對多核苷酸模板進行測序的方法

2023-04-28 00:34:01 2

專利名稱：：對多核苷酸模板進行測序的方法
技術領域：
：本發明涉M雙鏈多核苷酸模板進行成對測序的方法，本方法導致測定多核苷酸模板上兩個不同且分開的區域中的核苷酸序列。
背景技術：
：在本申請中參考了若干出版物和專利文件，從而更詳盡地描述本發明所述領域的現狀。每篇這些出版物和文件的公開內容均通過參考併入本文。生物分子研究的m—部分是由於用來表徵分子或其生物反應的技術改進所致。特別地，對核酸DNA和RNA的研究受益於序列分析技術的發展。用於對多核苷酸模板進行測序的一種方法涉及使用DNA聚合酶進行多重延伸>^應，以將經標記的核苷酸連續摻入模板鏈中。在這樣的"合成測序(sequencingbysynthesis)">^應中，通過連續地摻入與^^板鏈互補的個體核苷酸，以5'到3'的方向建立與模板鏈配對的新核苷酸鏈。在同時使用時，測序反應中使用的底物核普三磷酸可被封閉以防止過量摻入，並被差異性標記從而允許在添加連續核苷酸時確定所摻入核苷酸的身份。為了進行準確測序，可在底物核苷酸中加入可逆的鏈終止結構性修飾或"封閉基團(blockinggroup)"，以保證核普酸以受控方式逐個摻入。每摻入一個核普酸，封閉基團即阻止任何其它核苷酸再摻入該多核普酸鏈。一旦確定了最後摻入的標記核苷酸的身份，就除去標記部分和封閉基團，允許下一個封閉的標記核苷酸在隨後的測序輪次中摻入。在某些情況下(特別是在當使用封閉的經標記核苷酸時)，可通過使用合成測序技術可靠獲得的測序數據量可能是有限的。在一些情況下，優選將測序"運行(run)"限制在允許與人類基因組進行序列重新比對的g數，通常大約25-30個摻入循環。儘管此長度的測序運行非常有用(特別是在例如SNP分析和基因分型的應用中)，M很多情況下，能夠可靠地獲取同一模板分子的進一步序列數據是有利的。"配對末端(paired-end)"和"成對(pairwise)"測序技術在分子生物學領域是公知的，特別是在全基因組鳥槍測序法的情況下。配對末端測序允許確定來自單個多核苷酸雙鏈體中兩個位置的兩個序列"讀取(read)"。配對末端法的優點在於，對單個模板上各為"n"個威基的兩段進行測序比以隨機方式對兩個獨立模板上每一個的"n"個M序列進行測序明顯能得到更多的信息。使用用於裝配序列信息的合適軟體工具，就有可能利用到以下知識，即"配對末端，，序列並非完全隨機，而是已知發生在單個雙鏈體上，並且因此在基因組中是相連或成對的。該信息已顯示出非常有助於將全基因組序列組合成共有序列。配對末端測序法通常利用專門的環形鳥槍克隆栽體來實施。在特異性單位點切割載體後，將待測序模板DNA(通常是基因組DNA)插入到載體中，末端重新封閉形成新構建體。插入片段DNA側翼的載體序列包含測序引物的結合位點，所述引物允許對相及^鏈上的插入片段DNA進行測序。然而，模板片段兩端均需要測序引物，這使得^利用基於陣列的測序技術。使用通常依賴於單鏈模板的基於陣列的技術，通常僅可能從核苷酸^^板的一端開始測序，因為互補鏈未與表面結合。已報導了大量可在固體支持物上進行的用於多核苷酸模板雙末端測序的方法，例如US20060024681、US20060292611、WO06110855、WO06135342、WO03074734、WO07010252、WO07091077和WO00179553。WO98/44151和WO00/18957都描述了核酸擴增方法，其允許擴增產物被固定在固體支持物上，以形成由簇或"集群(colony)"構成的陣列，所i^或"集群"是由多個相同的固定化多核苷酸鏈和多個相同的固定化互補鏈形成的。根據這些方法製備的成簇陣列上的DNA集群中所存在的核酸分子可以為測序^L提供模板，例如，如WO98/44152中所述。如在本文方法中詳述的，使得能夠有效測序這些簇的兩M是有利的。發明概述本發明開發了對雙鏈多核苷酸模板進行末端配對測序的方法，所述雙鏈多核苷酸模板包括存在於成簇陣列上的雙^板，如本文所述的雙鏈模板。該方法允許對兩個不同的區域進行測序，所述兩個不同的區域在靶多核苷酸雙鏈體互4喊的每個末端各一個。使用本發明的方法，有可能獲得來自成簇陣列上每個雙^^板的兩個相連或配對的序列信息讀取，而不是僅獲得來自一條模板鏈的單個測序讀取。根據本發明的一種方法，提供了對靶雙鏈多核苷酸的第一和第二區域進行成對測序的方法，其中所述第一和第二區域位於相同的靶雙鏈多核苷酸中，所述方法包括(a)提供固體支持物，並提供多拷貝的一個或多個5'端固定的引物，所述固體支持物上已固定有多個雙鏈模板多核苷酸，其中每個都是由其5，端連接在所述固體支持物上的互補的第一和第二模板鏈所形成的，所述5，端固定的引物能夠與第一模板鏈的3，端雜交；(b)對所述多個雙鏈模板多核苷酸進行處理，以使第一模板鏈與5，端固定的引物雜交；(c)進行第一測序讀取，以測定模板多核苷酸第一區域的序列；(d)進行延伸反應以延伸一個或多個固定引物，從而複製第一模板鏈，以產生第二固定模板鏈；(e)對多個第一和第二固定模板鏈進行處理，以從固體支持物上除去第一模板鏈；(f)進行第二測序讀取，以測定模板多核普酸第二區域的序列，其中對靶多核苷酸第一和第二區域的序列測定實現了對所述靶雙鏈多核苷酸中所述第一和第二區域的成對測序。本發明的第二種方法提供了對靶雙鏈多核苷酸的末端區域A和B進行測序的方法，其中所述末端區域A和B在同一靶雙鏈多核苷酸中，所述方法包括(a)提供固體支持物，其上已固定有多個雙鏈模板多核苷酸，其中每個都是由其5，端連接在所述固體支持物上的互補的第一和第二模板鏈所形成的；(b)處理所述雙鏈模板多核普酸，以使每個雙鏈模板多核普酸在至少8兩處被切割，從而產生一端被固定的兩條縮短的雙鏈模板片段A和B,其中A和B不再直接相連；(c)處理所述一端被固定的兩條縮短的雙鏈模板片段A和B，從而使得兩個未固定的末端成為平末端雙鏈體；(d)處理所述兩個平末端雙鏈體，以使兩個平末端A和B連接形成兩端均被固定的雙鏈核苷酸序列，所述雙鏈核普酸序列在縮短的連續序列中含有原始靶片段的兩個末端A和B;(e)切割所述雙鏈核香酸序列的一條鏈以產生單鏈核普酸靶序列，所述雙鏈核苷酸序列含有連接在兩端均被固定的縮短連續序列中的原始靶片段的兩個遠端A和B，所述單鏈核苷酸靶序列在縮短的連續序列中含有原始靶片段的兩個遠端A和B，其中所述單鏈核苷酸靶序列在單個5，或3'末端被固定；(f)將測序引物與所述在縮短的連續序列中含有原始靶片段兩個遠端A和B的單鏈核苷酸靶序列雜交；和(g)進行單個測序反應，以測定原始靶片段的兩個末端A和B的連續序列。本發明的第三種方法提供了對靶雙鏈多核苷酸的第一和第二區域進行成對測序的方法，其中所述第一和第二區域位於同一靶雙鏈多核苷酸中，所述方法包括(a)提供固體支持物，並提供多拷貝的一個或多個5，端均被固定的引物，所述固體支持物上已固定有多個雙鏈模板多核苷酸，其中每個都是由其5，端均連接在所述固體支持物上的互補的第一和第二模板鏈所形成的，所述5，端固定的引物能夠與第一模板鏈的3，端雜交；(b)對所述多個雙鏈模板多核普酸進行處理，以使第一模板鏈與5，端固定在該固體支持物上的引物雜交；(c)進行第一測序讀取，以測定模板多核苷酸中第一區域的序列；(d)進行延伸反應，以將一個或多個固定引物延伸至第一模板鏈末端，從而產生第二固定模板鏈；(e)對所述多個模板多核普酸進行處理，從而從固體支持物上除去第一模板鏈，使得第二固定模板鏈成為單鏈；(f)進行第二測序讀取，以測定模板多核苷酸中第二區域的序列，其中對靶多核苷酸中第一和第二區域的序列測定實現了對該靶雙鏈多核苷酸中所述第一和第二區域的成對測序。在一個更具體的實例中，所述第三種方法是對靶雙鏈多核苷酸中第一和第二區域進行成對測序的方法，其中所述第一和第二區域在同一靶雙鏈多核苷酸中，所述方法包括(a)提供固體支持物，其上已固定有多個雙鏈模板多核苷酸，其中每個都是由其5，端連接在所述固體支持物上的互補的第一和第二模板鏈所形成的；(b)處理所述多個雙鏈模板多核苷酸，以使一條鏈從表面上釋放，留下其5'端固定在固體支持物上的單鏈第一模板鏈；(c)將引物與所述第一模板鏈雜交，使用以聚合酶和經標記核苷酸進行的引物延伸循環來產生第一延伸的測序引物，從而進行第一測序反應，以監測經標記核普酸在所雜交引物上的摻入並測定模板多核苷酸中第一區域的序列；(d)去除所述第一延伸的測序引物；(e)將固定的第一模板鏈與固定的引物雜交，並延伸所述固定的引物，以再生所述多個雙鏈模板多核苷酸，其中每個都是由其5，端連接在所述固體支持物上的互補的第一和第二模板鏈形成的；(f)處理所述多個模板多核苷酸，使得第一模板鏈從表面上被去除，使得第二固定模板鏈成為單鏈；(g)將第二測序引物與所述第二固定模板鏈雜交；和(h)使用以聚合酶和經標記核普酸進行的引物延伸循環來產生第二延伸測序引物，從而進行第二測序運行，以監測經標記核苷酸在第二測序引物上的摻入並測定模板多核苷酸中第二區域的序列，其中對靶多核苷酸中第一區域和第二區域的序列測定實現了對所述靶雙鏈多核苷酸中所述第一區域和第二區域的成對測序。本發明的實施方案中還涵蓋根據任何本文所述方法製備的成簇陣列，例如使用兩個測序讀數之間的鏈再合成來製備，或使用限制性內切核酸酶處理以切割固定的雙鏈體的中央區域來製備。本文還描述了改善對固定化模板進行的測序反應的數據質量的方法，所述方法包括將該模板與固定化的引物雜交，以使該模板通過兩個末端被固定。圖l顯示使用本發明第一種方法進行的配對末端讀取的示意圖，其使用切口酶實現。圖2顯示使用本發明的第一種方法進行的成對讀取的示意圖，其使用尿嘧啶引物實現。圖3顯示使用本發明第二種方法進行的成對讀取的示意圖。圖4a顯示使用本發明第三種方法進行的成對讀取的示意圖。該圖顯示從已雜交引物開始進行的第一測序讀取，但是該鏈也可以與表面上經磷酸根封閉的引物雜交，從而可通過兩個末端被固定(如圖4c中所示)。圖4b顯示使用本發明第三種方法進行的成對讀取的示意圖，其4吏用三種接枝引物實現。圖4c顯示圖4a的方法，其中在SBS讀取1中模板通過兩個末端被固定。圖5顯示在表面上延伸的簇的圖示。圖6顯示用於擴增的一條^^鏈的完整序列。圖7顯示來自對固定化測序引物進行的兩輪核普酸摻入的數據。圖8顯示來自測序讀取的數據，所述測序讀取J彈自圖4b中所示方法。所用樣品是140KB的片段化BAC,其被片段化為80個4^t的平均插入片段大小。兩個讀取得自片段的任一端。顯示了來自測序運行的單個模ii塊(tile)的數據。兩個讀取均清楚地與BAC序列匹配，只有4%的讀取來自於汙染原始樣品的大腸桿菌。圖9顯示使用兩種切口酶和鏈再合成進行的方法的示意圖。圖10顯示在鏈再合成之前任選的引物延伸步驟，其改善鏈再合成步圖11顯示可逆地封閉固定化引物的可選方法。圖12顯示索引成對讀取的示意圖，其中使用索引序列(indexingsequence)或標籤制^4羊品模板。發明詳述本發明提供了對靶雙鏈多核苷酸模板的兩個區域進行測序的方法，這兩個區域在本文中稱作用於序列測定的第一和第二區域。用於序列測定的第一和第二區域位於雙鏈多核苷酸模板互補鏈的兩個末端，所述互補鏈在本文中分別稱作第一和第二模板鏈。一旦已知一務逸的序列，則其互補鏈的序列也是已知的，因此術語"兩個區域"可等同地應用於單M^板的兩個末端，或雙^^板的兩個末端，其中第一區域及其互補序列是已知的，並且第二區域及其互補體是已知的。本發明方法的起點是提供固定於固體支持物上的多個模板多核苷酸雙鏈體。模板多核苷酸可以被固定為擴增的單模板分子陣列或"簇"的形式。特定蔟中的每個雙鏈體都包含相同的待測序雙鏈耙標區域。每個雙鏈體都是由互補的第一和第二模板鏈形成的，它們在5，末端或接近5，末端的地方連接在固體支持物上。通常，所述模板多核苷酸雙鏈體將以成簇陣列的形式提供。一種可選的起點是多個單^板，其作為與固定模板3，端互補的多個引物附著在同一表面上。該引物可被可逆地封閉，以防止延伸。該單^板可使用在3'端雜交的引物進行測序。測序後可除去測序引物，並對固定引物去封閉，以釋放可延伸的3，羥基。可使用橋接鏈再合成將這些引物用於複製模板，以產生與第一固定模板互補的第二固定模板。M面去除第一模板允許(仍從3，端起)對新的單鏈第二模板進行測序。這樣，原始固定模板的兩端均可測序。這樣的技術允許進行配對末端讀取，其中使用單個可延伸的固定引物來擴增^^板，例如Polony技術(A^c/e/c爿"Vfe及^efl^/127，24，e34(1999))或乳劑PCR(5We"ce309，5741，1728-1732(2005);A^i似^"7，376-380(2005))中所述。下文對各個步驟的詳細描述在加以必要修改後也適用於上文所述步驟，例如可使用與下文相關章節中所i^目同的技術來封閉引物。如果使用單個或多個可延伸引物在珠子上進行擴增，則珠子可在溶液中、在微量滴定板或皮量滴定板(picotitreplate)的個體孔中被分析，固定於(例如纖維光學類設備(fibreoptictypedevice)的)個體孔中，或在固體支持物上固定為陣列。固體支持物可為平坦的表面，例如載玻片，其中珠子隨機沉積並用聚合物(如瓊脂糖或丙烯醯胺)膜固定在適當位置。當提到分子(如核酸)固定或附著在固體支持物上時，術語"固定的"和"附著的，，在本文中可以互換使用，除非另有明確指出或通過上下文指出，否則這兩個術語都旨在包括直接或間接、共價或非共價的連接。在本發明的某些實施方案中，共價附著可能是優選的，但是一般來說，只要求在計劃使用所述支持物的條件下(例如在需要核酸擴增和/或測序的應用中)分子(如核酸)保持固定或附著在支持物上。本發明的某實施方案可能利用包含"官能化的"惰性基底或基質的固體支持物(例如，玻璃片、聚合物珠等)，所述官能化例如通過施加中間材料的層或覆層來實現，所述中間材料包含可共價附著至生物分子(如多核普酸)的反應基團。這些支持物的實例包括但不僅限於惰性基底(如玻璃)上所支持的聚丙烯醯胺7jc劍歐。在這些實施方案中，所述生物分子(如多核苷酸)可以直接共價附著至所述中間材料上(如水凝膠)，但所述中間材料本身可以非共價附著至基底或基質(如玻璃基底)上。因此術語"共價連接在固體支持物上"可以理解為包括這類布置。為了使用本發明的方法對給定靶標雙鏈多核苷酸的兩個區域進行測序，可對簇進行操作，以切除兩個末端之間的靶DNA區域，或獲得來自雙鏈體兩M的序列數據。如果切除了簇的中央部分並將末端掩^，則有可能在單個測序反應中讀取該簇的縮短的連續序列，所述測序M跨越原始模板的兩端進M取。這與在溶液中基於載體(雙標籤((ditag)))進行克隆的構思相似，但;K吏用表面上的蔟，所^H包含單個序列以確保原始片段的兩個末端^。對於溶液中載體的情況，DNA片段被連接成為環狀構13建體，因此即便是環被切開時，片段的兩個末端(或標籤)仍保留在同一分子上。這確保了來自同一原始片段的兩個末端重新M在一起(形成雙標籤)，而沒有分子間混亂。對於簇的情況，雙鏈體片段末端保持附著在表面上這一事實確保了接合來自原始片段的末端，也防止來自不同分子或簇的序列混合在一起。圖3是需要連接縮短末端的末端配對測序的示意圖。在程序開始時，兩個末端A和B通過一系列中間體鹼基(例如100-1000個鹼基)共價連接在一起。第一個處理步驟切割簇鏈，僅留下末端A和B作為不再共價連接的分離的短雙鏈體。每個雙鏈體的單個鏈與表面連接，另一M則是雜交的。如果雙鏈體被製成平末端並重新連接在一起，則末端AB(和AA和BB)重新共價掩^，而不含中間#^1基。處理雙鏈體從而在特定的但不依賴於序列的位置上切割鏈的方法包括使用限制性酶。合適的限制性酶是現有技術中公知的，例如切割距離其結合位點18和20個威基的Mmel。期望限制性酶能夠達到DNA的未知區域儘可能遠的地方，並優選酶在10-50個g或更遠處切割。在一個具體的實施方案中，預想了在距離其結合位點15-30個鹼基切割的酶，如EcoP15。所用特定限制性酶的識別位點可被設計在用於固相擴增的兩種引物中，並在樣品製備步驟中附著在靶片段的末端。通過連接使通用的已知末端附著至DNA片段文庫，這允許在單個擴增反應中擴增大量不同的序列。可以設計核酸模板中已知序列部分的序列，使得2s類限制性酶與該已知區域結合，並切割所擴增模板的未知區域。用限制性酶處理其中兩條鏈均被固定的雙鏈體會在每個簇中得到兩條縮短的雙鏈體片段，每個雙鏈體通過其5，-端之一錨定在表面上。用限制性酶處理通常在一務逸上留下突出端。可以分別用聚合酶或外切核酸酶補平或去除單鏈突出端，以確保雙鏈體的末端是平末端。然後可以通過連接將平末端雙鏈體片段M在一起，產生其中兩個5，端均被固定的雙鏈體。這樣縮短的雙鏈體含有來自原始片段兩端的序列，但是沒有任何居間M。例如50個鹼基的單個測序運行能夠獲得從原始片^L每個末端起25個威基的序列。為了便於測序，優選4面上去除一條漣，從而允許測序引物與剩餘的固定鏈有效雜交。用於線性化的合適方法在下文描述，並在申請號WO07010251中更詳細地描述，該申請的內容通過參考整體併入本文。線於具有末端A和B的每個片段而言，"殘枝"A和B在切割步驟後留在表面上。無法防止A與A連接或B與B連接得到一個末端的兩個重複拷貝，而不是期望的兩個末端的一個拷貝。一務漣的線性化幫助避免了該問題，因為對三種可能性A-A、A-B或B-B而言，一種雙鏈體的兩M均會被去除，一種雙鏈體的兩M均不會被去除，因此保持為不能夠雜交的雙鏈體。用於簇的線性化和測序的方法在下文中詳盡描述。在本發明的第一種方法中，可通過下述方法從固定的雙鏈體兩端獲得序列數據，所述方法中處理所述雙鏈體以釋放3，-羥基部分，所述3，-羥基部分可被用作延伸引物。然後可使用延伸引物讀取來自模板的一M的第一序列。在第一讀取後，可以延伸該鏈以完全複製直至第一鏈末端的所有鹼基。該第二拷貝保持在5，-端附著在表面上。如果M面上去除第一鏈，則可讀取第二鏈的序列。這給出了>^^始片段兩端開始的序列讀取。在本發明的第三種方法中，可如下^^板雙鏈體兩端獲得序列數據通過溶液中的引物>^^板的一#^獲得序列讀取，使用固定的引物複製該鏈，釋放第一鏈並測序第二條複製鏈。僅在兩端均固定的雙鏈體的一a中產生游離3，-羥基的方法包括用切口酶處理，或進行化學處理，以去除特定核普酸。合適的切口酶是本領域公知的，並優選地在其結合位點的3，遠端的位點處切割，以避免測序來自已知切口位點的鹼基。切口酶應當僅在與表面最接近的末端處切割固定鏈中的一條。圖l是使用切口酶的配對末端測序方法的示意圖。合適的限制性酶的實例應包括Nt.BstNBI和Nt.AlwI，它們除了所釋放的3，-羥基之外沒有確定序列的威基。從雙鏈體中去除核苷酸的方法包括對模板進fr沒計，以使與未知靶區域緊鄰的M可以被去除，形成無M位點(abasicsite)."無M位點"定義為多核苷酸鏈中M組分被除去的核苷酸位點。無^位點可以在生理條件下通過核苷酸殘基水解而在DNA上天然出現，也可以在人工IHt下化學形成或者通過酶作用形成。一旦形成後，無g位點可以被切割(如通過內切核酸酶或其它單鏈切割酶進行處理，或暴露於熱或鹼)，為多核苷酸鏈的位點特異性切割提供了一種方法。在一個非限制性的實施方案中，無g位點可以在模板多核苷酸雙鏈體的一#^上預定的位置處生成，然後在模板多核苷酸雙鏈體的一M上預定切割位點處通過首先摻入脫氧尿嘧啶(u)而被切割。這可以通過例如在用於固相擴增製備模板多核苷酸雙鏈體的引物之一中包含u來實現。接著可利用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)除去尿嘧咬鹼基，在一條鏈上生成無M位點。然後可以在無4^位點處通過內切核酸酶(如，EndoIV內切核酸酶、AP裂合酶、FPG糖基化酶/AP裂合酶、EndoVIII糖基化酶/AP裂解酶)、熱或鹼處理來切割包含無4^位點的多核苷酸鏈。在一個具體的實施方案中，使用可得自NewEngladBiolabs(M5505S)的USERtm試劑在雙鏈體鏈中尿嘧咬鹼基處產生單個核香酸缺口。內切核酸酶處理在切割位點處得到3，-磷酸部分，其可用合適的磷酸酶如鹼性磷酸酶去除。圖2是利用USER線性化再合成的配對末端測序反應的示意圖。無鹼基位點還可以在除脫氧尿香之外的非天然/修飾脫氧核糖核苷酸處生成，並以相似的方式通過內切核酸酶、熱或鹼處理進行切割。例如，通過暴露於FPG糖基化酶，可以將8-氧代鳥嘌呤轉化成無^位點。可以通過暴露於AlkA糖基化酶而將脫氧肌香轉化為無a位點。如此生成的無M位點可以接著被切割，通常是通過合適的內切核酸酶處理(如，EndoIV、AP聚合酶)。另一個實例包括使用特定的未甲基化胞嘧啶。如果引物序列的其餘組分和簇形成中使用的dNTP是曱基化的胞嘧啶殘基，則可通過用亞硫酸氫鹽處理而將未曱基化的胞嘧啶殘基特異性地轉化為尿嘧啶殘基。這允許使用相同的'USER，處理將簇的兩條鏈線性化，因為一種引物可含有尿嘧啶，一種引物可含有可被轉化為尿嘧啶(有效地為"保護的尿嘧啶"種類)的胞嘧啶。如果將在用於固相擴增的擴增引物中摻入非天然/經修飾的核苷酸，那麼該非天然/經修飾的核苷酸應該能夠通過用於擴增反應的聚合酶進行複製。在一個實施方案中，待切割分子可以暴露於包含合適的糖基化酶和一種或多種合適的內切核酸酶的混合物。在此類混合物中，所i^基化酶和所述內切核酸酶通常以至少約2:1的活性比存在。該切割方法在生成核酸測序模板的方面特別有優勢。特別是，對用試劑(如USER)處理生成的無^位點進行的切割自動地釋放被切割鏈上游離的3，磷酸基，所述磷^^磷酸酶處理後可提供對互#^區域進行測序的起點。另外，如果最初的雙鏈核酸在一#^上包含唯一一個可切割的鹼基(如尿嘧啶)，那麼可在雙鏈體的這4^上的唯一位置處生成單個"切口"。由於所述切割及JI需要非天然存在於DNA中而是獨立於序列背景的殘基(例如脫氧尿苷)，所以如果只包含一個非天然威基，那麼就不可能在雙鏈體上其它非所需位點處發生糖基化*導的切割。相反，若是雙鏈核酸被一個識別特異性序列的"切口"內切核酸酶切割，那麼如果具有正確的識別序列，酶就有可能在雙鏈體中的"其它，，位點處生成缺口(除了所需切割位點之外)。如果缺口生成在想要複製的鏈上，而不是在要被全部或部分去除的鏈上，那就會出現問題，並且如果雙鏈核酸分子的耙標部分的序列未知，那麼也特別有風險。可通過製備含有針對兩種不同切口酶的識別位點的樣品來克服這些局限性。如果使用該方法獨立地加工兩種製備物，則被一種切口酶切割的基因組區域應存在於另一製備物中。使用該方法不需要特定序列背景中的非天然戎基(例如尿嘧啶)來提供切割位點，這本身就是優點。特別地，如果所述切割位點將被摻入到用於通過固相擴增產生成簇陣列的擴增引物中，則只需要用非天然核苷酸(如U)替換引物中的一個天然核苷酸(如T)就能實現切割。不需要改造引物使其包含數個核苷酸長的限制性酶識別序列。可以容易地使用寡核苷酸化學合成的常規技術和設備來製備包含U核苷酸及其它如上所列非天然核苷酸的寡核苷酸引物。對通過UDG對尿嘧咬之作用在雙鏈分子中產生的無M位點進行切割的另外一個優點是，從通過切割這種位點所形成的3'末端游離羥基開始的"合成測序"反應中，摻入的第一個M總是T。因此，如果所^^板多核苦酸雙鏈體形成包含許多此類分子的成簇陣列的一部分(所有分子都通過這種方式切割生成測序模板)，那麼通用地摻入整個陣列的第一個鹼基將是T。這可以提供一種在測序"運行"開始時測定各個蔟強度的不依賴於序列的測定法。在具體的情況下，用雙脫氧核苷三磷酸和聚合酶和/或末端轉移酶進行封閉處理可以是有利的。在固相擴增後，表面上除了每條模板鏈的游離3，-端以外，仍剩餘大量未4吏用的擴增引物。用這樣經封閉的核苷酸處理確保在任何後續的聚合酶步驟中這些游離的3'-OH官能團都不能用於延伸。在其中通過化學處理或限制性內切核酸酶產生3，-羥基的方法中，在產生期望的3，-羥基之前封閉任何殘餘的3，-羥基是有利的。對於用USER試劑處理的情況，當磷n被釋放時，可在USER處理之前或之後進行封閉步驟，17因為磷^&會發揮保護基的作用，防止封閉期望的3，-羥基部分。可在進行封閉步驟後去除磷睃基。限制性酶處理的作用或者無4^位點的產生和切割在不再固定於表面的鏈上產生游離的5，-端。可通過用5，-3，外切核酸酶(如X或T7外切核酸酶)處理M面上完全去除該鏈。這樣的處理意味著，模板鏈是單鏈，並可用於隨後的複製。如果用於延伸3，-羥基的聚合酶具有鏈置換活性，則5，-3，外切核酸酶處理不是必需的。在使用固定引物進行測序的本發明實施方案中，在開始測序前用與模板互補的多個^延伸游離的3，-羥基引物是有利的。這既提高了固定雙鏈體的解鏈溫度，又幫助防止模板鏈在測序期間與其它固定引物再雜交，從而在簇中引起定相問題(phasingproblems)。在磷酸酶步驟已從固定引物上去除磷^&後，進行連接步驟。可通過連接M進行20-30個>^^序列的添加，所述連接反應使用在游離的3，-羥基附近雜交的5，-磷酸#^的引物。可使用連接酶如T4DNA連接酶封閉缺口。對於去除U核苷酸的USER處理，引物的5，-^會是替換被切除的U的T。為了有效地進行雜交步驟，必須已經如上述通過5，-3，外切核酸降解處理去除了5，-未固定的鏈。具有游離3，-羥基的這些被固定、延伸的引物被描述為延伸的5，-錨定引物，或延伸的固定引物，並且這些延伸引物的產生只是處理多個雙鏈模板多核苷酸以使第一^S板鏈與5，-端固定在固體支持物上的引物雜交的步驟之一。5，-錨定引物或延伸引物上的游離3，-羥基可用於起始測序輪次，以測定雜交的模板中的鹼基序列。可使用任何合適的"合成測序(sequencing-by-synthesis)"技術進行測序，其中向游離的3'羥基連續添加核香酸，導致以5'到3'的方向合成多核苷酸鏈。優選地在每次添加後確定所添加核苷酸的性質。測序的備選方法包括連接測序，例如如US6306597或WO06084132中所述，其內容通過參考併入本文。本發明USER的使用產生線性化的第一模板鏈和一層(lawn)帶有磷酸封閉部分的引物。不進行進一步的磷酸酶處理時，這層固定引物不適用於聚合酶延伸。可使用溶液中的測序引物起始針對第一模板鏈的測序讀取。如^引物層中去除磷睃基，那麼一旦去除了第一個^il伸的測序引物，則第一模板鏈可與引物層雜交，並進行一個或多個延伸、變性和再雜交的循環。可進行熱變性或等溫變性(例如使用化學變性)進行變性。化學變18性劑可以是尿素、氫氧化物或甲醯胺或其它類似試劑。這再生了其中兩條鏈均被固定的模板雙鏈體。可通過合適的互不影響(orthogonal)的線性化處理步驟(如二醇切割或8-氧代-G殘基的去除)去除第一鏈，並且在第一模板鏈變性後，可將第二測序引物與第二模板鏈雜交，並對第二^^L鏈進行測序。該互不影響的線性化策略允許>^板的兩端進行讀取。本發明的第一種方法提供了使用固定引物進行的測序反應。可將固定的測序引物變性，並使用第一模板鏈再起始如上述的更多輪延伸或擴增。這再次產生了其中兩^M均被固定的模板雙鏈體。可通過合適的互不影響的線性化處理步驟(如二醇切割或8-氧代-G殘基的去除)去除第一鏈，並且在對第一模板鏈變性後，可將第二測序引物與第二模板鏈雜交，並對第二模板鏈測序。該互不影響的線性化策略也允許>^^板的兩端進#^取。上文詳述的兩種方法均允許在第一和第二讀取之間再生簇。這有利於提高從蔟的第二讀取中獲得的信號水平。導致兩種擴增引物在第一測序讀取期間均保留在表面上的任何方法均屬於本發明第三種方法的範圍，儘管如果可以對引物進行處理(如USER的情況)使得測序反應期間3'-羥基不能進行引物延伸是有利的。封閉"伸的接枝引物的一種備選方法是使用帶有不可延伸的3'基團的核苷。用這樣的核苷和末端轉移酶處理表面會封閉該表面而使其不能進一步延伸。在第一測序運行後，可將核苷酸去保護，以允許複製模板鏈的進一步循環。如果核苷酸帶有雙脫氧修飾，則其可使用外切核酸酶或具有外切核酸酶活性的聚合酶去除。因此，可如所述用兩種接枝引物製造簇，在第一測序反應期間封閉未使用的引物，然後對其去保護以允許進一步複製模板鏈。擴增引物的一部分可附著在表面上，表面帶有封閉3'羥基而使其在擴增循環中不能延伸的修飾。這事實上意味著用三種或更多種而不是兩種擴增引物處理表面。擴增引物中的至少兩種應當包含相同序列的區域，但是至少一種引物應對用於在線性化過程期間去除第二引物的條件不敏感，並應含有3，-封閉部分。封閉部分可採取化學封閉的形式，如可用膦試劑去除的疊氮曱基(azidomethyl)，可通過酶去除的部分(如可用磷酸酶去除的磷酸基)，或可以是可使用3，-5，外切核酸降解去除的核苷酸基團的形式。這些核普修飾包括可如所述去除的無M位點，或可通過具有外切核酸酶活性的聚合酶去除的2，，3，雙脫氧核苷酸。其它修飾包括使用能夠形成自身互補區域的寡核苷酸序列，所述自身互補區域含有針對限制性酶的識別序列，如圖11中所示。用限制性酶處理應切割髮夾鏈並釋放具有游離3'羥基的更短序列。在第一測序運行後對表面進行處理以將引物去封閉，這會允許剩餘的第一鏈與去保護的引物雜交並再複製已經被測序的鏈。可如下獲得第二測序讀取去除第一鏈，雜交測序引物，並讀取新合成的第二鏈。可用於本發明方法的一個具體的測序方法依賴於使用可充當可逆性鏈終止子的經修飾核普酸。這樣的可逆性鏈終止子包含可去除的3，封閉基團。一旦這樣經修飾的核苷酸被摻入到與被測序模板區域互補的正在伸長的多核香酸鏈中，就沒有可用的游離3，羥基來指導進一步的序列延伸，因此聚合酶無法再添加另外的核苷酸。一旦確定了摻入正在伸長的鏈中的M的身份，可以除去3，封閉以允許添加下一個連續核苷酸。通過將使用這些經修飾的核普酸所得的產物排序，就有可能推斷出DNA模板的DNA序列。如果每個經修飾的核普酸上附著有已知對應於特定鹼基的不同標記以幫助區分每個摻入步驟中所添加的鹼基，那麼這些反應可以在單個實驗中完成。合適的標記描述於共同未決的PCT申請PCT/GB/2007/001770中，其內容通過參考整體併入本文。或者，可以實施包含單個加入的每種經修飾核苷酸的單獨反應。經修飾的核苷酸可能攜帶標記以方便其檢測。在一個具體的實施方案中，所述標記是螢光標記。每種核苷酸類型可以攜帶不同的螢光標記。然而，可檢測標記不一定是螢光標記。允許檢測DNA序列中所摻入核苷酸的任何標記都可以使用。一種檢測螢光標記核苷酸的方法包括4吏用對標記核苷酸而言為特定波長的雷射或使用其它合適的光源。可以通過CCD相機或其它合適的檢測方法檢測所摻入核苷酸上的標記所發的螢光。合適的檢測方法描述於共同未決的申請PCT/US2007/007991中，其內容通過參考整體併入本文。一旦完成了第一測序讀取，並確定了足夠的讀取長度，就可複製鏈的其餘部分。如果最初用切口酶產生3'-羥基，則可以在相同的位置上再產生新的3，-羥基並從該位置延伸，然而也可以從作為測序反應一部分摻入的核苷酸的3，-羥基開始繼續複製第一模板鏈。使用所有四種未標記核苷酸和聚合酶進行的該延伸反應會複製第一模板的所有M。固定的引物可含有針對切口酶的限制性位點，並且用限制性酶處理可縮短固定引物或固定^^板雙鏈體，以釋放未被封閉的3，羥基，如圖9中所示。20在開發本文所包含方案的過程中，意想不到地注意到，在模板的5'端能夠與固定引物雜交的情況下，測序結果得到了改善。筒言之，圖4c中所示測序優於圖4a中所示測序。在本文所示實驗結果中，"優於"表示多次循環中保留的信號水平更高，意味著兩個固定末端的衰減曲線斜率更低，並且信號比只固定一端的情況更高。這可能是由於下述事實測序過程期間發生的任何模板鏈斷裂不自動導致^^LM面上脫落，因為模板的3'端也通過雜交保持在合適的位置，但也可能有其他因素導致了這樣的效果。第一模板鏈可以以允許選擇性去除的方式與表面連接。如果>^面去除第一模板鏈，並例如通過用氫氧化物或甲醯胺處理將雙鏈體鏈變性，那麼第二條被複製的鏈作為線性化單鏈保持固定。因為該鏈的末端序列是已知的，所以可以將測序引物與第二^^L鏈雜交，並通過重複如上所述的測序循環，針對第一讀取^^板的另一端確定第二讀取的序列。可通過大量方法實現第一模板鏈的選擇性去除或線性化。允許溶液中測序引物雜交的線性化不一定在模板鏈上留下功能性的3'-羥基，並且可以切割一條鏈或兩務逸。因此，本文使用術語"線性化，，是指互補鏈的選擇性去除。如果將擴增引物之一固定以使其可v^面上切下，則可使用熱或化學變性4Hf使得到的雙鏈DNA成為單鏈，給出含有引物雜交位點的單鏈分子。該單鏈分子可與溶液中的測序引物雜交，以允許對固定的^^1鏈進行測序讀取。所述切割位點是允許通過化學、酶或光化學手段可控地切割第一模板鏈的位點。任何合適的酶、化學或光化學切割反應都可以用於切割。大量合適的方法描述於WO07010251中，其內^it過參考整體併入本文。切割反應可導致去除所切割鏈的部分或全部。合適的切割方法包括，例如，限制性酶消化，在此情況下，切割位點是涉及指導切割雙鏈體模板中一條或兩M的酶的合適P艮制性位點；脫氧核糖核酸和核糖核酸之間鍵的RNA酶消化或化學切割，在此情況下，切割位點可包含一個或多個核糖核苷酸；使用還原劑(如TCEP)對二硫鍵的化學還原，在此情況下，切割位點應包含合適的二硫鍵；用高碘酸鹽對二醇鍵的化學切割，在此情況下，切割位點應該包含二醇鍵；無M位點的生成和隨後的水解等。在一個實施方案中，切割可以發生在^^板多核苷酸雙鏈體中一條或兩M上的切割位點處，所述雙鏈體包含非天然核苷酸、核糖核苷酸或非核苷酸化學修飾之中的一種或多種或其任意組合。本發明方法中所使用的合適切割技術包括但不僅限於如下內容i)化學切割術語"化學切割"包括任何利用非核酸和非酶化學試劑來促i^/實現模板多核苷酸雙鏈體中一條或兩條鏈的切割的方法。如果需要，所述模板多核苷酸雙鏈體中的一條或兩條鏈可包含一個或多個非核苷酸的化學部分和/或非天然核普酸和/或非天然骨架連接，以允許進行化學切割反應。在一個具體的實施方案中，可以將實現化學切割所需的修飾摻入到用於通過固相核酸擴增形成模板多核苷酸雙鏈體的擴增引物中。在一個優選但是非限制性的實施方案中，所述模板多核苷酸雙鏈體的一條鏈(或者，如果通過固相擴增形成則是產生此鏈的擴增引物)可包含允許通過高碘酸鹽(如高碘酸鈉)處理進行切割的二醇鍵。應該理解，可以在切割位點包含多於一個二醇。適合摻入多核苷酸鏈中的基於亞磷醯胺(phosphoamidite)化學法的二醇連接子單元可以購自FidelitysystemInc.(Gaithersburg,MD,USA)。可以使用DNA自動化學合成的標準方法將一個或多個二醇單元摻入到多核苷酸中。因此，可以通過化學合成常規地製備包含一個或多個二醇連接子的寡核苷酸引物。為了將二醇連接子置於距固體支持物最優的距離，可以在二醇連接子和固體支持物的附著位點之間包含一個或多個間隔區分子。間隔區分子可以是非核苷酸的化學部分。用於與二醇連接子組合的基於亞磷醯胺化學法的合適間隔區單元也由FidelitySystems,Inc.提供。與二醇連接子一起使用的一種合適的間隔區是在附帶的實施例中所述的稱為臂26的間隔區。為了使得能在多核苷酸鏈5，端附著在固體支持物上，可修飾臂26使其包含硫代磷酸酯基團。可以在包含間隔區和二醇單元的"多核苷酸鏈"的化學合成中容易地附著疏代磷酸酯基團。其它間隔分子可被用作臂26的備選方案。例如，可以包括一串非乾標"間隔區"核苷酸。通常可以包含1到20個間隔核苷酸，更特別地為1到15個或1到10個，甚至更特別地為2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在一個具體實施方案中，10個間隔區核苷酸被置於固體支持物連接點和二醇連接子之間。在另一個具體實施方案中，使用多聚T間隔區，但也可以使用其它核苷酸及其組合。在另一個具體實施方案中，所述引物可以包含10T間隔區核苷酸。通過"切割劑"處理來切割所述二醇連接子，該切割劑可以是任何能夠促進二醇切割的物質。在一個具體的實施方案中，切割劑是高碘酸鹽，優選地是高碘酸鈉(NaIOj的水溶液。切割劑(如高碘酸鹽)處理切割二醇鍵之後，可以用"加帽劑"處理所述切割產物，以中和切割^^應中生成的反應性物質。用於該用途的合適加帽劑包括胺類，如乙醇胺或丙醇胺。有利的是，所述加帽劑(如丙醇胺)可以包含在與切割劑(如高碘酸鹽)的混合物中，使得反應性物質一形成就被加帽。因為高碘酸鹽處理與核酸完整性和7jC^^面化學性質相容，所以二醇鍵與用於實現切割模板多核苷酸雙鏈體中至少一務逸的切割劑(如高碘酸鹽)的組合可尤其有利地用於對支持於固相上的聚丙烯醯胺^^上模板雙鏈體的線性化。然而，使用二醇^/高碘酸鹽作為線性化的方法並不僅限於聚丙烯跣胺7m膠表面，而是還可擴展到對固定在其它固體支持物和表面上的雙鏈體進行線性化，包括由官能化矽烷包被的支持物(等)。在另一個實施方案中，待切割的鏈(或者，如果通過固相擴增製備的話則是產生此鏈的擴增引物)可以包含允許用化學還原劑(如三(2-羧乙基)磷酸鹽酸鹽(Tris(2-carboxyethyl)畫phosphatehydrochloride,TCEP))切割的二#。ii)切割無^l^位點上文描述了使用無鹼基位點來產生作為測序引物的游離3，-羥基部分。如果兩種擴增引物均被修飾以使得它們能夠被依次切割，則第二切割可用於M面上切下第一鏈。第一(或第二)引物可含有能夠被一種酶(UDG)切割的尿嘧咬鹼基，且第二(或第一)引物可含有能夠被第二種互不影響的酶(FPG糖基化酶)切割的8-氧代鳥嘌呤鹼基。可使用第二無磁J^位點切割來留下附著至表面的測序引物，使得G>5^在第一測序循環時摻入，或者可使所切割的雙鏈體鏈變性，以允許雜交溶液中的測序引物。iii)切割核糖核苷酸在其他各處均由脫氧核糖核苷酸(帶有或不帶有其它非核苦酸的化學23部分、非天然^或非天然骨架連接)組成的多核苷酸鏈中摻入一個或多個核糖核苦酸可以為使用能選擇性切割脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸之間磷酸二酯鍵的化學試劑或使用核糖核酸酶(RNAse)進行的切割提供位點。因此，可以通過使用此類化學試劑或RNA酶在包含一個或多個連續核糖核苷酸的位點處切割所述模板多核苷酸雙鏈體的一條鏈來產生測序;^板。在一個具體的實施方案中，待切割鏈包含單個核糖核苷酸以提^ft學切割位點。能夠選擇性切割脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸之間磷酸二酯鍵的合適化學切割劑包括金屬離子，例如，稀土金屬離子(尤其是La3+，特別是Tm3+、Yl)3+或Lu3+(Chen等.Biotechniques.2002,32:518-520;Komiyama等.Chem.Commun.1999,1443-1451))、Fe(3)或Cu(3)，或暴露於高pH值，例如用如氫氧化鈉等鹼進行處理。"選擇性切割脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸的4^組成通常並不重要，而是可以加以選擇以便優化化學(或酶)切割。例如，如果切割通ii暴露於金屬離子(特別是稀土金屬離子)來實施，則一般優選rUMP或rCMP。果通過固相擴增製備的話則是產生此鏈的擴增引物)，並可能位於所述雙鏈體中在該雙鏈體兩條互補鏈退火時為單鏈的區域中(即5，突出部分)。如果使用正向和反向擴增引物(其中一個引物包含至少一個核糖核苷酸)通過固相擴增來製備所述模板多核苷酸雙鏈體，則用於擴增的標準DNA聚合酶不能夠複製核糖核苷酸模板。因此，擴增產物將包含突出的5，區域,核糖核苷酸與脫氧核糖核香酸之間或兩個核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵也可以被RNA酶切割。任何具有合適底物特異性的內切核糖核酸酶都可以被用於此目的。如果核糖核苷酸存在於在雙鏈分子中兩條互補鏈退火時為單鏈的區域中(即在5，突出部分中)，那麼RNA酶將是對包含核糖核普酸的單鏈具有特異性的內切核酸酶。對於4吏用核糖核酸酶的切割，優選包含兩個或多個連續的核糖核苷酸，並優選地包含2到10個或5到10個連續的核糖核苷酸。核糖核苷酸的確切序列通常並不重要，只是有某些核糖核苷酸一般將摻入到模M中(或者，如24RNA酶對某些殘基之後的切割具有特異性。合適的RNA酶包括例如RNaseA,它在C和U殘基後進行切割。因此，當用RNaseA切割時，切割位點必須包含至少一個是C或U的核糖核苷酸。可以通過使用以適當核糖核普酸前體進行寡核普酸化學合成的標準技術容易地合成摻有一個或多個核糖核苷酸的多核苷酸。如果通過固相核酸擴增製備模板多核苷酸雙鏈體，那麼在用於擴增反應的引物之一中摻入一個或多個核糖核普酸是^艮方《更的。iv)光化學切割術語"光化學切割"包括任何利用光能來切割雙鏈核酸分子中一條或兩M的方法。光化學切割位點可以由雙鏈分子(或者，如果通過固相擴增製備的話則是產生此鏈的擴增引物)中一M的非核苷酸化學間隔區單元提供。合適的光化學可切割間隔區包括PC間隔區亞磷醯胺(4-(4,4，-二曱氧基三苯曱氧基)丁醯絲甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基)-2-氰乙基-(N，N-二異丙基)-亞磷*)(4畫(4,4，畫Dimethoxytrityloxy)butyramidomethyl)-l—(2隱nitrophenyl)國ehtyl畫2畫cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)畫phosphoramidite))，它由美國維吉尼亞州斯特林(Sterling,Virginia,USA)的GlenResearch公司提供(目錄號為10-4913-XX)。其結構如下可以通過暴露於紫外光源來切割所述間隔區單元。使用寡核苷酸化學合成的標準技術，可以將該間隔區單元與使之能附著至固體表面的硫代磷酸酯基團一起附著至多核苷酸的5，端。方便的是，該間隔區單元可以摻入到用於通過固相擴增合成可光切割模板多核苷酸雙鏈體的正向或反向擴增引物中。v)PCR阻塞物在本發明的另一個實施方案中，可以通過4吏用正向和反向引物的固相呵4^o—c附擴增來製備所述^K板多核苷酸雙鏈體，其中一個引物包含"PCR阻塞物(PCRstopper)"。"PCR阻塞物"是阻止用於擴增的聚合酶進行通讀(read-through)從而佳涎伸/複製不能越過該點的任何部分(核普酸或非核苷酸)。其結果是由包含該PCR阻塞物的引物延伸得到的擴增鏈將包含5'端突出部分。該5，端突出(PCR阻塞物本身除外)可由主要通過天然骨架連接的天然脫氧核糖核苷酸構成，即，它可以僅僅是一段單鏈DNA。隨後可以用選擇性切割單鏈DNA而非雙鏈DNA的切割劑(如酶)在5'端突出區域切割該分子，例如用綠豆核酸酶。PCR阻塞物可以是基本上任何阻止用於擴增反應的聚合酶通讀的部分。合適的PCR阻塞物包括但不僅限於六聚乙二醇(HEG)、無^位點和任何可以阻止聚合酶通讀的非天然或經修飾的核普酸，包括DNA類似物如肽核酸(PNA)。可以使用包含穩定無M位點的合適間隔區單元在寡核苷酸化學合成過程中引入穩定的無M位點。例如，可以在寡核普酸化學合成時摻入購自美國維吉尼亞州斯特林的GlenResearch的無>8^吹喃(5，-0-二甲氧三苯甲緣-1，，2，-二脫氧核糖-3，-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)-亞磷醯胺((5'畫0畫Dimethoxytrityl國l，，2，-Dideoxyribose-3,-[(2-cyanoethyl)-(N，N-diisopropyl)-phosphoramidite))間隔區，以引入無^l&位點。這樣，這種位點可以容易地引入到用於固相擴增的寡核苷酸引物中。如果將無M位點摻入到正向或反向擴增引物中，那麼所得擴增產物將在一條上具有包含該無g位點的5，端突出(以單鏈形式)。接著可以通過合適化學試劑(例如暴露於鹼)或敏例如AP內切核酸酶VI，Shida等.NucleicAcidsResearch,1996，Vol.24,4572-4576)的作用切割該單鏈無>^位點。vi)切割肽連接子還可以通過製備綴合結構而將切割位點引入到模板多核苷酸雙鏈體的一條鏈中，在該結構中肽分子與雙鏈體的一條鏈(或者，如果通過固相擴增製備的話則是產生此鏈的擴增引物)相連。隨後可以通過具有合適特異性的肽酶或其它任何合適的非酶化學或光化學切割方式切割肽分子。通常，通過將肽與模板多核普酸雙鏈體中僅一M共價連接來形成所述肽與核酸之間的綴合物，其中所述肽部分與該鏈5，端綴合，在固體表面的附著點附近。如果通過固相擴增制名^K板多核苷酸雙鏈，則可以在擴增引物之一的5'端摻入所述肽綴合物。顯然，該引物的肽組分在擴增時不會被複製，因此，"橋式(bridged)"擴增產物會在一M上包含可切割的5，端肽突出。可以使用本領域中的常規方法製備肽與核酸的綴合物，其中肽與核酸5，端綴合。在這樣的一項技術中，可以分別合成具有所需M酸和核^f列的肽和核酸組分，如通過標準自動化學合成技術，並隨後在7jC/有機溶液中綴合。例如，可從GlenResearch購得的OPeCTM系統是基於N末端硫酯官能化的肽與5，端半胱氨醯化寡核苷酸的"天然連接"。在基於Fmoc的標準固相肽組裝的最終偶聯步驟中使用五氟苯基S-苯甲基硫代琥珀酸酉旨(pentafluorophenylS-benzylthiosuccinate)。4吏用三氟乙酸去保護，在溶液中生成N端S-苯曱M代琥珀醯1^代的肽。在標準的亞磷醯胺固相寡核苷酸組裝的最終偶聯步驟中使用0-反式-4-(N-a-Fmoc-S-叔丁基亞磺醯基-l-半胱氨醯)氨基環己基0-2-氰乙基-N,N-二異丙基亞磷醯胺(0畫trans-4畫(N畫a-Fmoc畫S畫tert畫butylsulfenyl國l國cysteinyl)aminocyclohexyl0國2-cyanoethyl畫N，N-diisopropylphosphoramidite)。4吏用氛7K溶'液去保護，在溶液中生成5，-S-叔丁基亞磺g-L-半胱氨醯官能化的寡核苷酸。通過使用M酚將經修飾肽的千硫基末端轉化成千硫基類似物，同時用三(羧乙基)-膦還原經修飾寡核苷酸。這兩種中間產物的偶聯以及之後的"天然連接"步驟導致形成寡核苷酸-肽綴合物。可以使用本領域已知的任何與所選表面相容的共價附著技術將包含肽與核酸的綴合物鏈共價附著至固體支持物。如果Jlt/核酸綴合物結構是用於固相擴增的擴增引物，則與固體支持物的附著必須使核酸組分的3，端游離。所述肽組分可以設計成可被任意選定的肽酶切割，其中許多是本領域已知的。肽酶的性質沒有特別的限制，只須肽酶可以在所述肽部分的某處切割即可。相似地，肽部分的長度和M酸序列也沒有特別的限制，只是需要它們可以被所選的肽酶切割。對核酸部分的長度和確切序列也沒有特別的限制，它可以是任何期望的序列。如果所述核^l且分在固相擴增中起引物作用，則其長度和核苷酸序列將被選擇成能夠與待擴增模板退火。vii)以限制性內切核酸酶/切口內切核酸酶ii行酶消化用限制性內切核酸酶切割雙鏈多核普^A分子生物學領域一項常規使用的技術。切口內切核酸酶是一類對多核苷酸雙鏈體中一^M進行選擇性切割或"切口，，的酶，其在分子生物學領域也是公知的。本發明在酶的性質方面並沒有限制。基本上任何限制性或切口內切核酸酶都可以使用，只要切割位點可包含合適的識別序列即可。在使用兩個序列讀取的本發明情況下，切口酶的選擇必須與第一延伸循環中所用的不同，這可4吏用具有針對兩種不同酶的識別位點的擴增引物來實現。下文將進一步詳細描述本發明方法。可使用本領域已知的任何合適的固體支持物和任何合適的附著方式，其中的幾個將通過下面的實施例進行說明。在一個具體實施方案中，與固體支持物的連接可以通過共價附著來實現。多核苷酸雙鏈體通常將由兩條包含以磷酸二酯鍵連接的脫氧核糖核苷酸的互補多核苷酸鏈形成，但還可包含一個或多個核糖核苷酸和/或非核苷酸的化學部分和/或非天然核苷酸和/或非天然骨架連接。特別地，雙鏈核酸可在一條或兩M的5，端包含非核普酸化學部分(例如連接子或間隔區)。例如，雙鏈核酸可以包含甲基化核苷酸、尿嘧咬鹼基、硫代磷酸酯基團、核糖核苷酸、二醇鍵、二硫鍵、肽等，但並不限於此。可以包含這些非DNA或非天然修飾以允許進行切割或賦予其它期望的特性，例如，實現與固體支持物的共價附著，或作為間隔區將切割位點置於距固體支持物最佳距離處。模板雙鏈體還可包含位於乾標多核苷酸側翼5'端和3，端的非乾標序列。如果通過固相擴增形成模板雙鏈體，則這些非靶標序列通常來自於用於固相擴增的引物。多核普酸雙鏈體形成包舍〖午多這種第一和第二雙鏈體的單個簇或集群的一部分，所述蔟或集群本身通常形成具有許多這種簇或集群的陣列的一部分。術語"簇"和"集群"通篇可以互換4吏用，其指固體支持物上的離散位點，其包含多個相同的固定化核酸鏈以及多個相同的固定化互補核酸鏈。術語"成蔟陣列"指由此類簇或集群形成的陣列。本發明的一個關鍵特徵在於兩個測序運行可以發生在成簇陣列的同一簇或集群上。在該陣列上每個集群內的每個雙鏈體都包含相同的雙鏈乾標多核苷酸，而不同的集群可由包含不同雙鏈靶標多核苷酸的雙鏈體形28成。在一個具體實施方案中，給定的成簇陣列上至少卯％、更特別的至少95%的集群由包含不同雙鏈耙標多核苷酸的;^板雙鏈體形成，而所述陣列上每個單獨的集群內所有的模板雙鏈體包含相同的雙鏈乾標多核苷酸。然後可以以能夠延伸雜交的引物的方式處理擴增的多核苷酸。所述陣列上每個多核苷酸雙鏈體包含相同的通用引物識別區域，以允許使用相同引物對每個簇進行測序。接著第一測序引物與第一模板鏈雜交，通過將核苷酸或寡核苷酸連續摻入第一測序引物進行測序反應，從而測定靶標多核普酸第一區域的序列。在使原始片段兩端連續的方法中(見圖3)，第一測序運行給出原始片段兩端的序列信息。就這一點而言，該方法是完善的；不需要進一步加工樣品。相反，本發明的另一些方法需要進行兩個測序反應。第一測序>^應通it^固定雙鏈體中釋放的固定引物3'-羥基起始，或通過從溶液中添加的測序引物起始。第二測序反應通過可固定或應用於溶液中的測序引物起始。通it^促進引物與模板退火的4Hf下使引物接觸模板鏈來實現溶液中測序引物與模板鏈的雜交。這樣的條件通常是分子生物學領域技術人員公知的。完成第一測序反應時，如果第一測序引物是固定的，則它可用於進一步延伸該鏈，以複製^^L上的每一個鹼基。這使用四種天然的核苷三磷酸dATP、dGTP、dCTP和dTTP以及合適的聚合酶來實現。如果在測序反應前通過用5，-3，外切核酸酶步驟處理去除互補鏈，則延伸反應可在任何溫度下進行，因為鏈已經是單鏈，因此任何聚合酶如Klenow、Taq或vent都是合適的。如果未去除所述鏈，則會需要具有鏈置換活性的聚合酶如Bst聚合酵。在進行延伸反應前，延伸固定的引物可以是有利的，如圖10中所示。可使用具有下述序列的雜交的寡核苷酸進行延伸，所述序列延伸超過固定引物的3'端，所述固定引物的序列也與;^板末端相應區域的序列相同。該延伸的組分可作為固定引物延伸的基礎，因此所延伸的引物與固定^^L鏈互補。延伸的引物由於其提高的長度而可提高鏈再合成步驟的效率。一旦產生了第一鏈的互補鏈，則可如上所述^面去除第一鏈。然後將第二測序引物與複製的模板鏈雜交，並通過對第二測序引物連續添加核苷酸來進行測序>^應，導致確定靶多核苷酸第二區域的序列。見圖1。如上所述，可使用任何合適的"合成測序"技術進行測序，其中向游離的3'-羥基(其通常由測序引物的退火提供)連續添加核苷酸或寡核苷酸，導致在5，到3'方向上合成多核苷酸。在一個具體的實施方案中，在每次添加後確定所添加核苷酸或寡核香酸的性質。可用於本發明方法的一個具體的測序方法依賴於使用可充當可逆性鏈終止子的經修飾核普酸。本發明中所使用的核苷酸在WO04018497中有完整的說明。一旦經修飾的核苷酸被摻入到與被測序模板區域互補的正在伸長的多核苷酸鏈中，就沒有可用的游離3'羥基來指導進一步的序列延伸，因此聚合酶無法添加另外的核苷酸。一旦確定了摻入正在伸長的鏈中的鹼基的性質，就可除去3，封閉以允許添加下一個連續核苷酸。通過將使用這些經修飾核苷酸得到的產物排序，就有可能推斷出DNA模板的DNA序列。如果每個經修飾的核苷酸上連接有已知對應不同鹼基的不同標記(其幫助區分每個摻入步驟中所添加的鹼基)的話，那麼這些反應可以在單個實驗中完成。或者，可以實施包含單獨添加的每種經修飾核苷酸的單獨反應。經修飾的核苷酸可能攜帶標記以方便其檢測。在一個具體的實施方案中，所述標記是螢光標記。每個核苷酸類型可以攜帶不同的螢光標記。適合在本發明中使用的螢光標記在PCT申請PCT/GB2007/001770中有說明。然而，可檢測標記不一定是螢光標記。可以檢測DNA序列中所摻入核苷酸的任何標記都可以使用。一種檢測帶有螢光標記的核苷酸的方法包括^f吏用標記核苷酸的特定波長雷射或使用其它合適的光源。可以通過CCD相機或其它合適檢測方法檢測核普酸上標記所發的螢光。一種適於確定摻入核苷酸所發出的螢光信號的成像系統在PCT申請號PCT/US07/007991中有說明。本發明的方法並不僅限於使用上述的測序方法，而是可以與基本上任何依賴於在多核苷酸鏈上連續摻入核苷酸的測序方法聯用。合適的技術包括，例如PyrosequencingTM、FISSEQ(螢光原位測序)、MPSS(大規模平行特徵測序)和基於連接的測序方法。用本發明方法測序的靶標雙鏈多核苷酸可以是任何期望測序的多核普酸。所述乾標多核苷酸的序列可以是已知的、未知的或部分已知的，例如在重測序應用中的那些。使用下面詳細說明的模板製備方法，有可能從基本上任何具有已知、未知或部分已知序列的雙鏈耙標多核苷酸開始製備30^板陣列。通過使用陣列，就可能平行地對相同或不同序列的多個靶標進行測序。成對方法的一個具體的應用是在基因組DNA片段的測序中。本方法為基因組重排的鑑別提供了特別的優點，這是因為使用本方法獲得的每個靶標分子的兩個序列區域已知在基因組中一定距離內彼此相連，這取決於起始靶標分子的大小。制^^待測序^^可以通過固相核酸擴增產生核酸集群來製備適合使用本發明方法測序的模板。待擴增的模板通常會含有側翼是已知末端的未知區域，例如根據申請W007052006中所述方法製備的區域，所述參考文獻通過參考^^併入本文。例如，模板可來自基因組DNA樣品，或來自cDNA文庫。擴增可以使用W098/44151、WO00/18957、WO0206456或WO07107710中所述的類似方法來進行，其內^it過參考以務沐形式併入本文。可將待擴增^板製成含有標籤序列，例如如圖12中所示。標籤序列的使用允許在同一測序運行中分析多種不同樣品同時保留每個樣品的特性，所述標籤序列例如在申請W005068656中描述，其通過參考整體併入本文。圖12顯示在第一讀取末端讀取的標籤，但標籤也可在第二讀取的末端讀取，例如使用與標記為P7的鏈互補的測序引物。本發明不限於每蔟兩個讀取，可簡單地通過在簇再生/鏈再合成步驟前使第一延伸的測序引物去雜交並再雜交第二引物而獲M蔟三個或更多讀取。製備用於索引的合適樣品的方法描述於2007年2月1日提交的共同未決的申請US60/899221。為進行擴增，將至少兩種擴增引物的混合物固定化或"接枝"到合適的固體支持物表面上。所述擴增引物是具有以下結構的寡核普酸分子正向引物A-L-X-S1反向引物A-L-X-S2其中A代表允許附著至固體支持物的部分，L是任選的連接子或間隔區部分，X和Y是如上所述允許NU^^面上去除一M或其它鏈的任選的切割位點，Sl和S2是允許對包含耙標雙鏈多核苷酸的模板核酸分子進行擴增的多核苷酸序列。31引物的混合物一般包含大致等量的正向和反向引物。L代表可被包含在內但並非嚴格必不可少的連接子。該連接子可以是包含碳的鏈，例如式為(CH2)n的那些，其中"n"是從1到約1500,例如小於約IOOO，優選小於IOO，例如從2到50，特別是從5到25。然而，也可使用多種其它的連接子，對它們的結構唯一的限制是該連接子必須在隨後計劃使用多核香酸的條件下穩定，例如DNA擴增和測序時使用的條件。還可使用那些不只由碳原子組成的連接子。此類連接子包括具有通式(CHrCH2-0)m的聚乙二醇，其中m為1到600，特別的小於約500。也可將主要由碳原子鏈和PEG構成的連接子修飾成包含打斷所述鏈的官能團。此類基團的例子包括酮、酯、胺、醯胺、醚、硫醚、亞碸和碸。可以單獨使用或與此類官能團組^f吏用烯類、炔類、芳香族或雜芳族部分，或環脂肪族(例如環己基)。例如，環己基或苯環可以通過其l位和4位連接到PEG或(CH。n鏈上。作為上述主要基於飽和碳原子直鏈並任選地插入有不飽和碳原子或雜原子的連接子的替代選擇，可以考慮基於核酸或單糖單元(如葡萄糖)的其它連接子。使用肽作為連接子也在本發明範圍之內。在另一個實施方案中，連接子可包含構成擴增引物的一部分但不參與任何發生在該引物上或使用該引物進行的反應(例如，雜交或擴增反應)的一個或多個核苷酸。此類核苷酸在本文中也可稱為"間隔區"多核苷酸。通常可包含1到20個間隔區核苷酸，更特別地為1到15個或1到10個，更特別地為2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在一個具體的實施方案中，引物包含10個間隔區核苷酸。在一些實施方案中可使用多聚T間隔區，但也可使用其它核香酸和其組合。在一個具體的實施方案中，所述引物可包含10T間隔區核苷酸。所述一個或多個間隔區核苷酸的功能是將靶標雜交和指導擴增所需的引物部分與固體支持物附著位點(即S1或S2)間隔開來。在5，端包含間隔區核苷酸可以顯著改善互補多核苷酸與區域S1或S2雜交的性能。在一個更具體的實施方案中，多核苷酸包含10T間隔核苷酸和用於附著固體支持物的5，硫代磷酸酯基團(A部分)，但如下所述可使用其它附著部分。正向和反向引物中的序列Sl和S2是以組合的形式通過固相橋聯擴增反應來指導模板擴增的多核苷酸序列。待擴增模板本身必須在3，端包含(當視作單鏈時)能夠與正向引物中序列Sl雜交的序列，並在其互補序列5，端包含能夠與反向引物中序列S2雜交的序列。正向和反向引物寡核苷酸中的序列Sl和S2的確切性質取決於意圖擴增的^^的性質。Sl和S2必須能夠與待擴增^^L的互4hM中的相應序列雜交。術語"雜交"包括引物與模板之間的序列特異性結合。引物與模板鏈中其相應序列的結合應在標準PCR中用於引物和模板退火的典型條件下發生。典型的雜交M為初始變性步驟之後的40X:，5xSSC。序列Sl和S2與待擴增^^L鏈上其相應序列的完全互補對雜交來說並不是必不可少的，儘管其為優選的。Sl和S2可為不同的或相同的序列，其長度通常為大約20-30個核苷酸。引物可以包括天然和非天然的DNA鹼基、核糖核苷酸或其任何組合，還可包括非天然骨架連接，如二硫鍵或硫代磷酸酯。切割位點X和/或Y可位於序列Sl或S2內，或者如果連接子L本身是多核苷酸片段，則它們可形成連接子區域L的一組分。在其它一些實施方案中，切割位點可在序列L與Sl或者L與S2的連接處形成，或者在(如果L不存在的話)的連接處形成。A部分可以是任何允許寡核苷酸引物固定在固體支持物上的化學組分。固體支持物的表面本身可以被官能化以允許附著引物。可以使用任何合適的共價或非共價連接方法，其中許多是本領域公知的。例如，生物素化的白蛋白(BSA)可以通過蛋白在表面上的物理吸附而形成生物素基團的穩定附著。也可使用^進行共價修飾，其用於將分子附著在固體支持物上，通常是玻璃載片。例如，四乙HJ^烷和三乙氧基-澳乙醯胺基丙基國珪烷(triethoxy畫bromoacetamidopropyl國silane)的混合物(如1:100的比例)可用於製備官能化的玻璃載片，其允許分子如包含硫代磷酸或硫代磷酸酯官能團的核酸附著。使用可以與^ij^面反應的合適^JL性物質(如生物素-PEG-琥珀醯亞胺酯)，可以將生物素分子附著到表面上。接著可以將擴增引物的混合物與官能化的固體支持物相接觸。在另一些實施方案中，可以使用官能化的聚丙烯醯胺水凝膠來附著引物，其中A部分為含硫的親核基團。合適的含有硫親核體的多核苷酸例子在等(7V"c/e/cJcfV/s及ewflfrA，2001,29(4)，955-959)和戶iVniwg等(丄朋g挑M,V，2000,16，2185-2191)中公開，包括例如簡單硫醇、硫代砩酸酯和硫代磷酖^J^酸酯(thiophosphoramidate)。在一些具體的實施方案中，7jc劍歐由以下兩類的混合物構成(i)第一共聚單體，其為丙烯醯胺、曱基丙烯醯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羥乙酯或N-乙烯基吡咯烷酮；和(ii)第二共聚單體，其為式(i)的官能化的丙烯醯胺或丙烯酸酯H2C=C(H)-C(=0)-A-B-C(I)或者式(II)的甲基丙烯酸酯或曱基丙烯醯胺或H2C=C(CH3)-C(=0)-A-B-C-(II)沐中A是NR或O，其中R是氫或包含1到5個碳原子的任選地取代的飽和烴基；畫B國是任選地取代的式畫(CH2)n畫的亞烷基雙基(biradical)，其中n是1到50的整數；其中n=2或更大時，所述亞^&雙基的一個或多個任選地取代的亞乙基雙基-CH2CHr可以獨立地被亞乙烯基或亞乙生基所取代；其中n=l或更大時，一個或多個亞曱基雙基-CHr可以被包含4到50個碳原子的任選地取代的單環或多環烴雙a代，或被相應的雜單環基或雜多環基雙g代，其中至少一個CH2或CH2被氧、硫或氮原子或NH基所取代；並且C是與化合物反應(以將所述化合物共價結合到水凝膠上)以形成聚合產物的基團。在一個具體的實施方案中，水凝膠由丙烯醯胺與N-(5-溴乙醯氨基戊基)丙烯醯胺(N-(5-bromoacetamidylpentyl)acrylamide,BRAPA)共聚形成，如申請W005065814中所述，其內^t過^考整體併入本文。如本文中所用到的，術語"固體支持物"是指其上附著有多核苷酸分子的物質。合適的固體支持物是市售的，並且對本領域技術人員來說是顯而易見的。可以使用例如玻璃、陶瓷、二氧化矽和矽的材料生產所述支持物。也可以使用具有金表面的支持物。所述支持物通常包含一個平的表34面(平面)，或至少包含其中待連接的多核苷酸大致在同一平面上的結構。或者，所述固體支持物可以為非平面，例如#*。可使用任何合適的尺寸。例如，所述支持物可以在每個方向上為1到10cm的數量級。對於要進行的接枝反應，將擴增引物的混合物在允許部分A與所述支持物發生反應的條件下施加於(適當官能化的)固體支持物。接M應的結果是引物在固體支持物上大體均勻分布。在某些實施方案中，待擴增模板可以與擴增引物一起在單個接^應中接枝到固體支持物上。這可以通過將在5，端包含部分A的;^板分子添加到引物混合物中以形成引物-模板混合物來實現。接著該混合物在單個步驟中接枝到固體支持物上。然後，可以使用固定化的模板和引物在類似於WO00/18957中所述的反應中進行擴增。該反應的第一步是表面結合的模板與表面結合的擴增引物之間的雜交。如果僅將引物混合物接枝到固體支持物表面，並且待擴增模板存在於游離溶液中，則擴增^^應大體上可如WO98/44151中所述進行。簡單的說，引物附著之後，在允許模板和固定化引物雜交的M下將所述固體支持物與待擴增模^目接觸。通常在合適的雜交條件下將所述模板加入到游離溶液中，it^本領域技術人員是明顯的。通常雜交條件為例如起始變性步驟之後為40"C，5xSSC。接著可以進行固相擴增，擴增的第一步是引物^4伸步驟，其中將核苷酸添加到與^板雜交的固定化引物的3，端，以生成完整延伸的互^M。這樣，該互#^其3，端包含能夠與固定在固體支持物上的第二引物分子結合的序列。進一步的擴增輪次導致形成結合於固體支持物的模板分子簇或集群。擴增引物中的序列Sl和S2可以對期望擴增的特定靶標核苷酸具有特異性，但在另一些實施方案中，序列S1和S2可以是"通用的"引物序列，其使得可以擴增任何具有已知或未知序列的被修飾成可用該通用引物進行擴增的靶標核酸。可以通過在待擴增耙標核酸分子的5，端和3，端添加已知接頭序列來修飾耙標雙鏈多核苷酸，由此可製備待用通用引物擴增的合適模板。靶標分子本身可以是任何期望測序的雙鏈分子(如，人類基因組DNA的隨機片段)。接頭序列使得可以使用具有上述通用結構的正向和反向引物擴增固體支持物上的這些分子以形成簇，其中序列S1和S2是通用的引物序列。接頭通常是可以通過常規方法合成的短寡核苷酸。接頭可以通過多種方式(例如亞克隆、連接等)附著至靶標核酸片段的5，端和3，端。更特別的，將兩種不同的接頭序列附著至待擴增靶標核酸分子上，以使一個接頭附著至靶標核酸分子的一端而另一個接頭分子附著至靶標核酸分子另一端。包含側翼是接頭的靶標核酸序列的所得構建體在本文中被稱為"模板核酸構建體"。用於本文所述方法中的合適樣品製備方法在申請號US11/486953中詳述。在用接頭序列修飾之前可以有利地將靶標雙鏈多核苷酸按大小分級。接頭包含允許使用固定於固體支持物上的擴增引物分子擴增核酸的序列。接頭中的這些序列在本文中可被稱為"引物結合序列"。為了起到核酸擴增模板的作用，模板構建體的一條單鏈必須包含與正向擴增引物中序列Sl互補的序列(以使所"向引物分子可結合併引發互#^合成)以及與反向擴增引物分子中序列S2相對應的序列(以^^向引物分子可以結合到互補鏈上)。接頭中允許與引物分子雜交的序列通常長約20-30個核苷酸，但是本發明並不限於此長度的序列。擴增引物中序列Sl和S2確切身份(identity)以及接頭中的相應序列通常來說對本發明並不重要，只要所述引物分子可以與擴增序列相互作用來指導橋式擴增即可。引物設計的原則通常對本領域技術人員來說都是很熟悉的。通過WO98/44151或WO00/18957中類似的方法實施的固相擴增將導致生成"橋式"擴增產物的集群陣列。擴增產物的兩a都在5，端或其附近附著至固體支持物，該附著來自於擴增引物的初始附著。通常，每個集群內的擴增產物來自於單靶標分子的擴增。適用於本發明的擴增方法包括熱循環和等溫擴增。在本發明的一個具體的實施方案中，使用如申請號WO07107710中所述的等溫擴增條件。由於與表面結合的分子的更高滯留和因此造成的更明亮的簇(即摻入經螢光標記的核普酸後具有更大螢光強度的簇)，所以等溫擴增中使用的較低溫度是有利的，所述等溫擴增僅涉及交換緩衝液從而在延伸和變性條件之間改變的循環。36本發明測序方法的應用並不僅限於對擴增反應所產生^^板的測序，儘管其為優選的。本方法還可以應用於對通過適於雜交和測序重複循環的任何其它方法固定於支持物上的雙^^^L進行的測序。可通過參考下文非限制性的實施例進一步理解本發明實施例以下為可應用於本發明方法實施的常規^t術的實施例。實施例l:使用詳述的發明來製備蔟用丙烯醯胺包被玻璃晶片所用的固體支持物通常是8通道玻璃晶片，如SilexMicrosystems(Sweden)所拔_供的產品。然而，本實驗條件和程序也可以容易地適用於其它固體支持物。按以下步驟清洗晶片純Decon清洗30分鐘、milliQ水清洗30分鐘、1NNaOH清洗15分鐘、milliQ水清洗30分鐘、0.1NHC1清洗15分鐘、milliQ水清洗30分鐘。製備聚合物溶液製備10ml2%的聚合混合物。-10ml2%丙烯醯胺的milliQ7jC溶液-165nl100mg/ml的N-(5-溴乙醯^^戊基)丙烯醯胺(BRAPA)的DMF溶液(23.5mg溶於235plDMF)-11.5nl的TEMED-100fil50mg/ml過硫酸鉀的milliQ水溶液(20mg溶於400nl水中)首先用氬氣對10ml丙烯酖胺溶液除氣15分鐘。依次將BRAPA、TEMED和過硫酸鉀溶液加入到丙烯醯胺溶液中。接著將混合物快速渦旋混合後立即使用。1^聚合反應在室溫下進行1小時30分。然後，用milliQ水清洗通道30分鐘，並裝入0.1M磷酸鉀緩衝液保存待用。實施例2合成N-f5-溴乙醯氨基戊基)丙烯醯胺(BRAPA)(1)N-Boc-l，5-二氨基戊烷甲^Pt酸得自Novabiochem。溴乙醯氯和丙烯醯氯得自Fluka。所有其它試劑均為Aldrich的產品。通過壓力平衡式滴液漏鬥在0"C下歷時1小時將丙烯醯氯(1.13亳升，l份)加入到N-Boc-l,5-二氨基戊烷曱苯磺酸(5.2克，13.88mmol)和三乙胺(4.83毫升，2.5份)在THF(120亳升)中的攪拌懸浮液中。在室溫下攪拌反應混合物並用TLC檢查反應進度(石油醚:乙酸乙酯1:1)。兩小時後，濾掉反應中形成的鹽並將濾液蒸發至幹。用快速層析純化殘餘物(先用純石油醚，然後用最高至60%的乙酸乙酯梯度)得到2.56g(9.98mmol,71%)淺褐色固體產物2。NMR(400MHz,d6-DMSO):1.20-1.22(m，2H，CH2)，1.29-1.43(m,13H,tBu，2xCH2),2.86(q，2H，J=6.8Hz和12.9Hz,CH2)，3.07(q,2H，J=6.8Hz和12.9Hz,CH2)，5.53(dd，1H，J=2.3Hz和10.1Hz，CH)，6.05(dd，1H，J=2.3Hz和17.2Hz，CH),6.20(dd，1H,J=10.1Hz和17.2Hz，CH),6.77(t,1H，J=5.3Hz，NH)，8.04(bs，1H,NH)。C13H24N203的質量(電噴霧+)計算值為256，實測值為279(256+Na,。產物2(2,56g,lOmmol)溶解於三氟乙酸:二氯甲烷(1:9，100ml)中並在室溫下攪拌。通過TLC監測(二氯甲烷:甲醇9:1)M進程。結束時，將反應混合物蒸發至幹，將殘餘物與甲苯共蒸發3次，然後用快速色鐠進行純化(用純二氯甲烷，然後用最高至20%的甲醇梯度)。得到白色粉末狀的產物3(2.43g,9mmol，90%)。力NMR(400MHz,D20):1.29-1.40(m，2H，CH2)，1.52(quint.，2H，J=7.1Hz,CH2)，1.61(quint.，2H，J=7.7Hz，CH2)，2.92(t，2H，J=7.6Hz，CH2)，3.21(t,2H,J=6.8Hz,CH2)，5.68(dd，1H，J=1.5Hz和10.1Hz，CH)，6.10(dd，1H，J=1.5Hz和17.2Hz，CH)，6.20(dd，1H，J=10.1Hz和17.2Hz，CH)。C8H16N20的質量(電噴霧+)計算值為156,實測值為179(156+Na,。通過壓力平衡滴液漏鬥在-60"C下(在杜瓦瓶中cardice和異丙醇浴)歷時l小時將溴乙醯氯(2.07亳升，l.l份)加入到產物3(6.12g，22.64mmol)和三乙胺(6.94ml，2.2份)的THF(120ml)混懸液中。然後反應混合物在室溫下攪拌過夜，在次日通過TLC(二氯曱烷:甲醇9:1)檢查反應的完成情況。濾去^^應生成的鹽並將反應混合物蒸發至幹。將殘餘物用色譜純化(用純二氯甲烷，然後再用最高至5%的曱醇梯度)。得到3-2g(11.55mmol,51%)白色粉末狀產物1(BRAPA)。在石油醚乙酸乙酯的混合物中對產物進行重結晶，得到3g產物1。'HNMR(400MHz，d6-DMSO):1.21-1.30(m,2H,CH2),1.34-1.48(m,4H，2xCH2),3.02-3.12(m，4H，2xCH2),3.81(s，2H，CH2)，5.56(d，1H，J=9.85Hz，CH)，6.07(d，1H,J=16.9Hz，CH)，6.20(dd,1H,J=10.1Hz和16.9Hz，CH)，8.07(bs,1H,NH)，8.27(bs，1H，NH)。C1H17BrN202的分子量(電噴霧+)計算值為276或278，實測值為279(278+H4)，299(276+Na")。實施例3:將引物接枝在SFA包被的晶片上將SFA包被的晶片置於改裝過的MJ-Research熱循環儀中，並連接蠕動泵。將10mM磷酸緩衝液(pH7.0)中的0.5jiM正向引物和0.5jiM反向引物組成的接枝混合物以60fil/分鐘的流速在20X:下75秒內泵入晶片的通道內。隨後將熱循環儀加熱到51.6"C，晶片在該溫度下孵育l小時。在這段時間內，接枝混合物經歷了18輪泵循環以15nl/分鐘的;組持續泵入接枝混合物20秒，接著將溶液來回地(以15jd/分鐘泵入5秒，然後以15jil/分鐘泵出5秒)泵入泵出180秒。在18個泵循環之後，將晶片以15nl/分鐘的;絲在51.6"C下泵入5xSSC/5mMEDTA清洗，持續300秒。接著將熱循環儀冷卻至20x:。通常，所述引物^1摻入切割所需的任何特定序列或修"飾的5，-硫代磷酸酯化寡核香酸。它們的序列和供應商根據將務使用它們的實驗的不同而不同，在本實施例中，其與模板雙鏈體5，端互補。在本方法中4吏用的DNA序列是240個威基的單個單模板序列，其末端與接枝引物互補。模板雙鏈體的全序列在圖6中展示。如所述的，使用氫氧化鈉處理使雙鏈體DNA變性，^i2tit稀釋。對於一些詳述的實驗，擴增的簇在接枝引物之一中包含二醇鍵。可以通過將合適的^入到用於固相擴增的引物之一中而引入二醇鍵。二醇39亞磷醯胺的合成描述於下文實施例4中。可使用高碘酸鹽和丙醇胺如所述地切割含這些二醇鍵的產物，並如所述雜交得到的單鏈多核苷酸。接枝引物在5，末端含有TM序列，其用作間隔基團以輔助線性化和雜交。接枝到晶片上的兩個引物的序列被設計成使得適當的處理能夠釋放游離的3，-羥基部分，並如下含有任一UM:P5二醇5'PS-TTTTTTTTTT-diol-AATGATACGGCGACCACCGA(SEQIDtJO-l)P7GAU:5'PS-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAU(SEQ工DNO:2》如果推測待擴增的引物含有如下的相關識別位點，則相同的引物可允許用BstNBl進行切割為了能夠用i^巨離切割限制性酶Mmel進行切割；兩種接枝引物的末端均含有以下序列5，…TCCGAC-3，為了能夠用i^巨離切割限制性酶EcoP15進行切割；兩種接枝引物的末端均含有以下序列5，…CAGCAG-3，引物的i殳計顯示於圖5和圖6中。實施例4:製備用於DNA偶聯的二醇-亞磷醯胺formulaseeoriginaldocumentpage40在N2下將1,6誦己二醇(SigmaAldrich99%)(14.6g，124mmol)、7V，7V畫歩驟l:二異丙基乙胺(Htinig，s鹼；SigmaAldrich;經過再蒸鎦的)(21.6mL，124mmol)溶於無水DCM/DMF(250/50mL)中。將溶液冷卻至0t!並添加第一部分4，4，-二甲氧三苯甲基氯(DMTr-Cl;Sigma-Aldrich95%)(10.5g，31mmol)。然後將Jl應混合物溫熱至室溫。攪拌1小時後，將>^應混合物再次冷卻至On並添加第二部分DMTr-Cl(10.5g，31mmol),然後在室溫下再攪拌2小時。TLC(EtOAc:石油醚4:6)分析表明消耗了約95%的起始材料衍生物(DMTr-OH)。將反應物在減壓下濃縮，並向剩餘物中倒入NaHC03(飽和)水溶液(500mL)。用石油謝EtOAc(2:1)(3x1000mL)萃取得到的混合物。將合併的有機層在MgS04上乾燥，並真空濃縮。將殘餘物與二曱苯(2xi00mL)共同蒸發，以去除DMF。將>^混合物在>^上預吸附，並使用含l。/。Et3N從石油醚到石油S^/EtOAc(7:3)的溶劑作為洗脫液對其進行快速層析。得到的淡黃色油為16.58g，64%,還含有7.8g(17%)雙-三苯曱基化的副產物。TLC:及f:0.35(二醇-1);Jf:0.7(雙-三苯甲基化的副產物)(石油S^/EtOAc6:4)。力NMR(400MHz,CDC13):S1.32-1.44(m,4H，2xCH2)，1.54-1.68(m,4H,2xCH2)，3.06(t，/=6.6Hz,2H，CH20)，3.62-3.68(m,2H，CH2OH)，3.81(s,6H，2xMeO),6.83-6.85(m,4H,Ph)，7.24-7.35(m，7H，Ph)，7.45-7.47(m，2H，Ph)。步驟2:二辱1二醇-3在N2氣氛下，向無水DCM(200mL)中的二醇-l(16.6g,39.5mmol)溶液中添加四丙基過釕酸銨(tetrapropylammoniumperruthenate,TPAP;SigmaAldrich97%)(277mg，0.79mmol)。將溶液冷卻至0"C並添加7V國甲基嗎啉7V-氧化物(SigmaAldrich97%)(2.7g，23mmol)。將反應物溫熱至室溫。1小時後，在四個小時的時間添加其餘三部分的TV-曱基嗎啉iV-氧化物(3x2.0g，51.2mmol)。TLC(EtOAc:石油醚4:6)表明>^應完成。用(飽和)NaHC03水溶液(1000mL)猝3^Jl應，並萃取至CH2C12(4x1000mL)。將合併的有機層在MgS04上乾燥。將溶液減壓濃縮。使用含l%Et3N41從石油醚到石油敏EtOAc(6:4)的溶劑作為洗脫液，通過快速層析分離呈淡黃色油的二醇-3，9.9g，60%。TLC:及f:0.7(石油S^/EtOAc6:4)。iHNMR(400MHz,CDCl3):S1.30-1.37(m，2H，CH2)，1.48-1.57(m,4H，2xCH2)，2.34(td,/=1.7和7.4Hz，2H,C恥HO),2.97(s,2H，CH20)，3.72(s,6H,2xMeO)，6.73-6.76(m,4H,Ph),7.10-7.26(m，7H,Ph)，7.34-7.36(m，2H,Ph)，9.67(t，/=1.7，1H，CHO)。歩驟3:二醇-2在油浴(140。C)中，在N2下將三苯膦(Sigma-Aldrich99%，ReagentPlusTM)(39.3g，150mmol)和乙酸4國溴代丁酯(Sigma國Aldrich)(26mL，180mmol)在無水甲苯(300mL)中的溶液回流加熱36小時。回流期間油被沉澱出來。將反應混合物冷卻至室溫。曱^^液的TLC(石油S^/EtOAc7:3)分析表明仍然存在剩餘的三苯膦(Rf:0.8)。將上清液傾析進另一圓底燒瓶中，並濃縮至約30mL的體積。將溶液再回流加熱12小時。傾析上清液。合併油部分，溶於水(500mL)中並用EtOAc(2x500mL)萃取。將合併的有機層用水(150mL)反萃取。合併兩批7jC層，減壓蒸發。將得到的殘餘物與乙腈(2x100mL)共蒸發，得到78.4g、95%產率的淡黃色油狀物。NMR表明產物是純淨的，並被用於下一步驟反應而不進行進一步的純化。TLC:^f:0.0(石油St/EtOAc7:3)。力NMR(400MHz，CDC13):31.63-1.73(m，2H，CH2),1.94(s，3H，2xCH3),2.06-2.16(m,2H，CH2)，3.97-4.05(m,2H,CH2P)，4.11(t,/=6.0，2H,CH20)，7.69-7.95(m，15H，Ph)。31P匪R(162MHz，CDC13):25.9ppm。質鐠法細節LC-MS(電噴射陽性)(M+)377。步驟4:42formulaseeoriginaldocumentpage43二醇4將二醇-2(10.34g,22.7mmol)稱重進圓底燒瓶中，並用DCM(20mL)溶解。然後將溶液減壓蒸發，直到其產生白色泡沫。然後將燒瓶置於高真空24小時。在N2下向該燒瓶中添加無水THF(180mL)。用丙酮-乾冰浴將得到的懸浮液冷卻至-78。C。在N2下添加KOBut(3.3g,29.5mmol)同時劇烈攪拌。懸浮液的顏色緩慢地變為橙色，並逐漸沉澱出白色固體。在半個小時期間，向該懸浮液中逐滴添加THF(50mL)中的二醇-3溶液(在反應前在高真空下以60n乾燥1小時)(9.5g,22.7mmol)。然後去除丙酮-乾冰浴。將反應混合物緩慢溫熱至室溫並再攪拌l小時。反應混合物的顏色在添加二醇-3後變為黃色。減壓濃縮反應混合物。將所得殘餘物在DCM(800mL)和NaCl(飽和)水溶液(800mL)之間分配。用額外的DCM(2x800mL)萃取水層。合併有機層，在MgS04上乾燥，過濾，並減壓蒸發得到黃色油。將油溶於THF/MeOH(125/100mL)中並冷卻至0X:。向該溶液中添加NaOH(水中1M，25mL)。將>^應物攪拌1小時後，TLC分析表明起始材料已完全消耗。用乙酸(1.5mL)中和反應混合物。減壓濃縮反應混合物。將所得殘餘物在DCM(800mL)和NaHC03(飽和)水溶液(800mL)之間分配。用額外的DCM(2x800mL)萃取水層。合併有機層，在MgS04上乾燥，過濾並蒸發得到淡黃色油。使用含1%EtsN從石油醚到石油S^/EtOAc(5:5)的溶劑作為洗脫液，通過快速層析分離呈亮黃色油的二醇-4，6.45g,60%。TLC:Rf=0.45(石油！^/EtOAc6:4)。NMR(400MHz，CDC13)S1.24-1.32(m,4H,2xCH2)、1.54-1.57(m，4H,2xCH2)、1.93-1.96(m，2H,CH2)、2.02-2.07(m，2H，CH2)、2.96(t，/=6.6Hz，2H,CH20)、3.54-3.59(m，2H,CiJ2OH)、3.72(s,6H，2xMeO)、5.29-5.32(m，2H，2x=CH)、6.73-6.77(m，4H，Ph)、7.11-7.27(m,7H，Ph)、7.36-7.38(m，2H，Ph)。步驟5:formulaseeoriginaldocumentpage44二醇4二醇》5在室溫下和N2氣氛下，向二醇-4(5.68g，12mmol)和咪唑(SigmaAldrich,99%)(1.63g，24mmol)在無水DMF(100mL)中的溶液中，逐滴添加叔丁基二苯基甲珪M^氯(SigmaAldrich，98%)，(4.05mL，15.6mmol)。將反應物攪拌1小時。TLC(石油鼢EtOAc8:2)表明初始材料被完全消耗。添加飽和的NaHC03水溶液(500mL)以猝滅反應。用石油S^/EtOAc(2:l)(3x500mL)萃取得到的混合物。將有機層合併，在MgS04上乾燥，過濾，並蒸發得到黃色油。使用含1%Et3N從石油醚到石油St/EtOAc(9:1)的溶劑作為洗脫液，通過快速層析分離呈無色油的二醇-5,8.14g,95%。TLC:Rf-0.7(石油醚EtOAc8:2)。力NMR(400MHz,CDC13):80.97(s，9H，3xMe)，1.19-1.30(m，4H，2xCH2)，1.48-1.55(m，4H，2xCH2)，1.91-1.95(m,2H，CH2)，2.01-2.06(m，2H,CH2)，2.95(t，/=6.6Hz，2H，CH20)，3.58(t,/=6.3Hz，2H，CH20)，3.70(s,6H，2xMeO)，5.24-5.27(m，2H,2x=CH)，6.72-6.75(m,4H,Ph),7.11-7.37(m,15H,Ph)，7.57-7.60(m,4H,Ph)。步驟6:.OTBDPS二醇-S固Tr、TBDPS將二醇國5(9.27g，13mmol)、AD-mix-a(SigmaAldrich)(18.2g)、甲磺醯胺(SigmaAldrich，97%)(1.23g，13mmol)、《-BuOH(65mL)和7JC(65mL)在55t!下一起劇烈攪拌14小時。TLC分析(石油醚EtOAc6:4)表明初始材料消耗約95%。將反應混合物冷卻至室溫，用亞硫酸鈉(15.3g,12mmol)處理，然後再攪拌30分鐘。向反應物中添加飽和NaHC037JC溶液(500mL)。用EtOAc(3x500mL)萃取得到的混合物。將有機層合併，在MgS04上乾燥，過濾並蒸發得到黃色油。使用含1%Et3N從石油醚到石油醚/EtOAc(l:l)的溶劑作為洗脫液，通過快速層析(矽膠，Fluka，70-230篩44目)分離呈白色固體的二醇-6，7.96g,82%。TLC:Rf=0.3(石油醚EtOAc6:4)。力NMR(400MHz，CDC13)51.07(s,9H，3xMe)，1.41-1.7(m，12H，6xCH2)，1.94(d，/=4.3Hz，1H,OH),2.94-2.95(m，1H，OH)，3.06(t,/=6.6Hz,2H,CH20)，3.61-3.63(m，2H,2xCHOH),3.73(t，/=5.6Hz，2H，CH20),3.81(s，6H，2xMeO)，5.24-5.27(m,2H，2x=CH),6.82-6.85(m，4H，Ph)，7.21-7.47(m，15H,Ph)，7.57-7.60(m，4H，Ph)。步驟7:在室溫下向二醇-6(7.96g,13mmol)和DMAP(Sigma-AldrichReagentPlusTM，99%)(260mg，2.13mmol)在吡咬(15mL)與DCM(30mL)混合物中的溶液中，添加乙酸酐(Fluka99%)(2.5mL,26.68mmol),TLC分析(石油醚:EtOAc6:4)表明1小時後初始材料完全消耗。通過飽和NaHC03水溶液(500mL)猝滅反應。5分鐘後，用DCM(3x500mL)萃取混合物。將有機層合併，在MgS04上乾燥，過濾並蒸發。將殘餘物與甲苯(2x100mL)共同蒸發。將得到的黃色油應用於>^塞(50g,Fluka，70-230篩目)上，使用含0.1。/。Et3N從石油醚到石油S^/EtOAc(7:3)(各250mL)的洗脫液洗脫，以去除dmap。將合併的產物級分濃縮至幹。在ox:下將得到的無色油溶於THF(100mL)中並用TBAF(Sigma-Aldrich;5%(重量)水)(THF中1M，15mL)處理。將反應溶液緩慢溫熱至室溫並攪拌2小時。TLC分析(石油醚:EtOAc6:4)表明脫珪^&化完成。在低溫下減壓蒸發揮發性溶劑(THF)。向殘餘物中添加飽和NaHC037JC溶液(500mL)。用EtOAc(3x500mL)萃取得到的混合物。將有機層合併，在MgS04上乾燥，過濾，並蒸發得到黃色油。使用含l。/。Et3N從石油醚到石油B^/EtOAc(l:l)的溶劑作為洗脫液，通過快速層析分離呈白色固體的二醇-7，4.2g,66%。TLC:Rf=0.45(石油醚EtOAc1:1)。45力醒R(400MHz,CDC13)51.29-1.33(m,4H,2xCH2)，1.47-1.63(m,8H,4xCH2)，1.99,2.01(2s，6H，2MeC(O))，3.00(t，/=6.5Hz，2H,CH20),3.60-3.64(m，2H，CH20),3.75(s,6H,2xMeO)，4.92-4.97(m,2H，2xCHOAc),6.76-6.80(m，4H，Ph)，7.15-7.29(m，7H，Ph)，7.38-7.40(m,2H,Ph)。步驟8:在室溫和N2下，向DCM(17mL)中二醇-7(2.08g,3.5mmol)和二異丙基乙胺(SigmaAldrich)(1.53ml,8.75mmol)的溶液中逐滴添加2-氰乙基A^V-二異丙基氯亞磷酖胺(1.0g,4.2mmol)。攪拌1小時後，TLC分析(石油醚:EtOAc4:6)表明起始材料完全消耗。減壓濃縮溶劑(THF)。對所得的殘餘物直接進行層析。使用含1%Et3N從石油醚到石油S^/EtOAc(1:1)的溶劑作為洗脫液，通縮快速層析分離呈無色漿體的二醇-8，2.5g，卯。/。。TLC:Rf=0.55(石油醚:EtOAc4:6)。力NMR(400MHz,CDC13)81.09、1.10、1.11、1.12(4s，12H，N(CHMe2)2),1.26-1.31(m，4H，2xCH2)，1.45-1.56(m，8H，4xCH2)，1.95、1.969、1.971、1.98(4s，6H，2MeCO)，2.56(t,/=6.5Hz，2H，CH2CN),2.95(t，/=6.5Hz，2H，CH20)，3.49-3.55(m，4H，CH20)，3.72(s,6H，2xMeO)，4.89-4.92(m，2H,2xCHOAc)，6.74-6.76(m,4H，Ph)，7.13-7.25(m，7H，Ph)，7.34-7.37(m,2H,Ph)。31PNMR(162MHz,CDC13):148.67,148.69ppm。實施例5:通過等溫擴增制"^簇步驟l:雜交和擴增擴增過程中使用的DNA序列是240個鹼基的單個單模板序列，其末端與接枝引物互補。其中模板雙鏈體中一#^的全序列顯示於圖6中。所述雙鏈體DNA(1nM)用0.1M氫氧化鈉處理變性，隨後在"雜交緩衝46液"(5xSSC/0.1%吐溫)中快速稀釋(snapdilution)至所需的0.2-2pM"工作濃度"。通過使用MJResearch熱循環儀的等溫擴增來進行表面擴增，該儀器與裝有Ismatec管(桔黃/黃色，0.51mmID)的8通道蠕動泵IsmatecIPCISM931聯用。下文顯示該儀器的圖示。imageseeoriginaldocumentpage47臨擴增反應前將單鏈模板與所述接枝引物雜交，因此這從初始引物延伸步驟開始，而不^1^^^L變性步驟開始。雜交程序從嚴格緩衝液中的加熱步驟開始，以保證在雜交前完全變性。在20分鐘的緩慢冷卻步驟中發生雜交後，用清洗緩衝液清洗所述流通池5分鐘(0.3xSSC/0.1%吐溫)。典型的擴增過程在下表中有詳細說明，並詳細說明了每個通道的流通體積l.模板雜交和第一延伸tableseeoriginaldocumentpage47tableseeoriginaldocumentpage48雜交預混物(緩衝液)=5xSSC/0.1%吐溫；雜交混合物=0.1M氫氧化物DNA樣品，在雜交預混物中稀釋；清洗緩衝液=0.3xSSC/0.1%吐溫；擴增預混物-2M甜菜鹼，20mMTris，10mM硫酸銨，2mM硫酸鎂，0.1%Triton,1.3%DMSO，pH8.8;擴增混合物-2M甜菜鹼，20mMTris，10mM硫酸銨，2mM硫酸鎂，0.1%Triton,1.3%DMSO，pH8.8加上200fimdNTP和25單位/mL的Taq聚合酶(NEB產品號M0273L)。Bst混合物=2M甜菜鹼，20mMTris，10mM硫酸銨，2mM硫酸鎂，0.1%Triton，1.3%DMSO，pH8.8加上200jiMdNTP，s和80單位/mL的Bst聚合酶(NEB產品號M0275L)。步驟2:封閉可延伸的3，-OH基為了製備封閉預混物，將1530nl的水與170jil的10x封閉緩衝液(NEB緩衝液4;產品號為B7004S)混合，終體積為1700fil。為了製備封閉混合物，將1065.13nl的封閉預混物、21.12nl的125jiMddNTP混合物以及13.75jil的TdT末端轉移酶(NEB;組分號M0252S)混合，終體積為1100jiL。為了封閉在流通池通道中所形成的簇中的核酸，儀器的計算機組件使得適當的封閉緩衝液流經流通池，並如下文示範性實施方案中所示控制溫度。tableseeoriginaldocumentpage49實施例6:處理簇以獲得游離的3，-羥基方法a:USERtm在MJ平臺上以以下條件處理擴增的簇在38t!下用USER預混物(10mMKC1，20mMTris-HCl(pH8.8)，10mM(NH4)2S04，2mMMgS04，0.1%Triton-X100)流動5分鐘；在38C下用USER緩衝液(User預混物加10單位/mLUSER酶混合物(NEB目錄號M5505))流動5分鐘並孵育45分鐘；在清洗緩衝液中清洗5分鐘。在30r:下，在NEB緩衝液4(1xNEB4=50mM乙酸鉀，20mMTris畫乙酸，10mM乙酸鎂，lmMDTTpH7.9)中用T7外切核酸酶(100單位/mL)將被切割的鏈處理30分鐘，並用清洗緩衝液衝洗。通過SBS5連接引物的連接來延伸鏈3'-GTAGCTGAGCCAAGTCGTCCTTACGGCTCTGGCT-POW(SEQIDNO:3)將雜交預混物中的引物(lnM)在60"C下流入池中，並允許其雜交5分鐘。將池子用T4連接緩衝液衝洗並冷卻至301C。添加T4DNA連接酶，將反應保持30分鐘之後用洗滌緩衝液衝洗。經雜交的連接SBS5引物的3，-端可用於隨後的延伸反應。方法b:Nt.BstNBI在MJ平臺上用以下條件處理被擴增的簇；在551C下用15jd/分鐘的NEB緩沖液3將流通池洗滌5分鐘，然後用50nlNt.BstNBI(lxNEB緩衝液3;最終酶濃度1000單位/mL)處理。將池子在55lC下孵育1小時，然後降低至20X:並用NEB緩沖液3衝洗(15jtl/分鐘衝洗5分鐘)，然後用清洗緩衝液衝洗(15nl/分鐘衝洗5分鐘)。在30"C下，在NEB緩衝液4(1xNEB4=50mM乙酸鉀，20mMTris-乙酸，10mM乙酸鎂，lmMDTTpH7.9)中用T7外切核酸酶(100單位/mL)將被切割的鏈處理30分鐘，並用清洗緩沖液沖洗。實施例7:從固定引物開始測序使用經修飾的核香酸對來自上文說明性方案的簇進行測序，所述經修飾的核苷酸如國際專利申請WO2004/018493中所述製備，並如2006年5月18日提交的美國申請號60/801270中所述用四種光鐠不同的螢光團標記。簇的測序在國際專利公開WO06064199中更詳細描述。核苷酸摻入步驟中使用突變9。N聚合酶(一種包含三突變L408Y/Y409A/P410V和C223S的外切型變體(exo-variant))。將摻入混合物、摻入緩衝液(50mMTris-HClpH8.0，6mMMgS04，1mMEDTA，0.05%(v/v)Tween-20，50mMNaCl)以及110nMYAV外切型-C223S和各1nM的四種經標記的修飾核苷酸施加在成簇模板上，並加熱到45X:。50將模板在45t:保持30分鐘，冷卻至201C並用摻入緩衝液清洗，再用5xSSC/0.05。/。吐溫20清洗。然後，使模板暴露於成像緩衝液(新溶解的100mMTrispH7.0，30mMNaCl，0.05%吐溫20，50mM抗壞血酸鈉)。在室溫下用四種顏色掃描模板。接著使模l晷露於如下所述的切割和摻入的測序循環切割提供切割緩沖液(0.1MTrispH7.4，0.1MNaCl和0.05%吐溫20)，125fiL/通道；60jiL/分鐘。加熱至60"C。用切割混合物(切割緩衝液中的100mMTCEP)處理所述蔟，75jiL/通道；60jiL/分鐘。共等待15分鐘，另外每4分鐘泵入新鮮緩衝液，25jiL/通道；60jiL/分鐘。冷卻至2ox:。用酶緩衝液清洗。用5xSSC/0.05。/。吐溫20清洗。提供成^m衝液。室溫下用4種顏色掃描。摻入提^^入緩衝液，125nL/通道；60jiL/分鐘，加熱到60*C。用摻入混合物進行處理，75jiL/通道；60jiL/分鐘。共等待15分鐘，另外每4分鐘泵入新鮮的摻入混合物，25^L/通道；60nL/分鐘。冷卻至2ox:。用摻入緩衝液，清洗75^L/通道；60jiL/分鐘。用5xSSC/0.05。/。吐溫20清洗，75pL/通道；60jiL/分鐘。提供成4緣衝液，100nL/通道；60jiL/分鐘。室溫下用4種顏色掃描。51重複摻入和切割過程至期望的循環數。使用基於全內反射的螢光CCD成像設備檢測摻入的核苷酸，所述成像設備描述於2006年3月31日提交的"SystemsandDevicesforSequencebySynthesisAnalysis,"USSN60〃88,248+。顯示兩個摻入循環的代表性圖像顯示於圖7中。第一個摻入循環(右上圖)顯示具有3271個簇的圖像，所^根據單模M列摻入了G三磷酸。第二個循環(右下圖)顯示第二個循環的圖像，其中3235個簇已摻入A三磷酸。主圖顯示共定位的圖像，其中3058個簇是兩圖共有的，顯示簇可經歷從固定引物開始的測序循環。實施例8:用未標記的核苷酸進行延伸在測序程序的最後去封閉步驟後，用四種dNTP和Bst聚合酶對陣列進行處理以延伸一輪，與簇產生過程中的延伸循環類似。如下處理陣列說明溫度時間泵入體積(。c)(秒)(叫泵入擴增預混物60756075泵入Bst混合物60956095停止流動，保持溫度60180靜止0泵入清M衝液6012060120實施例9:處理以切除簇的中央區域用Mmel然後用T4聚合酶處理簇，以去除二核苷酸突出端，並用T4連接酶結合36個>5^對序列中經修飾的平末端。已在環狀栽體構建體的方案中描述了相同的程序(7Vfl似wM^/^&，2，105-111(2005))，並且使用針對適當酶推薦的緩衝液條件和溫度對擴增的簇重複該方法。實施例10:測序引物的線性化和雜交52為了製備線性化混合物，將1429jiL水、64mg高碘酸鈉、1500pL甲跣胺、601MTrispH8和6011.4jiL3-氨基丙醇混合成3mL的^f^積。將高碘酸鹽首先與水混合，而Tris與甲醯胺混合。然後將兩種溶液混合在一起，並向混合物中添加3-氨基丙醇。為了將流通池通道中形成的簇中的核酸線性化，在20X:下以15ftL/分鐘流過線性化混合物，每個通道300nL;然後以相同流速流過75nL水。為了製備引物混合物，將895.5nL雜交緩衝液和4.5pL測序引物(100jiM)混合至卯0nL的務沐積。該反應中使用的測序引物的序列為5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC(SEQIDNO:4)為了將簇中的核酸變性並雜交測序引物，將以下試劑流經流通池:步驟說明溫度(。C)時間(秒)流速(^1/分鐘)泵入體積(叫1泵入0.1MNaOH2030015752泵入TE2030015753泵入引物混合物2030015754保持在60C60卯0005泵入清M衝液復23001575實施例ll:從未固定的引物開始測序以與實施例7中所述完全相同的方式進行測序過程。在兩次讀取的情況下，可將第二讀取與第一讀取比對，或在Mmel處理的情況下將測序過程進行36個循環。這種單次讀取針對原始片段的每個末端產生18個鹼基的信息。儘管已為了清楚和理解的目的從一些細節上描述了前文的發明，但53是本領域技術人員閱讀本公開內容後會明白，可進行形式和細節上的多種改變，而不偏離本發明的真正範圍。例如，上述所有技術和i殳備均可以多種組合使用。本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請或其它文獻通過參考B併入用於所有的目的，視同已逐個指出每個單獨的出版物、專利、專利申請或其它文獻通過參考併入用於所有目的。實施例12:從片段文庫進行配對讀取以下的實驗細節描述了如上所述的本發明一個實施方案的完整解釋。使用純化的人BACDNA(將140k人染色體6插入片段克隆進pTARBAC載體中)來產生文庫。首先如下製備用於連接分叉接頭的DNA:通過噴霧(nebulization)使DNA片段化，對DNA末端進行末端修復使其成為平末端並磷酸化，然後向DNA片段的3，端添加單個'A，核苷酸。用製備好的片段化DNA與接頭進行連接>^應，所述接頭通過將"寡聚物A"和"寡聚物B"(序列在下文給出)退火而預先形成。通過凝膠電泳將>^應產物從未連接的接頭中分離/純化。最後，對連接反應的產物進行PCR循環，以選擇性擴增含有基因組DNA的連接產物，所述連接產物在片段的兩端均帶有接頭。材料和方法步驟l)噴霧材料0.5人BACDNA(克隆進pTARBAC載體的140k人染色體6插入片段)噴霧緩衝液(53.1ml甘油，42.1ml水，3.7ml1MTrisHC1pH7.5，1.1ml0.5MEDTA)TE噴霧器(Invitrogen,K7025-05)PCR純化試劑盒柱(Qiagen,28104)程序54將10nl(5fig)BACDNA與40filTE和700jil噴霧緩衝液混合。在32磅/平方英寸(psi)的壓強下，將冰冷的DNA溶液各自在噴霧器中於水上片段化6分鐘。用QiagenPCR純化試劑盒柱純化各個回收體積，並在30jilEB中洗脫。步驟2)末端修復材料經噴霧的DNA(來自步驟l)水用10mMATP(10x)緩衝的T4DNA連接酶緩衝液(NEB,B0202S)dNTP混合物(每種10mM)(NEB,N0447S)T4DNA聚合酶(3，)(NEB，M0203L)大腸桿菌DNAPolI大片段(Klenow)(5U/jnl)(NEB,M0210S)T4多核普酸激酶(10U/ji1)(NEB,M0201L)PCR純化試劑盒柱(Qiagen,28104)步驟如下裝配末端修復混合物經噴霧的DNA30fil水45pl含10mMATP的T4DNA連接酶邀l沖液lOjildNTPT4DNApol5jilKlenowDNApollplT4PNK5^1總計lOOfil將反應物在室溫下孵育30分鐘。在Qiagen柱上純化DNA，在30plEB中洗脫。步驟3)A-加尾反應材料經末端修復的DNA(來自步驟2)水NEB緩衝液2(10x)(NEB,B7002S)dATP(ImM)(Amersham-Pharmacia，272050)Klenow片段(無3，到5，外切)(5U/jil)(NEB，M0212B)熱塊(Hotblock)或PCR儀MinElutePCR純化試劑盒柱(Qiagen,28004)程序裝配以下的反應混合物經末端^f務復的DNA30fil水2jdNEB緩衝液25fddATPlOfilKlenow片段(無3，到5'外切)3^1總計50jil將反應物在37"C下孵育30分鐘，然後在QiagenMinElute柱上純化DNA，在lOjilEB中，^y^。歩驟4)退火的接頭材料寡聚物A:5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCxT(X=疏代磷酸酯鍵)(SEQIDNO:5)寡聚物B:5，磷酸-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG(SEQIDNO:6)50mMTris/50mMNaClpH7.0PCR儀程序將寡聚物混合在一起，在10mMTris/10mMNaClpH7.0中達到每種15nM的終濃度。在PCR儀中使接頭鏈退火，所述PCR儀設定為以下程序以0.5。C/秒升溫至97.5°C;在97.5°C保持150秒；然後的步驟是97.5°C256秒，以0.1。C/循環的溫度降低進行775個循環。步驟5)連接材料有A尾的基因組DNA(來自步驟3)快速連接酶緩衝液(2x)(NEB，B2200S)退火的接頭(15jiM)(來自4)快速連接酶(lU/nl)(NEB，M2200L)PCR純化試劑盒柱(Qiagen,28104)程序如下裝配>^應混合物有A尾的基因組DNA10nl快速連接酶緩衝液25nl經退火的接頭10jil快速連接酶5jil總計50fd將反應物在室溫下孵育15分鐘，然後在Qiagen柱上純化DNA，並在30jil洗脫緩衝液(EB)中洗脫。歩驟6〗凝膠純化材料連接反應物(來自步驟5)瓊脂糖(Biorad，161-3107)TAE(50x)蒸餾水溴化乙錠(Sigma，E1510)上樣緩沖液(4x)50mMTrispH8、40mMEDTA、40。/。w/v蔗糖)低分子量梯度(NEB，N3233L)^i^座和槽。電泳單元深色讀數透照燈(ClareChemicalResearch,D195M)^!^提取試劑盒柱(Qiagen，28704)程序將來自經純化的連接反應的整個樣品上樣在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠的一個泳道上，並在120V下電泳60分鐘。然後在"白光"盒('White-light，box)上觀察^^,並切下120bp到170bp的片段，並用^^提取柱純化，在30nl洗脫緩衝液(EB)中洗脫。步驟7)PCR引物的外切核酸酶I處理材料外切核酸酶I(大腸桿菌)(20U/pl)(NEB，M0293S)外切核酸酶I反應緩衝液(IOx)(NEB，M0293S)水n-l位上具有硫代磷酸酯的DNA引物P6Bio-Rad柱(Bio國Rad，732-6221)程序將n-l位上具有硫代磷酸酯的DNA引物(5x85pl每種引物(約25HM))等分進Eppendorf管中。向各管中添加IOjil10x外切核酸酶l反應緩衝液和5nl外切核酸酶I。#^個Eppendorf管置於架子上並在設定為37匸的烘箱中儲存16小時。16小時後，將管置於設置為80t:的熱塊上2分鐘。1^使溶液從Eppendorf流經P6Bio-Rad柱，並在離心機中於2000rpm下離心2分鐘。向柱中添加額外的20nlH20並將柱再次離心。將過濾的溶液置於SpeedVac⑧中並蒸發直至每份溶液為20pl，並合併級分。將合併的級分注射進反相HPLC體系中，收集主峰。將收集的級分在SpeedVac⑧中蒸發至千，添加50jil水並將級分再次蒸發至幹。將得到的沉澱物溶於50nl水中，合併並進行UV測量，以測定寡核苷酸的濃度。歩驟8)PCR材料經^純化的DNA(來自步驟6)水Phusion標準混合物(2x)(NEB，F-531L)經外切核酸酶處理的通用PCR引物1(25uM):5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCxT3',其中x=硫代磷酸酯鍵(來自步驟7)(SEQIDNO:7)經外切核酸酶處理的通用PCR引物2(25uM):5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCxT,其中x-硫代磷酸酯鍵(來自步驟7)(SEQIDNO:8)PCR儀PCR純化試劑盒柱(Qiagen,#28104)。程序如下製備PCR反應物經亂歐純4t的BACDNAPhusion標準混合物25jil通用PCR引物1通用PCR引物2水22pl總計50nl在PCR儀器上在以下條件下進行熱循環:98°C下30秒[卵。C下10秒，6S。C下30秒，72°C下30秒18個循環720C下5分鐘保持在4。C在Qiagen柱上純化PCR產物，在30jilEB中洗脫。得到的DNA文庫即可用於在表面擴增平臺上擴增。通過常規的Sanger測序來^E文庫根據製造商的說明將4nl文庫克隆進質粒載體(ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒，Invitrogen#K2800-20)中，並塗布在瓊脂上。湘詠菌落，小量製備並通過常規的Sanger測序對克隆的片段進行測序。59來自BAC文庫的16個克隆1(204bp)插入片段大腸桿菌85bp(SEQIDNO:9)i^^AGTGATTTCATTGCAGCCAMGGCAAACT丌GGCTGCATCGTTTTACAGTCGCCATMGCCTTTCCTCTG丌AAACCGCCTTCTGpjIi^t鵬縱0i2(214bp)插入片段BAC95bp(SEQIDNO:IO)^^慰ATCAATATTGTGAAAATGACCATACTGCCAAAAAAAAACTACAAATTCAATGCMTTTTCATCAAAATACCATCATCATTCTTCACAATATTGA7^PH3(215bp)插入片段BAC96bp(SEQIDNO:ll)隨激蘊CTCACTCCTGGCAGAGGGACGTGTGACTAGGCATGG(3CCCCTAGGTCTCCAGTTCCTGGGTAGCTTGTAITI1IGAACATCTCCTGTATATTAGTTi4(147bp)插入片段BAC28bp(SEQIDNO:12)蔬HlAGTGTAGTTGAGATCTGCCTTAGCAGCA!g&纖5(183bp)插入片段BAC64bp(SEQIDNO:13)^^SfAACACATTTCAAAGTTTGGGGCCCTCCTCCTCGCCAAAAAACAAAC6(170bp)插入片段BAC59bp(SEQIDNO:14)AATGCCTTTTATAGCATTTAATTTTTCCTAAGTATAATTACCAAATAAAAATTG(180bp)插入片段BAC61bp(SEQIDNO:15)陛MP,GGGCCCGGGAGGAGTTTGCCGGGGAGGAGTGGGTTTGGAATCG8(l卯bp)插入片段BAC73bp(SEQIDNO:16)g雨fMGATCTATTTCAAATGGACTGTAGATCTAAGTATAAAAGGTAAGAGA9(192bp)插入片段BAC74bp(SEQIDNO:17)^^GGGAGGCCAAGGTGGGTGGATCACCTGAGATCAGGAGTTCGAGACCAGCTGGCCAACATGATGAAACTCTGTCTi^^^S^纏10(185bp)插入片段BAC66bp(SEQIDNO:18)驟^Htgaccattgtaaccattaatgtagactgcaatgatatgcactattta^^^^^^^^11(199bp)插入片段BAC80bp(SEQIDNO:19)61!^翻CTTTGMGAGCTGGCAGTAGAAGATAAACAGGCTGGGGAAGAAGAGAAAGTGCTCAAGGAGAAGGAGGAGCAGCAGCAGC12(212bp)插入片段BAC93bp(SEQIDNO:20)^SP鵬襟纖綴GATG頓^Sfli^^gi^ffiS^隨暨/VGTATTCAACAAGTCTGTCTTTTGCAAGTG丁CTTTAAAGACCAGAAATACCTGTTnTAACACACAGGGTTGCAAAATTCAGAGGAGATTGGC竊,憩13(247bp)插入片段大腸桿菌128bp(SEQIDNO:21)iK國G丁TGAGATGAG"rGATGACGGCGCGCn"GGAAGTTGCTCGTC(3GGCTCGCGGTACGCiCGCGCATTGCCAACCGTCTGCTGCGTCGAGTGCGTGATTTCGCCGMGTGAAGCACGATGGCACCATCTCAAG矚驟顯^MJ^1^^B顧14(202bp)插入片段BAC83bp(SEQIDNO:22)g綴爾OGGG丌GGTGGMCCCAGATGCCTCCCAGGATTGGTGGGCCCTGTGGCACTTGTACGTGCTGTTGCTGTTGCTGCTGCTGCTG^S^^S燈迅暨15(166bp)插入片段BAC47bp(SEQIDNO:23)l^^gATGATMGGAGCAGGTTTACAGATCATAAGTGCAAAAGCGGGCGA16(147bp)插入片段BAC31bp(SEQIDNO:24)62蔽彌CTGATACTG丌GTMCCACCCAATTGGTTCAPCMI^l^冥^liii這些結果證實，該文庫製備方法產生了"可測序的"DNA模板文庫。每種文庫含有多種基因組插入片段，每種基因組插入片段的側翼均為簇形成和SBS測序所需的兩種接頭(:,絲i^flpg^^i離ATCT,鄉i5pp^pl^5pg鄉'g,敏郷SEQIDNO:25和NO:26)。將來自每個文庫的插入片段DNA與BAC參考進行比對，有少量的大腸桿菌汙染。如上文實施例1-5中所述從以上文庫製備簇。接枝至表面的引物具有以下序列P5二醇5'ps-tttttttttt-二醇.-AATGATACGGCGACCACCGA(SEQIDNO:l)P7國TU:5，TTTTTTTTUCAAGCAGAAGACGGCATACGA-0H(SEQIDNO:27)P5畫磷酸5'PS-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-PCU(SEQIDNO:28)以1:1:1的濃度將三種引物混合，並以每種引物O.SnM的濃度使用。如實施例10中所述使用高碘酸處理對簇進行線性化，並如實施例5步驟2中所述用末端轉移酶進行封閉。如上所述對簇進行處理，以雜交第一測序引物。該測序引物的序列為5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatc(SEQIDNO:4)為了將蔟內的核酸變性以雜交測序引物，如表4中所示使以下試劑從池中流過tableseeoriginaldocumentpage63tableseeoriginaldocumentpage64使用上文實施例7中所述試劑和方法從耙片段開始測序。實施例12a:獲得第二讀取步驟l:用T4多核苷酸激酶使磷^去封閉如下處理簇在20"C下以15jiL/通it/分鐘流過1x交換反應緩衝液(50mM咪唑-HClpH6.4;12mMMgCl2;1mM2-5t&乙醇；70nMADP)，持續5分鐘。然後在20X:下以15nL/通il/分鐘流過PNK溶液(1x交M應緩衝液中0.2U/jiLPNK),持續5分鐘。將流通池加熱至38"C保持30分鐘，並使其冷卻。用清洗緩衝液將通道清洗5分鐘，然後用5xSSC清洗5分鐘。步驟2:簇的再合成。如實施例5步驟1中所述，對簇進行15個循環的等溫擴增處理。步驟3:用USER進行線性化如實施例6中所述處理簇，以切割P7引物中的尿嘧咬部分。如實施例5步驟2中所述用末端轉移酶封閉簇。如上所述對蔟ii行處理以雜交第一測序引物。該測序引物的序列為5'-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC(SEQIDNO:29)。為了^J^內的核酸變性並雜交測序引物，如表4中所示將以下試劑從池中流過tableseeoriginaldocumentpage65使用上文實施例7中所述試劑和方法從耙片段開始測序。從第一和第二讀取獲得的數據顯示於圖8中。兩個讀取均清楚地與BAC序列匹配，只有4%的讀取來自於汙染原始樣品的大腸桿菌。插入片段的平均片段大小為80個4^對，兩個25個>5^對的讀取也是如此，讀取末端之間的距離平均為30個鹼基對。來自第一讀取的大部分簇(8208/8572)(96%)也針對第二讀取得到良好的讀取。實施例13:使用分別用尿嘧咬和8-氧代G修飾的兩種固定引物進行製備和配對末端測序。步驟l)將引物接枝在SFA包被的晶片表面上將SFA包被的晶片置於改裝過的MJ-Research熱循環儀中，並連接蠕動泵。將10mM磷酸緩衝液(pH7.0)中由0.5jiM正向引物和0.5jiM反向引物組成的接枝混合物以60jil/分鐘的j;i^在20X:下75秒內泵入晶片的通道內。隨後將熱循環儀加熱到51.6匸，晶片在該溫度下孵育l小時。在這段時間內，接枝混合物經歷了18輪泵循環以15nl/分鐘的il^il持續泵入接枝混合物20秒，接著將溶液來回地(以15|11/分鐘泵入5秒，然後以15jd/分鐘泵出5秒)泵入泵出180秒。在18個泵循環之後，晶片以15的流速在51.6匸下泵入5xSSC/5mMEDTA清洗，持續300秒。接著將熱循環儀冷卻至201C。引物通常是摻有切割所需的任何特定序列或修飾的5，-硫代磷酸酯寡核苷酸。它們的序列和供應商根據使用它們的實驗而不同，在該情況下與模板雙鏈體的5，端互補。本方法中使用的DNA序列是兩種文庫的合併，所述文庫具有與接枝引物互補的末端。如所述的，使用氫氧化鈉處理使文庫混合物變性，IC^快速稀釋。對詳述的一些實驗而言，擴增的簇在接枝引物之一中含有二醇鍵。可通it^用於固相擴增的引物之一中包含合適的鍵來引入二醇鍵。二醇亞磷醯胺的合成描述於下文實施例4中。可如所述使用高碘酸鹽和丙醇胺切割含有這類二醇鍵的產物，並如所述雜交得到的單鏈多核苷酸。接枝引物在5'端含有T鹼基序列，作為間隔基團發揮幫助線性化和雜交的作用。接枝在晶片上的三種引物的序列如下寡聚物A:5'-PS-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA口CTACAC-3'，其中U=2-脫|L>^苷(SEQIDNO:30);寡聚物B:5'-PS-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGoacoAT-3',其中GOXO-8畫氧代鳥嘌呤(SEQIDNO:31)。步驟2)通過等溫擴增制^^蔟擴增過程中使用的DNA序列是實施例1中製備的兩種文庫的混合物，其具有與接枝引物互補的末端。使用0.1M氫氧化鈉使雙鏈DNA(lnM)變性，然後在"雜交緩衝液"(5xSSC/0.1。/。吐溫)中快速稀釋至期望的0.2-2pM"工作濃度"。如PCT/US/2007/014649中所述，使用可購得的Solexa/Illumina簇工作站(clusterstation)通過等溫擴增進行表面擴增。所^l工作站主要是熱板和用於控制試劑遞送到流通池的流控體系。在臨進行擴增反應前將單鏈模板(如上文所述變性)與接枝引物雜交，因此所述擴增反應從最初的引物延伸步驟開始而不是從模板變性開始。雜交步^嚴^^緩衝液中的加熱步驟開始，以確保在雜交前完全變性。在20分鐘的緩慢冷卻步驟期間發生雜交後，用清M衝液(0.3xSSC/0.1%吐溫)將流通池清洗5分鐘。在模板雜交和第一延伸期間，通常使用多種溶^/緩衝液，例如包含DNA樣品的溶液、雜交緩衝液(5xSSC/0.1%吐溫)、清洗緩衝液(0.3xSSC/0.1%吐溫)、2M氫氧化鈉溶液、簇緩衝液(200mMTris，100mM名危酸銨，20mM硫酸鎂，l%Triton，1.3%DMSO，pH8.8);擴增添加劑(5M甜菜鹼)、DNA聚合酶和10mMdNTP混合物。為了製備雜交混合物，將0.2ml條帶樣品管和雜交緩衝液預冷。隨後使用1.7mlEppendorf管，將DNA模板在緩沖液EB(Qiagen)中稀釋至lnM。向19pL為板中添加lnL2MNaOH，稍振蕩並為室溫下孵育5分鐘，將DNA模板變性成單鏈。在預冷的雜交緩衝液中將變性的DNA稀釋至工作濃度(0.2-2pM)(例如對1mLlpM的雜交混合物而言，將1變性DNA稀釋進1mL預冷的雜交緩衝液中)。需要的體積取決於使用的通道數——可選地每個通道至少使用120jaL雜交混合物。因此，lmL雜交混合物足夠用於8個通道。將樣品稍振蕩，離心並等分進預冷的0.21111條帶管中(管底部沒有氣泡)並立即使用。為了製備(足以用於第一延伸和35個等溫擴增循環的體積的)擴增預混物，將35mLH20(milliQ)、7mL簇緩衝液(200mMTris,100mM硫酸銨，20mM硫酸鎂，1%Triton,1.3%DMSO,pH8.8)和28mL擴增添加劑(5M甜菜鹼溶液)混合，達到70mL的終體積。為了製備第一延伸的Taq混合物，將780nL擴增預混物、16jiL10mMdNTP和4jiLr叫DNA聚合酶混合在一起，達到800的終體積。下表(表1)中詳述了典型的擴增過程，詳述了每個通道的流動體積，其由本發明的計算機組件自動化控制。表l:模板雜交和第一延伸。步驟說明溫度(。c)時間(秒)流速(Ml/分鐘)泵入體積(叫1泵入雜交預混物20120601202泵入雜交混合物96300157567tableseeoriginaldocumentpage68使用曱,作為變性劑在6on下進行等溫擴增可^^用甲醯胺作為變性劑在601C下將所複製的DNA等溫擴增成為簇。等溫擴增由計算機組件來監控(包括溫度控制和試劑控制)。表2給出了示範性腳本控制的概述。等溫擴增和任選的清洗步驟發生後，簇中的核酸即可用於線性化(見下文)。表2:等溫擴增tableseeoriginaldocumentpage68擴增預混物-2M甜菜鹼，20mMTris，10mM硫酸銨，2mM硫酸鎂，0.1%Triton，1.3%DMSO,pH8.8;Bst混合物=2M甜菜鹼，20mMTris，10mM硫酸銨，2mM硫酸鎂，0.1%Triton，1.3%DMSO,pH8.8加上200jiMdNTP和80單位/mL的Bst聚合酶(NEB產品號M0275L)。儲存緩衝液5xSSC。歩驟3)製備用於第一測序讀取的簇在IUumina蔟工作站上進行讀取l的製備。除非另有說明，否則該方案中使用的所有體積均為每泳道95ul。通過與USER酶混合物(尿嘧啶DNA糖基化酶和內切核酸酶VIII的混合物，NEB#M5505,10U/ml，10mMKC1，20mMTrispH8.8,10mM(HN4)2S04，2mMMgS04，0.1%TritonX-100,37。C，30分鐘)孵育來實現A型表面固定的寡核苷酸的線性化。^使用末端轉移酶(0.25U/jil)和經修飾的聚合酶(如下文所述的SBS聚合酶)的混合物(0.015mg/ml，100jiMddNTP，50mMtris，50mMNaCl，6mMMgS04，1mMEDTA,0.05%吐溫20)，通過雙脫氧鏈終止來封閉DNA中所有暴露的3，-OH端，其來自延伸的模板或未延伸的表面寡核苷酸。封閉在兩階段的方案中實現，首先在37"C下孵育30分鐘，然後降低至60"C並將流通池再孵育15分鐘。用0.3xSSC和儲存緩沖液洗滌經線性化和封閉的蔟，之後用0.1NNaOH變性。用TE緩衝液(10mMTrispH8.0，ImMEDTA)中和變性的蔟，並用儲存緩衝液洗滌。通過在60匸下孵育15分鐘，然後在40"C下用0.3xSSC洗滌(下降速率l"C/秒)，使讀取1的特異性測序引物(5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3',雜交緩衝液中0.5nM(SEQIDNO:4))與簇退火。最後用儲存緩衝液(在20"C下)衝洗流通池。將處理過的流通池轉移至Illumina基因組分析儀進行測序讀取l。步驟4)從耙片段開始測序使用經修飾的核苷酸對來自上述說明性方案的簇進行測序，所述經修飾的核苷酸如國際專利申請WO2004/018493中所述製備，並如PCT申請號PCT/GB2007/001770中所述用四種光鐠不同的螢光團標記。簇的測序在專利WO06064199中更詳細描述。上文所列三篇文獻的內容通過參考整體併入本文。在核苷酸摻入步驟中使用突變的9。N聚合酶(包含三重突變L408Y/Y409A/P410V和C223S的外切型變體)(SBS聚合酶)。所有過程如Illumina基因組分析儀操作手冊中所述進行。將流通池^分析儀上，提供測序試劑位置#1=摻入混合物(lfiMdNTP混合物，0.015ng/mlSBS聚合酶，50mMTrispH9.0,50mMNaCl，6mMMgS04，1mMEDTA，0.05%吐溫20);位置#2=空(僅有MilliQ水)；位置#3=掃描混合物(100mMTrispH7.0,50mM抗壞血酸鈉)；位置#4=高鹽清洗液(5xSSC,0.05%吐溫20);位置#5=摻入緩沖液(50mMTrispH9.0，50mMNaCl，1mMEDTA，0.05%吐溫20);位置#6=切割混合物(100mMTCEP,100mMTrispH9.0，lOOmMNaCl,50mM抗壞血酸鈉，0.05%吐溫20);#7=切割緩衝液(100mMTrispH9.0，100mMNaCl，0.05%吐溫20);#8=空(單次讀取)或與PE模塊輸出連接(成對讀取實驗)。使用針對27或37個循環實驗的標準測序方案對流通池進行測序。使用標準分析流水線分析數據。摻入提供摻入緩衝液，125nL/通道；60nL/分鐘，加熱至60"C。用移^入混合物處理，75nL/通道；60jiL/分鐘。除了泵入新鮮摻入混合物(25jiL/通道；60fiL/分鐘，每4分鐘)以外，總計等待15分鐘。冷卻至20匸。用移^入緩衝液洗滌，75jiL/通道；60jiL/分鐘。用5xSSC/0.05。/。吐溫20洗滌，75jiL/通道；60jiL/分鐘。提供成#^_衝液，100nL/通道；60jiL/分鐘。在室溫下以四種顏色掃描。切割提供切割緩衝液(0.1MTrispH7.4,0.1MNaCl和0.05%吐溫20)，125nL/通道；60jiL/分鐘。加熱至60t:。用切割混合物(切割緩衝液中100mMTCEP)處理蔟，75nL/通道；60fiL/分鐘。除了泵入新鮮切割混合物(25jiL/通道；60jiL/分鐘，每4分鐘)以外，總計等待15分鐘。冷卻至20r。用酶緩衝液清洗。用5xSSC/0.05。/。吐溫20清洗。將#^入和切割過程重複至所需的循環數。使用Illumina基因組分析儀檢測摻入的核普酸，所述Illumina基因組分析儀是在2006年3月31日提交的"SystemsandDevicesforSequencebySynthesisAnalysis,"USSN60/788,248和2007年3月30日提交的相應PCT申請PCT/US07/07991中描述的基於全反射的螢光CCD成像設備。步驟5)製備用於第二讀取的簇在基因組分析儀上成功地完成讀取1的測序後，流通池保持安裝，並使用Illumina配對末端模塊原位製備讀取2。通過使用基因組分析儀peltier實現溫度控制。除非另有說明，所有的流速為60^L/分鐘和75jaL/泳道。用O.lMNaOH將簇變性，以去除來自讀取l的延伸的測序引物。使用T4多核普酸激酶(Invitrogen#18004-010，200U/ml，50mM咪唑pH6.4，12mMMgCl2，70jiMADP，lmM2-巰基乙醇，37°C，30分鐘)將簇3，-脫磷酸化，之後使用15個循環的60"C等溫擴增(除了以30nL/分鐘進行以外，均與針對簇產生所述的試劑和條件相同)實現A鏈的再合成。再合成之前和之後用0.3xSSC(分別為150nL和245jiL)洗滌蔟。通過使用Fpg(曱醯胺嘧啶DNA糖基化酶，NEB#M0240，80U/ml,10mMBisTris丙烷pH7.0，10mMMgCl2,ImM二硫蘇糖醇，37°C，30分鐘)從B型寡聚物上切除8-氧代鳥嘌呤，從而實現再合成簇中B鏈的線性化。使用相同的封閉混合物如針對讀取1所述進行封閉。在雜交讀取2的特異性測序引物(5,-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC-3,，雜交緩沖液中0.5jiM(SEQIDNO:29))之前，如針對讀取1所述將經線性化和封閉的簇變性。隨後在Illumina基因組分析儀上對經處理的流通池的讀取2進行測序。儘管已為了清楚和理解的目的從一些細節上描述了上述發明，但是本領域技術人員閱讀本公開內容後會明白，可進行形式和細節上的多種改變，而不偏離本發明的範圍。例如，上述所有技術和i殳備可以以多種組合使用。本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請或其它文獻通過參考整體併入用於所有的目的，視同已獨立地指出每個單獨的出版物、專利、專利申請或其它文獻被通過參考併入用於所有的目的。權利要求1.用於對靶標雙鏈多核苷酸的第一和第二區域進行成對測序的方法，其中所述第一和第二區域在同一靶標雙鏈多核苷酸上，該方法包括(a)提供固體支持物，其上已固定有多個雙鏈模板多核苷酸，其中每個都是由以5』端連接在所述固體支持物上的互補的第一和第二模板鏈所形成的；並提供能夠與第一模板鏈的3』端雜交的一種或多種5』端固定的引物的多個拷貝；(b)對所述多個雙鏈模板多核苷酸進行處理，以使第一模板鏈與5』端固定的引物雜交；(c)進行第一測序讀取，以測定該模板多核苷酸中第一區域的序列；(d)進行延伸反應以延伸一個或多個所述固定的引物，從而複製第一模板鏈，以產生固定的第二模板鏈；(e)對第一和第二固定模板鏈進行處理，從而從固體支持物上除去第一模板鏈；(f)進行第二測序讀取，以測定該模板多核苷酸中第二區域的序列，其中對所述靶多核苷酸中第一和第二區域的序列測定實現了對該靶雙鏈多核苷酸中所述第一和第二區域的成對測序。2.用於對靶雙鏈多核普酸中遠端區域A和B進行測序的方法，其中所述遠端區域A和B在同一靶雙鏈多核苷酸中，該方法包括(a)提供固體支持物，其上已固定有多個雙鏈模板多核苷酸，其中每個都是由以5，端連接在所述固體支持物上的互補的第一和第二模板鏈所形成的；(b)處理所述雙鏈模板多核苷酸，以使每個雙鏈模板多核普酸在至少兩處被切割，從而產生一端被固定的兩條縮短的雙鏈模板片段A和B，其中A和B不再直接相連；(c)處理所述一端被固定的兩條縮短的雙鏈模板片段A和B，以使兩個未固定的末端成為平末端雙鏈體；(d)處理所述兩個平末端雙鏈體，以使兩個平末端A和B連接形成兩端均被固定的雙鏈核苷酸序列，所述雙鏈核苷酸序列在縮短的連續序列中含有原始靶片段的兩個末端A和B;(e)切割所述兩端均被固定的雙鏈核苷酸序列中的一條鏈產生單鏈核苷酸靶序列，所述雙鏈核苷酸序列在縮短的連續序列中含有原始靶片段的兩個遠端A和B，所述單鏈核普酸靶序列含有連接在縮短的連續序列中的原始靶片段的兩個遠端A和B，其中所述單鏈核苷酸靶序列在單個5，或3，端被固定；(f)將測序引物與該單鏈核苷酸靶序列雜交，所述單鏈核苷酸靶序列在縮短的連續序列中含有原始靶片段的兩個遠端A和B;和(g)進行單個測序反應，以測定原始靶片段的兩端A和B的連續序列。3.根據權利要求1或2的方法，其中使用經標記的核苷酸或寡核苷酸進行所述測序讀取。4.根據權利要求1或2的方法，其中所述模板被固定在單個平坦的固體支持物上。5.根據權利要求1或2的方法，其中所述模板被固定在多個微球體上。6.根據權利要求5的方法，其中所述微球體被固定在單個固體支持物上。7.根據權利要求1或2的方法，其中步驟l(b)、1(e)或2(e)中的處理包括用內切核酸酶在被固定的雙鏈模板多核苷酸中產生切口。8.根據權利要求1或2的方法，其中步驟l(b)、1(e)或2(e)中的處理包括在被固定的雙鏈模板多核苷酸中形成和切割無鹼基位點。9.根據權利要求8的方法，其中所述無鹼基位點由尿嘧咬鹼基產生。10.根據權利要求9的方法，其中通過用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂合酶內切核酸酶VIII處理來去除所述尿嘧咬11.根據權利要求8的方法，其中所述無鹼基位點由8-氧代-鳥噤呤鹼基產生。12.根據權利要求l(c)的方法，其中使用具有鏈置換活性的聚合酶在雙鏈模板上進行所述測序讀取。13.根據權利要求1的方法，其在步驟1(c)前還包括使被固定的模板成為單鏈的額外步驟。14.根據權利要求13的方法，其中所述額外步驟包括用5，-3，外切核酸酶處理，以消化未以其5，端固定的鏈。15.根據權利要求13的方法，其中所述額外步驟包括用化學變性劑處理。16.根據權利要求l的方法，其中使用被固定的引物進行所述第一測序讀取。17.根據權利要求1的方法，其在步驟1(c)之前還包括使未固定的測序引物與被固定的模板雜交的額外步驟。18.根據權利要求1的方法，其在步驟1(d)之前還包括去除步驟1(c)中所添加鹼基的額外步驟。19.根據權利要求18的方法，其中通過在使用切口酶之後用5，-3，外切核酸酶處理來實現所述去除。20.根據權利要求18的方法，其中通過使未固定的測序引物變性來實現所述去除。21.根據權利要求l(e)或2(e)的方法，其中所述第一模板鏈通過二醇鍵進行附著，通過用包括高碘酸鹽在內的化學切割劑進行處理來切割所述二醇鍵，隨後使雙鏈體變性。22.根據權利要求21的方法，其中所述變性是使用氫氧化物或甲醯胺進行化學處理。23.權利要求2(b)的方法，其中通過遠距離切割限制性酶來進行所述處理。24.權利要求23的方法，其中使用相同的限制性酶在至少兩處進行切割。25.根據權利要求23的方法，其中所述限制性酶在距離其序列依賴性結合位點10-50個鹼基處進行切割。26.根據權利要求10的方法，其中在步驟l(d)前用磷酸酶處理所述表面，以去除尿嘧啶DNA糖基化酶作用所留下的3，-磷酸基。27.根據權利要求l的方法，還包括下述步驟在步驟l(d)前用限制性酶進行處理，以縮短被固定的引物和釋放游離的3，羥基用於延伸。28.根據權利要求l的方法，其中在步驟ld前延伸被固定的引物。29.根據權利要求28的方法，其中通過與帶有5，突出端的未固定互補序列雜交來延伸被固定的引物，並延伸被固定的引物以複製該突出。30.根據權利要求l的方法，其中通過延伸和變性的多個循環來重複步驟ld。31.根據權利要求l的方法，其中至少一個被固定的引物在3，端被封閉，並在步驟l(d)之前去除所述封閉。32.權利要求31的方法，其中所述封閉是磷酸部分。33.權利要求31的方法，其中所述封閉是3，-脫氧核苷酸。34.權利要求31的方法，其中所述被固定的引物包含自身互補髮夾，所述髮夾具有結合限制性酶並可被所述限制性酶切割的序列。35.根據權利要求l(a-d)製備的成簇陣列。36.根據權利要求2製備的成簇陣列。37.改善被固定的模板上測序反應的數據質量的方法，所述方法包括將模板與被固定的引物雜交，使得模板在兩端均被固定。38.根據權利要求l的方法，其中所述靶雙鏈多核苷酸包含特定的核普酸序列標籤，以表明該多核苷酸的來源。39.權利要求38的方法，其中在獨立於測定靶多核苷酸中第一和第二區域序列之測序讀取的測序讀取中對所述標籤進行測序。40.權利要求39的方法，其中在權利要求l的步驟(c)和(d)之間進行所述額外的測序讀取。41.權利要求39的方法，其中在權利要求l的步驟(f)後進行所述額外的測序讀取。全文摘要本發明涉及對雙鏈多核苷酸模板進行成對測序的方法，本方法導致依次測定多核苷酸模板上兩個不同且分開的區域中的核苷酸序列。使用本發明的方法，有可能獲得來自成簇陣列上每個雙鏈模板的兩個相連或配對的序列信息讀取，而不是僅獲得來自一條模板鏈的單個測序讀取。文檔編號C12Q1/68GK101663405SQ200780044851公開日2010年3月3日申請日期2007年10月8日優先權日2006年10月6日發明者託比亞斯·奧斯特,羅伯託·裡加蒂,薩拉·法舍娜申請人:億明達劍橋有限公司