Mphosph1肽及包含它們的疫苗的製作方法

2023-05-19 13:54:26 2

Mphosph1肽及包含它們的疫苗的製作方法
【專利摘要】如本申請中更詳細地討論的，衍生自MPHOSPH1的分離的表位肽結合HLA抗原並誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，因此適於在癌症免疫治療，更具體地說是癌症疫苗的語境中使用。本發明的肽涵蓋上述的MPHOSPH1衍生的胺基酸序列，以及其修飾形式，其中取代、缺失、插入或添加了一個、兩個或幾個胺基酸，只要這樣的修飾形式保留所需的原始序列的CTL誘導能力。此外還提供編碼任何上述肽的多核苷酸，以及包含任何上述肽或多核苷酸的藥物作用劑或藥物組合物。本發明的肽、多核苷酸、和藥物作用劑或藥物組合物特別有用於癌症和腫瘤，包括例如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤的治療和/或預防。
【專利說明】MPH0SPH1肽及包含它們的疫苗
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物科學領域，更具體的說是癌症治療領域。具體而言，本發明涉及作為癌症疫苗有用的新肽，以及用於治療和/或預防腫瘤的藥物。
[0002]優先權
[0003]本申請要求2011年8月12日提交的美國臨時申請61/522，991的權益，通過援引將其全部內容併入本文。
【背景技術】
[0004]已經證明，細胞毒性T淋巴細胞(CTL)可識別主要組織相容性複合物(MHC) I類分子上出現的腫瘤相關抗原(TAA)所衍生的表位肽，然後殺死腫瘤細胞。從黑素瘤抗原(MAGE)家族被發現起，人們主要通過免疫學手段已經發現了許多其它TAA(NPL1，BoonT, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2):177-80;NPL2, Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med1996 Mar 1，183 (3): 725-9)。這些TAA中的一些目前正在作為免疫治療靶標接受臨床開發。
[0005]有利的TAA對於癌細胞的擴增和存活而言是不可或缺的。使用這樣的TAA作為免疫治療的靶標，可以最大程度的減小人們熟知的癌細胞免疫逃逸的風險。癌細胞免疫逃逸可歸因於治療驅動的免疫選擇(therapeutically driven immune selection)而導致的TAA刪除、突變或下調。因此，能夠誘導強力且特異性的抗腫瘤免疫應答的新TAA的鑑定保證了進一步開發，因此針對各種類型癌症的肽疫苗接種策略的臨床應用正在進行中(NPL3, Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20):1442-55; NPL
4,ButterfieldLH et al., Cancer Res 1999 Jul I,59 (13):3134-42;NPL5, VissersJL et al., Cancer Res 1999 Novi, 59(21): 5554-9; NPL6, van der Burg SH etal., J ImmunoI 1996 May I, 156(9):3308-14;NPL7,Tanaka F et al., CancerRes 1997 Oct 15,57 (20):4465-8;NPL8, Fujie T et al.,Int J Cancer 1999Jan 18,80 (2):169-72;NPL9,Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May5,81 (3):459-66;NPL10, Oiso M et al.,Int J Cancer 1999 May 5，81(3):387-94)。迄今為止，已經有數項使用這些TAA衍生肽進行臨床試驗的報告。不幸的是，當前進行的癌症疫苗試驗很多隻觀察到較低的客觀應答率(NPLll，Belli F et al.，J ClinOncol 2002 Oct 15,20 (20):4169-80;NPL12, Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002Oct, 188:33-42; NPL13, Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep, 10(9):909-15) ? 因此，本領域中仍然存在鑑定能作為免疫治療靶的新TAA的需要。
[0006]MPH0SPH1(M-期磷蛋白 I ;GenBank Accession N0.NM_016195 和 NP_057279, SEQID N0:125和126)原被鑑定為在G2/M過渡時被特異性磷酸化的蛋白質之一，並且被表徵為正端導向的驅動蛋白相關蛋白(plus-end-directed kinesin related protein)(NPL14, Abaza A et al., J Biol Chem 2003,278:27844-52)。更具體地說，先前已經報導MPH0SPHI是一種正端導向的分子馬達(plus-end-directed molecular motor),它在胞質分裂中扮演重要角色，並且在HeLa細胞中在分裂後期至分裂末期的過程中在紡錘體的中間區積累(NPL14, Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278:27844-52; NPL15, KamimotoT et al., J Biol Chem 2001,276:37520-8)。在一項使用含23040個基因的基因組範圍cDNA微陣列的基因表達譜分析的過程中，發現MPH0SPH1是一種在膀胱癌中上調的新分子(NPL16, Kanehira M et al., Cancer Res.2007 Apr I;67(7):3276-85.;PTL1, W02006/085684)。此外，通過Northern印跡分析，發現MPH0SPH1基因產物局限於睪丸，而不存在於正常生命器官中。
[0007]先前鑑定了一些衍生自MPH0SPH1的具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力的肽片段((PTL2，W02008/047473)。這些片段顯示誘導針對用關聯肽片段刺激的細胞的CTL的能力。然而，先前的研究未能確認這些肽片段是否具有誘導靶向表達MPH0SPH1基因和HLA-A2抗原的腫瘤細胞的CTL的能力。
[0008]引用表
[0009]專利文獻
[0010][PTLl]W02006/085684
[0011][PTL2]W02008/047473
[0012]非專利文獻
[0013][NPLljBoon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2):177-80
[0014][NPL2]Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar I, 183 (3):725-9
[0015][NPL3]Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20):1442-55
[0016][NPL4]Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul I, 59(13):3134-42
[0017][NPL5]Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov I, 59 (21):5554-9
[0018][NPL6]van der Burg SH et al., J Tmmunol 1996 May I,156 (9):3308-14
[0019][NPL7]Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20):4465-8
[0020][NPL8]Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2):169-72
[0021][NPL9]Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5,81(3):459-66
[0022][NPL10]0iso M et al., Int J Cancer 1999 May 5,81 (3):387-94
[0023][NPLlljBelli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20):4169-80
[0024][NPL12]Coulie PG et al., Tmmunol Rev 2002 Oct, 188:33-42
[0025][NPL13]Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep,10 (9):909-15
[0026][NPL14]Abaza A et al., J Biol Chem 2003,278:27844-52.[0027][NPL15]Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276:37520-8
[0028][NPL16]Kanehira M et al., Cancer Res.2007 Apr I;67 (7):3276-85。

【發明內容】

[0029]本發明至少部分地基於可作為免疫療法的合適靶標的新肽的發現。由於TAA —般被免疫系統察覺為「自身」並因此常常沒有免疫原性，適宜靶標的發現是極其重要的。如上所述，MPH0SPH1(例如 SEQ ID NO: 126，由 GenBank Accession N0.NM_016195 (SEQID NO: 125)的基因編碼)已經被鑑定為在癌症中上調，所述癌症包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、慢性髓細胞性白血病(CML)、結直腸癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。因此，本發明聚焦於MPH0SPH1作為合適的癌症/腫瘤免疫療法靶標的候選者，更具體地說是可以充當合適的免疫療法靶標的新MPH0SPH1表位肽。
[0030]為此目的，本發明致力於，至少部分地致力於在衍生自MPH0SPH1的肽中鑑定具有誘導針對MPH0SPH1的CTL的能力的特異性表位肽。如下文進一步詳細討論的，使用源自MPH0SPH1的HLA-A*0201結合性候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個核細胞(PBMC)。然後建立了具有針對經每種候選肽衝激的HLA-A2陽性靶細胞的特異性細胞毒性的CTL系。本文中的結果證明這些肽是可誘導針對表達MPH0SPH1的細胞的強而特異性的免疫應答的HLA-A2限制型表位肽。這些結果提示MPH0SPH1具有強免疫原性，而且它的表位是癌症/腫瘤免疫療法的有效靶標。
[0031]因此，本發明的一個目的是提供分離的肽，其結合HLA抗原並誘導CTL，其中所述肽包括MPH0SPH1 (SEQ ID NO: 126)的免疫學活性片段。這些肽可以用來體外或離體誘導CTL，或者用來施用給受試者以誘導針對癌症的免疫應答，癌症的例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0032]本發明的肽的長度通常少於15，14，13，12，11，或10個胺基酸。本發明的優選的肽是九肽或十肽。特別優選的肽具有選自SEQ ID NO: 5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列，因為這些肽顯示可結合HLA-A2抗原並誘導CTL。
[0033]因此，在一些實施方案中，本發明的肽是長度少於15，14，13，12，11，或10個胺基酸、具有選自SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的肽。在典型的實施方案中，本發明的肽是具有選自SEQ ID N0:5，14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的九肽或十肽。此外，如本文中證明的，具有SEQ ID NO: 120的胺基酸序列的肽被確證可誘導靶向表達MPH0SPH1和HLA-A2抗原的腫瘤細胞的CTL。因此，在優選的實施方案中，本發明的肽是具有SEQ ID NO: 120的胺基酸序列的肽。
[0034]當本發明的肽在體外、離體或體內接觸抗原呈遞細胞(APC)時，將與APC上的HLA-A2結合併作為與HLA-A2抗原的複合物被呈遞在APC上。或者，本發明的肽可以被APC攝入，在APC中被加工成為由選自SEQ ID N0:5，14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列構成的片段，並作為與HLA-A2抗原的複合物被呈遞在APC上。結果，對這樣的肽特異性的CTL被誘導出來，且這樣的CTL被視為本發明的要素。
[0035]本發明還考慮修飾肽，它們具有在選自SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一個、兩個或幾個胺基酸的胺基酸序列，只要該修飾肽保留與原始的未修飾肽等同的CTL誘導能力。為此目的，本發明提供長度少於15，14，13，12，11或10個胺基酸的分離的肽，其具有CTL誘導能力並且包含選自下組的胺基酸序列:
[0036](i) 在選自SEQ ID NO: 5、14和64的胺基酸序列中取代了 I個、2個或幾個胺基酸的胺基酸序列，和
[0037](ii)(i)的胺基酸序列，其中該胺基酸序列具有下列特徵之一或二者:
[0038](a)所述SEQ ID NO的N端第二個胺基酸選自亮氨酸和甲硫氨酸；和
[0039](b)所述SEQ ID NO的C端胺基酸選自纈氨酸和亮氨酸。
[0040]此外，本發明還提供長度少於15，14，13，12或11個胺基酸的分離的肽，其具有CTL誘導能力並且包含選自下組的胺基酸序列:
[0041](i，)在選自SEQ ID Ν0:73，77，79，97，103和120的胺基酸序列中取代了 I個、2
個或幾個胺基酸的胺基酸序列，和
[0042](ii』 ) (i』 )的胺基酸序列，其中該胺基酸序列具有下列特徵之一或二者:
[0043](a)所述SEQ ID NO的N端第二個胺基酸選自亮氨酸和甲硫氨酸；和
[0044](b)所述SEQ ID NO的C端胺基酸選自纈氨酸和亮氨酸。
[0045]如本文中演示的，這樣的肽可能與APC上的HLA-A2抗原結合併作為與HLA-A2抗原的複合物被呈遞在APC上。或者，當這些肽與APC接觸時，可以被APC攝入，在APC中被加工成為由選自(i)，(ii), (P )和(ii')的胺基酸序列構成的片段，並作為與HLA-A2抗原的複合物被呈遞在APC上。結果，對這樣的肽特異性的CTL被誘導出來，且這樣的CTL被視為本發明的要素。
[0046]本發明還涵蓋編碼任何本發明的肽的分離的多核苷酸。這些多核苷酸可以用來誘導或製備具有CTL誘導能力的APC。和上述的本發明的肽一樣，這樣的APC可以施用給受試者以誘導針對癌症的免疫應答。
[0047]當被施用給受試者時，本發明的肽被呈遞在APC的表面上，以誘導靶向相應肽的CTL0因此，本發明的一個目的是提供用於誘導CTL的組合物或作用劑，其包括一種或多種本發明所提供的肽或者多核苷酸，用於誘導APC和/或CTL。這樣的組合物或作用劑還可以用於一種或多種選自下列的目的:治療癌症、預防癌症，和防止癌症的手術後復發。目標癌症的例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC,淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。因此，本發明的又一個目的是提供用於治療癌症和/或預防癌症的藥物作用劑或藥物組合物，這樣的藥物作用劑或組合物配製為包含一種或多種本發明的肽或多核苷酸，作為本發明的肽或多核苷酸的替代或補充，本發明的藥物作用劑或藥物組合物可以包含呈遞有任何本發明的肽的APC或外來體作為活性成分。
[0048]本發明的肽或多核苷酸可以用來誘導在表面上呈遞HLA抗原與此處的肽的複合物的APC，例如通過使APC與本發明的肽接觸或者將編碼本發明的肽的多核苷酸導入APC中。這樣的APC具有誘導特異識別在其表面上呈遞有靶肽的細胞的CTL的能力，並且能夠用於癌症免疫治療。因此，本發明涵蓋用於誘導具有CTL誘導能力的APC的方法，以及通過此類方法獲得的APC。
[0049]此外，本發明還涵蓋用於誘導APC的作用劑或組合物，這樣的作用劑或組合物包含任何本發明的肽或多核苷酸。
[0050]本發明的另一個目標是提供用於誘導CTL的方法，此類方法包括將⑶8陽性T細胞與在其表面上呈遞本發明的肽的APC或外來體共培養的步驟，或者導入編碼兩個T細胞受體(TCR)亞單位的一個多核苷酸，或編碼每一個TCR亞單位的多個多核苷酸的步驟，其中所述TCR能夠結合細胞表面上呈遞的本發明的肽與HLA抗原的複合物。通過此類方法獲得的CTL可以用來治療癌症和/或預防癌症，癌症的例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0051]本發明的還有一個目的是提供分離的APC，其在表面上呈遞有HLA抗原與本發明的抗體的複合物。本發明還提供靶向本發明的肽的分離的CTL。這些APC和CTL在癌症免疫治療的語境中有用處。
[0052]本發明還有一個目的是提供用於在有需要的受試者體內誘導針對癌症的免疫應答的方法，所述方法包括施用作用劑或組合物的步驟，所述作用劑或組合物包括至少一種選自下列的組分:本發明的肽、編碼此類肽的多核苷酸、呈遞有此類的肽的外來體或APC、和識別在其表面上呈遞有此類肽的細胞的CTL。
[0053]本發明的應用延及多種與MPH0SPH1過表達相關，或者源於MPH0SPH1過表達的疾病中的任何一種，諸如癌症，癌症的例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0054]更具體而言，本發明提供下述:
[0055][I]下述(a)或(b)的分離的肽:
[0056](a)包含選自 SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103 和 120 的胺基酸序列的肽；
[0057](b)包含在選自 SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103 和 120 的胺基酸序列中取
代、缺失、插入和/或添加1、2或幾個胺基酸的胺基酸序列的肽，且其中該肽具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力，
[0058][2] [I]分離的肽，其中該肽具有下列特徵之一或二者:
[0059](a)選自 SEQ ID NO: 5, 14，64，73，77，79，97，103 和 120 的胺基酸序列的 N 端第二
個胺基酸選自亮氨酸和甲硫氨酸；和
[0060](b)選自 SEQ ID NO: 5, 14，64，73，77，79，97，103 和 120 的胺基酸序列的 C 端氨基
酸選自纈氨酸和亮氨酸，
[0061][3] [I]或[2]的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽，
[0062][4] 一種分離的多核苷酸，其編碼[1]_[3]中任一項的肽；
[0063][5] 一種用於誘導CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種[I] _[3]中任一項的肽，或者一種或多種[4]的多核苷酸，
[0064][6] 一種用於誘導具有CTL誘導能力的APC的組合物，其中所述組合物包含一種或多種[1]_[3]中任一項的肽，或者一種或多種[4]的多核苷酸，
[0065][7] 一種藥物組合物，其包含選自下組的至少一種活性成分:
[0066](a) 一種或多種[1]-[3]中任一項的肽，
[0067](b) 一種或多種編碼[1]_[3]中任一項的肽的多核苷酸；
[0068](c) 一種或多種在其表面上呈遞有[1]_[3]中任一項的肽與HLA抗原的複合物的APC或外來體；和
[0069](d) 一種或多種識別在其表面上呈遞有[1]_[3]中任一項的肽與HLA抗原的複合物的細胞的CTL，
[0070][8] [7]的藥物組合物，供用於在受試者中治療和/或預防癌症，或誘導針對癌症的免疫應答，
[0071][9] [7]或[8]的藥物組合物，其中所述藥物組合物配製為供施用於HLA抗原為HLA-A2的受試者，
[0072][10] 一種用於誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞(APC)的方法，所述方法包括選自下組的步驟:
[0073](a)在體外、離體或在體內使APC與[1]-[3]中任一項的肽接觸，和[0074](b)將編碼[1]-[3]中任一項的肽的多核苷酸導入APC ；
[0075][11] 一種用於誘導CTL的方法，所述方法包括選自下組的步驟:
[0076](a)將⑶8陽性T細胞與在其表面上呈遞有HLA抗原與[1]-[3]中任一項的肽的複合物的APC共培養；
[0077](b)將⑶8陽性T細胞與在其表面上呈遞有HLA抗原與[1]-[3]中任一項的肽的複合物的外來體共培養；和
[0078](c)向⑶8陽性T細胞中導入編碼兩個T細胞受體(TCR)亞單位的一個多核苷酸，或編碼每一個TCR亞單位的多個多核苷酸，其中所述TCR能夠結合呈遞在細胞表面上的HLA抗原與[1]_[3]中任一項的肽的複合物；
[0079][12] 一種分離的APC，所述APC在其表面上呈遞有HLA抗原與[1]_[3]中任一項的肽的複合物；
[0080][13] [12]的APC，其是通過[10]的方法誘導的，
[0081][14] 一種分離的CTL，其識別在其表面上呈遞有HLA抗原與[1]-[3]中任一項的肽的複合物的細胞，
[0082][15] [14]的CTL，其中所述CTL是通過[11]的方法誘導的，
[0083][16] 一種治療和/或預防受試者中的癌症的方法，其中所述方法包括對受試者施用藥學有效量的
[0084](a) 一種或多種[1]-[3]中任一項的肽；
[0085](b) 一種或多種編碼[1]_[3]中任一項的肽的多核苷酸；
[0086](c) 一種或多種在其表面上呈遞有[1]_[3]中任一項的肽與HLA抗原的複合物的APC或外來體；或
[0087](d) 一種或多種識別在其表面上呈遞有[1]_[3]中任一項的肽與HLA抗原的複合物的細胞的CTL
[0088]的步驟，
[0089][17] 一種在有需要的受試者中誘導針對癌症的免疫應答的方法，所述方法包括對所述受試者施用包含[1]_[3]中任一項的肽或編碼所述肽的多核苷酸的組合物的步驟，
[0090][18]針對[1]_[3]中任一項的肽的抗體或其免疫學活性片段，
[0091][19] 一種載體,其包含編碼[1]_[3]中任一項的肽的核苷酸序列；
[0092][20] 一種宿主細胞，其經過[19]的載體轉化或轉染；；和
[0093][21] 一種診斷試劑盒，其包含[1]_[3]中任一項的肽、[4]的多核苷酸、或[18]的抗體。
[0094]在聯繫附圖和實施例閱讀下面的詳細說明時，本發明的目的和特徵將變得更加顯而易見。應當理解，前面的發明概要和後面的詳細說明都僅僅提出了示例性的實施方案，並不對本發明或本發明的其它可替換實施方案構成限制。尤其是，雖然在本文中就若干具體的實施方案對本發明進行了說明，應當理解這些描述對本發明而言是示例說明性的，不解釋成對本發明的限制。在不背離如隨附的權利要求所描述的本發明的精神和範圍的前提下本領域技術人員將容易地想到本發明的多種修改和應用。類似地，本發明的其它目的、特徵、好處和優勢是從此`處的概要和下文描述的特定實施方案可以容易地想到的，並且是本領域技術人員可以顯見的。根據上文的內容並結合隨附的實施例、數據、附圖以及從中能夠合理推斷的內容，或者進一步考慮本文中引用的參考文獻，這樣的目的、特徵、好處和優勢是容易想到的。
[0095]附圖簡述
[0096]本領域技術人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發明及其優選實施方案的詳細說明後將清楚地得知本發明的各個方面的應用。
[0097]圖1由一組照片(a)-(j)組成，描繪顯示對用源自MPH0SPH1的肽誘導的CTL進行的 IFN-Y ELISP0T 測定的結果。在用 MPH0SPH1-A02-9-850 (SEQ ID NO: 5) (a)刺激的 7 號孔、用 MPH0SPHl-A02-9-129(SEQ ID NO: 14) (b)刺激的 5 號孔、用 MPH0SPH1-A02-9-846 (SEQID NO: 64) (c)刺激的 5 號孔、用 MPH0SPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO: 73) (d)刺激的 2 號孔、用 MPH0SPH1-A02-10-770 (SEQ ID NO: 77) (e)刺激的 I 號孔、用 MPH0SPH1-A02-10-407 (SEQID NO: 79) (f)刺激的 I 號孔、用MPH0SPH1-A02-10-923(SEQ ID NO:97) (g)刺激的4號孔、用MPH0SPH1-A02-10-1484(SEQ ID NO: 103) (h)刺激的5號孔、和用MPH0SPH1-A02-10-282(SEQID NO: 120)⑴刺激的8號孔中的CTL分別與對照相比分別顯示了強的IFN-Y生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應孔中的細胞被擴增以建立CTL系。對比地，作為典型的陰性數據，用MPH0SPHl-A02-9-575(SEQ ID NO:1) (j)刺激的CTL未顯示特異性IFN-Y生成。在圖中，"+"指示針對經適宜肽衝激的靶細胞的IFN-Y生成，而"指示針對未經任何肽衝激的靶細胞的IFN-Y生成。
[0098]圖2a_f由一組線圖(a) - (f)組成，描繪IFN- Y ELISA測定法的結果，其顯示用 MPH0SPH1-A02-9-850(SEQ ID NO:5)(a)，MPH0SPH1-A02-9-129(SEQ ID NO:14)(bMPHOSPH1)，MPH0SPH1-A02-9-846 (SEQ ID NO:64)(c), MPH0SPH1-A02-10-460 (SEQ ID NO:73)
(d)，MPH0SPH1-A02-10-770(SEQID NO:77)(e),和 MPH0SPH1-A02-10-407(SEQ ID NO:79)(f)刺激的CTL系的IFN-y生成。用IFN-y酶聯免疫吸附測定(ELISA)測量了 CTL系產生的IFN-Y的量。結果顯示，用每種肽刺激而建立的CTL系都顯示了與對照相比強的IFN-Y生成。在圖中，"+"指示針對經適宜肽衝激的靶細胞的IFN-Y生成，而"指示針對未經任何肽衝激的靶細胞的IFN-Y生成。R/S比表明應答細胞(CTL系)與刺激細胞的數目的比例。
[0099]圖2g_i由一組線圖(g)-(i)組成，描繪IFN-Y ELISA測定法的結果，其顯示用MPH0SPH1-A02-10-923(SEQ ID NO:97)(g), MPH0SPH1-A02-10-1484(SEQ ID NO:103)(h)和MPH0SPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO: 120)⑴刺激的 CTL 系的 IFN-Y 生成。用 IFN-Y 酶聯免疫吸附測定(ELISA)測量了 CTL系產生的IFN-Y的量。結果顯示，用每種肽刺激而建立的CTL系都顯示了與對照相比強的IFN-Y生成。在圖中，"+"指示針對經適宜肽衝激的靶細胞的IFN-Y生成，而"指示針對未經任何肽衝激的靶細胞的IFN-Y生成。R/S比表明應答細胞(CTL系)與刺激細胞的數目的比例。
[0100]圖3由一系列線圖(a)至(e)組成，是描繪從用MPH0SPH1-A02-9-850 (SEQ IDNO:5) (a), MPH0SPH1-A02-9-846(SEQ IDNO:64)(b), MPH0SPH1-A02-10-460(SEQ ID NO:73)
(c), MPH0SPH1-A02-10-770(SEQ ID NO:77) (d)和 MPH0SPH1-A02-10-282(SEQ ID NO:120)
(e)刺激的CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克隆的IFN-Y的生成。結果證明了通過用每種肽刺激而建立的CTL克隆顯示與對照相比強的IFN-Y生成。在圖中，"+"指示針對經適宜肽衝激的靶細胞的IFN-Y生成，而"指示針對未經任何肽衝激的靶細胞的IFN-Y生成。R/S比表明應答細胞(CTL克隆)與刺激細胞的數目的比例。
[0101]圖4是描繪針對腫瘤細胞系的特異性CTL活性的線圖。使用表達MPH0SPH1和HLA-A*0201的J82細胞、表達MPH0SPH1但不表達HLA_A*0201的HT1376細胞、及表達HLA-A*0201 但不表達 MPH0SPH1 的 T2 細胞作為刺激細胞。用 MPH0SPH1-A02-10-282 (SEQID NO: 120)建立的CTL克隆顯示了針對J82細胞的特異性CTL活性。另一方面，沒有檢測到顯著的針對HT1376和T2細胞的特異性CTL活性。R/S比表明應答細胞(CTL克隆)與刺激細胞的數目的比例。
[0102]圖5是描繪CTL針對腫瘤細胞系的細胞毒活性的線圖。使用表達MPH0SPH1和HLA-A*0201的UMUC-3細胞、表達MPH0SPH1但不表達HLA_A*0201的MKN45細胞、及表達HLA-A*0201 但不表達 MPH0SPH1 的 T2 細胞作為靶細胞。用 MPH0SPH1-A02-10-282 (SEQ IDNO: 120)建立的CTL克隆顯示了針對UMUC-3細胞的強細胞毒活性。另一方面，沒有檢測到顯著的針對MKN45和T2細胞的特異性CTL活性。E/T比表明效應細胞(CTL克隆)與靶細胞的數目的比例。
[0103]圖6是描繪CTL針對表達MPH0SPH1和HLA_A*0206的靶細胞的細胞毒活性的線圖。製備用HLA-A*0206或全長MPH0SPH1基因轉染的C0S7細胞作為對照。用MPH0SPH1-A02-10-282 (SEQ ID NO:120)建立的 CTL 系顯示了針對用 MPH0SPH1 和HLA-A*0206 二者轉染的C0S7細胞的特異性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，沒有檢測到顯著的針對表達HLA-A*0206 (三角形)或MPH0SPH1 (圓形)的靶細胞的特異性CTL活性。
[0104]實施方案的描述
[0105]現在描述優選的材料、裝置、和方法，不過在實施或檢驗本發明的實施方案時可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發明材料和方法之前，要理解這些描述只是說明性的，並不意圖限定。還要理解的是，本發明不限於特定大小、性狀、尺度、材料、方法學、方案等，因為它們可因循例行實驗和/或優化而變化。此外，所述描述中使用的術語只是出於描述特定樣式或實施方案的目的，而非意圖限制本發明的範圍，本發明的範圍只會由所附權利要求來限制。
[0106]通過提述明確地將本說明書中提到的每個出版物、專利或專利申請的公開內容完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認本發明沒有資格憑藉發明在先而早於這些公開。
[0107]除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語均具有本發明相關領域的技術人員通常知曉的意義。然而，如果有衝突，以本說明書(包括定義)為準。此外，這些材料、方法和實例僅是示例說明性的，而不意在限制。
[0108]1.定義
[0109]如本文中使用的，詞語「一個/種」、「該」、和「所述」意味著「至少一個/種」，除非
另有明確說明。
[0110]與物質(例如肽、抗體、多核苷酸等)聯用的術語「分離的」和「純化的」表示該物質基本上不含至少一種可能包括於天然來源中的其它物質。因此，分離的或純化的肽指這樣的肽，其基本上不含 來自該肽所來源的細胞或組織的細胞物質例如碳水化合物、脂質或其它汙染性蛋白，或當其為化學合成時，基本上不含化學前體或其它化學品的抗體。術語「基本上不含細胞物質」包括其中肽與來自其被分離或重組產生的細胞的細胞組分相分離的肽製備物。因此，基本上不含細胞物質的肽包括具有少於約30%、20%、10%或5% (按乾重計)的異源蛋白質(在此也稱為「汙染蛋白質」)的多肽製備物。當肽系重組產生時，其還優選基本上不含培養基，包括含有少於約20%、10%或5%肽製備物體積的培養基的肽製備物。當多通過化學合成產生時，其優選基本上不含化學前體或其它化學品，包括具有少於約30%、20%、10%,5% (按乾重計)的與肽合成有關的化學前體或其它化學藥品的肽製備物。特定肽製備物含有分離的或純化的肽可以通過，例如在蛋白質製備物的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍染色等之後單一條帶的出現來顯示。在一個優選的實施方案中，本發明的肽和多核苷酸是分離的或純化的。[0111]術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基可以是經過修飾的殘基或非天然存在型殘基(諸如相應的天然存在的胺基酸的人工化學模擬物)的胺基酸聚合物，以及天然存在的胺基酸聚合物。
[0112]本說明書中有時使用的術語「寡肽」用於指長度為20個殘基或更少，典型地為15個殘基或更少的本發明的肽，通常由約8個-約11個殘基，經常為9個或10個殘基組成。後兩者在本文中分別稱為「九肽」和「十肽」。
[0113]如本文中使用的，術語「胺基酸」指天然存在的和合成的胺基酸，以及具有與天然存在的胺基酸相似的功能的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。胺基酸可以是L-胺基酸或D-胺基酸。天然存在的胺基酸指由遺傳密碼編碼的胺基酸，以及在細胞中在翻譯後被修飾的胺基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基穀氨酸、和O-磷酸絲氨酸)。短語「胺基酸類似物」指與天然存在型胺基酸具有相同的基礎化學結構(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團結合)但具有一個或多個經過修飾的R基團或經過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶)。短語「胺基酸模擬物」指與具有與一般胺基酸不同的結構但發揮與一般胺基酸相似的功能的化學化合物。
[0114]胺基酸在本文中可以通過它們公知的三字母符號或IUPAC-1UB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來指稱。
[0115]術語「基因」、「多核苷酸」和「核酸」在本文中除非另有明確說明可互換使用，而且與胺基酸類似地通過它們普遍接受的單字母代碼來指稱。
[0116]術語「作用劑」和「組合物」和在本文中可互換使用，用於指包含規定量的規定成分的產品，以及通過所述規定量的規定成分的組合直接或間接地得到的任何產品。這些術語與修飾語「藥物」關聯使用(如「藥物作用劑」和「藥物組合物」)時，意在涵蓋:包括活性成分以及任何組成載體的惰性成分的產品，以及通過所述任何兩種或更多種成分的組合、複合或聚集，或通過一種或多種組分的解離，或通過一種或多種成分的其它類型的反應或相互作用而直接或間接地得到的任何產品。相應地，在本發明的語境中，術語「藥物作用劑」和「藥物組合物」指任何通過混合本發明的分子或化合物與藥學或生理學上可接受的載體而製成的產品。
[0117]本文中所用的短語「藥學上可接受的載體」或「生理學上可接受的載體」意思是藥學上或生理學上可接受的材料、組合物、物質、或媒介，包括但不限於液體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包埋材料。
[0118]本發明的藥物作用劑或藥物組合物特別可以用作疫苗。在本發明的語境中，短語「疫苗」(又稱「免疫原性組合物)是指在接種到動物體內後具有誘導抗腫瘤免疫功能的作用劑組合物。
[0119]術語「活性成分」在本文中意指組合物中具有生物學活性或生理學活性的作用劑或物質。尤其是，在藥物組合物的語境中，術語「活性成分」是指顯示客觀的藥理學效果的物質。例如，在用於治療或預防癌症的藥物組合物的場合，組合物中的活性成分可直接或間接地導致對於癌細胞和/或組織的至少一種生物學或生理學作用。優選地，這樣的作用可包括減少或抑制癌細胞生長、破壞或殺死癌細胞和/或癌組織，等等。典型地，活性成分的間接效果包括誘導可識別或殺死癌細胞的CTL。在配製之前，「活性成分」又可稱「原料藥」 (bulk)、「藥物物質」 (drug substance)或「技術產品」 (technical product)。
[0120]除非另有定義，術語「癌症」指過表達MPH0SPH1基因的癌症，過表達MPH0SPH1的癌症的實例包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0121]除非另有定義，術語「細胞毒性T淋巴細胞」、「細胞毒性T細胞」和「CTL」在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細胞(例如腫瘤/癌細胞、病毒感染的細胞)並誘導此類細胞死亡的T淋巴細胞亞群。
[0122]除非另有定義，本文中使用的術語「HLA-A2」代表性地指亞型，其例子包括但不限於 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA_A*0203，HLA_A*0204，HLA_A*0205，HLA_A*0206，HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA_A*0211, HLA_A*0213, HLA_A*0216, HLA_A*0218, HLA_A*0219,HLA-A*0228 和 HLA-A*0250。
[0123]除非另有定義，如本文中所用的術語「試劑盒」是指試劑及其它材料的組合。考慮術語「試劑盒」可包括微陣列、晶片、標記物、等等。術語「試劑盒」不意圖限於某種特定的試劑和/或材料組合。
[0124]如本文中使用的,在受試者或者患者的語境中，短語「受試者(或患者)的HLA抗原是HLA-A2」是指受試者或患者純合地或者雜合地擁有HLA-A2抗原基因作為MHC (主要組織相容性複合物)I類分子，且HLA-A2抗原在受試者或患者的細胞中作為HLA抗原表達。
[0125]以本發明的方法和組合物在「治療」癌症的語境中有用為限，如果治療導致臨床上的收益，例如受試者體內癌症的尺寸、普遍性(prevalence)或轉移潛力的降低,癌症進展的延遲，癌症臨床症狀的緩解，生存時間的延長，手術後復發的抑制等等，則認為治療是「有效的」。當預防性地應用治療時，「有效的」意思是其阻礙或阻止癌症的形成，或者阻止或減輕癌症的臨床症狀。「有效性」結合用於診斷或治療特定腫瘤類型的任何已知方法來確定。
[0126]以本發明的材料和方法可用於「預防」和「防範」癌症的語境為限，此類術語在本文中可互換使用，指降低緣於疾病的死亡率或發病率負擔的任何活動。預防和防範可發生於「一級、二級和三級預防水平」。一級預防和防範避免疾病的發生，而二級和三級水平的預防和防範涵蓋旨在預防和防範疾病的進展與症狀的出現、以及通過恢復功能和減輕疾病相關併發症來降低已建立的疾病的負面影響的活動。或者，預防和防範可包括旨在減輕特定病症的嚴重性(例如降低腫瘤的增殖和轉移等)的多種多樣的預防性療法。
[0127]在本發明的語境中，治療和/或預防癌症和/或預防其手術後復發包括任何導致例如下述事件的行為: 癌性細胞生長抑制、腫瘤的衰退或消退、癌症減退的誘導和癌症發生的阻抑、腫瘤的消退、轉移的降低或抑制、癌症手術後復發的抑制，以及生存時間的延長。癌症的有效治療和/或預防可降低患癌個體死亡率及改善其預後，降低其血液中腫瘤標誌物的水平，及減輕其伴隨癌症的可檢測症狀。例如，症狀的減輕或改善構成有效治療和/或預防，包括10%、20%、30%或更多降低，或實現病情穩定。
[0128]在本發明的語境中，術語「抗體」指可以與指定的蛋白或其肽具有特異性反應性的免疫球蛋白及其片段。抗體可以包括人抗體、靈長源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標記物融合的抗體、和抗體片段。另外，在本文中，抗體以最廣義使用，具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現期望的生物學活性。「抗體」指示所有類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
[0129]I1.At
[0130]下文詳述的本發明的肽可稱為「MPH0SPH1肽」或「MPH0SPH1多肽」。
[0131]為了證明源自MPH0SPH1的肽發揮被CTL所識別的抗原的功能，對源自MPH0SPH1 (SEQ ID NO: 126)的肽進行了分析以確定它們是否為HLA-A2限制性的抗原表位，HLA-A2是經常遇到的HLA等位基因(Date Y et al., Tissue Antigens47:93-101, 1996;Kondo A et al., J Immunol 155:4307-12，1995;Kubo RT et al., JTmmunol 152:3913-24，1994)。
[0132]基於有關它們對HLA-A2的結合親和力的信息，鑑定了源自MPH0SPH1的HLA-A2結合肽的候選者。
[0133]此外，用經過這些肽衝激(加載)了的樹突細胞(DC)體外刺激T細胞後，通過使用下述每一種肽刺激DC成功地建立了 CTL:
[0134]MPH0SPH1-A2-9-850(SEQ ID NO:5)，
[0135]MPH0SPH1-A2-9-129(SEQ ID NO:14)，
[0136]MPH0SPH1-A2-9-846(SEQ ID NO:64)，
[0137]MPH0SPH1-A2-10-460(SEQ ID NO:73)，
[0138]MPH0SPH1-A2-10-770(SEQ ID NO:77)，
[0139]MPH0SPH1-A2-10-407(SEQ ID NO:79)，
[0140]MPH0SPH1-A2-10-923(SEQ ID NO:97)，
[0141]MPH0SPH1-A2-10-1484(SEQ ID NO:103)和
[0142]MPH0SPH1-A2-10-282(SEQ ID NO:120)
[0143]這些建立的CTL針對經相應肽衝激的靶細胞顯示強且特異性的CTL活性。這些結果證明MPH0SPH1是被CTL識別的抗原，且這些被測試的肽是MPH0SPH1的受HLA-A2限制的表位肽；因此，這些肽作為CTL細胞毒作用的靶抗原可能是有效的。此外，MPH0SPH1-A2-10-282 (SEQ ID NO: 120)誘導的 CTL 具有針對表達 MPH0SPH1 和作為 MHC I類分子的HLA-A2的癌細胞的強細胞毒活性。該結果提示MPH0SPH1-A2-10-282在體內天然存在，並被HLA-A2抗原(例如HLA-A*0201或HLA_A*0206)提呈在表達MPH0SPH1的癌細胞上。根據這些發現，包含選自S EQ ID N0:5，14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的肽，或其衍生物、突變體、變體或修飾肽，可以在免疫治療的語境中使用，用於治療表達MPH0SPH1和HLA-A2抗原的癌症。在本發明的特定實施方案中，由本文中公開的胺基酸序列構成的肽可用於癌症的免疫治療。要治療的癌症包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。但是，本發明的肽可應用於任何癌症，只要它們表達MPH0SPH1和HLA-A2抗原。
[0144]由於MPH0SPH1基因在癌細胞，例如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤中過表達，而在大多數正常器官中不表達，它是良好的免疫治療靶標。因此，本發明提供來源於MPH0SPH1的被CTL識別的表位的九肽(由九個胺基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個胺基酸殘基組成的肽)。或者，本發明提供結合HLA抗原且誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的分離的肽，其中所述肽由MPH0SPH1 (SEQ ID NO: 126)的免疫學活性片段構成。更具體地，本發明提供包含選自SEQ IDNO: 5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的肽。更具體地，在一些實施方案中，本發明的肽是包含SEQ ID NO: 120的胺基酸序列的肽。 [0145]一般而言，目前可以通過例如網際網路訪問的軟體程序，如Parker KC etal., J Immunol 1994,Jan I 152 (I):163-75,和 Nielsen M et al., Protein Sci2003; 12:1007-17等中描述的那些，可以用來在計算機上計算不同肽與HLA抗原之間的結合親和力。與HLA抗原的結合親和力可以按照例如下列文獻中描述的那樣進行測定:Parker KC et al., J Tmmunol 1994, Jan I 152 (I):163-75, Kuzushima K et al., Blood2001,98 (6):1872-81, Larsen MV et al.BMC Bioinformatics.2007 Oct 31;8:424,BuusS et al.Tissue Antigens.,62:378-84,2003,Nielsen M et al., Protein Sci2003;12:1007-17,和 Nielsen M et al.PLoS ONE 2007;2:e796,其總結於例如 LafuenteEM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009，15，3209-3220。用於測定結合親和力的方法在例如 Journal of Immunological Methods, (1995，185:181-190);和 ProteinScience (2000, 9:1838-1846)中有描述。因而可以容易地利用這樣的軟體程序來選擇具有高度的HLA抗原結合親和力的源自MPH0SPH1的片段。因此，本發明涵蓋由任何將通過這些已知程序被確定為與HLA抗原結合的、衍生自MPH0SPH1片段構成的肽。此外，這樣的肽可包括由MPH0SPH1的全長序列組成的肽。
[0146]本發明的肽，尤其是本發明的九肽和十肽，在其側翼可以具有額外的胺基酸殘基，只要這些肽保持它們的CTL誘導能力即可。具體的額外胺基酸殘基可以由任何種類的胺基酸構成，只要其不損害原來的肽的CTL誘導能力。因此，本發明涵蓋具有CTL誘導能力的肽，其中所述肽包含衍生自MPH0SPH1的胺基酸序列。這樣的肽為例如少於約40個胺基酸，經常少於約20個胺基酸，通常少於約15個胺基酸。
[0147]公知肽中一個、兩個、幾個或多個胺基酸的修飾不影響肽的功能，或者在有些情況下甚至會增強原肽的期望功能。事實上，已知有經過修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中修飾(即由通過對原參考序列取代、插入、缺失和/或添加一個、兩個或數個胺基酸殘基而修飾的胺基酸序列構成的肽)保留原始肽的生物學活性(Mark et al.，Proc Natl AcadSci USA 1984,81:5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500;Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在本發明的一個實施方案中，本發明的具有CTL誘導能力的肽可以由這樣的肽構成，所述肽具有選自SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列，其中添加、缺失、插入、和/或取代了一個、兩個或幾個胺基酸。
[0148]在另一個實施方案中，本發明的肽可以是這樣的肽，其包含在選自SEQ IDNO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩
個或幾個胺基酸的胺基酸序列，條件是該修飾肽保留原始肽的CTL誘導能力。在優選的實施方案中，本發明的肽可以是包含在SEQ ID NO: 120的胺基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或幾個胺基酸的胺基酸序列的肽，條件是該修飾肽保留原始肽的CTL誘導能力。
[0149]本領域技術人員會認識到，改變全體胺基酸序列中的單個胺基酸或少數百分比胺基酸的個別修飾(即添加、插入、缺失、或取代)往往導致原始胺基酸側鏈的特性得以保留；因此其被稱作「保守取代」或「保守修飾」，其中對蛋白質的改變導致具有類似的功能的蛋白質。提供功能上相似的胺基酸的保守取代表是本領域公知的。胺基酸側鏈特徵的例子包括例如疏水性胺基酸(A, I, L, M, F，P, W, Y, V)、親水性胺基酸(R, D, N, C，E, Q, G, H, K, S，T)、和具有下面的共同官能團或特徵的側鏈:脂肪族側鏈(G，A，V，L，I，P);含羥基側鏈(S, T, Y)；含硫原子側鏈(C, M);含羧酸和醯胺側鏈(D, N, E, Q);含鹼側鏈(R, K, H);和含芳香族側鏈(H, F，Y, W)。另外，下面的八組各自含有互為保守取代的胺基酸:
[0150]I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
[0151]2)天冬氨酸(D)，穀氨酸(E)；
[0152]3)天冬醯胺(N)，穀氨醯胺(Q)；
[0153]4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；
[0154]5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；
[0155]6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
`[0156]7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和
[0157]8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。
[0158]此類保守修飾肽也被視為本發明的肽。然而，本發明的肽不限於此，可包括非保守修飾，只要該肽保留原始的未修飾肽的CTL誘導能力。另外，經過修飾的肽不應排除衍生自MPH0SPH1的多態變體、種間同源物、或等位基因中的可誘導CTL的肽。
[0159]可以對本發明的肽插入、取代、缺失和/或添加胺基酸殘基，或者，可以從本發明的肽缺失胺基酸殘基，以實現更高的結合親和力。為了保持所需的CTL誘導能力，可以修飾(插入、缺失、添加和/或取代)少數(例如，I個、2個或幾個)或小百分比的胺基酸。這裡，術語「幾個」意指5個以下的胺基酸，如4個或3個以下。要被修飾的胺基酸的百分比優選為20%以下，例如15%以下，更優選10%以下，進一步更優選或1_5%。
[0160]當在癌症免疫療法的語境中使用時，本發明的肽可作為與HLA抗原的複合物被呈遞在細胞或外來體的表面上。因此，優選的是選擇不但可誘導CTL而且還具備對HLA抗原的高結合親和力的肽。為此目的，可通過取代、插入、缺失和/或添加胺基酸殘基對肽加以修飾以產生結合親和力改善的修飾肽。除了天然被展示的肽之外，由於已經知道通過結合HLA抗原而被展示的肽的序列規律(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogeneticsl995, 41:178; J Immunol 1994，155:4307)，可將基於此類規律的修飾引入本發明的免疫原性肽。
[0161]例如，顯示高的HLA-A2結合親和力的肽的N端第二個胺基酸傾向於被取代為亮氨酸或甲硫氨酸。類似地，C端胺基酸被取代為纈氨酸或亮氨酸的肽也可以優選地使用。因此，具有選自SEQ ID N0:5，14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列，其中所述SEQID NO的胺基酸序列的N端第二個胺基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或其中所述SEQ ID NO的胺基酸序列的C端被取代為纈氨酸或亮氨酸的肽涵蓋在本發明之內。在另一個實施方案中，本發明涵蓋具有這樣的胺基酸序列的肽，所述胺基酸序列中選自SEQ IDNO: 5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的N端第二個胺基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或所述SEQ ID NO的胺基酸序列的C端被取代為纈氨酸或亮氨酸。在優選的實施方案中，本發明的肽可包含這樣的胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 120的胺基酸序列的N端第二個胺基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或所述SEQ ID NO的胺基酸序列的C端被取代為纈氨酸或亮氨酸。
[0162]在一個實施方案中，本發明提供具有CTL誘導能力的肽，其中所述肽具有選自下組⑴至(9)的通式:
[0163](I)-對應於 MPH0SPHl-A2-9-850(SEQ ID N0:5)_
[0164]F[X1]L TIEN E[X2],
[0165](2)-對應於 MPH0SPHl-A2-9-129(SEQ ID NO: 14)-
[0166]F[X1]G CIMQ P[X2],
[0167](3)-對應於 MPH0SPHl-A2-9-846(SEQ ID NO:64)-
[0168]G[X1]R AFLL T[X2],
[0169](4)-對應於 MPH0SPH1-A2-10-460(SEQ ID NO:73)-
[0170]Y[X1]A YDETL N[X2],`[0171](5)-對應於 MPH0SPH1-A2-10-770(SEQ ID NO:77)-
[0172]K[X1]I CNETV E[X2]
[0173](6)-對應於 MPH0SPH1-A2-10-407(SEQ ID NO:79)-
[0174]L[X1]T LGKCI N[X2]
[0175](7)-對應於 MPH0SPH1-A2-10-923(SEQ ID NO:97)-
[0176]K[X1]S NEIET A[X2]
[0177](8)-對應於 MPH0SPH1-A2-10-1484(SEQ ID NO: 103)-
[0178]Q[X1]V AALEI Q[X2],和
[0179](9)-對應於 MPH0SPH1-A2-10-282(SEQ ID NO: 120)-
[0180]Y[X1]Y DLFVP V[X2]。
[0181]在通式(1)-(9)中，[XI]是亮氨酸或甲硫氨酸，且[X2]是纈氨酸或亮氨酸。在本發明的一個特別優選的實施方案中，通式可為(9)，其對應於SEQ ID N0:120。本發明還提供由上面的通式(1)-(9)表示的分離的肽，其中在其N端和/或C端添加了一個、兩個或幾個胺基酸。在一個替代實施方案中，本發明提供由上面的通式(1)-(9)表示的分離的肽，其中在其N端和/或C端缺失了一個、兩個或幾個胺基酸。本發明還提供由上面的通式(1)-(9)表示的分離的肽，其中在該序列中的任何地方插入或缺失了一個、兩個或幾個胺基酸。
[0182]不僅可以在肽的末端胺基酸處引入取代，而且可以在肽的潛在T細胞受體(TCR)識別位置處引入取代。數項研究已證明了具有胺基酸取代的肽可等同於或好於原來的，例如 CAPU p53(264_272)、Her-2/neu(369-377)或 gplOO(209_217) (Zaremba et al.CancerRes.57，4570-4577，1997，T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002) ; 168 (3): 1338-47.，S.0.Dionne et al.Cancer Tmmunol immunother.(2003)52:199-206 及 S.0.Dionne etal.Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53, 307-314)。[0183]本發明還考慮向本發明的肽的N和/或C端添加一個、兩個或幾個胺基酸。此類保留CTL誘導能力的修飾肽也包含在本發明之內。
[0184]然而，當肽序列與具有不同功能的內源或外源蛋白質的胺基酸序列的一部分相同時，可能誘導副作用，諸如自身免疫性病症或針對特定物質的變應性症狀。因此，可以利用可用的資料庫實施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質的胺基酸序列匹配的情況。當根據同源性搜索清楚了即使對目標肽僅有I個或2個胺基酸差異的肽亦不存在時，可以修飾目標肽以提高其與HLA抗原的結合親和力，和/或提高其CTL誘導能力，而沒有任何發生此類副作用的危險。
[0185]雖然如上所述的對HLA抗原具有高結合親和力的肽預期是高度有效的，但還是對根據高結合親和力的存在為指標選出的候選肽檢查了 CTL誘導能力的存在。這裡，短語「CTL誘導能力」指肽被呈遞到抗原呈遞細胞(APC)上時誘導CTL的能力。另外，「CTL誘導能力」包括肽誘導CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細胞、和提高CTL IFN- Y生成的能力。 [0186]CTL誘導能力的確認通過如下來實現,誘導攜帶人MHC抗原的APC(例如B-淋巴細胞、巨噬細胞、和樹突細胞(DC))，或者更具體地說，源自人外周血單核白細胞的DC，並且在用測試肽刺激APC後，將APC與CD8-陽性細胞混合以誘導CTL，然後測量由CTL生成和釋放的針對靶細胞的IFN-Y。作為反應系統，可使用已經製成的表達人HLA抗原的轉基因動物(例如 BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C，Low L, Primus J, DiamondDJ, Hum Tmmunol 2000,Aug, 61(8):764-79Related Articles, Books, Linkout Inductionof CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1transgenicmice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T (H) response 中描述的那些)。或者，可以用51Cr等放射性標記靶細胞，並且可以自靶細胞釋放的放射性計算CTL的細胞毒性活性。或者，它可以如下評估:測量在攜帶固定化肽的細胞存在下由CTL生成和釋放的IFN- Y，並使用抗IFN- Y單克隆抗體顯現培養基上的抑制區。
[0187]作為如上所述檢查肽的CTL誘導能力的結果，發現選自具有選自SEQ IDNO: 5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的九肽或十肽不但具有對HLA抗原的高結合親和力，還具有CTL誘導能力。因此，例舉這些肽為本發明優選的實施方案。
[0188]另外，同源性分析結果顯示了這些肽與自任何其它已知人基因產物衍生的肽不具有顯著的同源性。這降低了用於免疫療法時發生未知的或不想要的免疫應答的可能性。因此，也是根據這個方面，這些肽可用於在癌症患者中引發針對MPH0SPH1的免疫力。因此，本發明涵蓋具有選自SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的肽。
[0189]除上文討論的修飾之外，可將本發明的肽連接至其它肽，只要所得的連接肽保留原始肽的CTL誘導能力。合適的「其它肽」的例子包括:本發明的肽或者從其它TAA衍生的能誘導CTL的肽。本發明的肽可以直接地或者通過接頭間接地連接「其它」肽。肽間的接頭是本領域公知的,例如 AAY (P.M.Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AM, NKRK (R.P.M.SutmulIer et al., J Immunol.2000，165: 7308-7315)或 K(S.0ta et al., CanRes.62,1471-1476, K.S.Kawamura et al., J Tmmunol.2002, 168:5709-5715)。
[0190]例如，衍生自非MPH0SPH1的腫瘤相關抗原的肽也可以用來增加藉由HLA I類和/或II類的免疫應答。公知癌細胞表達超過一種腫瘤相關基因。一些衍生自這樣的TAA的 CTL 可誘導肽已經得到分離(例如 W02008/047473, W02010/047062, W02008/102557, W02009/025116)。因此，連接於本發明的肽的「其它」肽的例子包括但不限於衍生自MPH0SPH1之外的TAA的CTL可誘導肽。在本發明中，「其它」肽可不僅僅是MHC I類限制型肽，頁可以是MHC II類限制型肽。本領域技術人員使用常規的分子生物學程序可以製備包括一種或多種MPH0SPH1肽以及一種或多種非MPH0SPH1肽的多肽，或編碼此類多肽的核酸。
[0191]上述的連接肽在本文中被稱為「多表位」(polytope) 」，即兩個或更多個潛在免疫原性或免疫應答刺激性肽構成的組，這些肽可以以各種排列方式(例如串聯、交疊)連接在一起。該多表位(或編碼該多表位的核酸)可以依照標準免疫方案施用，例如施用於動物，以測試該多表位刺激、增強和/或引起免疫應答的有效性。
[0192]肽可直接地或經使用側翼序列連接在一起以形成多表位，而且多表位作為疫苗的用途是本領域公知的(參見例如Thomson et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA92(13):5845-5849, 1995;Gilbert et al., Nature Biotechnol.15 (12):1280-1284, 1997;Thomson et al.,J Immunol.157 (2):822-826，1996;Tarn et al.,J Exp.Med.171(1):299-306, 1990)。可製備含有不同數目和組合的表位的多表位並測試它們被CTL識別的情況及提高免疫應答的功效。
[0193]可將本發明的肽進一步連接至其它物質，只要它們保留CTL誘導能力。此類「其它」物質的示例性例子包括但不限於:肽、脂質、糖和糖鏈、乙醯基、天然的和合成的聚合物等。肽還可含有修飾，諸如糖基化、側鏈氧化、或磷酸化；前提是該修飾不破壞如肽的本文所述的生物學活性。可以進行這些類型的修飾以賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)或使多肽穩定。
[0194]例如，為了提高多肽的體內穩定性，本領域已知引入D-胺基酸、胺基酸模擬物或非天然胺基酸；此構思也可適用於本發明多肽。可以以多種方式測定多肽的穩定性。例如，可使用肽酶和各種生物學介質(諸如人血漿和血清)來測試穩定性(參見例如Verhoef etal.,Eur J Drug Metab Pharmacokinl986, 11:291-302)。
[0195]當本發明的肽包含半`胱氨酸殘基時，肽易於通過半胱氨酸殘基的SH基團之間的二硫鍵形成二聚體。因此，本發明的肽還包括本發明的肽的二聚體。
[0196]此外，如上文所述，在取代、缺失、插入、和/或添加了一個、兩個或數個胺基酸殘基的修飾肽中，可以篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高者。因此，本發明還提供由於篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高的修飾肽的方法。例如，所述方法可包括下述步驟:
[0197]a:對本發明的肽修飾(即取代、缺失、插入、或添加)至少一個胺基酸殘基，
[0198]b:測定步驟(a)中修飾得到肽的活性，和
[0199]c:選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。
[0200]這裡，所述活性可包括MHC結合活性和APC或CTL誘導能力。優選地，肽的活性是CTL誘導能力。
[0201]II1.MPH0SPH1 狀的制各
[0202]本發明的肽可使用公知技術來製備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術或化學合成來製備。本發明的肽可個別地合成，或合成為包括兩個或更多個肽的較長多肽。然後可以分離，即純化或分離所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主細胞蛋白質及其片段或任何其它化學物質。
[0203]本發明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破壞原始肽的生物學活性。其它示例性的修飾包括摻入D-胺基酸或其它可用的胺基酸模擬物，以便例如增加肽的血清半壽期。
[0204]可以根據選定的胺基酸序列，藉助化學合成來獲得本發明的肽。可適用於合成的常規肽合成法的例子包括:
[0205](i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
[0206](ii) The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976 ；
[0207](iii) Peptide Synthesis (日文)，Maruzen C0., 1975 ；
[0208](iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文),MaruzenC0.,1985 ；
[0209](v) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol.14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；
[0210](vi)W099/67288 ;和
[0211](vii)Barany G.&Merrifield R.B., Peptides Vol.2, " Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York, 1980，100-118。
[0212]或者，可採用任何已知的遺傳工程肽生產方法來獲得本發明的肽(例如Morrison J, J Bacteriology1977, 132:349-51;Clark-Curtiss&Curtiss,MethodsinEnzymology (eds.Wu et al.) 1983, 101:347-62)。例如，首先，製備包含處於可表達形式(例如處於相當於啟動子序列的調節序列下遊)的編碼目標肽的多核苷酸的合適載體，並轉化入合適的宿主細胞。本發明也提供這樣的載體和宿主細胞。然後培養宿主細胞以生成感興趣的肽。也可以採用體外翻譯系統在體外生產肽。
[0213]IV.多核苷酸:
[0214]本發明還提供編碼任何上述本發明肽的多核苷酸。本發明的多核苷酸可包括源自天然存在型MPH0SPH1 基因(例如，GenBank Accession N0.ΝΜ_001031702 (SEQ ID NO: 125))的多核苷酸以及具有它們的經過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語「經過保守修飾的核苷酸序列」指編碼相同或本質上相同的胺基酸序列的序列。由於遺傳密碼的簡併性，對於任何給定蛋白質都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成所述的任何相應密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異在本領域被稱為「沉默變異」，代表了保守修飾變異體的一種。本文中每一種描述為編碼肽的核酸序列也描述該核酸的每一種可能的沉默變異。本領域技術人員很容易認識到，核酸中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)都可以被修飾以產生功能上相同的分子。因而，公開的每一個編碼肽的核苷酸序列均代表與之相關的沉默變異的隱含公開。
[0215] 本發明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構成。如本領域公知的，DNA分子由鹼基諸如天然存在的鹼基A、T、C、和G合適地構成，而T在RNA中被U替換。本領域技術人員會認識到非天然存在的鹼基也包括在多核苷酸中。
[0216]本發明的多核苷酸可編碼多個本發明的肽，其中有或無居間胺基酸序列存在。例如，居間胺基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(例如酶識別序列)。另外，本發明的多核苷酸除編碼本發明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，本發明的多核苷酸可以是包括表達肽所需要的調節序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標誌基因等等的表達載體(質粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規重組技術操作多核苷酸來製備，例如通過使用聚合酶和內切核酸酶。
[0217]重組和化學合成技術都可用來生成本發明的多核苷酸。例如，可以通過將具有本發明肽的編碼序列的多核苷酸插入到在轉染入感受態細胞後能表達的適宜載體中來生成本發明的多核苷酸。或者，可藉助PCR技術或通過在合適宿主中的複製來擴增本發明的多核苷酸(參見例如 Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, New York, 1989)。或者,可使用固相技術來合成本發明的多核苷酸，如 Beaucage SL&Iyer RP, Tetrahedron 1992，48:2223-311;Matthes et al., EMBO J1984，3:801-5 中記載的。
[0218]V.外來體(exosomes): [0219]本發明進一步提供了稱作外來體的細胞內囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞有本發明肽與HLA抗原之間形成的複合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報平11-510507和W099/03499中詳細描述的方法來製備，並可以用從作為治療和/或預防對象的患者獲得的APC製備。本發明的外來體可以作為疫苗以與本發明的肽相似的方式進行接種。
[0220]複合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預防的受試者的類型匹配。例如，對於日本人而言，HLA-A2,尤其是HLA-A*0201和HLA-A*0206常常可能是合適的。使用在日本人和白種人中高度表達的HLA-A2型對於獲得有效的結果是有利的，而且可以使用HLA-A*0201和HLA-A*0206等亞型。典型地，在臨床上，預先考察需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠合適地選擇對這種抗原具有高水平的結合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的CTL誘導能力的肽。此外，為了獲得顯示高結合親和力和CTL誘導能力的肽，可以在天然存在的MPH0SPH1部分肽的胺基酸序列的基礎上進行I個、2個或幾個胺基酸的取代、缺失或添加。
[0221]當為本發明的外來體使用HLA-A2型HLA抗原時，具有SEQ IDNO: 5, 14，64，73，77，79，97，103和120中的任一胺基酸序列的肽是特別有用的。在某些實施方案中，本發明的外來體是在其表面上呈遞有本發明的肽與HLA-A2抗原的複合物的外來體。此類複合物中包含的HLA-A2抗原的典型例子包括但不限於HLA-A*0201和HLA_A*0206。
[0222]V1.杭原旱遞細朐(APC):
[0223]本發明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發明的肽形成的複合物的分離的APC0所述APC可源自作為治療和/或預防對象的患者，而且可作為疫苗單獨地或與其它藥物(包括本發明的肽、外來體、或CTL)組合來施用。
[0224]APC不限於特定種類的細胞，並且包括樹突細胞(DC)、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知這些細胞可在它們的細胞表面上呈遞蛋白質性質的抗原，以供淋巴細胞識別。由於DC是APC中具有最強CTL誘導活性的代表性APC，DC適合用作本發明的APC。
[0225]例如，可通過自外周血單核細胞誘導DC，然後在體外、離體或在體內用本發明的肽接觸(刺激)它們來獲得APC。當對受試者施用本發明的肽時，在受試者的身體中誘導出呈遞本發明肽的APC。因此，可以通過對受試者使用本發明的肽，然後從受試者收集APC，來獲得本發明的APC。或者，可以通過使從受試者收集的APC與本發明的肽接觸來獲得本發明的APC。
[0226]本發明的APC可以單獨或者與其它藥物，包括本發明的肽、外來體或CTL組合施用給受試者，以在受試者體內誘導針對癌症的免疫應答。例如，離體施用可包括下述步驟:
[0227]a:自第一受試者收集APC ；
[0228]b:使本發明的肽接觸步驟a的APC ；並
[0229]c:對第二受試者步驟b的APC。
[0230]第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。步驟b獲得的APC可以作為疫苗施用來治療和/或預防癌症，癌症的例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0231]本發明還提供製造用於誘導APC的藥物組合物的方法，其中所述方法包括將本發明的肽與藥學可接受的載體混合或配製的步驟。
[0232]依照本發明的一個方面，本發明的APC具有CTL誘導能力。在APC的語境中，短語「具有CTL誘導能力」是指與未和肽接觸的APC相比顯示更高的CTL誘導能力。這樣的具有CTL誘導能力的APC除了用上文描述的方法外，還包括在體外將含有編碼本發明肽的多核苷酸的基因轉移至APC的步驟的方法來製備。所導入的基因可以是DNA或RNA的形式。用於進行導入的方法的例子包括但不具體限於本領域中常規實施的各種方法，諸如可以使用脂質體轉染、電穿孔、或磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Res 1996, 56:5672-7; JImmunol 1998, 161:5607-13 ; J Exp Med 1996，184:465-72;國際公開文本N0.2000-509281的已
【公開日】文翻譯中所述來實施。通過將所述基因轉移入APC，基因在細胞中經歷轉錄、翻譯、等等，然後得到的蛋白質被MHC I類或II類加工，並經由呈遞途徑以呈遞部分肽。
[0233]在一些實施方案中，本發明的APC是在它們的表面上呈遞HLA-A2抗原與本發明的肽的複合物的APC。此類複合物中包含的HLA-A2抗原的典型實例包括但不限於HLA_A*0201和 HLA-A*0206。
[0234]VI1.細朐毒件T細朐(CTL):
[0235]誘導出的針對任何本發明肽的CTL可在體內加強靶向癌細胞的免疫應答，因此可以以與所述肽相似的方式用作疫苗。因此，本發明提供由任何本發明肽特異性誘導或活化的、分離的CTL。
[0236]此類CTL可通過下述步驟來獲得:(I)對受試者施用本發明的肽；(2)在體外用本發明的肽接觸(刺激)源自受試者的APC以及CD8-陽性T細胞或外周血單核白細胞；或(3)在體外使CD8-陽性T細胞或外周血單核白細胞接觸在其表面上呈遞有HLA抗原與所述肽之間形成的複合物的APC或外來體；或⑷導入編碼兩個T細胞受體(TCR)亞單位的一個多核苷酸，或編碼每個TCR亞單位的多個多核苷酸，其中所述TCR能夠結合細胞表面上的HLA-A2抗原與本發明的肽的複合物。要在CTL製備中使用的此類APC或外來體可通過上文記載的方法來製備。(4)的方法的詳情在下文「VII1.T細胞受體(TCR) 」部分中記載。
[0237]本發明的CTL可以從要進行治療和/或預防的患者獲取，而且可以將它們單獨施用，或者與其它包括本發明的肽、APC或外來體的藥物組合施用以產生調節效果。所得到的CTL特異性針對呈遞本發明的肽(例如與用於誘導的肽相同的肽)的靶細胞起作用。靶細胞可以是內源表達MPH0SPH1的細胞，例如癌細胞，或者或被MPH0SPH1基因轉染的細胞；而且因本發明肽的刺激而在細胞表面上呈遞有本發明肽的細胞也可充當活化CTL攻擊的靶標。
[0238]在某些實施方案中，本發明的CTL識別呈遞有HLA-A2抗原與本發明的肽的複合物的細胞。在該CTL的語境中，短語「識別細胞」是指通過其TCR結合細胞表面上HLA-A2抗原與本發明的肽的複合物，並顯示針對該細胞的特異性細胞毒活性。本文中，「特異性細胞毒活性」是指針對呈遞HLA-A2抗原和本發明的肽的複合物的細胞，而不針對其它細胞顯示細胞毒活性。此類複合物中包含的HLA-A2抗原的典型實例包括但不限於HLA-A*0201和HLA-A祁206。
[0239]VII1.T 細朐等體(TCR):
[0240]本發明還提供組合物，其包含編碼兩個TCR亞單位的一個多核苷酸，或編碼每個TCR亞單位的多個多核苷酸，其中所述TCR能夠結合細胞表面上的HLA-A2抗原與本發明的肽的複合物，以及使用該組合物的方法。此類TCR亞基具有形成這樣的TCR的能力，所述TCR賦予T細胞以針對表達MPH0SPH1的腫瘤細胞的特異性。通過使用本領域已知的方法，可鑑定出分別編碼用本發明的肽誘導出的CTL的TCR的α和β鏈的多核苷酸(W02007/032255 及 Morgan et al., J Immunol, 171，3288 (2003))。例如，可優選使用PCR方法。用於分析的PCR引物可以是，例如，作為5』側引物的5』 -R引物(5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3' ) (SEQ ID NO: 127)，以及作為 3』側引物的對TCR α 鏈C區特異的 3-TRa-C 引物(5' -tcagctggaccacagccgcagcgt-3' ) (SEQ ID NO: 128),對TCR β鏈 Cl 區特異的 3-TRb-Cl 引物(5' -tcagaaatcctttctcttgac-3; ) (SEQ IDN0:129)，或對TCR β 鏈 C2 區特異的 3_TRbeta_C2 引物(5' -ctagcctctggaatcctttctctt-3' ) (SEQ IDNO: 130)，但不限於此。衍生的TCR能夠以高親合力結合呈遞有MPH0SPH1肽的靶細胞，並任選地在體內和體外介導針對呈遞本發明的MPH0SPH1肽的靶細胞的高效殺傷。
[0241]可以將編碼兩個TCR亞單位的一個多核苷酸或編碼每個TCR亞單位的多個多核苷酸摻入合適的載體，例如逆轉錄病毒載體中。這些載體是本領域公知的。可以將所述多核苷酸或者包含它們的載體有用地轉入T細胞(例如，⑶8陽性T細胞)，例如來自患者的T細胞中。有利的是，本發明提供一種即配即用型組合物，其容許快速修飾患者自己的T細胞(或其它哺乳動物的T細胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細胞殺傷特性的修飾型T細胞。
[0242]針對本發明的肽的特異性的TCR應該能夠特異性地識別本發明的肽與HLA抗原的複合物，當該TCR呈現在T細胞的表面上時給予T細胞針對呈遞本發明的肽與HLA抗原的複合物的靶細胞的特異性。可以通過任何已知方法來確認所需要的活性，通過導入編碼此類TCR亞單位的多肽而製備的CTL能夠特異性識別此類靶細胞。此類方法的優選例子包括，例如，利用HLA分子和本發明的肽的HLA多聚體染色分析、以及ELISP0T測定。通過實施ELISP0T測定，可以確認通過上述方法製備的CTL能夠特異性TCR識別細胞，且該識別作用所產生的信號能夠在細胞內傳遞。此外，也可以通過已知方法來確認通過上述的方法製備的CTL具有針對靶細胞的特異性細胞毒活性。此類方法的例子包括，例如，使用表達HLA-A2抗原與MPH0SPH1 二者的Cr釋放測定。
[0243]在一個方面，本發明提供通過用編碼兩個TCR亞單位多肽的多核苷酸或者編碼每一個TCR亞單位的多個多核苷酸轉導而製備的CTL，其中所述TCR能夠結合細胞表面上的由具有選自 SEQ ID NO: 5，14，64，73，77，79，97，103和 120胺基酸序列的MPH0SPH1 肽與HLA-A2抗原的複合物。
[0244]經過轉導的CTL在體內能夠歸巢(homing)到癌細胞，並且可以利用公知的體外培養方法擴增(例如 Kawakami et al., J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。可以利用本發明的T細胞來形成免疫原性組合物,所述組合物可以用來在需要治療或保護的患者中治療和/或預防癌症(W02006/031221)。
[0245]IX.藥物糹目合物:
[0246]由於MPH0SPH1表達在癌症(癌症的例子包括但不一定限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤)中與正常組織相比上調，本發明的肽或多核苷酸可用於治療和/或預防癌症。因此，本發明提供配製為用於治療和/或預防癌症的藥物作用劑或組合物，所述作用劑或組合物包括一種或多種本發明的肽或多核苷酸作為活性成分。或者，任何上述的呈遞有本發明肽與HLA抗原的複合物的外來體或APC可以用作藥物作用劑或組合物的活性成分。另外，上述可識別呈遞有本發明的肽和HLA抗原的細胞的CTL也可用作本發明藥物作用劑或藥物組合物的活性成分。
[0247]因此，本發明提供作用劑或組合物，其包含選自下列的至少一種活性成分:
[0248](a) —種或多種本發明的肽；
[0249](b) 一種或多種`處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的多核苷酸；
[0250](c) 一種或多種本發明的APC或外來體；和
[0251](d) —種或多種本發明的CTL。
[0252]本發明的藥物作用劑或組合物還可用作疫苗。在本發明的語境中，短語「疫苗」(也稱作「免疫原性組合物」)指具有在接種入動物後改善、增加和/或誘導抗腫瘤免疫力的功能的組合物。換言之，本發明提供了適用於在受試者中誘導針對癌症的免疫應答的本發明的藥物作用劑或組合物。
[0253]本發明的藥物作用劑或組合物可用於在受試者中治療和/或預防癌症。此類可適用所述藥物作用劑或組合物的受試者的例子包括人，以及其它哺乳動物，包括但不限於小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩，特別是商業上重要的動物或馴養的動物。在一些實施方案中，本發明的藥物作用劑或組合物可以配製為供適用於HLA抗原是HLA-A2的受試者。
[0254]在另一個實施方案中，本發明還提供活性成分在製備配製為用於治療和/或預防癌症或腫瘤，包括其手術後復發，的藥物作用劑或藥物組合物中的用途，所述活性成分選自下組:
[0255](a)本發明的肽；
[0256](b)處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的多核苷酸；
[0257](c)在其表面上呈遞有本發明的肽的APC或外來體；和
[0258](d)本發明的細胞毒性T細胞。[0259]或者，本發明進一步提供用於治療和/或預防癌症或腫瘤的活性成分，所述活性成分選自下組:
[0260](a)本發明的肽；
[0261](b)處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的多核苷酸；
[0262](c)在其表面上呈遞有本發明的肽的APC或外來體；和
[0263](d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0264]或者，本發明進一步提供一種製備用於治療和/或預防癌症或腫瘤的藥物組合物或藥物作用劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配製藥學或生理學上可接受的載體與選自下組的活性成分的步驟:
[0265](a)本發明的肽；
[0266](b)處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的多核苷酸；
[0267](c)在其表面上呈遞有本發明的肽的APC或外來體；和
[0268](d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0269]在另一個實施方案中，本發明還提供一種製備用於治療和/或預防癌症或腫瘤的藥物組合物或藥物作用劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性成分與藥學或生理學可接受的載體的步驟，其中所述活性成分選自下組:
[0270](a)本發明的肽；
[0271](b)處於可表達形式的編`碼如本文中公開的肽的多核苷酸；
[0272](c)在其表面上呈遞本發明的肽的APC或外來體；和
[0273](d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0274]在另一個實施方案中，本發明還提供用於治療和/或預防癌症或腫瘤的方法，其中所述方法包括對受試者施用選自下列的至少一種活性成分的步驟:
[0275](a)本發明的肽；
[0276](b)處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的多核苷酸；
[0277](c)在其表面上呈遞本發明的肽的APC或外來體；和
[0278](d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0279]依照本發明，已經發現包含選自SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120中的胺基酸序列的肽是HLA-A2限制型表位肽，因此是可能誘導受試者中針對表達HLA-A2和MPH0SPH1的癌症的特異性的免疫應答的候選者。這些肽中特別優選的例子是具有SEQ IDNO: 120的胺基酸序列的肽，其已被驗證為具有誘導靶向表達HLA-A2抗原和MPH0SPH1的癌細胞的CTL的能力。相應地，在優選的實施方案中，本發明的藥物作用劑或藥物組合物將包含具有SEQ ID NO: 120的胺基酸序列的肽或其修飾形式，或包含編碼此類肽的多核苷酸。對於包含編碼這些肽中的任一個的多核苷酸(即本發明的多核苷酸)的藥物作用劑或藥物組合物也是如此。
[0280]要用本發明的藥物作用劑或藥物組合物治療的癌症或腫瘤不受限制，包括其中表達(例如過表達)MPH0SPH1的任何癌症，癌症的例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0281]本發明的藥物作用劑或藥物組合物除上述活性成分之外還可含有例如其它具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細胞，等等。此類「其它」具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽包括，但不限於癌症特異性抗原(例如已鑑定的TAA)。
[0282]如果必要，本發明的藥物作用劑或藥物組合物可任選包括其它治療性物質作為額外的活性成分，只要該物質不抑制本發明的活性成分(例如本發明的肽、多核苷酸、外來體、APC、CTL)的抗腫瘤效果。例如，配製劑可包括抗炎物質、鎮痛劑、化療劑、諸如此類。除了藥物自身中的其它治療性物質之外，本發明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學作用劑或組合物順序或同時施用。藥理學作用劑或組合物的量取決於例如所使用的藥理學作用劑或組合物的類型、所治療的疾病、及施用的時序安排和路徑。
[0283]本領域技術人員會認識到，除在本文中具體提及的組分之外，本發明的藥物作用劑或藥物組合物可包括與所討論的配製劑類型相關的本領域常規的其它物質(例如，填充劑、粘合劑、稀釋劑等)。 [0284]在本發明的一個實施方案中，本發明的藥物作用劑或藥物組合物可包裝在制品中，例如作為含有可用於治療要治療的疾病(例如癌症)的病理狀況的材料的試劑盒。製品可包括任何本發明藥物作用劑或藥物組合物的容器及標籤。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。容器可以用多種材料製成，諸如玻璃或塑料。容器上的標籤應指明該劑或組合物用於治療或預防疾病的一種或多種狀況。標籤還可指明關於施用的指導等等。
[0285]除上文描述的容器之外，包括本發明藥物作用劑或藥物組合物的試劑盒還可任選進一步包括第二容器，其中裝有藥學可接受的稀釋劑。它可進一步包括從商業和用戶立場看期望的其它材料，包括其它緩衝液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。
[0286]如果期望的話，藥物作用劑或藥物組合物可包裝在藥包或分配器裝置中，該藥包或分配器裝置可裝有一個或多個含有活性成分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。
[0287](I)含有肽作為活性成分的藥物組合物:
[0288]本發明的肽可以作為藥物作用劑或藥物組合物直接施用，或者如果必要，通過常規配製方法來配製。在後一種情況中，除本發明的肽之外，還可以視情況包括通常用於藥物的載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類載體的例子包括但不限於滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝液、培養液、等等。另外，藥物物質、藥物作用劑或藥物組合物可在必要時含有穩定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發明的藥物作用劑或藥物組合物可用於抗癌目的。
[0289]本發明的肽可製備成組合，其包含兩種或更多種本發明肽，以在體內誘導CTL。肽可以形成雞尾酒，或者可使用標準技術彼此綴合。例如，可以將各個肽化學連接或表達成為單一融合多肽序列，該序列可具有一個或數個胺基酸作為接頭(例如賴氨酸接頭:K.S.Kawamura et al.J.1mmunol.2002, 168:5709-5715)。組合中的各個妝可以是相同的或不同的。通過施用本發明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然後誘導出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的複合物特異性起反應的CTL。或者，可以從受試者分離APC(例如DC)，然後用本發明的肽刺激它們，來獲得在其細胞表面上展示任何所述本發明肽的APC。可以將這些APC重新施用給受試者而在受試者體內誘導出CTL，結果，可提高針對腫瘤相關內皮的攻擊性。
[0290]包括任何本發明的肽作為活性成分的本發明藥物作用劑或藥物組合物還可以包括佐劑，以便有效地建立細胞免疫，或者，本發明藥物作用劑或藥物組合物可以與其它活性成分一起施用，而且它們可以通過配製成顆粒來施用。佐劑是指在與具有免疫學活性的蛋白質一起(或順序)施用時增強針對該蛋白質的免疫應答的任何化合物、物質或組合物。可以應用的佐劑包括文獻中記載的那些(Clin Microbiol Rev 1994，7:277-89)。示例性的佐劑包括但不限於磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、不完全弗氏佐劑(IFA)、完全弗氏佐劑(CFA)、ISCOMatrix、GM-CSF，CpG, Ο/ff乳液等等，但不限於此。
[0291]另外，可方便地使用脂質體配製劑、其中肽結合至幾微米直徑的珠子的顆粒配製劑、和其中脂質結合至肽的配製劑。
[0292]在本發明的另一個實施方案中，本發明的肽還可以作為可藥用鹽的形式施用。所述鹽的優選實例包括與鹼金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機鹼的鹽、與胺的鹽，與有機酸(乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等等)的鹽、和與無機酸(鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸等)的鹽。如本文中使用的，短語「可藥用鹽」指這樣的鹽，它們保留化合物的生物學有效性和性質，並且是通過與無機或有機酸或鹼反應而獲得的。
[0293]在一些實施方案中，本發明的藥物作用劑或藥物組合物包括引發(prime)CTL的成分。已經確認脂質是能夠在體內引發針對病毒抗原的CTL的物質。例如，可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，然後連接至本發明的肽。然後該脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質體，或在佐劑中乳化。作為脂質引發CTL應答的另一個例子，大腸桿菌(E.coli)脂蛋白，諸如三棕櫚醯基-S-甘油基半胱氨醯絲氨醯-絲氨酸(P3CSS),當與適宜的肽共價連接時,可用來引發CTL(參見例如Deres et al., Nature1989，342:561-4)。
[0294]合適的施用方法的例子包括，但不一定限於，口服、皮內、皮下、肌肉內、骨內、腹膜、和靜脈內注射等等，及系統施用或局部施用至靶位點附近(即直接注射)。施用可以通過單次施用來實施，或者通`過多次施用來強化。本發明肽的劑量可以依據要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當加以調整，通常是0.0Olmg至1，OOOmg,例如0.01mg至IOOmg,例如0.1mg至IOmg,而且可以每少數天施用一次至每少數月施用一次。本領域技術人員容易地選擇合適和最優的劑量。
[0295](2)含有多核苷酸作為活性成分的藥物組合物:
[0296]本發明的藥物作用劑或藥物組合物也可含有處於可表達形式的編碼本文中公開的肽的多核苷酸。在本文中，短語「處於可表達形式的」意味著多核苷酸在導入細胞時會在體內表達成誘導抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達所必需的調節元件。多核苷酸可具有為實現穩定插入靶細胞的基因組所需的配置(關於同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR&Capecchi MR, Cell1987，51:503-12)。還參見例如 Wolff et al., Science 1990，247:1465-8;美國專利 N0.5，580，859; 5，589，466; 5，804，566; 5，739，118; 5，736，524; 5，679，647;及 W098/04720)。基於DNA的投遞技術的例子包括「裸DNA」、易化(布比卡因、聚合物、肽介導的)投遞、陽離子脂質複合物、和顆粒介導的(「基因槍」)或壓力介導的投遞(參見例如美國專利N0.5，922，687)。
[0297]本發明的肽還可用病毒或細菌載體來表達。表達載體的例子包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如牛痘病毒作為載體來表達編碼肽的核苷酸序列。在導入宿主後，重組牛痘病毒表達表達免疫原性肽，並由此引發免疫應答。可用於免疫接種方案的牛痘載體和方法記載於例如美國專利N0.4，722，848。另一種載體是卡介苗(BCG, Bacille Calmette Guerin)。BCG 載體記載於 Stover et al., Nature1991,351:456-60。有很多種可用於治療性施用或免疫接種的其它載體是容易想到的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如 Shata et al., Mol Med Today 2000，6:66-71; Shedlocket al.，J Leukoc Biol 2000，68:793-806;Hipp et al.，In Vivo 2000，14:571-85。
[0298]將多核苷酸投遞入患者可以是直接的，其中使受試者直接暴露於攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉化細胞，然後將細胞移植入患者。這兩種辦法分別稱作體內和離體基因療法。
[0299]關於基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al., Clinical Pharmacy1993,12:488-505;Wu and ffu,Biotherapyl991, 3:87-95;Tolstoshev, Ann Rev PharmacolToxicol 1993, 33:573-96;Mulligan,Science 1993, 260:926-32;Morgan&Anderson,AnnRev Biochem 1993, 62:191-217;Trends in Biotechnology 1993，11(5):155-215。在 eds.Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, NY, 1993;及 Krieger,於 Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual, StocktonPress, NY, 1990中描述的重組DNA【技術領域】的公知方法可應用於本發明。
[0300]和施用肽一樣，多核苷酸的施用可以通過口服、皮內、皮下、靜脈內、肌肉內、骨內、和/或腹膜注射等等來進行，以及通過系統施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。合適的載體或經編碼本發明肽的多核苷酸轉化的細胞中的多核苷酸的劑量可以依據要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當加以調整，通常是0.0Olmg至1000mg,例如0.01mg至IOOmg,例如0.1mg至IOmg,而且可以每數天施用一次至每數月施用一次。本領域技術人員能恰當選擇合適的劑量。
[0301]X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法:
[0302]本發明的肽和多核苷酸可用於製備或誘導APC和CTL。本發明的外來體和APC也可用於誘導CTL。以及用於誘導`針對癌症或腫瘤的免疫應答。所述肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該其它的化合物不抑制它們的CTL誘導能力。因此，任何前文所述的本發明的藥物作用劑或藥物組合物均可用於誘導CTL。除它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用於誘導APC，如下文解釋的。
[0303](I)誘導抗原呈遞細胞(APC)的方法:
[0304]本發明提供了使用本發明的肽或多核苷酸來誘導具有CTL誘導能力的APC的方法。
[0305]本發明的方法包括在體外、離體或體內使APC與本發明的肽接觸的步驟。例如，包括離體將APC與肽接觸的步驟的方法可包括下述步驟:
[0306]a:從受試者收集APC ;和
[0307]b:使步驟a的APC與本發明的肽接觸。
[0308]APC不限於特定種類的細胞，且包括DC、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知它們在它們的細胞表面上呈遞蛋白質性質的抗原，從而被淋巴細胞識別。優選地，可使用DC，因為DC是APC中具有最強CTL誘導能力的。任何一種本發明肽都可以單獨使用或與其它本發明的肽或衍生自MPH0SPH1之外的TAA的CTL可誘導肽組合使用。
[0309]另一方面，當將本發明的肽施用給受試者時，APC在體內接觸到所述肽，其結果，在受試者的身體中誘導出具有CTL誘導能力的APC。因此，本發明的方法包括將本發明的肽施用於受試者以在該受試者體內誘導出具有CTL誘導能力的APC。類似地，當將處於可表達形式的本發明的多核苷酸施用於受試者時，本發明的肽在體內表達並與APC接觸，結果，在受試者的身體中誘導出具有CTL誘導能力的APC。因此，本發明的方法也可包括將本發明的多核苷酸施用於受試者以在該受試者體內誘導出具有CTL誘導能力的APC。術語「可表達的形式」描述於上文「IX.藥物組合物，(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥物組合物」部分。
[0310]此外，本發明的方法可包括將本發明的多核苷酸導入APC以誘導具有CTL誘導能力的APC。例如，該方法可包括下述步驟:
[0311]a:自受試者收集APC ;並
[0312]b:導入編碼本發明肽的多核苷酸導入APC。
[0313]步驟b可如上文「V1.抗原呈遞細胞」部分中所述來實施。
[0314]或者，本發明提供了一種用於製備特異性誘導針對MPH0SPH1的CTL活性的抗原呈遞細胞(APC)的方法，其中所述方法可包括下述步驟之一:
[0315](a)在體外、離體或體內使APC與本發明的肽接觸；和
[0316](b)將編碼本發明的肽的多核苷酸導入APC中。
[0317]或者，本發明提供用於誘導具有CTL誘導能力的APC的方法，其中所述方法包括選自下列的步驟:
[0318](a)使APC與本發明的肽接觸；
[0319](b)將編碼本發明的肽的多核苷酸導入APC。
[0320]本發明的方法可以在體外、離體在體內實施。優選地，本發明的方法可以在體外或離體實施。用於誘導具有CTL誘導能力的APC的APC可以優選地為表達HLA-A2抗原的APC0這樣的APC可以通過從HLA抗原為HLA-A2的受試者獲得的外周血單核細胞(PBMC)用本領域公知的方法製備。用本發明的方法誘導出的APC可以是在其表面中呈遞本發明的肽與HLA抗原(HLA-A2抗原)的複合物的APC。當將通過本發明的方法誘導出的APC施用給受試者以在該受試者中誘導針對癌症的免疫應答時，該受試者優選是APC所來源的同一受試者。然而，受試者可以不同於APC供體，只要受試者與APC供體的HLA型相同。
[0321]在另一實施方案中，本發明提供用於在誘導具有CTL誘導能力的APC中使用的作用劑或組合物，且此類作用劑或組合物包括一種或多種本發明的肽或多核苷酸。
[0322]在另一實施方案中，本發明提供本發明的肽或編碼所述肽的多核苷酸在製備配製為用於誘導APC的組合物中的用途。
[0323]或者，本發明還提供本發明的肽或編碼所述肽的多核苷酸，其用於在誘導具有CTL誘導能力的APC中使用。
[0324](2)誘導CTL的方法:
[0325]本發明還提供了使用本發明的肽、多核苷酸、或外來體或APC來誘導CTL的方法。
[0326]本發明還提供了使用編碼兩個TCR亞單位的一個多核苷酸或編碼每個TCR亞單位的多個多核苷酸來誘導CTL的方法，其中所述TCR能夠識別(結合)呈遞在細胞表面上的本發明的肽與HLA抗原的複合物。優選地，所述誘導CTL的方法可包括選自下組的至少一個步驟:
[0327]a)使CD8陽性T細胞與抗原呈遞細胞和/或外來體接觸，所述抗原呈遞細胞和外來體在其表面上呈遞有HLA抗原與本發明的肽之間形成的複合物；和
[0328]b)向⑶8陽性T細胞中導入編碼兩個TCR亞單位的一個多核苷酸或編碼每個TCR亞單位的多個多核苷酸，其中所述TCR能夠識別(結合)呈遞在細胞表面上的本發明的肽與HLA抗原的複合物。
[0329]當本發明的肽、多核苷酸、APC或外來體被施用給受試者後，受試者的身體中誘導出CTL，而且靶向編碼MPH0SPH1的癌細胞的免疫應答增強。因此，本發明的方法可包括將本發明的肽、多核苷酸、APC或外來體施用於受試者的步驟。
[0330]或者，也可通過離體或體外使用它們來誘導CTL，並且在誘導CTL後，可以將活化的CTL返還受試者。例如，該方法可包括下述步驟:
[0331]a:自受試者收集APC;
[0332]b:用肽接觸步驟a的APC ;並
[0333]c:將步驟b的APC與⑶8陽性細胞共培養。
[0334]上文步驟c中要與⑶8陽性細胞共培養的APC也可通過將包含本發明的多核苷酸的基因轉移入如上文「V1.抗原呈遞細胞」部分所述的APC來製備，但是本發明不限於此，而且因此涵蓋任何在表面上有效呈遞HLA抗原和本發明肽形成的複合物的APC。
[0335]任選地可使用在其表面上呈遞HLA抗原和本發明肽形成的複合物的外來體來替代上述的APC。即，本發明可包括將在其表面上呈遞HLA抗原和本發明肽形成的複合物的外來體共培養的步驟。此類外來體可通過上文「V.外來體」部分中描述的方法來製備。
[0336]用於誘導CTL的APC或外來體優選地可以是在其表面上呈遞本發明的肽與HLA-A2抗原的複合物的APC或外來體。
[0337]另外，可通過向⑶8陽性T細胞中導入編碼兩個TCR亞單位的一個多核苷酸或編碼每個TCR亞單位的多個多核苷酸來誘導CTL，其中所述TCR能夠識別(結合)呈遞在細胞表面上的本發明的肽與HLA抗原的複合物。此類轉導可如上文「VII1.T細胞受體(TCR) 」部分中所述來實施。
[0338]本發明的方法可以在體外、離體在體內實施。優選地，本發明的方法可以在體外或離體實施。用於誘導CTL的CD8-陽性T細胞可以通過從受試者獲得PBMC用本領域公知的方法製備。在優選的實施方案中，CD8-陽性T細胞的供體可以是HLA抗原為HLA-A2的受試者。用本發明的方法誘導出的CTL可以是在其表面上呈遞有本發明的肽與HLA抗原的複合物的CTL。當將通過本發明的方法誘導出的CTL施用給受試者以在該受試者中誘導針對癌症的免疫應答時，該受試者優選是CD8-陽性T細胞所來源的同一受試者。然而，受試者可以不同於CD8-陽性T細胞供體，只要受試者與CD8-陽性T細胞供體的HLA型相同。
[0339]另外，本發明提供了一種製造用於誘導CTL的藥物作用劑或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合或配製本發明的肽與藥學可接受的載體的步驟。
[0340]在另一實施方 案中，本發明提供用於誘導CTL的作用劑或組合物，其中所述作用劑或組合物包含一種或多種本發明的肽、一種或多種本發明的多核苷酸、或一種或多種本發明的APC或外來體。
[0341 ] 在另一實施方案中，本發明提供本發明的肽、多核苷酸或APC或外來體用於製備配製為用於誘導CTL的作用劑或組合物中的用途。
[0342]或者，本發明提供本發明的肽、多核苷酸、或APC或外來體用於誘導CTL。
[0343](3)誘導免疫應答的方法:
[0344]此外，本發明提供了誘導針對涉及MPH0SPH1的疾病的免疫應答的方法。考慮的疾病包括癌症，其例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0345]本發明的方法可包括對受試者施用含有任何本發明肽或編碼它們的多核苷酸的作用劑或組合物的步驟。本發明的方法也可涵蓋施用呈遞有任何本發明的肽的外來體或APC0關於詳情參見「IX.藥物組合物」項，特別是描述本發明的藥物作用劑或藥物組合物作為疫苗的用途的部分。另外，用於本發明誘導免疫應答的方法的外來體和APC詳細描述於上文「V.外來體」、「V1.抗原呈遞細胞(APC) 」、和「X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法」的⑴和⑵部分。
[0346]在優選的實施方案中，用本發明的方法治療的受試者可以是HLA抗原為HLA-A2的
受試者。
[0347]本發明還提供了製造用於誘導免疫應答的藥物作用劑或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法可包括混合或配製本發明的肽或多核苷酸與藥學上可接受的載體的步驟。
[0348]或者，本發明的 方法可包括施用本發明的疫苗或藥物組合物的步驟，所述疫苗或藥物組合物包含:
[0349](a)本發明的肽；
[0350](b)處於可表達的形式的編碼如本文公開的此類肽的核酸(多核苷酸)；
[0351](C)在其表面上呈遞有本發明的肽的APC或外來體；或
[0352](d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0353]在本發明的語境中，表達MPH0SPH1的癌症可用這些活性成分來治療。所述癌症的例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。因而，在施用包括所述活性組分的疫苗或藥物組合物之前，優選確認要治療的細胞或組織中的MPH0SPH1表達水平與同一器官的正常細胞相比是否增強了。因此，在一個實施方案中，本發明提供了用於治療表達MPH0SPH1的癌症的方法，該方法可包括下述步驟:
[0354]i)測定自具有要治療的癌症的受試者獲得的細胞或組織中的MPH0SPH1表達水平；
[0355]ii)將該MPH0SPH1表達水平與正常對照比較；並
[0356]iii)對具有與正常對照相比過表達MPH0SPH1的癌症的受試者施用至少一種選自上文所述步驟(a)至(d)的成分。
[0357]或者，本發明還提供包括至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或藥物組合物，其用於對具有過表達MPH0SPH1的癌症的受試者施用。換言之，本發明進一步提供了用於鑑定要用本發明MPH0SPH1多肽來治療的受試者的方法，所述方法包括測定源自受試者的癌細胞或組織中的MPH0SPH1表達水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示該受試者可能具有可用本發明MPH0SPH1多肽來治療的癌症。本發明的鑑定要治療癌症的受試者的方法在下面更加詳細的加以敘述。[0358]任何源自受試者的細胞或組織均可用於測定MPH0SPH1表達水平，只要其包括目標的MPH0SPH1轉錄或翻譯產物。合適樣品的例子包括但不僅限於身體組織與體液，例如血液、痰與尿液。優選地，源自受試者的細胞或組織樣品含有這樣的細胞群體，該群體包括上皮細胞，更優選癌性上皮細胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細胞。進一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細胞，然後將其用作源自受試者的樣品。
[0359]需用本方法治療的受試者優選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限於例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。
[0360]根據本發明，可以測定在自受試者獲得的細胞或組織中MPH0SPH1的表達水平。表達水平可在轉錄(核酸)產物水平確定，使用本領域已知方法。舉例而言，MPH0SPH1的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量。檢測可在晶片、陣列等等上實施。對檢測MPH0SPH1的表達水平而言，使用陣列可能是優選的。本領域技術人員可利用MPH0SPH1的序列信息製備上述探針。舉例而言，MPH0SPH1的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物來標記，例如染料、螢光物質和同位素，且所述基因的表達水平可以作為所雜交的標記物的強度檢測。
[0361]此外，MPH0SPH1的轉錄產物(例如，SEQ ID NO: 125)還可通過基於擴增的檢測方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。此類引物可基於所述基因的可得序列信息製備。
[0362]具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件或低嚴格條件下與MPH0SPH1的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語「嚴格(雜交)條件」是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴於序列的，而且在不同的環境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。一般地，嚴格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5攝氏度。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態下有50%的與其靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm，平衡時50%的探針被佔據。典型地，嚴格條件會是這樣的:其中鹽濃度小於大約1.0M鈉離子，典型地大約0.01-1.0M鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7.0-8.3，溫度對於較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30攝氏度， 用於較長的探針或引物是至少大約60攝氏度。嚴格條件也可以通過添加去穩定物質，例如甲醯胺，來實現。
[0363]本發明的探針或引物典型地是基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸典型地包括這樣的核苷酸序列區域，其在嚴格條件下與包括MPH0SPH1序列的核酸的至少大約2000，1000，500，400，350，300，250，200，150，100，50，或25個連續有義鏈核苷酸序列，或者包括MPH0SPH1序列的核酸的反義鏈核苷酸序列，或者這些序列的天然存在的突變體雜交。尤其是，例如，在優選的實施方案中，可以使用長度為5-50的寡核苷酸作為引物來擴增要檢測的基因。更優選地，可以用特定大小，一般是長度15_30b的寡核苷酸探針或引物來檢測MPH0SPH1基因的mRNA或cDNA。大小可以在至少10個核苷酸，至少12個核苷酸，至少15個核苷酸，至少20個核苷酸，至少25個核苷酸，至少30個核苷酸的範圍，且探針和引物的大小可以為5-10個核苷酸，10-15個核苷酸，15-20個核苷酸，20-25個核苷酸和25-30個核苷酸。在優選的實施方案中，寡核苷酸探針或引物的長度可以從15-25中選擇。使用此類寡核苷酸探針或引物檢測基因的測定程序、裝置或試劑是公知的(例如寡核苷酸微陣列或PCR)。在這些測定中，探針或引物也可以包括標籤或接頭序列。此外，可以使用可檢測的標記物或待捕捉的親和配體來修飾探針或引物。或者，在基於雜交的檢測程序中，也可以使用長度為數百個(例如約100-200個)鹼基至數千個(例如約1000-2000個)鹼基的多核苷酸用於探針(例如Northern印跡測定或cDNA微陣列分析)。
[0364]或者，可以檢測翻譯產物以進行本發明的診斷。例如，可以確定MPH0SPH1蛋白(SEQ ID NO: 126)或其免疫學活性片段的量。測定作為翻譯產物的蛋白量的方法包括免疫測定方法，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab』)2、Fv等)均可用於檢測,只要該片段或經修飾抗體保留對MPH0SPH1蛋白的結合能力即可。本發明也提供這樣的針對本發明的肽及的抗體及其片段。製備這些類型的用於檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的，並且在本發明中可以使用任何方法製備這些抗體和它們的等價物。
[0365]作為另一種基於MPH0SPH1的翻譯產物檢測MPH0SPH1基因的表達水平的方法，可利用針對MPH0SPH1蛋白的抗體通過免疫組織化學分析測量其染色的強度。意即，在這種測量中，強染色表明所述蛋白質存在/水平增加，且同時表明MPH0SPH1基因的高表達水平。
[0366]對於癌細胞中的靶基因(例如MPH0SPH1基因)，如果其較之靶基因的對照水平(例如正常細胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過1.1倍，超過1.5倍，超過2.0倍，超過5.0倍，超過10倍或者更多，則可以認為其在癌細胞中的表達水平增加了。
[0367]對照水平可以與癌細胞同時確定，使用先前從疾病狀態(患癌或未患癌)已知的受試者(一名或多名)收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌症的器官的非癌性區獲得的正常細胞可用作正常對照。或者，對照水平可以藉助統計方法，根據通過分析先前測定的來自疾病狀態已知的受試者的樣品的MPH0SPH1基因表達水平獲得的結果加以確定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達模式資料庫。而且，根據本發明的一個方面，可以將生物樣品中MPH0SPH1基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優選地使用從來自與源自受試者的樣品的組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優選地，使用具有已知的疾病狀態的群體中MPH0SPH1基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已`知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的範圍可以用作標準值。
[0368]在本發明的語境中，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作「正常對照水平」。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則會稱作「癌性對照水平」。樣品表達水平與對照水平間的差異可以相對已知表達水平不會隨著細胞的癌或非癌狀態改變的對照核酸(例如管家基因)的表達水平加以標準化。示例的對照基因包括，但不僅限於，肌動蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。
[0369]當MPH0SPH1基因的表達水平相比正常表達水平有所提高，或與癌性對照水平相似/等同，則受試者可診斷為具有要治療的癌症。
[0370]本發明還提供了一種(i)診斷受試者是否疑似具有要治療的癌症，和/或(ii)選擇受試者進行癌症治療的方法，該方法可包括下述步驟:
[0371]a)測定MPH0SPH1在自懷疑具有要治療的癌症的受試者獲得的癌細胞或組織中的表達水平；
[0372]b)將MPH0SPH1的表達水平與正常對照水平比較；[0373]c)若MPH0SPH1的表達水平與正常對照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治療的癌症；並
[0374]d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌症的話，選擇受試者進行癌症治療。
[0375]或者，此類方法可包括下述步驟:
[0376]a)測定在自懷疑具有要治療的癌症的受試者獲得的細胞或組織中MPH0SPH1的表達水平；
[0377]b)將MPH0SPH1的表達水平與癌性對照水平比較；
[0378]c) Smphosphi的表達水平與癌性對照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要治療的癌症；並
[0379]d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌症的話，選擇受試者進行癌症治療。
[0380]本發明還提供了用於診斷或確定患有或疑似患有、或有風險發生能用本發明的MPH0SPH1多肽來治療的癌症的受試者的診斷試劑盒，其亦可用於評價和/或監測癌症免疫療法的功效或適用性。優選地，所述癌症包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。更特別地，所述試劑盒優選可包含至少一種在源自受試者的細胞中檢測MPH0SPH1基因表達的試劑，所述試劑選自下組:
[0381 ] (a)用於檢測MPH0SPH1基因的mRNA的試劑；
`[0382](b)用於檢測MPH0SPH1蛋白或其免疫學活性片段的試劑；和
[0383](c)用於檢測MPH0SPH1蛋白的生物學活性的試劑。
[0384]適於檢測MPH0SPH1基因mRNA的試劑可包括特異性結合或識別MPH0SPH1 mRNA的核酸，諸如具有與MPH0SPH1 mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對MPH0SPH1 mRNA特異性的引物與探針。這類寡核苷酸可基於本領域眾所周知的方法製備。如果需要，用於檢測MPH0SPH1 mRNA的試劑可固定化在固體基質上。另外，在所述試劑盒中可包括多於一種檢測MPH0SPH1 mRNA的試劑。
[0385]另一方面，適於檢測MPH0SPH1蛋白或其免疫學活性片段的試劑可包括針對MPH0SPH1蛋白或其免疫學活性片段的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab』)2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要所述片段或經修飾抗體保留與MPH0SPH1蛋白或其免疫學活性片段的結合能力。為檢測蛋白製備此類抗體的方法在本領域是眾所周知的，且可在本發明中使用任何方法製備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產生信號的分子通過直接連接或間接標記技術進行標記。標記物與標記抗體以及檢測抗體與其靶的結合的方法在本領域是眾所周知的，且本發明可使用任何標記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多於一種用於檢測MPH0SPH1蛋白的試劑。
[0386]所述試劑盒可包含多於一種前述的試劑。所述試劑盒還可包含用於結合針對MPH0SPH1基因的探針或者針對MPH0SPH1肽的抗體的固體基質和試劑、用於培養細胞的培養基和容器、陽性和陰性對照試劑、和用於檢測針對MPH0SPH1肽的抗體的第二抗體。舉例而言，從沒有癌症或患有癌症的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發明的試劑盒可進一步包括其它從商業或用戶角度而言期望的材料，包括緩衝液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和帶有使用說明書(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)的裝箱單。這些試劑之類的可標上標籤包含在容器中。合適的容器可包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可用多種材料製造，例如玻璃或塑料。
[0387]在本發明的一個實施方案中，當所述試劑是針對MPH0SPH1 mRNA的探針時，所述試劑可固定化於固體基質例如多孔條上，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量或檢測區域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位置。或者，對照位置可位於與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較大而在後面的位置上量較小。在加入測試樣品之後，顯示可檢測信號位置的數目提供了在樣品中存在的MPH0SPH1 mRNA量的定量指徵。所述檢測位置可設置成具有任何合適可檢測的形狀，通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。 [0388]本發明所述試劑盒可進一步包括陽性對照樣品或MPH0SPH1標準樣品。本發明的所述陽性對照樣品可通過收集MPH0SPH1陽性樣品，隨後測定其MPH0SPH1水平來製備。此外，可將純化的MPH0SPH1蛋白或多核苷酸添加到不表達MPH0SPH1的細胞中以形成所述陽性樣品或MPH0SPH1標準樣品。在本發明的語境中，純化的MPH0SPH1可以是重組蛋白。例如，陽性對照樣品的MPH0SPH1水平大於截留值。
[0389]在一個實施方案中，本發明進一步提供了一種診斷試劑盒，其包括被本發明抗體特異性識別的蛋白或其部分蛋白或其免疫原性片段。
[0390]本發明的蛋白質的部分肽的例子包括由本發明蛋白的胺基酸序列中的至少8個、優選15個、更優選20個連續胺基酸構成的多肽。癌症可通過使用本發明的蛋白或肽(多肽)檢測樣品(例如血液、組織)中的抗體來診斷。上文描述了用於製備本發明的肽或蛋白質的方法。
[0391]本發明的用於診斷癌症的方法可通過如上所述測定抗MPH0SPH1抗體量和相應對照樣品中的量之間的差異來進行。若受試者的細胞或組織含有針對該基因的表達產物(MPH0SPH1)的抗體並且測得的抗MPH0SPH1抗體的量大於截留值(與正常對照中的水平相t匕)的話，則該受試者懷疑患有癌症。
[0392]在另一個實施方案中，本發明的診斷試劑盒可包括本發明的肽及與它結合的HLA分子。使用抗原性肽和HLA分子檢測抗原特異性CTL的合適方法早已確立(例如AltmanJD et al.，Science.1996，274(5284):94-6)。因此，本發明肽和HLA分子形成的複合物可用於檢測方法來檢測腫瘤抗原特異性CTL，由此能夠較早檢測癌症的復發和/或轉移。進一步，它可用於選擇適用包含本發明肽作為活性組分的藥物的受試者或評估該藥物的治療效果O
[0393]特別地，依照已知方法(參見例如AltmanJD et al.，Science.1996，274(5284):94-6)，可製備放射性標記的HLA分子和本發明肽的寡聚物複合物，諸如四聚體。可例如通過使用該複合物來對源自懷疑患有癌症的受試者的外周血淋巴細胞中的抗原-肽特異性CTL定量來進行診斷。
[0394]本發明進一步提供了使用如本文所述的肽表位來評估受試者的免疫學應答的方法或診斷試劑。在本發明的一個實施方案中，可使用本文所述的HLA-A2限制肽作為試劑來評估或預測受試者的免疫應答。要評估的免疫應答是通過在體外或在體內使免疫原接觸免疫活性細胞來誘導的。在一些實施方案中，任何可導致識別和結合肽表位的抗原特異性CTL的生成的物質或組合物均可用作所述試劑。肽試劑無需用作所述免疫原。用於此類分析的測定系統包括相對較新的技術發展，諸如四聚體、胞內淋巴因子染色和幹擾素釋放測定法、或ELISPOT測定法。在優選的實施方案中，用於評估免疫應答的免疫活性細胞可以選自外周血、外周血淋巴細胞(PBL)、和外周血單個核細胞(PBMC)。用於收集或分離此類免疫活性細胞的方法是本領域公知的。在替代的優選實施方案中，要與肽試劑接觸的免疫活性細胞包括抗原呈遞細胞，例如樹突細胞。
[0395]例如，本發明的肽可用於四聚體染色測定法，評估外周血單個核細胞在暴露於腫瘤細胞抗原或免疫原後抗原特異性CTL的存在。HLA四聚體複合物可用於直接顯現抗原特異性CTL(參見例如 Ogg et al., Science 279:2103-2106，1998;和Altman et al, Science174:94-96, 1996)和測定抗原特異性CTL群體在外周血單個核細胞樣品中的頻率。使用本發明肽的四聚體試劑可如下所述來生成。
[0396]使與HLA分子結合的肽在相應HLA重鏈和β 2_微球蛋白存在下重摺疊以生成三分子複合物。在該複合物中，重鏈的羧基末端在先前工程化到蛋白質中的位點處被生物素化。然後，將鏈親和素添加至複合物以形成由三分子複合物和鏈親和素組成的四聚體。藉助螢光標記的鏈親和素，可利用該四聚體對抗原特異性細胞染色。然後可例如通過流式細胞術鑑定細胞。此類分析可用於診斷或預後目的。通過該規程鑑定的細胞也可用於治療目的。
[0397]本發明還提供了包括本發明肽的用於免疫回憶應答的試劑(參見例如 Bertoni et al,J.Clin.1nvest.100:503-513,1997 和 Penna et al.,J Exp.Med.174:1565-1570, 1991)。例如，使用特定肽對獲得自具有要治療的癌症的個體的患者PBMC樣品分析抗原特異性CTL的存在。含有單個核細胞的血液樣品可如下評估:培養PBMC，並用本發明的肽刺激該細胞。適宜培養時段後，可對擴增的細胞群體進行分析，例如分析CTL活性。
[0398]肽還可作為試劑用於評估疫苗的功效。可使用例如上文所述方法來分析自疫苗接種免疫原的患者獲得的PBMC。測定患者的HLA型，並選擇識別該患者中存在的等位基因特異性分子的肽表位試劑進行分析。疫苗的免疫原性可通過PBMC樣品中表位特異性CTL的存在來指示。本發明的肽還可用於製備抗體，使用本領域公知技術(參見例如CURRENT PROTO⑶LS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY;和 Antibodies A LaboratoryManual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),其可作為試劑用於診斷、檢測或監測癌症。此類抗體可包括識別HLA分子背景中的肽的抗體，即結合肽-MHC複合物的抗體。
[0399]本發明的肽和組合物還具有多種其它應用，本文中描述了其中一些。例如，本發明提供了一種用於診斷或檢測以MPH0SPH1免疫原性多肽的量為特徵的病症的方法。這些方法涉及測定MPH0SPH1HLA結合肽、或MPH0SPH1肽與I類HLA分子形成的複合物在生物學樣品中的表達。肽或肽和I類HLA分子形成的複合物的表達可通過用針對肽或複合物的結合配偶測定來測定或檢測。在一個優選的實施方案中，針對肽或複合物的結合配偶可以是識別和特異性結合該肽的抗體。MPH0SPH1在生物學樣品諸如腫瘤活檢中的表達也可使用MPH0SPH1引物通過標準PCR擴增方案來測試。本文中呈現了腫瘤表達的一個例子，而且用於MPH0SPH1擴增的例示性條件和引物的進一步公開內容可見於W02003/27322，本文通過援引併入其內容。
[0400]優選地，診斷方法涉及使自受試者分離的生物學樣品接觸對MPH0SPH1肽特異性的作用劑以檢測MPH0SPH1肽在該生物學樣品中的存在。如本文中使用的，「接觸」意味著在適宜條件(例如濃度、溫度、時間、離子強度)下放置生物學樣品使其足夠接近所述作用劑，以容許作用劑和生物學樣品中存在的MPH0SPH1肽之間的特異性相互作用。一般地，作用劑接觸生物學樣品的條件是本領域普通技術人員知道的可促進生物學樣品中分子與其關聯物(例如蛋白質與其受體關聯物、抗體與其蛋白質抗原關聯物、核酸與其互補序列關聯物)之間的特異性相互作用的條件。用於促進分子與其關聯物之間的特異性相互作用的最優條件記載於授權給Low等人的美國專利N0.5，108, 921,本文通過援引併入其內容。
[0401]本發明的診斷方法可以在體內和/或在體外實施。因而，生物學樣品在本發明中可位於體內或體外。例如，生物學樣品可以是體內組織，而且可使用對MPH0SPH1免疫原性多肽特異性的作用劑來檢測此類分子在組織中的存在。或者，可在體外收集或分離生物學樣品(例如血液樣品、腫瘤活檢、組織提取物)。在一個特別優選的實施方案中，生物學樣品可以是含有細胞的樣品，更優選自要診斷或治療的受試者收集的含有腫瘤細胞的樣品。
[0402]或者，診斷可使用容許通過對螢光素標記的HLA多聚體複合物染色而直接定量抗原特異性T細胞的方法來進行(例如Altman, J.D.et al.，1996，Science274:94; Altman, J.D.et al., 1993，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:10330)。還提供了對胞內淋巴因子的染色和幹擾素-Y釋放測定法或ELISPOT測定法。多聚體染色、胞內淋巴因子染色和ELISPOT測定法都表現出比更常規的測定法靈敏至少10倍(Mural1-Krishna，K.etal., 1998, Immunity 8:177; Lalvani, A.et al., 1997, J.Exp.Med.186:859; Dunbar, P.R.etal.，1998，Curr.Biol.8:413)。也可使用五聚體(例如 US2004-209295A)、Dextramers (例如 W002/072631)、和 Streptamers (例如 Nature medicine 6.631-637 (2002))。
[0403] 相應地，在一些實施方案中，本發明提供一種用於診斷或評價被施用了至少一種本發明的MPH0SPH1肽的受試者的免疫應答的方法，所述方法包括下述步驟:
[0404](a)在適合於誘導對免疫原特異性的CTL的條件下使免疫原與具免疫活性細胞接觸；
[0405](b)檢測或測定步驟(a)中誘導的CTL的誘導水平；和
[0406](c)將所述受試者的免疫應答與所述CTL誘導水平相關聯。
[0407]在本發明的語境中，免疫原優選包括下述中至少一種:(a)選自SEQ IDNO: 5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的MPH0SPH1肽，和(b)具有所述胺基酸序列，其中該胺基酸已經過I個、2個或更多個胺基酸取代而修飾的肽。同時，適合誘導免疫原特異性CTL的條件是本領域公知的。例如，可以在體外在免疫原存在下培養具免疫活性細胞來誘導免疫原特異性CTL。為了誘導免疫原特異性CTL，可以將任何刺激因子添加至細胞培養物。例如，IL-2是用於CTL誘導的優選的刺激因子。
[0408]在一些實施方案中，對要用肽癌症療法治療的受試者的免疫應答的監測或評價步驟可以在治療之前、之中和/或之後進行。一般而言，在癌症治療規程中，反覆地對要治療的受試者施用免疫原性肽。例如，可以每周施用免疫原性肽3-10周。相應地，可以在整個癌症治療程序中評價或監測受試者的免疫應答。或者，評價或監測免疫應答的步驟可以在治療程序完成時進行。 [0409]根據本發明，免疫原特異性CTL的誘導相對於對照增強，表明要評價或診斷的受試者對已施用的免疫原免疫應答。用於評價免疫應答的合適的對照可包括，例如，免疫活性細胞未與肽接觸時的CTL誘導水平，或者與具有MPH0SPH1肽之外的胺基酸序列(例如隨機胺基酸序列)的對照肽接觸時的CTL誘導水平。在一個優選的實施方案中，以序列特異性的方式評價受試者的免疫應答，方法是在施用給受試者的各種免疫原之間比較免疫應答。具體地，即使當數種MPH0SPH1肽的混合物被施用給受試者時，免疫應答也會依賴於肽而改變。在這種情況下，通過比較每種肽的免疫應答，可以鑑定出受試者對其顯示更高應答的肽。
[0410]X1.杭體:
[0411]本發明還提供了與本發明的肽結合的抗體。優選的抗體特異性結合本發明的肽且不會結合(或會微弱結合)其它肽。或者，抗體可結合本發明的肽及其同源物。針對本發明肽的抗體可用於癌症診斷和預後測定法、及成像方法學。類似地，此類抗體可用於其它癌症的治療、診斷、和/或預後，只要癌症患者中也表達或過表達MPH0SPH1。此外，胞內表達的抗體(例如單鏈抗體)在治療上可用於治療涉及MPH0SPH1表達的癌症，這樣的癌症的例子包括但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0412]本發明還提供了多種免疫學測定法，用於檢測和/或定量MPH0SPH1蛋白(SEQ IDNO: 126)或其片段，包括由選自SEQ ID NO:5，14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸構成的多肽。此類測定法可根據需要包括一種或多種能夠識別和結合MPH0SPH1蛋白或其片段的抗MPH0SPH1抗體。在本發明的語境中，與MPH0SPH1多肽結合的抗MPH0SPH1抗體優選將識別由選自SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列構成的多肽，而不識別其它肽。抗體的結合特異性可利用抑制測試來確認。即，當要分析的抗體與全長MPH0SPH1多肽之間的結合在任何具有選自SEQ ID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的片段多肽存在下受到抑制時，認為此抗體特異性結合該片段。在本發明的語境中，此類免疫學測定法以本領域公知的各種免疫學測定形式實施，包括但不限於各種類型的放射免疫測定法、免疫層析技術、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、酶聯免疫螢光測定法(ELIFA)、等等。
[0413]本發明的相關免疫學的但非抗體的測定法也包括T細胞免疫原性測定法(抑制性的或刺激性的)以及MHC結合測定法。另外，本發明還提供能夠檢測表達MPH0SPH1的癌症的免疫學成像方法，包括但不限於使用經標記的本發明抗體的放射閃爍成像方法。此類測定法在臨床上可用於表達MPH0SPH1的癌症的檢測、監測、和預後，所述癌症但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
[0414]本發明還提供了與本發明的肽結合的抗體。本發明的抗體可以以任何形式使用，例如單克隆或多克隆抗體，而且包括通過用本發明的肽免疫動物(諸如家兔)而獲得的抗血清、所有種類的多克隆和單克隆抗體、及通過遺傳重組生成的人抗體和人源化抗體。
[0415]本發明的作為抗原用於獲得抗體的肽可來源於任何動物物種，但優選來源於哺乳動物，諸如人、小鼠或大鼠，更優選來源於人。來源於人的肽可以由本文所公開的核苷酸或胺基酸序列獲得。
[0416]根據本發明，完整的蛋白質或蛋白質的部分肽可以用作免疫抗原。合適的部分肽的例子包括，例如本發明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。
[0417]在本文中，抗體定義為能與MPH0SPH1肽的全長或片段起反應的蛋白質。在一個優選的實施方案中，本發明的抗體將會識別具有選自SEQ ID NO:5, 14, 64, 73, 77, 79,97, 103和120的胺基酸序列的MPH0SPH1的片段肽。用於合成寡肽的方法是本領域公知的。合成後，可任選在作為免疫原使用之前純化肽。在本發明的語境中，寡肽(例如9或10聚物)可與載體綴合或連接以增強免疫原性。匙孔蟲戚血藍蛋白(KLH)作為載體是公知的。用於綴合KLH和肽的方法也是本領域公知的。
[0418]或者，可以將編碼本發明肽或其片段的基因插入已知的表達載體，然後用該載體轉化本文所述宿主細胞。可以通過任何標準方法從宿主細胞外部或內部回收所需肽或其片段，然後可將其用作抗原。或者，表達肽的完整細胞或其溶胞物或者化學合成的肽也可用作抗原。
[0419]可以用抗原免疫任何哺乳動物，但優選考慮與用於細胞融合的親本細胞的相容性。通常，可使用卩齒齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長類(Primate family)的動物。齧齒科動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形科動物包括例如家兔。靈長類包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old worldmonkey))諸如食蟹猴(Macacafascicularis)、恆河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
[0420]用抗原免疫動物的方法是本領域已知的。腹膜內注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標準方法。更具體的說，可以在適量的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要， 可將抗原懸浮液與適量的標準佐劑諸如弗氏(Freund)完全佐劑混合，製成乳狀液，然後施用於哺乳動物。優選的是，其後每4-21天施用數次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。還可使用適宜的載體進行免疫。如上所述進行免疫後，可以通過標準方法檢驗血清中所需抗體的量的增加。
[0421]可以如下製備針對本發明肽的多克隆抗體:從經過免疫的哺乳動物(該哺乳動物經檢驗其血清中所需抗體增加)收集血液,並通過任何常規方法從血液中分離血清。多克隆抗體可包括含有多克隆抗體的血清，以及可以從所述血清中分離的、含有該多克隆抗體的級分。可以使用例如偶聯有本發明肽的親和柱從僅識別本發明肽的級分中製備免疫球蛋白G或M，並進一步使用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。
[0422]為了製備用於本發明語境中的單克隆抗體，從經過抗原免疫並如上所述檢查出血清中所需抗體水平升高的哺乳動物收集免疫細胞，並進行細胞融合。用於細胞融合的免疫細胞優選獲自脾。其它要與上述免疫細胞融合的優選親本細胞包括例如哺乳動物的骨髓瘤細胞，更優選具有為了用藥物選擇融合細胞而獲得的特性的骨髓瘤細胞。
[0423]可根據已知的方法，例如Milstein 等(Galfre 和 Milstein, Methods Enzymol73:3-46 (1981))的方法，將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞進行融合。
[0424]對於由細胞融合得到的雜交瘤，可在標準選擇培養基諸如HAT培養基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養基)中培養以進行選擇。通常，細胞培養在HAT培養基中連續進行數天至數周，培養的時間足以使除了所需雜交瘤之外的所有其它細胞(非融合的細胞)死亡。然後，可以進行標準有限稀釋(standard limiting dilution)來篩選和克隆生成所需抗體的雜交瘤細胞。
[0425]除了上述用抗原免疫非人動物來製備雜交瘤的方法外，還可以在體外用肽、表達肽的細胞或其溶胞物免疫人淋巴細胞，諸如那些感染了 EB病毒的人淋巴細胞。然後，可以使經過免疫的淋巴細胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細胞諸如U266融合，以產生期望的生成能夠與所述肽結合的人抗體的雜交瘤(已公開但未審查的日本專利申請N0.Sho63-17688)。
[0426]隨後可以將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，並抽取腹水。所得的單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉澱、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯有本發明肽的親和柱進行純化。本發明的抗體不僅可用於純化和檢測本發明的肽，還可以用作本發明肽的激動劑和拮抗劑的候選物。 [0427]或者，可以通過癌基因使生成抗體的免疫細胞(諸如經過免疫的淋巴細胞)永生化，並用於製備單克隆抗體。
[0428]如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術來重組製備(參見例如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies,由 MacMillanPublishers LTD在英國出版(1990))。例如，可以從生成抗體的免疫細胞諸如雜交瘤或經免疫淋巴細胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，並導入宿主細胞以製備重組抗體。本發明還提供如上所述製備的重組抗體。
[0429]本發明的抗體可以是抗體片段或經過修飾的抗體，只要它結合一種或多種本發明的肽。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab』)2、Fv或將來自H鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv) (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA85:5879-83(1988))。更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段。或者，可以構建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，並在合適的宿主細胞中表達(參見例如 Co et al., J Immunol 152:2968-76 (1994) ; Betterand Horwitz, Methods Enzymol 178:476-96(1989);Pluckthun and Skerra, MethodsEnzymol 178:497-515(1989);Lamoyi, Methods Enzymol 121:652-63(1986);Rousseauxet al., Methods Enzymol 121:663-9(1986) ;Bird and Walker, Trends Biotechnol9:132-7(1991))。
[0430]抗體可以通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)綴合來修飾。本發明提供了經過這樣修飾的抗體。可通過化學修飾抗體來獲得經過修飾的抗體。這些修飾方法是本領域常規的。
[0431]或者，可以以源自非人抗體的可變區與源自人抗體的恆定區之間的嵌合抗體或者包含源自非人抗體的互補決定區(CDR)、源自人抗體的框架區(FR)及恆定區的人源化抗體的形式來獲得本發明的抗體。此類抗體可依照已知技術來製備。人源化可通過用嚙齒類的⑶R或⑶R序列替換人抗體的相應序列來進行(參見例如Verhoeyen et al., Science239:1534-1536(1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中人可變域的一小部分已被來自非人物種的相應序列所替換。
[0432]也可以使用完全的人抗體，這樣的抗體除了人框架區和恆定區外還包含人可變區。此類抗體可使用本領域已知的多種技術來製備。例如，體外方法包括使用展示在噬菌體上的人抗體片段的重組文庫(例如Hoogenboom&ffinter, J.Mol.Biol.227:381 (1991))。類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座導入轉基因動物，例如內源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠，來生成人抗體。該方法記載於例如美國專利Nos.6，150，584 ;5，545，807 ；5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016。
[0433]可以將如上獲得的抗體純化至同質。例如，可依照用於一般蛋白質的分離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當選擇和組合使用柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳和等電聚焦來分出和分離抗體(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring HarborLaboratory (1988)),但並不局限於此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白 A 柱包括例如 Hyper D、P0R0S 和 Sepharose F.F.(Pharmacia)。
[0434]除親和層析外的合適的層析技術的例子包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析、等等(Strategies for Protein Purification和Characterization:A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al., ColdSpring Harbor Laboratory Press (1996))。可以通過液相層析來進行層析規程,諸如HPLC和 FPLC。
[0435]例如，可使用吸光度測量、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)和/或免疫螢光來測量本發明抗體的抗原結合活性。在ELISA中，將本發明的抗體固定化在板上，將本發明的肽施加到該板上，再施加含有期望的抗體的樣品，諸如生成抗體的細胞的培養物上清液或純化的抗體。然後施加用酶(諸如鹼性磷酸酶)標記的、識別所述第一抗體的第二抗體，並將板溫育。接著，在洗滌後，向板中加入酶底物，諸如磷酸對硝基苯酯，並測量吸光度以評估樣品的抗原結合活性。可以使用肽的片段，諸如C-末端或N-末端片段作為抗原來評估抗體的結合活性。可以使用BIAcore (Pharmacia)來評估本發明抗體的活性。
[0436]上述方法允許通過將本發明的抗體暴露於假定含有本發明肽的樣品，並檢測或測量由抗體與肽形成的免疫`複合物，來檢測或測量本發明的肽。
[0437]因為依照本發明的肽檢測或測量方法可特異性的檢測或測量肽，所以該方法可用於使用肽的各種實驗。
[0438]XI1.載體和宿豐細朐:
[0439]本發明還提供了編碼本發明肽的載體和導入有編碼本發明肽的多核苷酸的宿主細胞。本發明的載體可用於在宿主細胞中作為本發明的多核苷酸擔載體(carrier)，尤其是DNA，用於表達本發明的肽，或者用於施用本發明的多核苷酸以用於基因療法。
[0440]當選用大腸桿菌作為宿主細胞且在大腸桿菌(例如JM109、DH5a、HBlOl或XLlBlue)中大量擴增和生成載體時，載體應具有適合於大腸桿菌中擴增的「(複製)起點」和適合於選擇經過轉化的大腸桿菌的標誌基因(例如通過藥物諸如氨苄青黴素、四環素、卡那黴素、氯黴素等進行選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR_Script 等。另外，與上述載體一樣,pGEM_T、pDIRECT 和 pT7 也可以用於亞克隆和提取cDNA。當使用載體來生成本發明的蛋白質時，表達載體是有用的。例如，要在大腸桿菌中表達的表達載體應具備上述在大腸桿菌中擴增的特徵。當使用大腸桿菌諸如JM109、DH5 a、HBlOl或XLlBlue作為宿主細胞時，載體應具有能在大腸桿菌中高效表達所需基因的啟動子，例如IacZ啟動子(Ward et al., Nature 341:544-6 (1989) ;FASEBJ 6:2422-7(1992))、araB啟動子(Better et al., Science 240:1041-3 (1988))、T7啟動子等。在這方面，可以使用例如 pGEX_5X_l (Pharmacia)、「QIAexpress 系統」(Qiagen)、pEGFP和pET(在這種情況中，宿主優選為表達T7RNA聚合酶的BL21)來取代上述載體。另外，載體還可以包含用於肽分泌的信號序列。指導肽分泌至大腸桿菌周質的例示性信號序列有PelB信號序列(Lei et al., J Bacteriol 169:4379(1987))。用於將載體導入靶宿主細胞的手段包括例如氯化鈣法和電穿孔法。
[0441]除了大腸桿菌外，還可以使用例如源自哺乳動物的表達載體(例如pcDNA3 (Invitrogen)和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18 (17):5322 (1990))、pEF、PCDM8)、源自昆蟲細胞的表達載體(例如「Bac-to-BAC杆狀病毒表達系統」(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、源自植物的表達載體(例如pMHl、pMH2)、源自動物病毒的表達載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、源自逆轉錄病毒的表達載體(例如pZIpneo)、源自酵母的表達載體(例如「畢赤酵母表達試劑盒」(Invitrogen)、pNVll、SP-QOI)及源自枯草芽孢桿菌的表達載體(例如pPL608、pKTH50)來生成本發明的多肽。
[0442]為了在動物細胞諸如CHO、COS或NIH3T3細胞中表達載體，載體應攜帶在所述細胞中進行表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al., Nature277:108 (1979))、MMLV-LTR 啟動子、EFla 啟動子(Mizushima et al., Nucleic Acids Res18:5322 (1990))、CMV啟動子、等等，及優選用於選擇轉化子的標誌基因(例如通過藥物(例如新黴素、G418)進行選擇的藥物抗性基因)。具有這些特徵的已知載體的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 p0P13。
[0443]下面參考實施例更詳細地描述本發明。但是，雖然下述的材料、方法和實施例可能有助於本領域普通技術人員來製備和使用本發明的特定實施方案，它們僅僅意圖用來例示本發明的方法，因此不會限 制本發明的範圍。正如本領域普通技術認為會承認的，與本文中描述的方法和材料類似或等同的方法和材料也可以用於實施或檢驗本發明。
實施例
[0444]材料和方法
[0445]細朐系
[0446]T2，HLA-A*0201_陽性B-淋巴母細胞樣細胞系，HLA_A*0206-陽性B-淋巴母細胞樣細胞系，HT1376, J82, C0S7 和 UM-UC3 購自 ATCC0 MKN-45 購自 JCRB0
[0447]源自MPH0SPH1的狀的候詵者詵擇
[0448]使用結合預測軟體"BIMAS" (http: //www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al.,J Immunol 1994, 152 (1):163-75;Kuzushima etal.,Blood 2001,98(6):1872-81)預測了 衍生自 MPH0SPH1(GenBank AccessionNo:EAW63006(SEQ ID NO:40))的結合HLA_A*0201分子的9聚體和10聚體肽。這些肽由BioSynthesis (Lewisville, Texas)根據標準固相合成法合成，並通過反相高效液相色譜(HPLC)純化。分別通過分析型HPLC和質譜分析來確定肽的純度(>90%)和身份。將肽以20mg/ml溶解在二甲基亞碸中並保存於_80°C。
[0449]體外CTL誘導
[0450]使用單核細胞衍生的樹突細胞(DC)作為抗原呈遞細胞來誘導針對呈現在人白細胞抗原(HLA)上的肽的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。如他處所述(NakaharaS et al., Cancer Res 2003 Jul 15，63 (14):4112-8)體外產生 DC。具體地說，對於用Ficoll-Paque plus (Pharmacia)溶液從正常志願者(HLA_A*0201陽性)分離的外周血單個核細胞，通過粘附塑料組織培養盤(Becton Dickinson)加以分離，以將它們作為單核細胞級分加以富集。將富集了單核細胞的群體在含2%熱滅活的自體血清(AS)的AM-V培養基(Invitrogen)中，在1000U/ml的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(R&D System)和1000U/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培養。培養7天後，將經細胞因子誘導的DC在AIM-V培養基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽於37°C衝激3小時。所生成的細胞表觀上在它們的細胞表面上表達DC相關分子，諸如⑶80、⑶83、⑶86和HLA II類(數據未顯示)。然後將這些經肽衝激的DC用X射線輻照(20Gy)滅活，並以1:20比例與用⑶8陽性分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的自體⑶8+T細胞混合。在48孔板(Corning)中設立這些培養物；每個孔在0.5ml AM_V/2%AS培養基中含有 1.5X104 個經肽衝激的 DC、3X105 個 CD8+T 細胞和 10ng/ml IL-7 (R&D System)。3 天后，給這些培養物補充IL-2 (CHIRON)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將T細胞用經肽衝激的自體DC進一步刺激。每次通過與上文所述相同的方式來製備DC。在第21天在第三輪肽刺激後測試針對經肽衝激的T2細胞的CTL (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001Jan 5,84 (I):94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20，84 (8):1052-7;Uchida Net al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24):8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006May, 97(5):411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506)。
[0451]CTL擴增規稈
[0452]使用與Riddell 等人(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct
19,333(16):1038-44; Riddell SR et al.，Nat Med 1996 Feb, 2 (2): 216-23)記載的方法相似的方法在培養中擴增CTL。將總共5X104個CTL在25ml AM_V/5%AS培養基中懸浮，其中有在40ng/ml抗⑶3單克隆抗體(Pharmingen)存在下經絲裂黴素C滅活的兩種人B-淋巴母細胞樣細胞系。啟動培養後一天，向培養物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天給培養物補加`新鮮的含有30IU/ml IL-2的AIM_V/5%AS培養基(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(I):94-9;Umano Y et al., Br JCancer 2001 Apr 20，84 (8):1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec15,10(24):8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9;Watanabe T etal., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506)?
[0453]CTL克降的律立
[0454]在96圓底微量滴定板(Nalge Nunc International)中進行稀釋以獲得0.3、I和3個CTL/孔。在總共150微升/孔的含5%AS的AIM-V培養基中，將CTL與IxlO4個細胞/孔的兩種人B-淋巴母細胞樣細胞系、30ng/ml的抗CD3抗體，和125U/ml的IL-2 —起培養。10天後向培養基中加入50微升/孔的IL-2以達到終濃度125U/ml的IL-2。在第14天測試CTL活性，並使用如上所述的相同方法擴增CTL克隆(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004Dec 15, 10(24):8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9;Watanabe Tet al., Cancer Sci 2005 Aug, 96 (8):498-506)?
[0455]特異件CTL活件[0456]為了檢查特異性CTL活性，實施了幹擾素(IFN)I酶聯免疫斑點(ELISPOT)測定法和IFN-Y酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。製備經肽衝激的T2 (IxlO4/孔)作為刺激細胞。使用48孔板中培養的細胞、CTL系和CTL克隆作為應答細胞。依照製造商的規程實施IFN- Y ELISPOT 測定法和 IFN- y ELISA 測定法。
[0457]CTL識別內源表汰MPH0SPH1和HLA_A*0201的靶細朐系的能力
[0458]檢查了 CTL克隆識別內源表達MPH0SPH1和HLA_A*0201的靶細胞系的能力。將建立的CTL克隆與靶細胞系(5X104/孔)培養兩次過夜(twoovernight)。溫育之後，用ELISA測量培養基中的IFN- Y。IFN- Y ELISA按照製造商的程序進行。
[0459]細胞毒活性
[0460]檢查了 CTL克隆殺死內源表達MPH0SPH1和HLA_A*0201的腫瘤細胞的能力。靶細胞(腫瘤細胞系)用IOOmicro-Ci的Na251CrO4 (Perkin Elmer)在CO2培養箱中標記I小時。肽衝激的靶細胞通過在標記之前將細胞與20微克/ml的肽溫育16小時來製備。將標記有51Cr的靶細胞清洗並與CTL在96孔圓底微量滴定板以200微升的終體積混合。將平板離心(800rpm，4分鐘)以增加細胞與細胞的接觸，並置於CO2培養箱中。溫育4小時後，從每個孔收集50微升上清液,使用Y計數器(PerkinElmer)測定放射性。按照下式計算比51Cr釋放的百分比來確定特異性細胞毒性的百分比:{(測試樣品釋放的cpm-自發釋放的cpm)/(最大釋放的cpm -自發釋放的cpm)} X100。自發釋放通過在沒有效應細胞的條件下單獨溫育靶細胞來測定。最大釋放通過將靶與IN HCl溫育來獲得。所有測量均一式三份進行。
[0461]強迫表汰靶某閔和/或HLA-A0206的細朐的律立
[0462]通過PCR來擴增編碼靶基因可讀框或HLA_A*0206的cDNA。將PCR擴增產物克隆入表達載體。使用Lipofectamine2000 (Invitrogen)依照製造商的規程將質粒轉染入C0S7(靶基因和HLA-A*0206陰性的細胞系)。自轉染起2天後，用Versene (Invitrogen)收穫經轉染的細胞，並用作CTL活性測定法的刺激細胞(5X104個細胞/孔)。
[0463]CTL識別內源表汰MPH0SPH1和HLA_A*0206的靶細朐系的能力
[0464]檢查了該CTL克隆識別內源表達MPH0SPH1和HLA_A*0206的靶細胞的能力。將建立的CTL系和克隆與靶細胞系(5X104/孔)培養兩次過夜。在溫育後，通過ELISA測量培養基中的IFN- Y。IFN- Y ELISA按照製造商的程序進行。
[0465]結果
[0466]癌症中MPH0SPH1表汰提高
[0467]利用cDNA微陣列從不同癌症中獲得的全局基因表達譜數據顯示MPHOSPHl(GenBank Accession N0.NM_016195; SEQ ID No: 125)表達在癌症組織中相比於對應的正常組織顯著升高。MPH0SPH1表達在31例膀胱癌中的30例、36例乳腺癌中的8例、18例宮頸癌中的18例、17例膽管細胞癌中的5例、31例CML中的25例、11例結直腸癌中的6例、14例胃癌中的6例、5例NSCLC中的5例、7例淋巴瘤中的7例、10例骨肉瘤中的6例、22例前列腺癌中的7例、18例腎癌中的10例、以及21例軟組織肉瘤中顯著升高(表1)。
[0468]表1:在癌症組織中相比於正常對應組織觀察到MPH0SPH1上調的病例的比例
[0469]
【權利要求】
1.下述(a)或(b)的分離的肽: (a)包含選自SEQID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的肽； (b)包含在選自SEQID NO:5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1、2或幾個胺基酸的胺基酸序列的肽，且其中該肽具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力。
2.權利要求1的分離的肽，其中該肽具有下列特徵之一或二者: (a)選自SEQID NO: 5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的N端第二個胺基酸選自亮氨酸和甲硫氨酸；和 (b)選自SEQID NO: 5, 14，64，73，77，79，97，103和120的胺基酸序列的C端胺基酸選自纈氨酸和亮氨酸。
3.權利要求1或2的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽。
4.一種分離的多核苷酸,其編碼權利要求1-3中任一項的肽。
5.一種用於誘導CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種權利要求1-3中任一項的肽，或者一種或多種權利要求4的多核苷酸。
6.一種用於誘導具有CTL誘導能力的APC的組合物，其中所述組合物包含一種或多種權利要求1-3中任一項的肽，或者一種或多種權利要求4的多核苷酸。
7.—種藥物組合物，其包含選自下組的至少一種活性成分: (a)—種或多種權利要求1-3中任一項的肽， (b)—種或多種編碼權利要求1-3中任一項的肽的多核苷酸； (c)一種或多種在其表面上呈遞有權利要求1-3中任一項的肽與HLA抗原的複合物的APC或外來體；和 (d)一種或多種識別在其表面上呈遞有權利要求1-3中任一項的肽與HLA抗原的複合物的細胞的CTL。
8.權利要求7的藥物組合物，供用於在受試者中治療和/或預防癌症，或誘導針對癌症的免疫應答。
9.權利要求7或8的藥物組合物，其中所述藥物組合物配製為供施用於HLA抗原為HLA-A2的受試者。
10.一種用於誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞(APC)的方法，所述方法包括選自下組的步驟: (a)在體外、離體或在體內使APC與權利要求1-3中任一項的肽接觸，和 (b)將編碼權利要求1-3中任一項的肽的多核苷酸導入APC。
11.一種用於誘導CTL的方法，所述方法包括選自下組的步驟: (a)將CD8陽性T細胞與在其表面上呈遞有HLA抗原與權利要求1_3中任一項的肽的複合物的APC共培養； (b)將CD8陽性T細胞與在其表面上呈遞有HLA抗原與權利要求1_3中任一項的肽的複合物的外來體共培養；和 (c)向CD8陽性T細胞中導入編碼兩個T細胞受體(TCR)亞單位的一個多核苷酸或編碼每一個TCR亞單位的多個多核苷酸，其中所述TCR能夠結合呈遞在細胞表面上的HLA抗原與權利要求1-3中任一項的肽的複合物。
12.—種分離的APC，所述APC在其表面上呈遞有HLA抗原與權利要求1_3中任一項的肽的複合物。
13.權利要求12的APC，其是通過權利要求10的方法誘導的。
14.一種分離的CTL，其識別在其表面上呈遞有HLA抗原與權利要求1-3中任一項的肽的複合物的細胞。
15.權利要求14的CTL，其中所述CTL是通過權利要求11的方法誘導的。
16.一種治療和/或預防受試者中的癌症的方法，其中所述方法包括對受試者施用藥學有效量的 (a)—種或多種權利要求1-3中任一項的肽； (b)—種或多種編碼權利要求1-3中任一項的肽的多核苷酸； (c)一種或多種在其表面上呈遞有權利要求1-3中任一項的肽與HLA抗原的複合物的APC或外來體；或 (d)一種或多種識別在其表面上呈遞有權利要求1-3中任一項的肽與HLA抗原的複合物的細胞的CTL的步驟。
17.一種在有需要的受試者中誘導針對癌症的免疫應答的方法，所述方法包括對所述受試者施用包含權利要求1-3中任一項的肽或編碼所述肽的多核苷酸的組合物的步驟。
18.針對權利要求1-3中任一項的肽的抗體或其免疫學活性片段。
19.一種載體,其包含編`碼權利要求1-3中任一項的肽的核苷酸序列。
20.一種宿主細胞，其經過權利要求19的載體轉化或轉染。
21.—種診斷試劑盒，其包含權利要求1-3中任一項的肽、權利要求4的多核苷酸、或權利要求18的抗體。
【文檔編號】C07K7/06GK103732743SQ201280039507
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年8月9日 優先權日:2011年8月12日
【發明者】角田卓也, 大澤龍司, 吉村祥子, 渡邊朝久, 中村佑輔 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司