前除少數泡桐生長區外，各泡桐產區都普遍遭受此病的危害。在重病區的河南、山東、陝西等省區，苗期發病率為1-8 %，1-3年生幼樹發病率為5 % -10 %，3-5年中幼齡樹可達30-50%，10年生樹可達100%。此病害造成直接經濟損失包括死苗和幼樹的死亡，成年樹幹型差和材積的減少。據報導，1990年對河南、山東、陝西、河北、安徽、甘肅、江蘇和山西等省的調查顯示，全國叢枝病發生面積達88萬公頃，每年造成直接經濟損失超過一億元。目前用於16SrI組植原體的檢測方法包括普通PCR、螢光PCR、電子顯微鏡技術、螢光顯微鏡等，該類方法存在特異性不強、步驟繁瑣等局限性，而且對於未知的、新發的植原體無法進行檢測與監測。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種篩查16SrI組植原體的探針。本發明提供的篩查16SrI組植原體的探針，由5條探針組成，所述5條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。上述探針中，16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發明的另一個目的是提供一種篩查16SrI組植原體的基因晶片。本發明提供的篩查16SrI組植原體的基因晶片，為將上述的探針固定在片基表面得到的基因晶片。在上述基因晶片中，所述片基為醛基化玻璃片基，在本發明的實施例中採用的是博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產品目錄號420022。
在上述基因晶片中，所述16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發明的第三個目的是提供一種篩查16SrI組植原體的試劑盒。本發明提供的試劑盒，包括上述的基因晶片。在上述試劑盒中，還包括如下引物組所述引物組由如下引物對A-引物對D的4對引物對組成；所述引物對A由引物1和引物2組成；所述引物對B由引物3和引物4組成；所述引物對C由引物5和引物6組成；所述引物對D由引物7和引物8組成；所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；上述試劑盒由上述的基因晶片和上述引物組組成。上述試劑盒中，所述16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發明的第四個目的是提供一種用於篩查16SrI組植原體的引物組。本發明提供的引物組，由如下引物對A-引物對D的4對引物對組成；所述弓丨物對A由引物1和引物2組成；所述弓丨物對B由引物3和引物4組成；所述弓丨物對C由引物5和引物6組成；所述弓丨物對D由引物7和引物8組成；所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發明還提供一種用於篩查16SrI組植原體的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑，由上述的引物組、dNTP、PCR緩衝液和聚合酶組成。上述PCR試劑中，上述引物組中的各條引物在所述PCR試劑中的濃度均為 0.2mmol/L。
所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。上述探針、上述基因晶片、上述的試劑盒、上述的引物組或上述的PCR試劑在鑑定或輔助鑑定16SrI組植原中的應用也是本發明保護的範圍。上述探針、上述基因晶片、上述的試劑盒、上述的引物組或上述的PCR試劑在製備鑑定或輔助鑑定16SrI組植原產品中的應用也是本發明保護的範圍。所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發明的第五個目的是提供一種篩查或輔助篩查待測樣品感染16SrI組植原體的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)將待測樣品的基因組DNA進行標記，得到標記後產物；2)將步驟1)得到的標記後產物與上述的基因晶片進行雜交，得到雜交後晶片；2)將步驟1)得到的雜交後晶片掃描；若所述基因晶片上至少一條所述探針的信號絕對值大於5000且信噪比大於3. 0， 則待測樣品感染或候選感染16SrI組植原體。所述至少一條所述探針為5條探針。在上述方法中，步驟1)中，所述標記為以待測樣品的基因組DNA為模板，以上述引物組進行PCR擴增，得到標記後產物；在上述方法中，步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h。在上述方法中，在所述步驟2、後和步驟幻前還包括將所述雜交後晶片進行洗滌的步驟。在上述方法中，所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。本發明的實驗證明，本發明提供的篩查16SrI組植原體的晶片中的探針具有 16SrI組植原體組水平上的高兼容性和植原體組內的特異性，數小時內完成對待檢樣品中可能存在的新發植原體的篩查，所需的樣品量極少，一般僅需0. lg。另外數據的分析與計算機圖像處理軟體相結合，達到分析結果能夠直觀化、可視化。本發明採用生物信息學方法對 16SrI組植原體的16S rDNA、16S_23S rDNA spacer、imp、tuf核苷酸序列進行分析，設計了該組的兼容性探針，標準植原體樣品驗證結果證明探針效果良好。本發明的篩查16SrI組植原體的晶片可用於16SrI組植原體的檢疫鑑定。
圖1為16SrI組植原體篩查晶片探針點陣示意圖(5X6)圖2為應用草莓枝狀果植原體標準樣品驗證16SrI組植原體篩查晶片的結果圖3為應用泡桐叢枝植原體標準樣品驗證16SrI組植原體篩查晶片的結果圖4為篩查晶片靈敏度檢測結果圖5為PCR靈敏度檢測結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、篩查16SrI組植原體的晶片的製備1、組級高兼容性寡核苷酸探針的設計1)從美國國立生物技術信息中心(NCBI)及核糖體資料庫項目官方網站(RDP)資料庫下載16SrI組植原體全基因組及核酸序列數據用於設計探針。2)整理植原體核酸序列，去除小於200bp長度的核酸序列並分組；同一組內所有植原體序列簡稱為組內序列，非本組的所有植原體序列簡稱為組外序列。3)使用ClusterW聯配組內序列，尋找序列保守區域設計探針。探針設計時在序列保守區域內以2 3個鹼基作為間隔，連續提取所有19bp的核酸序列，對選取的核酸序列進行篩選，標準為GC含量在40%及60%之間，沒有大於!3bp的連續重複鹼基，以及不會形成大於:3bp的發卡結構。4)使用自編程序將通過步驟幻篩選的探針序列與組外序列聯配，程序計算二級結構的自由能、MMPD(The distance of the mismatch in the middle position)、最長相同片段等條件進行綜合打分，棄用高於模擬雜交標準分的探針。5)使用自編程序將通過步驟4)篩選的探針序列與組內序列進行比對，程序計算打分，棄用低於模擬雜交標準分的探針。6)使用BLASTN將通過步驟5)篩選得到的探針序列與步驟2)得到的特異性資料庫進行特異性比對，Word size設為7，篩選標準為Max Score小於15分，並且無7bp以上的相同片段7)對於剩餘的每一條探針進行排序，排序標準依次為探針對組內序列模擬雜交總分、探針對組外序列模擬雜交總分及探針對特異性資料庫的BlastN Max Score總分，取排名前兩名的兩條探針為組特異性探針。8)如果經過步驟7)無法達到每組至少2個探針對應的標準，則在步驟3)降低序列保守性標準，重新設計，依此循環直到所有16SrI組序列都有2個探針對應。如果無法從保守區域設計探針，或16SrI組內序列無保守區域，則使用所有16SrI組全長序列設計探針。探針設計標準與步驟幻到步驟7)相同。根據上述原則設計了 16S rDNA區域的1條探針(探針1)、tuf的2條探針(探針 57和探針58)、16S-23S rDNA spacer的1條探針(探針73)、及imp基因的1條探針(探針76)，其核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、2、3、4、5所示。可以人工合成上述5條探針。2、晶片的製備將上述1得到的5條探針用點樣緩衝液(博奧生物有限公司晶芯 晶片點樣液，產品目錄號440010)溶解，濃度為50 μ Μ,每條探針橫向重複3點點在醛基化玻璃片基晶片 (博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產品目錄號420022)上，每點約0. 25nL,點直徑約 180 μ m，點間距為300 μ m，點樣均勻度的標準方差為15%。將晶片點有探針的一面在65°C 水浴鍋上水合10s，晶片距水面距離為3cm，在空氣中室溫自然乾燥，在進行一次水合。將點有探針的一面向上，放在紫外交聯儀中250mJ交聯。將晶片放在42°C預熱，0. 5% SDS清洗lOmin。將晶片轉移到42°C預熱蒸餾水中清洗aiiin。把晶片放在50ml錐形離心管中， 2000rpm離心lmin，以去除晶片表面的液體，獲得篩查16SrI組植原體的晶片。
篩查16SrI組植原體的晶片如圖1所示，圖1中1、57、58、73、76為16SrI組植原體篩查晶片探針1、57、58、73、76(對應序列1_5)，Hex為晶片固定陽性質控，PC為雜交陽性質控，NC為雜交陰性質控。實施例2、篩查16SrI組植原體的晶片的應用一、篩查16SrI組植原體的晶片檢測樣品1、用於檢測的樣品總DNA提取1)取感染草莓枝狀果植原體的草莓葉片(拉丁名=Strawberry Phylloid Fruit Phytoplasma, id^ci :Molecular Identification and Classification of Strawberry Phylloid Fruit Phytoplasma in Group 16SrI, New Subgroup.Plant disease,2002, 86(8) :920.，公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。)和感染泡桐叢枝植原體的泡桐葉片(拉丁名Paulownia witches' broom phytoplasma.記載在泡桐叢枝植原體抗原膜蛋白抗血清的製備及應用，植物病理學報，2011,41 ) :161-170.)各0. lg，取適量液氮研磨， 再加入研磨液2ml充分研磨，4°C 20000rpm離心20min，棄上清。2)加入ImlDNA提取液，40ul蛋白酶K(5mg/ml)，輕輕混勻，加入160ul 10%十二烷肌氨酸鈉，混勻，在55°C溫育1 2小時，期間不斷的顛倒混勻，4°C 6000rpm, IOmin,取上清。3)加入2/3體積異丙醇到上清液中，輕混勻，-20°C保持至少30min，4°C 12000rpm, 15分鐘，棄上清。4)加入600ul帶有RNase的水液，加入30ulSDS，12ul蛋白酶K，輕輕徹底混勻， 37°C溫育60分鐘。5)加IOOul 5M NaCl混勻，再加入84ulCTAB/NaCl溶液混勻，65°C溫育10分鐘。6)加入等體積苯酚氯仿異戊醇05 24 1)混勻，4°C 12000rpm，10分鐘，
重複直至無中間白色層。7)上層水相加入等體積氯仿異戊醇04 1)，混勻，4°C 12000rpm，10分鐘。8)上清液加入2/3體積異丙醇，混勻，_20°C保持至少30分鐘，4°C 12000rpm, 10分
鍾，棄上清液。9)加入Iml 70%乙醇12000rpm離心1分鐘。洗滌兩次。加入30ul TE混勻溶解， 分別得到草莓枝狀果植原體基因組DNA和泡桐叢枝植原體基因組DNA。2、樣品標記與雜交標記體系為20 μ L，即在每個0. 2mL的反應管中加入2μ L上述1得到的基因組 DNA、上遊引物0. 2 μ L (終濃度為0. 2mmol/L)、下遊引物0. 2 μ L (終濃度為0. 2mmol/L，5』端 TAMARA 標記)、dNTP Mix (10mmol/L) 1· 6 μ L、LA-Taq 酶 0· 5 μ L、10 X Buffer (Mg2+) 2 μ L 及 DEPC-H20 13.5 μ L0上下遊引物由分別用於擴增包括16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp及tuf探針序列的引物對組成，上述用於擴增16S rDNA的引物對由序列表中的序列6和序列表中的序列7組成；上述用於擴增16S-23S rDNA spacer的引物對由序列表中的序列8和序列表中的序列9組成；上述用於擴增imp的引物對由序列表中的序列10和序列表中的序列11組成；
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上述用於擴增tuf的引物對由序列表中的序列12和序列表中的序列13組成。PCR 反應程序-MV 5min ；94°C 30sec，60°C 30sec，72°C Imin 30sec, 35cycles ； 72°C IOmin。雜交雜交液包括2. 4μ L 3XSSC.0. 32 μ L 0. 2% SDS、4 μ L25% 甲醯胺、0. 32 μ L 外標、1. 6 μ L5XDenhard，s及標記樣品7. 36 μ L ；95°C變性3min,冰浴5min,瞬時離心；將雜交液加到由實施例1得到的16SrI組植原體篩查晶片上，蓋薄片蓋好，42°C水浴雜交過夜 (12h)。分別得到雜交後的晶片(草莓枝狀果植原體)和雜交後的晶片(泡桐叢枝植原體)。3、洗滌、掃描清洗體系及程序如下
洗液I洗液II
洗液組分(最終濃度)2xSSC, 0.2%SDS 0.2xSSC
清洗溫度42。C42 V
清洗時間4min4min先將洗液I、II放在微波爐中預熱到42V，轉移到清洗盒中。雜交結束後，將雜交後的晶片轉移到盛放洗液的清洗盒中，雜交面向上，放在水平搖床上緩慢清洗。晶片清洗後，放在50ml錐形離心管中，2000rpm離心lmin，除去晶片表面的液體，分別得到待檢測晶片(草莓枝狀果植原體)、待檢測晶片(泡桐叢枝植原體)。將上述待檢測晶片(草莓枝狀果植原體)、待檢測晶片(泡桐叢枝植原體)置於掃描儀中進行掃描分析；PMT設為900，獲得各點螢光強度、背景強度等數據。使用博奧生物開發的LuxScan 3. 0從掃描的晶片中提取數據，探針的信號值為探針前景值的中位值減去背景值的中位值。信噪比為圖像對應點內所有信號值中位值與背景值中位值的比值。若至少一條所述探針的信號絕對值均大於5000且信噪比均大於3. 0，判為陽性 (為16SrI組植原體感染)；探針的信號絕對值均小於5000且信噪比均小於2. 0，判為陰性 (不為16SrI組植原體感染)；如果信號模糊且信噪比介於2. 0和3. 0之間，判為可疑，實驗
需重複驗證。圖2、圖3的探針排列與圖1相同，陽性探針均為1、57、58、73、76。草莓枝狀果植原體的結果如圖2所示，探針1、57、58、73、76所在位置的信號絕對值均為7000 ；且信噪比均為4，說明本發明可以檢測16SrI組植原體的草莓枝狀果植原體；泡桐叢枝植原體的結果如圖3所示，探針1、57、58、73、76所在位置的信號絕對值均為7500 ；且信噪比均為4. 5，說明本發明可以檢測16SrI組植原體的泡桐叢枝植原體；上述晶片的固定陽性質控、雜交陽性質控及雜交陰性質控表現良好，標準樣品雜交信號強而無背景噪音，說明設計的探針及建立的晶片篩查程序具有良好的工作效果。二、篩查16SrI組植原體晶片與PCR檢測靈敏度比較準確稱取0. Ig泡桐叢枝植原體侵染的泡桐葉片，提取基因組DNA，分別用於16SrI
組植原體篩查晶片檢測和PCR檢測，兩者所用的DNA均進行5°、5人5_2、5_3和5_4倍梯度稀釋。晶片檢測的方法同上述的一，晶片檢測實驗結果如圖4所示，圖4的探針排列與圖1相同，其中A :5_2稀釋；B 5_3稀釋；C :5_4稀釋；可以看出，16SrI組植原體篩查晶片可檢測到待檢對象的最高稀釋倍數為54。PCR檢測的引物為上遊引物5，-CCTGTTAACTGGCTTTCTCCTA-3，；下遊引物5，-GGAGGTTTTTGGCATTATCG-3，。PCR檢測的結果如圖5所示，1 :5°稀釋；2斤1稀釋；3 :5_2稀釋；4 :5_3稀釋；5 5-4稀釋；M =Marker DL2000，可以看出，均得到34Ibp的產物(Genbank號NC 005303的第 688569-688909位核苷酸)，待檢對象的最高稀釋倍數為53。因此，16SrI組植原體篩查晶片檢測靈敏度比PCR方法高5倍。
權利要求
1.一種篩查16SrI組植原體的探針，由5條探針組成，所述5條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。
2.根據權利要求1所述的探針，其特徵在於所述16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
3.—種篩查16SrI組植原體的基因晶片，為將權利要求1或2所述的探針固定在片基表面得到的基因晶片。
4.根據權利要求3所述的基因晶片，其特徵在於所述片基為醛基化玻璃片基；所述 16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
5.一種篩查16SrI組植原體的試劑盒，包括權利要求3或4所述的基因晶片。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括如下引物組 所述引物組由如下引物對A-引物對D的4對引物對組成；所述引物對A由引物1和引物2組成；所述引物對B由引物3和引物4組成；所述引物對C由引物5和引物6組成；所述引物對D由引物7和引物8組成；所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列10 ；所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列11 ；所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；所述試劑盒由權利要求3或4所述的基因晶片和所述引物組組成；所述16SrI組植原體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
7.一種用於篩查16SrI組植原體的引物組，由如下引物對A-引物對D的4對引物對組成；所述引物對A由引物1和引物2組成； 所述引物對B由引物3和引物4組成； 所述引物對C由引物5和引物6組成； 所述引物對D由引物7和引物8組成； 所述引物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 ； 所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ； 所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列8 ； 所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列9 ； 所述引物5的核苷酸序列為序列表中的序列10 ； 所述引物6的核苷酸序列為序列表中的序列11 ； 所述引物7的核苷酸序列為序列表中的序列12 ； 所述引物8的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
8.權利要求1或2所述探針、權利要求3或4所述的基因晶片、權利要求5或6所述的試劑盒或權利要求7所述的引物組在鑑定或輔助鑑定16SrI組植原中的應用；或權利要求1或2所述探針、權利要求3或4所述的基因晶片、權利要求5或6所述的試劑盒或權利要求7所述的引物組在製備鑑定或輔助鑑定16SrI組植原產品中的應用； 所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
9.一種篩查或輔助篩查待測樣品感染16SrI組植原體的方法，包括如下步驟1)將待測樣品的基因組DNA進行標記，得到標記後產物；2)將步驟1)得到的標記後產物與權利要求3或4所述的基因晶片進行雜交，得到雜交後晶片；2)將步驟1)得到的雜交後晶片掃描，若所述基因晶片上至少一條所述探針的信號絕對值大於5000且信噪比大於3. 0，則待測樣品感染或候選感染16SrI組植原體。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述標記為以待測樣品的基因組DNA為模板，以權利要求5或6所述的試劑盒或權利要求7所述的引物組中的引物組進行PCR擴增，得到標記後產物； 步驟幻中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h; 在所述步驟幻後和步驟幻前還包括將所述雜交後晶片進行洗滌的步驟； 所述16SrI組植原體具體為草莓枝狀果植原體或泡桐叢枝植原體。
全文摘要
本發明公開了一種篩查16SrI組植原體的晶片及其應用。本發明的的篩查16SrI組植原體的探針，由5條探針組成，所述5條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-5。還提供了篩查16SrI組植原體的基因晶片，為將上述的探針固定在晶片表面得到的基因晶片。本發明的實驗證明，本發明採用生物信息學方法對16SrI組植原體的16S rDNA、16S-23S rDNA spacer、imp、tuf核苷酸序列進行分析，設計了該組的兼容性探針，標準植原體樣品驗證結果證明探針效果良好。本發明的篩查16SrI組植原體的晶片可用於16SrI組植原體的檢疫鑑定。
文檔編號C40B40/06GK102492773SQ20111040276
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者張永江, 朱水芳, 牟海清, 趙文軍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院