利用靶信號產生引物進行的靶檢測的製作方法

2023-04-24 07:21:56

專利名稱：利用靶信號產生引物進行的靶檢測的製作方法
利用靶信號產生引物進行的靶檢測
技術領域：
本發明涉及一種利用革巴信號產生引物(Target Signal Generating Primer)進行的靶核酸序列的檢測。
背景技術：
用於檢測靶核酸的大部分技術包括靶核酸的擴增過程。核酸擴增是在分子生物學領域中所利用的必不可少的過程，並對此提出了多種擴增方法。例如，密勒(Miller)、H. I.等(W089/06700)公開了包括將助催化劑/引物序列與靶單鏈DNA(〃ssDNA〃)進行雜交之後，轉錄上述序列的許多RNA複製過程的核酸序列擴增方法。其他公知的核酸擴 增方法包括基於轉錄的擴增系統(Kwoh，D. etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,86 :1173 (1989)；以及 GingerasT. R. etal.，W088/10315)。公知為聚合酶鏈式反應(以下簡稱為「PCR」)的最為廣泛利用的核酸擴增方法包括雙鏈DNA的變性、向DNA模板進行寡核苷酸引物的退火以及DNA聚合酶引起的引物延長的反覆的循環過程(Mullis等，美國專利第4,683,195號，第4，683，202號以及第4,800,159號；Saiki 等，(1985) Science 230，1350-1354)。基於聚合酶鏈式反應(PCR)的技術不僅利用在靶DNA序列的擴增，還廣泛地利用在生物學和醫學研究領域中的科學應用或方法中，例如，反轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、分別表示(Differential Display)-聚合酶鏈式反應(DD-PCR)、公知或未知的利用基因的PCR的克隆、CD NA末端的高速擴增(RACE)、任意的引發-聚合酶鏈式反應(AP-PCR)、多重PCR、單核苷酸多態性(SNP)基因組分型以及基於PCR的基因組分析等(McPherson and Moller,(2000)PCR. BIOSS cientific Publishers,Springer-Verlag NewYork Berlin Heidelberg, NY)。另一方面，基於至今提出的核酸擴增的靶核酸檢測方法進行如下概括。I.急行-聚合酶鏈式反應(post-PCR)檢測方法典型的急行-聚合酶鏈式反應(post-PCR)方法包括核酸擴增及之後的擴增產物的檢測，用於分析靶核酸序列。根據以往的急行-聚合酶鏈式反應(post-PCR)檢測方法，應將擴增產物按其大小差異分離(通常利用凝膠電泳來實施)或通過擴增產物的固定化而分離。但是，分離過程會引起汙染以及低工作性等嚴重的問題。2.實時檢測方法為了克服急行-聚合酶鏈式反應(post-PCR)方法的問題，提出了實時檢測擴增產物的實時PCR的方法，以此擺脫汙染，能夠定量地分析靶核酸序列。2.I基於標記引物的設計方法2.I. I發卡式引物的設計方法該方法利用發卡式引物(sunriseprimer),其通過在5』末端形成髮夾環來使一對的突光團以及粹滅劑相鄰近，從而表示出減少的突光。這樣的引物包含(incorporated)在PCR的產物時，其尾部成為雙鏈，並且其髮夾環被解開，以此增加螢光(Nazarenko等，2516-2521NucleicAcids Research, 1997, v. 25no. 12，以及美國專利第 6，117，635 號)。但是，就發卡式引物設計方法而言，使引物包含與靶核酸序列互補的序列及能夠在其5』末端形成髮夾環的序列，這種設計非常複雜，因此大大降低了便利性。並且，對於引物而言，髮夾環的存在將降低對靶核酸的雜交效率。2.I. 2蠍形引物設計方法該方法利用包含集成(integrated)信號系統的蠍形引物。上述引物具有模板結合區域以及尾部，尾部包含連接肽與祀結合區域(region)。祀結合區域在引物的延長產物中與互補的序列進行雜交。之後，靶特意雜交結果與信號系統連接，並且雜交引起可檢測的變化。加尾引物的連接肽妨礙引物模板的尾部區域的聚合酶-介質鏈式複製(Whitcombe等，804-807，Nature Biotechnology v. 17 AUGUST 1999 美國專利第 6. 6，326，145 號)。加尾引物應包含用於產生擴增子-依賴性信號的連接肽及與引物延長產物雜交的靶結合區域，因此類似於發卡式引物方法，難以對引物進行設計以及合成。並且，對於引物而言，髮夾環的存在將降低對靶核酸的雜交效率。2.I. 3單一標記引物設計方法(勒克司(Lux)方法)單一標記引物設計方法是利用包含單一螢光標記的引物的方法，通過觀察與靶序列雜交的引物上的螢光特性的變化來檢測靶序列(美國專利第7，537，886號)。並且，該方法為了有效地產生信號，引物應具有髮夾-環結構。不僅如此，標記的種類、螢光標記周圍的引物的序列、螢光標記在引物上的位置、周圍其他成分等多種因素能使引物上的螢光特性改變，這致使弓I物設計的最優化難以實現。[2. I. 4裡昂(Lion)方法(利用3，— 5，核酸酶活性)該方法利用在引物的3』末端人為的錯配至少一個核苷酸的標記引物。在充分實現雜交的條件下培養標記引物以及試樣，接著，試樣暴露於具有3』 一 5』校正活性的核酸聚合酶，以此放出標記或標記系統的一部分(美國專利第6,248,526號)。但是，錯配引物需設計成複雜的形態，即在其3』末端包含錯配核苷酸。更為困難的是，在3』 -末端與非-靶序列發生錯配的情況下，錯配的引物由具有3』 一 5』校正活性的核酸聚合酶來產生假陽性信號的可能性也大。2.2基於標記探針的設計方法2.2. I 分子信標(Molecular beacon)方法雖然分子信標包含螢光以及猝滅染料，但是只有在猝滅染料與螢光染料鄰近的情況下發生突光共振能量轉移(FRET, fluorescence resonance energy transfer)。分子信標在溶液內單一存在時被設計成形成髮夾結構，由此兩個染料相鄰近。分子信標與靶進行雜交時，螢光及猝滅染料將會分離。不發生螢光共振能量轉移(FRET )，且螢光染料通過照射(irradiation)來發光(Indian J Med Res 124:385-398 (2006)以及 Tyagietal, NatureBiotechnologyv. 14MARCH 1996)。但是，分子信標方法存在如下幾個缺點。第一、髮夾結構的兩個反向重複序列(inverted repeat)應在祀核酸具有互補的配對物，這在靶上也要求通常不存在於靶上的反向重複的存在。第二、具有互補的核酸序列的髮夾結構的環部位的Tm以及莖區部位的Tm需仔細地保持均衡，這需從分析溫度的觀點保持均衡，其無需非特異性伸展Unfolding)，在存在靶的情況下使髮夾探針可進行特異性伸展。最終，該方法為了擴增靶核酸序列需要追加的引物。2.2. 2雜交探針的設計方法該方法利用四個寡核苷酸，即為兩個引物以及兩個探針。這些雜交探針具有單一標記時，一個具有供體螢光團，另一個具有受體螢光團。兩個探針的序列被選為，使這些序列以頭尾排列方式(head to tail arrangement)與祀序列進行雜交,並使兩個染料相鄰近來發生螢光共振能量轉移(FRET)。探針中一個探針的受體染料轉移能量，另一個探針在其他波長放出螢光。螢光的量與在PCR過程中生成的靶DNA的量成正比例(385-398，IndianJ Med Res 124,review article 0ctober2006 以及303-308 以及Bernad等，147-148 ClinChem 2000 ;46)。但是，該方法不適合於多重檢測，為了對靶核酸序列進行擴增，需要追加的引物。2.2. 3拖慢(TaqMan)探針方法(利用5』 一 3』核酸酶活性)這些拖慢(TaqMan)探針製備成，能夠在PCR產物的內部進行雜交。在PCR期間，即，聚合酶複製結合有拖慢(TaqMan)探針的模板時，聚合酶的5』外切核酸酶活性用於切割探針。這將分離螢光和猝滅染料，且不再發生螢光共振能量轉移(FRET，fluorescenceresonance energy transfer)(385-398,Indian J Med Res 124,review article October2006以及303-308，美國專利第5,210,015號)。但是，該方法在利用三個寡核苷酸(一個雙重標記探針以及兩個引物)的方面具有限界點。該方法導致探針的設計、合成以及反應條件的最優化變得複雜。2.2.4自身-猝滅探針方法(利用5』 一3』核酸酶活性)自身-猝滅探針方法利用具有與PCR產物的內部區域(region)雜交的序列的雙重-標記探針(美國專利第5，723，591號)。與拖慢(TaqMan)探針方法相同，自身-猝滅探針方法為了能夠進行同類試驗(homogeneous assay)需要利用三個寡核苷酸(一個雙重標記探針以及兩個引物)。該方法導致探針的設計以及反應條件的最優化變得非常複雜。
如上所述，至今開發出的以往的大部分靶檢測方法具有本質上的缺點，這將被視為難以克服。因此，需要開發出改善了技術性_、時間性-以及比容積-效率性的用於檢測靶核酸序列的新穎的接近法。在本說明書全文中參照多個專利及文獻，其引用由括號來表示。這些專利及文獻，作為參照全部包括在本說明書中，因此能夠更加明確地說明本發明所屬的技術領域的水準及本發明的內容。發明概述本發明者為了解決用於實時檢測靶核酸序列的以往技術的缺點而銳意研究努力。本發明者開發了在對於靶核酸序列的雜交及延長反應中依賴性地產生信號的新穎的TSG引物(Target Signal Generating Primer),並利用該TSG引物定立了用於檢測祀核酸序列的多種方案。其結果，本發明者確認了，本發明的新穎的方案或者方法在靶核酸序列的檢測，特別是在實時檢測的方面呈現出優秀的工作性，並且不僅在液相還在固相中以更強、更快的方式產生用於表示靶核酸序列的信號。因此，本發明的目的在於提供一種利用TSG引物(Target Signal GeneratingPrimer),從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法。本發明的再一目的在於提供一種在擴增反應中利用TSG引物(Target SignalGenerating Primer),從DNA或者核酸混合物中檢測祀核酸序列的方法。本發明的另一目的在於提供一種利用TSG引物(Target Signal GeneratingPrimer),從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒。參照所附的權利要求書以及附圖，能夠更加明確地說明本發明的其他目的及優點。

本發明的基本原理概括在圖I-圖4。圖I表示關於利用TSG引物，來檢測靶核酸序列的試驗的步驟。圖Ia表示具有用於檢測靶核酸序列的常規結構的TSG引物的利用。圖Ib表示，在靶核酸序列的檢測中，為了確保引物退火特異性，具有雙重引發寡核苷酸(DPO)結構的TSG引物的利用。圖2表示利用本發明的TSG引物及不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶，以實時方式檢測靶核酸的實時PCR擴增。圖2a表示，為了實現實時PCR擴增，具有常規結構的TSG引物的利用。圖2b表示，在實時PCR擴增中，為了確保引物退火特異性，具有雙重引發寡核苷酸(DPO)結構的TSG引物的利用。圖3表示利用本發明的TSG引物及具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶，以實時方式檢測靶核酸的實時PCR擴增。圖3a表示，為了實施實時PCR擴增，具有常規結構的TSG引物的利用。圖3b表示，在實時PCR擴增中，為了確保引物退火特異性，具有雙重引發寡核苷酸(DPO)結構的TSG引物的利用。圖4表示關於利用固定化在固相基質的TSG引物，來檢測靶核酸序列的試驗的步驟。圖4a表示具有用於檢測靶核酸序列的常規結構的TSG引物的利用。圖4b表示在靶核酸序列的檢測中，為了確保引物退火特異性，具有雙重引發寡核苷酸(DPO)結構的TSG引物的利用。圖5表示在無變性、雜交及引物延長的反覆地實施核酸合成反應的過程中，通過利用不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶，僅依靠TSG引物的雜交 及延長來檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)的結果。圖6表示在無變性、雜交及引物延長的反覆地實施核酸合成反應的過程中，通過利用不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶，僅依靠TSG引物的雜交及延長來檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)的結果。圖7表示利用TSG引物及不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)的實時PCR擴增的結果。圖8表示利用TSG引物及不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)的實時PCR擴增的結果。圖9表示利用TSG引物及不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的實時PCR擴增的結果。圖10表示利用TSG引物及不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的實時PCR擴增的結果。
圖11表示利用TSG引物及不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)的實時PCR擴增的結果。圖12表示在反覆進行變性、雜交及引物延長來實施核酸合成反應的過程中，利用具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶或者利用不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶產生從TSG引物發出的信號以及積累該信號的結果。圖13表示利用TSG引物及具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)的實時PCR擴增的結果。圖14表示利用TSG引物及具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)的實時PCR擴增的結果。圖15表示利用TSG引物及具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的實時PCR擴增的結果。 圖16表示利用TSG引物及具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的實時PCR擴增的結果。圖17表示利用TSG引物及具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶來檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)的實時PCR靈敏度的結果。發明詳述本發明涉及一種利用具有雙重標記系統的TSG引物(Target Signal GeneratingPrimer)以及模板-依賴性核酸聚合酶，以實時方式檢測靶核酸序列的新穎的方法。根據本發明，如果被命名為TSG引物(Target Signal Generating Primer)的信號被猝滅狀態的雙重標記引物與靶核酸序列進行雜交，則發生信號不猝滅現象，接著上述雙重標記引物被延長，以此合成對於靶核酸序列的互補的序列，最終能夠檢測用於表示革巴核酸序列存在的信號。S卩，在TSG引物上引起信號不粹滅的結構變化(conformationalchange)及3』 -延長反應均會發生。本發明者首次發現了，作為不具有如髮夾環結構等任何變形的結構的引物的TSG引物通過進行雜交及引物延長，從猝滅狀態轉換為不猝滅狀態就能夠產生信號。TSG引物及利用該引物的實時方法由本發明者首次提出。TSG引物的優點之一為，TSG引物的3』 -末端的延長，能夠抑制根據反應條件(例如，反應溫度)的變化而發生的信號強度變化(variation)。TSG引物3』 -末端的延長能夠使信號幾乎或根本不受反應溫度的變化，進而能夠得到更可靠、更穩定的信號結果。尤其，TSG引物3』 -末端的延長能夠使TSG引物擴增靶核酸序列。擴增反應，尤其對於基於PCR的實時檢測方法而言，本發明的TSG引物不僅與信號產生有關，還與祀擴增有關，並且能夠順利達成對於祀序列的同類(homogeneous)試驗。有趣的是，利用TSG引物的本發明的新穎的實時PCR檢測方法以與通用的實時PCR接近法明顯不同的方式起到作用，這克服了以往技術的缺點，並提高實時檢測的有效性。與基於TSG引物的設計方法和分子信標以及TaqMan探針方法相同的以往基於探針的設計方法的最明顯的區別之處在於，標記探針不擴增靶序列而僅產生靶信號，但是TSG引物則不僅能夠產生靶信號，還能夠擴增靶序列。基於探針的設計方法為了靶擴增還需要使用引物，這一點是與本發明有明確差異的事項。由於利用標記探針的以往的方法為了擴增靶序列還需要引物，因而難以實現探針設計、引物設計、序列的選擇及反應的最優化。相反，由於TSG引物方法不另外需要探針，因而可以將這些問題最小化。並且,雖然TSG引物包含(incorporated)在延長產物或擴增產物內，但標記探針不包含在任何產物，所以雖然TGS引物方法能夠直接測定擴增產物，但通過標記探針方法發出的信號則不直接反映擴增產物。並且，靶序列和標記探針的雜交隨著標記探針及擴增產物的濃度而不同，這使得定量分析難以實現。即使為了提高定量分析的準確性，可以使用過量的標記探針，但引起高本底問題的可能性非常高。相反，TSG引物方法能夠利用標記引物直接測定靶擴增，這以更高的準確性來實現靶序列的定量分析。另一方面，發卡式方法以及蠍形方法等幾種以往的基於引物的實時檢測方法，在與靶序列雜交之前，應具有用於猝滅螢光的髮夾結構。但是，在基於標記引物的設計方法中，利用髮夾結構不僅會降低雜交有效性還會 降低擴增有效性。並且，適用於標記引物的髮夾結構需要追加的序列，因此，引物的設計及製造需要把靶互補序列以及髮夾-形成序列全部考慮在內。在這種情況下，設計具有髮夾結構的標記引物是難以實現的。相反，TSG引物無需髮夾結構的幫助也能產生信號，可以克服因髮夾結構隨之產生的缺點。在對於產生信號的基本的機制的觀點，利用引物的單一標記的勒克司(Lux)方法與利用引物的雙重相互作用性標記系統的本發明是不同的。從引物的單一標記分子發出的信號可藉助標記的種類、標記周圍的引物的序列、引物上的標記的位置、周圍其他因素等多種因素來改變，這被視為勒克司方法的缺點。如上所述，本發明的基於TSG引物的實時檢測方法具有與以往基於引物及基於探針的設計方法有差別的一些技術特徵(尤其是，產生信號的原理、寡核苷酸的結構及寡核苷酸的功能)。本發明的技術特徵能夠克服以往實時方法的界限，以更有效的方式檢測出靶核酸序列。令人驚訝的是，本發明者發現藉助具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶在與靶核酸序列雜交的引物的5』 -末端部位發生5』 -切割反應，在靶序列的檢測中巧妙採用上述5』 -切割反應來產生對於靶序列的信號(參照PCT/KR2009/007064)。在5』-末端部位具有報導分子及猝滅分子的TSG引物與靶序列(即，模板)雜交時，藉助具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶，在其5』 -末端部位發生5』 -切割反應，之後，報導分子及猝滅分子互相隔開，這將引起TSG引物的信號不猝滅。發生5』 -切割反應的TSG引物的比例隨著模板-依賴性核酸聚合酶的5』 一 3』核酸酶活性、反應條件以及報導分子及猝滅分子之間的距離而不同。在利用具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶以及在5』 -末端部位具有報導分子或者猝滅分子的TSG引物時，考慮到發生5』 -切割反應，本發明能夠以兩種不同方式提供表示靶核酸序列存在的信號(i)藉助根據與靶核酸序列的雜交產生的結構變化引起的，利用TSG引物上的相互作用性標記系統的信號不猝滅(unqunching)的信號產生；以及(ii)利用具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的藉助TSG引物5』 -末端部位上的5』 -切割反應的信號產生。在利用具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的本發明中，優選地，5』 -切割反應僅在TSG引物的5』 -末端部位(更為優選地，為5』 -末端)與靶核酸序列互補時發生。根據本發明，能夠以極大提高的有效性及可靠度來實時檢測靶核酸序列。本發明者可知，這種科學結果以及技術戰略由本發明者最初提出。根據本發明的一實施方式，本發明提供一種利用TSG引物(Target Sign alGenerating Primer)從DNA或者核酸混合物中檢測祀核酸序列的方法,該方法包括以下步驟步驟(a)，使上述靶核酸序列與上述TSG引物進行雜交，上述TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii )報導分子及猝滅分子；在上述TSG弓丨物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅(quenching)從上述報導分子發出的信號；在上述TSG引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅(unquenching)從上述報導分子發出的信號，由此能夠得到表示上述靶核酸序列存在的信號； 步驟(b)，在引物延長條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述TSG引物的3』 -末端發生3』 -延長反應；以及步驟(C)，對表示上述靶核酸序列存在的信號進行檢測，由此，上述信號表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。本發明者為了克服以往靶核酸序列實時檢測技術的問題而銳意研究努力。本發明者研製出了根據對於靶核酸序列的雜交以及延長能夠產生信號的新穎的TSG引物(TargetSignal Generating Primer),利用該TSG引物定立了用於檢測祀核酸序列的多種方案。其結果，本發明者確認了，本發明的新穎的方案或者方法，在靶核酸序列的檢測，特別是在實時檢測的方面呈現出優秀的工作性，而且不僅是在液相，在固相也能以更強、更快的方式產生用於表不祀核酸序列的信號。根據本發明，與靶核酸序列雜交的TSG引物具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性標記系統。在上述TSG引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅(quenching)從上述報導分子發出的信號；相反，在上述TSG引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅(unquenching)從上述報導分子發出的信號，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信號。如此，TSG引物具有雙重功能(i)產生對於靶核酸序列的信號；以及(ii)與靶核酸序列互補的序列的合成。因此，將本發明中利用的引物命名為「TSG引物(Target Signal GeneratingPrimer)」，據此將本發明的方法命名為「TSG引物祀檢測試驗(TSG primer TargetDetection Assay)，，。根據本發明，首先將靶核酸序列與TSG引物進行雜交。在本說明書中使用的術語「靶核酸」、「靶核酸序列」或者「靶序列」意味著所要檢測的核酸序列，且，在雜交、退火或者擴增條件下與引物以及探針進行退火或者雜交。在本說明書中使用的術語「引物」意味著寡核苷酸，在誘導與核酸鏈(模板)互補的引物延長產物的合成的條件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合劑的存在以及適合的溫度與PH的條件下，可起到合成的起始點的作用。優選地，引物在擴增中作為具有最大有效性的單鏈。優選地，引物為寡脫氧核糖核苷酸。在本發明中利用的引物可包含自然(naturallyoccurring)脫氧單磷酸核苷(dNMP)(即，脫氧腺苷酸(dAMP)、dGMP (脫氧鳥苷酸)、dCMP (脫氧胞苷酸)及dTMP (脫氧胸苷酸))、變形的核苷酸或者非-自然核苷酸。並且，引物還可包含核糖核苷酸。就引物而言，應充分長，以便能夠在聚合劑的存在之下引發延長產物的合成。引物的適合的長度取決於多個因素，例如，溫度、應用領域及引物的根源(source)。在本說明書中使用的術語「退火」或「引發」意味著在模板核酸並置(apposition)寡脫氧核苷酸或者核酸，就上述並置而言，通過聚合酶對核苷酸進行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互補的核酸分子。在本說明書中使用的術語「雜交(hybridization)」意味著互補的單鏈核酸形成雙鏈核酸。雜交在兩個核酸鏈之間完全互補時(perfect match)產生,或存在部分錯配的(mismatch)鹼基也會產生雜交。雜交所需的互補程度可隨著雜交條件而不同，尤其可以根據溫度進行調整。 在本說明書中使用的術語「退火」和「雜交」沒有區分，在本說明書中混用。在本說明書中使用的術語「TSG引物」意味著能夠進行自身-猝滅、自身-不猝滅以及延長的引物。尤其，在本發明中使用的TSG引物意味著能夠產生用於表示與靶序列互補的序列的合成及靶核酸序列的存在的信號的雙重-標記引物，在不與靶核酸序列雜交的情況下，將誘導相互作用性標記系統的猝滅，在與靶核酸序列雜交的情況下，將誘導相互作用性標記系統的不猝滅，最終，產生用於表示靶核酸序列存在的信號。本說明書中使用的術語「正向引物」意味著與向3』 一 5』方向排列的靶核酸序列的單鏈互補的引物(5』 一 3』方向)。反向引物在上述核酸序列的另一側鏈上具有互補的序列。本說明書中，在提及TSG引物的報導分子及猝滅分子而使用的術語「三維地鄰近(three-dimensionalIy adjacent)」意味著在沒有如髮夾環等引物的任何分子內結構的幫助下，報導分子及猝滅分子結構性地互相鄰近。TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)雙重相互作用性標記系統。在本說明書中使用的術語「互補的」意味著在預定的退火條件或者嚴格條件下引物以選擇性地與靶核酸序列雜交的程度充分地互補，並包含「實質上互補的(substantially complementary)，，及「完全互補的(perfectly complementary)，，的意義，優選地意味著完全互補的意思。選擇性地，TSG引物在其5』 -末端還可包含與靶核酸序列非-互補的非-雜交核苷酸序列。優選地，上述靶信號產生引物的上述報導分子及上述猝滅分子中的一個位於非-雜交核苷酸序列，另一個位於雜交核苷酸序列。TSG引物的非-雜交核苷酸序列優選地不形成髮夾-環結構，不參與如髮夾-環等的分子內結構的形成。TSG引物的非-雜交核苷酸序列優選地不具有限制酶切位點(restriction site)。優選地，TSG引物不形成髮夾-環結構。根據本發明的優選實例，雙重標記系統位於TSG引物的靶互補序列。根據本發明的優選實例，TSG引物的5』 -末端或者5』 -末端部位具有與靶核酸序列完美互補的序列。
TSG引物具有包含報導分子及猝滅分子的相互作用性標記系統。上述相互作用性標記系統為能量非-放射性地(non-radioacively)傳達到供體分子及受體分子之間的信號產生系統。作為相互作用性標記系統的代表性例子，螢光共振能量轉移技術(FRET, fluorescence resonance energy transfer)標記系統包含突光報導分子(供體分子)及猝滅分子(受體分子)。在螢光共振能量轉移技術中，能量供體為螢光性，但是，能量受體可以是螢光性或者非-螢光性。在相互作用性標記系統的再一形態中，能量供體為非-螢光性，例如，為發色團(chromophore),能量受體為突光性。在相互作用性標記系統的另一形態中，能量供體為發光性，例如，生物發光性、化學發光性或者電化學發光性，受體為螢光性。優選地，用於表示靶核酸序列存在的信號藉助雙重相互作用性標記系統來產生，最優選為螢光共振能量轉移(FRET)標記系統。將螢光共振能量轉移(FRET)標記利用到TSG引物時，在兩個標記(螢光報導分子 及粹滅分子)藉助TSG引物與祀核酸序列雜交而具有延伸形態(stretch conformation)的情況下，互相隔開，發生信號的不猝滅。在TSG引物不與靶核酸序列雜交而具有扭曲形態(twist conformation)的情況下,兩個標記互相鄰近,發生信號的粹滅。在本說明書中，術語「猝滅」及「不猝滅」將被解釋為相對的概念。例如，「不猝滅」與「猝滅」相比，猝滅效率或水準低。即，從報導分子發出的信號的猝滅並不僅僅意味著上述信號的完全消滅，而是具有包含與沒有猝滅現象的情況相比較，信號相對減少的意思。並且，從報導分子發出的信號的不猝滅並不僅僅意味著上述信號的完全恢復，而是具有包含與有猝滅現象的情況相比較，信號相對增加的意思。如上所述，通過信號的猝滅程度的差異能夠得到表示靶核酸序列的信號。例如，為了檢測靶核酸而測定從上述螢光報導分子發出的相對螢光強度時，由於螢光報導分子及猝滅分子在空間上(或三維地)互相鄰近，因此不與靶核酸序列雜交的TSG引物將表現出相對低的螢光強度(猝滅狀態)。在TSG引物與靶核酸序列雜交的情況下，由於螢光報導分子及猝滅分子在空間上互相隔開，因而表現出相對高的螢光強度(不猝滅狀態)。若能夠發生上述猝滅-不猝滅轉換現象，則報導分子及猝滅分子均可位於TSG引物的任何位點(site)。根據本發明的優選實例，報導分子及猝滅分子位於互相隔開4-50核苷酸的位置。根據本發明的優選實例，報導分子及猝滅分子將互相隔開最大50核苷酸，更為優選地，互相隔開最大40核苷酸，進而優選地互相隔開最大30核苷酸，最為優選地互相隔開最大25核苷酸。根據本發明的優選實例，報導分子及猝滅分子將隔開最少4核苷酸，更為優選地隔開最少6核苷酸，進而優選地隔開最少10核苷酸，最為優選地隔開最少15核苷酸。根據本發明的優選實例，TSG引物的報導分子及上述猝滅分子位於5』 -末端或者從5』-末端隔開1-5核苷酸的位置。例如，報導分子位於TSG引物的5』-末端或者從5』-末端隔開1-5核苷酸的位置，猝滅分子位於從報導分子隔開4-50核苷酸的位置。根據本發明的優選實例，TSG引物的報導分子位於5』 -末端或者從5』 -末端隔開1-10核苷酸的位置，更為優選地位於5』 -末端。根據本發明的優選實例，TSG引物的猝滅分子位於5』 -末端或者從5』 -末端隔開1-10核苷酸的位置，更為優選地位於5』 -末端。在本發明中利用的報導分子及猝滅分子可利用本發明所屬技術領域中公知的任何標記。例如Cy2 (506)、YO-PROtm-I (509)、Υ0Υ0 -1 (509),Calcein (517),FITC (518)、FluorX (519),Alexa (520),Rhodamine I1 0(520)、5_FAM(522)'Oregon Green 500(522)、Oregon Green 488 (524)、RiboGreen (525)、Rhodamine Green (527)、Rhodaminel23(529),Magnesium Green (531),Calcium Green (533)、TO-PROtm-I (533),TOTOl (533)、JOE (548)、B0DIPY530/550 (550),Dil (565),BODIPY TMR (568)、B0DIPY558/568 (568)、B0DIPY564/570 (570)、Cy3 (570)、Alexa 546 (570)、TRITC (572)、Magnesium Orange (575)>Phycoerythrin R&B (575)、Rhodamine Phalloidin (575)、Calcium Orange (576)、PyroninY (580)、Rhodamine B (580)、TAMRA (582)、Rhodamine Red (590)、Cy3.5 (596)、ROX (608)、Calcium Crimson (615)、Alexa 594 (615)、Texas Red (615)、Nile Red(628)、Y0-PR0 -3 (631)、Y0Y0 -3 (631)、R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648)、T0-PR0 -3 (660)、T0T03 (660)、DiD DilC (5) (665)、Cy5 (670)、Thiadicarbocyanine(671)以及Cy5. 5 (694)。括號的數字為以納米單位表示的最大發光波長。適合的一對報導分子-粹滅分子公開在如下的許多文獻中Pesce等，editors,FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (MarcelDekker, NewYork, 1971) ；White 等，FLUORESCENCEANALYSIS APRACTICAL APPROACH (MarcelDekker, NewYork,1970) ；Berlman, HANDBOOK OFFLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES，2nd EDITION (AcademicPress, NewYork,1971) Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (AcademicPress,NewYork, 1976)；Bishop, editor, INDICATORS (PergamonPress, Oxford,1972) ；Haugland,HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALSCMolecular Probes,Eugene,1992) ；Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers,NewYork,1949)；Haugland, R. P. , HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCHCHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg. , 1996 ;美國專利第 3,996,345號以及第4,351,760號。本發明中，值得關注的是可以利用能夠對廣範圍波長或者特定波長的螢光進行猝滅的非-螢光黑猝滅分子。在應用於TSG引物的螢光共振能量轉移(FRET)標記中，報導分子包含螢光共振能量轉移(FRET)的供體，猝滅分子包含螢光共振能量轉移(FRET)的剩餘夥伴(受體)。例如，突光素染料(fluorescein dye)利用為報導分子,羅丹明染料(rhodamine dye)利用為粹滅分子。在與靶核酸序列雜交之後，為了延長與靶核酸序列雜交的TSG引物，在引物延長條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸。「在引物延長條件下」的內容意味著藉助模板-依賴性核酸聚合酶在TSG引物的3』 -末端充分發生延長反應的條件。這些條件可遵循以往核酸聚合酶引起的引物延長所需的條件。例如，這些條件可在 Joseph Sambrook 等、Molecular Cloning、A LaboratoryManualsCoId Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor>N. Y. (2001)中石角認。如實施例所示，條件包含適當時間內在相對高溫(例如，50°C -75V )下的靶核酸序列、TSG引物、熱穩定性DNA聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)、dNTPs及MgCl2的培養。
TSG引物的延長是本發明中非常重要的步驟。在藉助TSG引物的延長反應生成延長產物的情況下，將引起包含在延長產物內的TSG引物序列和靶核酸序列的更為穩定的雜交。並且，TSG引物的延長反應使得TSG引物的標記包含於延長產物內，由此與擴增產物的量成正比例地增加信號的強度。本發明中發生的這種耦合現象能夠實現更為準確的靶核酸序列的定量分析。根據本發明，與標記探針不同，在TSG引物自身與非-靶序列非-特異性地雜交的情況下，在如高溫(例如，50°C -85°C )等嚴格條件(stringent conditions)下實施信號檢測，由此有可能不產生任何假陽性信號。並且，TSG引物的延長能夠擴增靶核酸序列，並可同時實現靶擴增和信號擴增。根據本發明，模板-依賴性核酸聚合酶均包含本發明所屬技術領域公知的任何核酸聚合酶。本發明的重要優點之一為，在不具有核酸酶活性的情況下利用模板-依賴性核酸聚合酶產生IE信號。根據本發明的優選實例，本發明中所利用的模板-依賴性核酸聚合酶不具有核酸 酶活性。根據本發明的優選實例，本發明中所利用的模板-依賴性核酸聚合酶不具有5』 一 3』核酸酶活性。本發明中所利用的模板-依賴性核酸聚合酶可以是任何核酸聚合酶，例如包含E. coli DNA聚合酶I的「克列諾(Klenow)」片段、熱穩定性DNA聚合酶及噬菌體T7 DNA聚合酶。優選地，聚合酶為能夠從多種細菌種得到的熱穩定性DNA聚合酶。根據本發明的優選實例，本發明中所利用的模板-依賴性核酸聚合酶具有5』 一 3』核酸酶活性，上述TSG引物的3』 -末端藉助上述模板-依賴性核酸聚合酶的聚合酶活性而延長，上述TSG引物的5』 -末端由上述模板-依賴性核酸聚合酶的5』 一3』核酸酶活性所切割，由此報導分子或猝滅分子被分離，產生用於表示靶核酸序列存在的信號。優選地，具有5』 一3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶為熱穩定性DNA聚合酶，這能夠從多種細菌種得到，例如，包含Thermus aquaticus (Taq)、ThermusthermophiIus、Thermus filiformis、Thermus flavus、Thermus antranikianii、Thermuscaldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermusoshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05 以及 Thermus species sps 17。最為優選地，具有 5』 一 3』 核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶為Taq DNA聚合酶。有趣的是，本發明者發現僅僅通過將與靶核酸序列雜交的TSG引物與具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶接觸，不僅其3』 -末端延長，而且其5』 -末端部位(例如，5』 -末端)將被切割。並且，TSG引物5』 -末端部位的切割反應將導致本發明的信號產生。概括地講，本發明在與TSG引物的5』-切割反應相關聯實施的情況下，本發明能夠以兩種不同方式提供表示靶核酸序列存在的信號(i)藉助根據與靶核酸序列的雜交產生的結構變化來引起的，利用TSG引物上的相互作用性標記系統的信號不粹滅(unqunching)來產生信號；以及(ii)藉助利用具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的TSG引物5』 -末端部位上的5』 -切割反應來產生信號。
根據本發明的優選實例，TSG引物在其5』 -末端或者5』 -末端部位具有與靶核酸序列相匹配的序列。在本說明書中提及TSG引物而使用的術語「5』 -末端部位」意味著，從TSG引物的5』 -末端包含某一長度的連續序列的部位或者區域。優選地，TSG引物的5』 -末端部位具有從5』-末端及從5』-末端隔開的包含1-10核苷酸的序列(更優選為1-7核苷酸，進而優選為1-5核苷酸，進一步優選為1-3核苷酸)。選擇性地，本發明中可以利用具有3』 一5』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸
聚合酶。根據本發明的優選實例，在利用具有3』 一 5』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的情況下，TSG引物在其3』 -末端部位或者3』 -末端包含至少一個錯配核苷酸序列。
根據本發明的優選實例，在TSG引物在其3』 -末端部位或者3』 -末端包含至少一個錯配核苷酸序列的情況下，錯配核苷酸序列不具有標記。錯配核苷酸的數量為1-5，優選為1-4，更優選為1-3，進而優選為1_2，最優選為I。在引物中具有至少兩個錯配核苷酸的情況下，錯配核苷酸可連續或非連續地定位。根據本發明的優選實例，在利用具有3』 一 5』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的情況下，TSG引物在其3』-末端部位具有至少一個錯配核苷酸，該錯配核苷酸包含對模板-依賴性核酸聚合酶的3』 一5』核酸酶活性具有耐性的主鏈(backbone)。根據本發明的優選實例，在利用具有3』 一5』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的情況下，TSG引物在其3』 -末端具有包含對模板-依賴性核酸聚合酶的3』 一5』核酸酶活性具有耐性的主鏈(backbone)的單一匹配-決定核苷酸(singlematch-determinant nucleotide)。TSG引物3』-末端的單一匹配-決定核苷酸只在與存在於相反鏈的匹配核苷酸雜交的情況下才形成鹼基對。但是，在存在於相反鏈的核苷酸不與單一匹配-決定核苷酸互補的情況下，TSG引物的單一匹配-決定核苷酸不能形成鹼基對。在本發明中，在TSG引物的3』 -末端不形成鹼基-對的情況下，由於TSG引物3』_末端的單一匹配-決定核苷酸包含對3』一 5』核酸酶活性具有耐性的主鏈(backbone)，因而不發生切割反應，由此也不會發生延長反應。TSG引物的延長，與沒有延長的TSG引物的情況相比能夠提供與靶序列的更高穩定性的雜交。因此，通過調節溫度，分析信號變化可以檢測延長產物(即，靶序列)的存在。優選地，本發明對於檢測核苷酸變異非常有用。更為優選地，在本發明中被檢測的核苷酸變異為鹼基置換，更優選為單核苷酸多態性(SNP, single nucleotidepolymorphism)及點突變。根據本發明的優選實例，可將核苷酸變異置於TSG引物3』 -末端的單一匹配-決定核苷酸的對面。對3』一 5』核酸酶活性具有耐性的主鏈(backbone)均包含本發明所屬技術領域公知的任何主鏈。例如，上述核苷酸包含多種硫代磷酸酯鍵合(linkage)、磷酸酯鍵合、磷醯胺酯鍵合及2』-碳水化合物改性。根據本發明的優選實例，包含對3』一 5』核酸酶具有耐性的主鏈的核苷酸包含硫代磷酸酯合(phosphorothioate inkage)、燒基磷酸三酯鍵合(alkylphosphotriester linkage)、芳基憐酸三酉旨鍵合(aryl phosphotriester linkage)、燒基憐酸酯鍵合(alkyl phosphonate linkage)、芳基憐酸酯鍵合(aryl phosphonatelinkage)、氫磷酸酯鍵合(hydrogen phosphonate linkage)、燒基磷醯胺酯鍵合(alkylphosphoroamidate linkage)、芳基憐酉先胺酉旨鍵合(aryl phosphoroamidate linkage)、憐硒酸酯鍵合(phosphoroselenate linkage)、2』 _0_ 氨丙基改性(2，-O-aminopropylmodification)、〗』 -O-燒基改性(2，-0-alkyl modification)、〗』 -O-烯丙基改性(2，-0-allyl modification)、〗，-O-丁基改性(2，-0-butyl modification)、α -異頭寡核苷酸(α -anomeric oligodeoxynucleotide)及 I- (4，-硫代-β -D-呋喃核糖基)改性(I- (4，-thio-β-D-ribofuranosyl) modification)。根據本發明的優選實例，具有3』 一5』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶為熱穩定性DNA聚合酶,這能夠從多種細菌種得到，包含Thermococcus litoralis、Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoganeapolitana、 Thermosipho africanus、 Pyrococcus furiosus(Pfu)、 Pyrococcuswoesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictium occultum、Aquifexpyrophilus以及Aquifex aeolieus的DNA聚合酶。最為優選地,具有3』一 5』核酸酶活性·的模板-依賴性核酸聚合酶為Pfu DNA聚合酶。根據本發明的優選實例，本發明為了擴增用於表示靶核酸序列存在的信號，在反覆循環之間包括變性過程，還包括至少反覆進行兩次上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)_步驟(C)的步驟。反覆循環次數沒有特別限制，典型為至少2次，優選為至少5次，進而優選為至少10次。變性使通過步驟(b)中形成的雙鏈二聚物變成單鏈核酸。關於變性的方法包括加熱、鹼、甲醯胺、尿素及乙醇酸處理、酶方法(例如，解旋酶反應)及結合蛋白質，但並不局限於此。例如，變性可以通過以80°C至105°C範圍的溫度進行加熱而達成。用於達成這種處理的一般的方法提供在 Joseph Sambrook,等,Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)。最終，檢測出表示靶核酸序列存在的信號。信號檢測可在反覆的各循環中(即，實時方式)、在反覆的終點(即，終-點方式)或者在反覆過程期間的各個預定時間間隔實施。優選地，信號檢測在反覆的各循環中實施，這能夠提高檢測的準確度。對各標記的信號可通過以往方法進行檢測或測定。例如螢光信號可通過以往方法，例如利用螢光強度測定儀進行檢測或測定。本發明的優點在信號檢測步驟中也表現得明確。在如高溫(例如，50°C -85°C )等高度嚴格條件(high stringent conditions)下實施信號檢測的情況下,可完全去除與非-革巴核酸序列非特異性地雜交而產生的假陽性信號。根據本發明的優選實例，在由報導分子及猝滅分子組成的標記系統中通過對報導分子的信號的變化進行測定或分析來實施信號檢測。根據本發明的優選實例，在猝滅分子為螢光的情況下，通過測定猝滅分子的信號變化或者猝滅分子及報導分子全部的信號變化來實施信號檢測。根據本發明的優選實例，猝滅分子為螢光，所檢測出的表示靶核酸序列存在的信號為從螢光猝滅分子發出的信號。本發明的突出的特點之一為，在液相以及固相都能成功地取得信號。本發明的方法大體上可以在兩種相，即液相以及固相中實施。I.在液相中的靶檢測I.利用TSG引物及核酸聚合酶的靶檢測根據第一方案，利用TSG引物及模板-依賴性核酸聚合酶檢測靶核酸序列(參照圖Ia及圖lb)。第一方案包括如下步驟步驟(a)，使上述靶核酸序列與上述TSG引物進行雜交，上述TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii )報導分子及猝滅分子；在上述TSG弓丨物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互 相鄰近，上述猝滅分子猝滅(quenching)從上述報導分子發出的信號；在上述TSG引物與靶 核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅(unquenching)從上述報導分子發出的信號，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信號；步驟(b)，在引物延長條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述TSG引物的3』 -末端發生3』 -延長反應；以及步驟(C)，對表示上述靶核酸序列存在的信號進行檢測，由此，上述信號表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。根據本發明的優選實例，步驟(C)的信號檢測以實時方式、終-點方式或者預定時間間隔方式來實施。2.利用TSG引物以及具有5』一 3』核酸酶活性的核酸聚合酶的靶檢測根據第二方案，利用TSG引物以及具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶檢測靶核酸序列。優選地，第二方案包括如下步驟步驟(a)，使上述靶核酸序列與上述TSG引物進行雜交，上述TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii )報導分子及猝滅分子；在上述TSG弓丨物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅(quenching)從上述報導分子發出的信號；在上述TSG引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅(unquenching)從上述報導分子發出的信號，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信號；步驟(b)，在引物延長及切割條件下，將步驟(a)的結果物與具有5』一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述TSG引物的3』 -末端發生3』 -延長反應，在上述TSG引物的5』 -末端發生5』 -切割反應，由此上述報導分子或上述猝滅分子從上述TSG引物被放出，並產生用於表不祀核酸序列存在的信號；以及步驟(C)，對表示上述靶核酸序列存在的信號進行檢測，由此，上述信號表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。根據本發明的優選實例，本發明在反覆循環之間包括變性過程，還包括至少反覆進行兩次上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)_步驟(C)的步驟，以便擴增用於表示靶核酸序列存在的信號。
根據本發明的優選實例，步驟(C)的信號檢測以實時方式、終-點方式或者預定時間間隔方式來實施。3.利用TSG引物、配對引物以及核酸聚合酶的靶檢測本發明的第三方案利用(i )模板-依賴性核酸聚合酶以及(i i )由能夠擴增靶核酸序列的TSG弓丨物及該TSG弓丨物的配對引物(counterpart primer )組成的一對弓I物來檢測革巴核酸序列，該方案在擴增用於表示這種靶核酸序列存在的信號的同時還擴增靶(參照圖2a及圖2b)。配對引物可以是TSG引物也可以不是。優選地，該第三方案通過利用TSG引物(Target Signal Generating Primer)的 擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列，該方案包括如下步驟步驟(a)，使包含作為能夠對上述靶核酸序列進行擴增的正向引物以及反向引物的兩個引物的一對引物與上述靶核酸序列進行雜交；在上述兩個引物中至少一個是TSG引物；上述TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)報導分子及猝滅分子；在上述TSG引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅從上述報導分子發出的信號；在上述TSG引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅從上述報導分子發出的信號，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信號；步驟(b)，在引物延長條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述兩個引物的3』 -末端發生3』 -延長反應；步驟(C)，使步驟(b)的結果物發生變性；步驟(d)，至少反覆兩次上述步驟(a)-步驟(c)，對上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的信號均進行擴增；以及步驟(e)，用於檢測表示上述靶核酸序列存在的信號；上述信號檢測在步驟(d)的上述反覆的各循環中、在步驟(d)的上述反覆的終點或者上述反覆期間的各個預定時間間隔內實施，這些信號表不祀核酸序列的存在。4.利用TSG引物、配對引物以及具有5』一 3』核酸酶活性的核酸聚合酶的靶檢測本發明的第四方案利用(i)具有5』一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶以及(ii )由能夠擴增祀核酸序列的TSG弓丨物及該TSG弓丨物的配對引物(counterpart primer)組成的一對引物來檢測靶核酸序列，該方案在擴增用於表示這種靶核酸序列存在的信號的同時還擴增靶(參照圖3a以及圖3b)。優選地，第四方案包括如下步驟步驟(a)，使包含作為能夠對上述靶核酸序列進行擴增的正向引物以及反向引物的兩個引物的一對引物與上述靶核酸序列進行雜交；在上述兩個引物中至少一個是TSG引物；上述TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)報導分子及猝滅分子；在上述TSG引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅從上述報導分子發出的信號；在上述TSG引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅從上述報導分子發出的信號，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信號；步驟(b)，在引物延長及切割的條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述TSG引物的3 』 -末端發生3 』 -延長反應，在上述TSG引物的5 』 -末端部位發生5』-切割反應，由此上述報導分子或上述猝滅分子從上述TSG引物被放出，並產生用於表不IE核酸序列存在的信號；步驟(C)，使步驟(b)的結果物發生變性；步驟(d)，至少反覆兩次上述步驟(a)-步驟(c)，對上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的信號均進行擴增；以及步驟(e)，用於檢測表示上述靶核酸序列存在的信號；上述信號檢測在步驟(d)的上述反覆的各循環中、在步驟(d)的上述反覆的終點或者上述反覆期間的各個預定時間間隔內實施，這些信號表不祀核酸序列的存在。 [II.固相中的靶檢測本發明的突出的優點是即使在像微陳列的固相中也能夠非常有效地檢測靶核酸序列。根據本發明的優選實例，本發明在固相中實施，TSG引物通過其5 』 -末端在固相基質的表面實現固定化。I.利用TSG引物以及核酸聚合酶的晶片上(On-Chip)靶檢測根據第一固相方案，在固相中利用TSG引物以及模板-依賴性聚合酶來檢測靶核酸序列(參照圖4a及圖4b)。優選地，第一方案包括如下步驟步驟(a)，使上述靶核酸序列與上述TSG引物進行雜交，上述TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)報導分子及猝滅分子；上述TSG引物通過其5』 -末端在固相基質的表面實現固定化；在上述TSG引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子粹滅(quenching)從上述報導分子發出的信號；在上述TSG引物與祀核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅(unquenching)從上述報導分子發出的信號，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信號;步驟(b)，在引物延長條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述TSG引物的3』 -末端發生3』 -延長反應；以及步驟(C)，在上述固相中對表示上述靶核酸序列存在的信號進行檢測，由此，上述信號表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。2.利用TSG引物、配對引物以及核酸聚合酶的晶片上(On-Chip)靶檢測本發明的第二固相方案利用(i)模板-依賴性核酸聚合酶以及(ii)由能夠擴增靶核酸序列的TSG引物及該TSG引物的配對引物(counterpart primer)組成的一對引物來檢測靶核酸序列，該方案在擴增用於表示這種靶核酸序列存在的信號的同時還擴增靶。S卩，第二固相方案能夠實現晶片上實時PCR技術。優選地，第二固相方案包括如下步驟
步驟(a)，使包含作為能夠對上述靶核酸序列進行擴增的正向引物以及反向引物的兩個引物的一對引物與上述靶核酸序列進行雜交；在上述兩個引物中至少一個是TSG引物；上述TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)報導分子及猝滅分子；上述兩個引物中的至少一個通過其5』 -末端在固相基質的表面實現固定化，實現固定化的上述引物為TSG引物；在上述TSG引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅(quenching)從上述報導分子發出的信號；在上述TSG引物與祀核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅(unquenching)從上述報導分子發出的信號，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信號;步驟(b)，在引物延長條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述兩個引物的3』 -末端發生3』 -延長反應；步驟(C)，使步驟(b)的結果物發生變性； 步驟(d)，至少反覆兩次上述步驟(a)_步驟(C)，對上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的信號均進行擴增；以及步驟(e)，用於檢測表示靶核酸序列存在的信號；上述信號檢測在步驟(d)的上述反覆的各循環中、在步驟(d)的上述反覆的終點或者上述反覆期間的各個預定時間間隔內實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。根據本發明的優選實例，上述TSG引物通過其5』 -末端在固相基質的表面實現固定化，另一個引物則未被固定化，也不是TSG引物。根據本發明的優選實例，TSG引物及配對引物具有以下通式I的雙重引發寡核苷酸(DPO)結構5，-Xp-YfZr-3，(I)上述通式中，Xp為具有與靶核酸互補的雜交核苷酸序列的5』 -第一次引發部位(5，-first priming portion) ;Yq為包含三個以上的通用鹼基的分離部位(separationportion) ;Z,為具有與靶核酸互補的雜交核苷酸序列的3』 -第二次引發部位(3』 -secondpriming portion) ;p、q以及r表示核苷酸的數量,X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5』-第一次引發部位的Tm高於3』-第二次引發部位的Tm，上述分離部位在上述三個區域中具有最低的Tm ;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5』 -第一次引發部位從上述3』 -第二次引發部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性藉助上述5』 -第一次引發部位以及上述3』 -第二次引發部位來雙重性地決定，其結果，使上述引物的整體退火特異性得到提高。雙重引發寡核苷酸(DPO)結構為雙重特異性寡核苷酸(DS0, dual specificityoligonucleotide)的引物形態，首次由本發明者所提出(W0 2006/095981 ;Chun等,Dualpriming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratoryviruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research，35 :6e40(2007))o雙重引發寡核苷酸(DPO)體現雜交或退火藉助分離區域相互分離的5』 _高Tm特異性部位(或者5』 -第一次引發部位)及3』 -低Tm特異性部位(或者3』 -第二次引發部位)雙重性地決定的新穎的概念，表示出非常驚人的雜交特異性(參照WO 2006/095981 ；Kim 等，Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants bymultiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of VirologicalMethods,149 :76-84 (2008) ；Kim 等，Rapid detection and identification of 12respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplexPCR assay, Journal of Virological Methods, doi 10.1016/j.jviromet. 2008. 11. 007(2008);Horii 等，Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplexsexualIy transmitted pathogens in clinical specimens,Letters in AppliedMicrobiology, doi :10. 111/j. 1472-765X2009. 02618x (2009))。如上所述，雙重引發寡核苷酸(DPO)最終獲得具有相互不同的雜交特性的兩個引物片段，其為如下造成初期的穩定的雜交的5』 -第一次引發部位及決定靶特異性的3』 -第二次引發部位。在利用具有本發明的上述DPO結構的引物進行擴增(尤其，進行多重擴增)的情況下，可無假陽性或者假陰性結果地成功獲得擴增子。根據本發明的優選實例，位於分離部位的通用鹼基選自包含脫氧肌苷 (deoxyinosine)、肌苷(inosine)、7_ 去氮-2，-脫氧肌苷(7-deaza_2，-deoxyinosine)、2-氮雜-2』 -脫氧肌苷(2_aza_2』 -deoxyinosine)Λ2^ -甲氧基肌苷(2』 -OMe inosine)、2』 -F 肌苷(2』 -F inosine)、脫氧 3-硝基卩比咯(deoxy 3-nitropyrrole)、3-硝基 P比咯(3-nitropyrrole)、2，-甲氧基 3_ 硝基卩比咯(2，-0Me3-nitropyrrole)、2，_F3_ 硝基吡咯(2』 -F 3-nitropyrrole)U- (2』 -脫氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(I- (2，-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)、脫氧 5_ 硝基批咯(deoxy5_nitroindole)、5-硝基口引哚(5_nitroindole)、2』 -甲氧基 5-硝基口引哚(2，-OMe5_nitroindole)、2』 -F5-硝基口引哚(2，-F 5_nitroindole)、脫氧 4-硝基苯並咪唑(deoxy4-nitrobenzimidazole)λ4-硝基苯並咪唑(4_nitrobenzimidazole)、脫氧 4_ 氨基苯並咪唑(deoxy 4-aminobenzimidazole)、4_ 氨基苯並咪唑(4_aminobenzimidazole)、脫氧水粉蕈素(deoxy nebularine)、2』 -F 水粉蕈素(2』 -F nebularine)、2』 -F 4_ 硝基苯並咪唑(2』 -F4_nitrobenzimidazole)、妝核酸 _5_ 硝基卩引哚(PNA-5-nitroindole)、妝核酸-水粉蕈素(PNA-nebularine)、肽核酸-肌苷(PNA-inosine)、肽核酸_4_硝基苯並咪唑(PNA-4-nitrobenzimidazole)、妝核酸 _3_ 硝基卩比咯(PNA-3-nitropyrrole)、嗎啉基 _5硝基卩引哚(morpholino-5-nitroindole)、嗎啉基 _ 水粉蕈素(morpholino-nebularine)、嗎啉基-肌苷(morpholino-inosine)、嗎啉基-4-硝基苯並咪唑(morpholino-4-nitrobenzimidazole)λ 嗎啉基-3-硝基卩比咯(morpholino-3-nitropyrrole)、氨基磷酸酯_5_硝基卩引哚(phosphoramidate-5-nitroindole)、氨基磷酸酯-水粉蕈素(phosphoramidate-nebularine)、氨基憐酸酉旨-肌苷(phosphoramidate-inosine)、氨基憐酸酯_4_硝基苯並咪唑(phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole)、氨基憐酸酯_3_硝基批咯(phosphoramidate-3-nitropyrrole)、2』 -O-甲氧基乙基肌苷(2』 -0-methoxyethylinosine)、2，-O-甲氧基乙基水粉蕈素(2』 0-methoxyethyl nebularine)、2』 -O-甲氧基乙基5_硝基卩引哚(2』 -0-methoxyethyl 5_nitroindole)、2』 -O-甲氧基乙基4_硝基-苯並咪唑(2』 -0-methoxyethyl 4-nitro_benzimidazole)、2』 -O-甲氧基乙基 3_ 硝基卩比咯(2』 -0-methoxyethyl 3-nitropyrrole)及上述鹼基的組合的群。更優選地，位於分離部位的通用鹼基為脫氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、I- (2』 -脫氧-β -D-呋喃核糖)-3-硝基卩比咯(I- (2，-deoxybeta-D-ribofuranosyl) -3-nitropyrroIe)或者 5-硝基口引哚(5_ni troindole),最優選為脫氧肌苷(deoxy inosine)。優選地，上述分離部位包含具有至少三個通用鹼基的連續的核苷酸，更優選為至少四個通用鹼基，最優選為至少五個通用鹼基。優選地，雙重引發寡核苷酸(DPO)的結構的5』 -第一次引發部位的長度比3』 -第二次引發部位的長度更長。上述5』-第一次引發部位優選地具有15-60核苷酸的長度，更優選地具有15-40核苷酸的長度，進而優選地具有15-25核苷酸的長度。優選地，上述3』-第二次引發部位具有3-15核苷酸的長度，更優選地具有5-15核苷酸的長度，進而優選地具有6-13核苷酸的長度。優選地，上述分離部位具有3-10核苷酸的長度，更優選地具有4-8核苷酸的長度，最優選地具有5-7核苷酸的長度。根據本發明的優選實例，上述5』-第一次引發部位具有40°C -80°C的Tm，更優選地具有45°C _65°C的Tm。上述3』 -第二次引發部位優選地具有10°C -40°C的Tm。上述分離部位優選地具有3°C -15°C的Tm。 根據本發明的優選實例，上述3』 -第一次引發部位具有4(TC-80t^^Tm，更優選地具有45°C -65°C的Tm。上述5』 -第二次引發部位優選地具有10°C _40°C的Tm。上述分離部位優選地具有3°C -15°C的Tm。根據本發明的優選實例，在本發明的上述擴增中所利用的兩個引物都具有雙重引發寡核苷酸(DPO)結構。利用引物檢測靶核酸序列的以往技術，因所使用的引物以及探針的內在的局限性，並不能完全去除錯誤信號。但是包含這種刻意設計的雙重引發核苷酸(DPO)結構的引物，以戲劇性地提高的特異度與靶核酸序列雜交，以便無錯誤信號地檢測出靶核酸序列。在本發明中涉及引物而使用的術語「常規的」意味著不具有雙重引發核苷酸(DPO)結構的所有引物。這些在本說明書中被解釋為常規弓I物。根據本發明的優選實例，上述報導分子及上述猝滅分子中的一個位於上述5』 -第一次引發部位，另一個位於上述5』 -第一次引發部位、上述3』 -第二次引發部位或者上述分離部位。本發明對要檢測和/或擴增的靶核酸序列不需要任何特定序列或者長度。將mRNA利用為初期物質時，在實施退火步驟之前需要進行反轉錄步驟，對此的詳細內容公開在 Joseph Sambrook,等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001);及 Noonan, K. F.等，Nucleic Acids Res. 16 :10366 (1988)。為了反轉錄反應，可利用與隨機六聚體或者mRNA雜交的寡核苷酸dT引物。寡核苷酸dT引物由dTMPs構成，且在dT弓丨物可以起到引物作用的範圍內其dTMPs的一個或者其以上可由其他脫氧單磷酸核苷(dNMP)來代替。反轉錄可以由具有核糖核酸酶(RNase H Ribonuclease H)活性的反轉錄酶來實施。利用具有核糖核酸酶(RNaseH Ribonuclease H)活性的酶時,慎重地選擇反應條件,從而可以省略額外的核糖核酸酶(RNase H Ribonuclease H)切割過程。尤其，在本發明中可檢測及/或擴增的靶核酸序列還都包含任何自然(naturallyoccurring)原核細胞核酸、真核細胞(例如，原生動物和寄生動物、菌類、酵母、高等植物、低等動物及包含哺乳動物和人類的高等動物)核酸、病毒(例如，皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS)、流感病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒以及脊髓灰質炎病毒等)核酸或者類病毒核酸。能夠同時檢測(多重檢測)出至少兩個靶核酸序列，從這一點上更能顯示出本發明的優點。根據本發明的優選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優選為至少三種，進而優選為至少五種)，TSG引物包含至少兩種引物(更優選為至少三種，進而優選為至少五種)。根據本發明的優選實例，與TSG引物成對且能夠擴增靶核酸序列的配對引物包含至少兩種引物(更優選為三種，進而優選為5種)。例如，在利用包含五種TSG引物(是包含具有各個不同發光波長的螢光報導分子的TSG引物)、五種配對引物以及核酸試樣的反應容器實施本發明的情況下，產生相當於五種不同的靶核酸序列的五種不同的螢光信號，以實時方式同時檢測五種不同的靶核酸序列。在此情況下，可將所使用的猝滅分子選擇為均具有各自互相不同的特性。選擇性地，可 將所使用的猝滅分子選擇為全部或一部分具有相同的特性。並且，本發明對核苷酸變異的檢測而言非常有用。在本發明中使用的術語「核苷酸變異」意味著在連續的DNA片段或者序列類似的DNA片段中存在於特定位點的DNA序列的核苷酸的多樣性。這種連續的DNA片段包含一個基因或者一個染色體的任意其他部位。例如，可以通過本發明的方法而檢測的核苷酸變異包括單核苷酸多態性(SNP，single nucleotide polymorphism)、缺失、插入、置換及易位。核苷酸變異的例子包括人類基因組的多種變異(例如，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR, methyIenetetrahydrofolatereductase)基因的變異)、藥物耐性病原體的核苷酸變異及癌產生_相關核苷酸的變異。根據本發明的優選實例，在本發明中所使用的靶核酸序列為預-擴增的(pre-ampIified)核酸序列。利用預_擴增的核酸序列能夠使得本發明的祀檢測的靈敏度以及特異性大大增加。對少量的靶核酸序列以適當的水準進行預-擴增，接著根據本發明來進行檢測，就會提高本發明的靶檢測的靈敏度以及特異性。有趣的是，在利用與位於在預-擴增中利用的引物的下遊的序列雜交的TSG引物的情況下，上述TSG引物將起到套式弓I物的作用來增加本發明的靶檢測的特異性。根據本發明的優選實例，在為了利用擴增反應來檢測靶核酸序列而在本發明中利用預-擴增的核酸序列的情況下，本發明中所使用的引物對為用於套式擴增的引物對。根據本發明的另一實施方式，本發明提供利用TSG引物(Target SignalGenerating Primer)從DNA或者核酸混合物中檢測祀核酸序列的試劑盒,包括(a) TSG引物；上述TSG引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)報導分子及猝滅分子；在上述TSG引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅從上述報導分子發出的信號；在上述TSG引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述TSG引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅(unquenching)從上述報導分子發出的信號，由此可以得到表示上述靶核酸序列存在的信號；以及(b)模板-依賴性核酸聚合酶；上述模板-依賴性核酸聚合酶作用於上述TSG引物和上述靶核酸序列間的雜交結果物，由此能夠在上述TSG引物的3』 -末端引起3』 -延長反應。本發明的試劑盒是為了能夠實施上述的本發明的檢測方法而構成的，為了避免本說明書的過度複雜性，故省略共同的內容。本發明的試劑盒可選擇性地包含在靶擴增聚合酶鏈式反應(PCR)(例如，聚合酶鏈式反應)中所需的如緩衝液、DNA聚合酶輔因子及脫氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等試劑。選擇性地，本發明的試劑盒還可包含多種多聚核苷酸分子、反轉錄酶、多種緩衝液、試劑以及抑制DNA聚合酶活性的抗體。並且，試劑盒可包含實施陽性對照組及陰性對照組反應時所需的試劑。熟知本說明書的公開事項的本技術領域的普通技術人員能夠容易地決定在任意一個特定反應中使用的試劑的最適量。典型的是，本發明的試劑盒由包含在前面揭示的組成成分的額外的包 裝體或者組分(compartment)所製備。對本發明的特徵及優點如下進行概括(a)本發明對用於檢測靶核酸序列的新穎的實時PCR方法接近研究。TSG引物可以產生用於表示從雙重相互作用性標記系統發出的靶核酸序列存在的信號，在PCR反應期間，可藉助其3』-延長反應來擴增靶核酸序列。因此，本發明可以提供以實時方式擴增靶的同時能夠檢測靶核酸序列的新穎的方法。(b) TSG引物的延長反應能夠使得延長產物內包含(incorporated)雙重標記TSG引物，由此與擴增產物的量成正比例地產生信號的強度。應用於本發明的這種耦合現象可實現更加準確的靶核酸序列的定量分析。(C)與標記探針不同，TSG引物自身在無任何引物延長反應地與非-靶核酸序列非-特異性地雜交的情況下，通過在高溫等高度嚴格條件(high stringent conditions)下實施信號檢測，由此有可能不產生假陽性信號。(d)本發明的信號產生可在沒有藉助核酸酶活性的切割反應的情況下，僅依靠與靶核酸序列的雜交來達成。在這種情況下，本發明並不是必須需要具有5』 一 3』核酸酶活性或者3』 一5』核酸酶活性的核酸聚合酶，因此為了多種應用可利用多種核酸聚合酶。(e)在利用具有5』 一 3』核酸酶活性的核酸聚合酶的情況下，本發明能夠從與靶核酸序列雜交的TSG引物的5』 -切割反應得到信號，這將提高靶檢測效率。(f)以往的實時PCR方法需要如標記探針或者髮夾結構一樣複雜地變形的引物結構，這導致難以實現探針及引物的設計、合成或者序列選擇。但是，就本發明的TSG引物而言，沒有追加的標記探針或者複雜地變形的引物結構地，不僅利用於靶擴增，而且還可利用於信號擴增，並且相對簡單而容易地實現用於實時PCR的引物的設計、合成及序列選擇。因此，本發明提供與以往實時PCR技術相比能夠以更加便利的方式實施的新穎的實時PCR方法。(g)就以往基於探針的實時PCR方法而言，由於使不僅對引物還對探針的雜交條件最優化是必不可少的過程，因而難以實現以往基於探針的實時PCR方法的最優化。利用具有形成髮夾環的尾部的引物的以往的實時PCR方法，考慮到在引物中的髮夾環形成及變形，應實現反應條件的最優化。相反，由於本發明無任何結構性變形地僅考慮對引物的最優化，因此可以完全擺脫關於以往的實時PCR方法的最優化的頑固性問題及缺點。(h)就以往的實時PCR方法而言，由於難以實現引物或者探針設計及最優化，因此不適於多重試驗。相反，本發明在實時PCR中沒有追加的探針或者複雜地變形的引物結構地，僅利用標記的引物，因此，能夠以多重方式，卓越地實時進行靶檢測。(i)與以往的實時PCR探針相比較，在進行過程中TSG引物被延長，延長的TSG引物對靶核酸序列呈現更加高的結合力。以往的實時PCR引物需要如髮夾結構一樣複雜地變形的結構，這妨礙與靶核酸序列的結合。相反，TSG引物不需要那種變形，因而具有TSG引物與靶核酸序列的更好的結合效率。這一特徵得以提高基於本發明的方法的靶檢測效率。(j)本發明的方法，將設計成利用於常規PCR反應的引物實現標記化，並將該標記引物作為TSG引物用於實時PCR反應，由此能夠容易地實施實時PCR反應。簡言之，用合適的標記容易地對在以往PCR反應中生成擴增子的引物進行標記後，根據本發明利用於基於 實時PCR反應的靶核酸序列的檢測。因此，本發明的方法在實時PCR試驗的開發中，具有時間有效性及費用有效性。(k)如上所述，具有在本發明中使用的DPO結構的引物提高了結合特異性，由此去除在實時PCR反應中關於引物的非-靶結合的假陽性信號。下面，將通過實施例對本發明進行更詳細的說明。這些實施例僅用於更加具體說明本發明，根據本發明的宗旨，本發明的範圍不局限於這些實施例，這對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
實施例實施例I:對在靶核酸序列的檢測中利用不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶的靶信號產生(TSG)引物的評價在利用不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的情況下，對本發明的TSG引物僅依靠TSG引物的靶雜交及延長，能否產生充分檢測靶核酸序列的信號的情況進行了評價。為了對此評價進行實驗，本發明者將肺炎鏈球菌(Streptococcus. Pneumoniae)基因或者金黃色葡萄球菌(Staphylococcus, aureus)基因用作祀模板。為了確保實驗的簡便，將對於肺炎鏈球菌(Streptococcus. Pneumoniae)基因或者金黃色葡萄球菌(Staphylococcus, aureus)基因的合成寡核苷酸用作模板。將不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的斯託菲爾片段(Stoffel fragment)用作DNA聚合酶。將報導分子及粹滅分子之間隔開的程度不同的兩個TSG引物對各個靶分別進行了實驗。將6-羧基螢光素(6-FAM，6-carboxyfluorescein)用作突光報導分子，並置於TSG引物的5』 -末端。將黑洞粹滅劑(BHQ-1, Black Hole Quencher I)用作猝滅分子。沒有反覆進行變性、雜交及引物延長地實施了核酸合成反應。在預定時間間隔(predetermined time interval)內測定了信號。A.用於檢測肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)基因的核酸合成反應將肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)基因的祀核酸序列作為模板利用時,在本實施例中利用的合成模板及TSG引物的序列如下SP_T1055，-TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTTCGCGAAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAGTTTGAAGGACAAACC-3』 (SEQ ID NO :1)SP_TSG(9)5』-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ-l)]GTGGATTTGGGTGT-3』(SEQ ID NO :2)SP_TSG (21) 5』-[6-FAM] TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG [T(BHQ-I) ]GT-3』 (SEQ ID NO:3)(括號內的數字9或者21意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核苷酸數量。)以含有模板(SEQ ID NO :l)2pmole、10X斯託菲爾緩衝液(Stoffel buffer)含有IOOmM 三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl )(ρΗ8· 3)及 IOOmM 氯化鉀(KCl)2 μ l、AmpHTaq DNA聚合酶、斯託菲爾片段(美國應用生物系統公司，美國Applied BioSystems, US) I單元、4 種 dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200 μ M、5mM 氯化鎂(MgCl2)及 TSG 引物(SEQID NO 2或者3)5pmole的20 μ I的最終體積實施了利用TSG引物的核酸合成反應；將含有上述反應混合物的管位於實時熱循環儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);在951下對上述反應混合物進行2分鐘變性後，在50°C下進行40分鐘的培養(incubation)。以I分鐘為間隔檢測所產生的信號。如圖5所示，兩個TGS引物分別在有模板的情況下(No. I及No. 3)比在沒有模板的情況(No. 2及No. 4)表現出更高的螢光強度。因此，可以得知，TSG引物在核酸合成反應期間通過TSG引物的雜交及延長能夠對檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)基因提供充 分的信號。對模板的有無而言，值得關注的是比起在從猝滅分子隔開9核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :2)，在從猝滅分子隔開21核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :3)呈現出更明顯的信號強度的差異(B卩，螢光強度(RFU)值的差異)。B.用於檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因的核酸合成反應將金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因的靶核酸序列作為模板利用時，在本實施例中利用的合成模板及TSG引物的序列如下SA_T2005，-GCCAATAAAACTAGGAGGAAATTTAAATGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATCATTTAGCGACTTTAAAGGTCATTGGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTATCGCTATCAACACAGACGGTCAAGCTTTAAACTTATCTAMGCTGAATCTAAA-3』(SEQ ID NO
4)SA_TSG(6) 5』-[6-FAM]CATTCCG[T(BHQ-I) ]GGTCAATCATTCGGTT-3』 (SEQ ID NO :5)SA_TSG(21)5，-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ-1) ]T-3，(SEQ ID NO :6)(括號內的數字6或者21意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核苷酸數量。)除了模板金黃色葡萄球菌(S. aureus O. 2pmole)及TSG引物(SEQ ID NO :5或者6)以外,通過在檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)時所利用的相同的方案實施了核酸合成反應。如圖6所示，兩個TGS引物分別在有模板的情況下(No. I及No. 3)比在沒有模板的情況(No. 2及No. 4)表現出更高的螢光強度。因此，可以得知，TSG引物在核酸合成反應期間通過TSG引物的雜交及延長，能夠對檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因提供充分的信號。對模板的有無而言，值得關注的是比起在從猝滅分子隔開6核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :5)，在從猝滅分子隔開21核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :6)呈現出更明顯的信號強度的差異(B卩，螢光強度(RFU)值的差異)。實施例2:對在用於靶核酸的檢測的實時聚合酶鏈式反應(PCR)條件下，利用不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶的TSG引物的評價
對在實時聚合酶鏈式反應(PCR)期間利用不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的情況下，本發明的TSG引物能否產生充分檢測靶核酸序列的信號的情況進行了實驗。為了對該評價進行實驗，利用包含TSG引物的引物對，分別實施了用於檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)>淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)及腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)基因的實時聚合酶鏈式反應(PCR)0將不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的斯託菲爾片段(Stoffel fragment)用作DNA聚合酶。將報導分子及猝滅分子間隔開的程度不同的兩個TSG引物對各個靶基因分別進行了實驗。A.用於檢測肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)基因的實時聚合酶鏈式反應(PCR)將肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)基因的祀核酸序列作為模板利用時,在本實施例中利用的正向引物及TSG引物(反向引物)的序列如下 SP_F15』-GGTTTCCGTACAGCCTTGAIIIIIGTTATCAATG-3』 (SEQ ID NO :7)SP_TSG(9)5』-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ-l)]GTGGATTTGGGTGT-3』(SEQ ID NO :2)SP_TSG (21) 5』-[6-FAM] TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG [T(BHQ-I) ]GT-3』 (SEQ ID NO:
3)(I表示脫氧肌苷，括號內的數字9或者21意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核苷酸數量。)以含有肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)基因組DNAlOng、10X斯託菲爾緩衝液(Stoffel buffer)含有IOOmM三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.3)及IOOmM氯化鉀(KCi)2μ l.AmpliTaq dna聚合酶、斯託菲爾片段(美國應用生物系統公司，美國Applied BioSystems, USA) I 單元、4 種 dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200 μ M、5mM氯化鎂(MgCl2)、正向引物(SEQ ID NO :7) 5pmole及作為反向引物的TSG弓丨物(SEQ ID NO:2或3) 5pmole的20 μ I的最終體積，實施了用於檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)的實時聚合酶鏈式反應(PCR);將含有上述反應混合物的管位於實時熱循環儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);在95°C下對上述反應混合物進行2分鐘變性後，在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的過程實施了 30次。由此檢測了在各循環的退火步驟(55°C)中產生的信號。如圖7所示，在利用TSG引物及不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶的實時聚合酶鏈式反應(PCR)中，在有肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)模板的情況下觀察到了對肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)的螢光信號(No. I及No. 3)，相反在沒有靶模板的陰性對照組中則沒有出現螢光信號(No. 2及No. 4)。比起在從猝滅分子隔開9核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO 2),在從猝滅分子隔開21核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :3)呈現出了更低的Ct值和更高的螢光強度(RFU)值。B.用於檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因的實時聚合酶鏈式反應(PCR)將金黃色葡萄球菌(S. aureus)的靶核酸序列作為模板利用時，在本實施例中利用的正向引物及TSG引物(反向引物)的序列如下SA_F15，-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAI111ITAGCGACTTT-3J (SEQ ID NO 8)
SA_TSG(6) 5』-[6-FAM]CATTCCG[T(BHQ-I) ]GGTCAATCATTCGGTT-3』 (SEQ ID NO :5)SA_TSG(21)5，-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ-1) ]T-3，(SEQ ID NO :6)(I表示脫氧肌苷，括號內的數字6或者21意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核苷酸數量。)除了模板(S. aureus)、正向引物(SEQ ID NO :8)及作為反向引物的TSG引物(SEQID NO 5或者6)以外，通過在檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)時所利用的相同的方案實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR)。如圖8所示，在利用TSG引物及不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶的實時聚合酶鏈式反應(PCR)中，在有金黃色葡萄球菌(S. aureus)模板的情況下觀察到了對金黃色葡萄球菌(S. aureus)的螢光信號(No. I及No. 3)，相反在沒有靶模板的陰性對照組中則沒有出現螢光信號(No. 2及No. 4)。 比起在從猝滅分子隔開6核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO 5),在從猝滅分子隔開21核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :6)呈現出了更低的Ct值和更高的螢光強度(RFU)值。C.用於檢測淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)基因的實時聚合酶鏈式反應(PCR)將淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的祀核酸序列作為模板利用時,在本實施例中利用的正向引物及TSG引物(反向引物)的序列如下NG_F15，-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGAT-3，(SEQ ID NO :9)NG_TSG (4) 5，- [6-FAM] CTCAT [T (BHQ-1) ] GGCGTGTTTCGCATATTTAAG-3，(SEQ ID NO 10)NG_TSG(22)5， -[6-FAM]CTCATTGGCGTGTTTCGCATATT[T(BHQ-I)]AAG-3』 (SEQ IDNO 11)(I表示脫氧肌苷，括號內的數字4或者22意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核苷酸數量。)除了模板(N. gonorrhoeae)、正向引物(SEQ ID NO :9)及作為反向引物的TSG引物(SEQ ID NO 10或者11)以外，通過在檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)時所利用的相同的方案實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR)。如圖9所示，在利用TSG引物及不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶的實時聚合酶鏈式反應(PCR)中，在有淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)模板的情況下觀察到了對淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的突光信號(No. I及No. 3),相反在沒有革巴模板的陰性對照組中則沒有出現螢光信號(No. 2及No. 4)。並且，如圖9所示，比起在從猝滅分子隔開4核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :10)，在從猝滅分子隔開22核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ IDN011)呈現出了更低的Ct值和更高的螢光強度(RFU)值。D.用於檢測腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)基因的實時聚合酶鏈式反應(PCR)]將腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的祀核酸序列作為模板利用時,在本實施例中利用的反向引物及TSG引物(正向引物)的序列如下NM_R15，-CCATAACCTTGAGCAATCCAIIIIICCTGACGTTC-3，(SEQ ID NO :12)
NM_TSG(7) 5』-[6-FAM]CTTATCGC[T(BHQ-I) ]TTCTGAAGCCATTG-3』 (SEQ ID NO :13)NM_TSG(20)5，-[6-FAM]CTTATCGCTTTCTGAAGCCAT[T(BHQ-1)]G_3，(SEQ ID NO : 14)(I表示脫氧肌苷，括號內的數字7或者20意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核苷酸數量。)除了模板(N. meningitidis)、反向引物(SEQ ID NO :12)及作為正向引物的TSG弓丨物(SEQ ID NO 13或者14)以外，通過在檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)時所利用的相同的方案實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR)。如圖10所示，在利用TSG引物及不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶的實時聚合酶鏈式反應(PCR)中,在有腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)模板的情況下觀察到了對腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的突光信號(No. I及No. 3),相反在沒有靶模板的陰性對照組中則沒有出現螢光信號(No. 2及No. 4)。 並且，如圖10所示，比起在從猝滅分子隔開7核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :13)，在從猝滅分子隔開20核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQID NO 14)呈現出了更低的Ct值和更高的螢光強度(RFU)值。實施例3:為了檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)，利用TSG引物及不具有5』一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶的實時聚合酶鏈式反應(PCR)的靈敏度通過檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因的靶核酸序列，確認了利用TSG引物及不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶的實時聚合酶鏈式反應(PCR)的靈敏度。為了此實驗，在實時聚合酶鏈式反應(PCR)中作為反向引物利用了 TSG引物(SEQ ID NO :6)。將從IOOpg連續稀釋到IOfg的(分別稀釋為10倍)金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因組DNA用作模板。在本實施例中利用的正向引物及TSG引物(反向引物)的序列如下SA_F15』-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3』 (SEQ ID NO :8)SA_TSG(21)5，-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ-1) ]T-3，(SEQ ID NO :6)(I表示脫氧肌苷，括號內的數字21意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核
苷酸數量。)以含有連續稀釋的金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因組DNA(從IOOpg稀釋到IOfg ；分別稀釋為10倍)、IOX斯託菲爾緩衝液(Stoffel buffer)含有IOOmM三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH 8. 3)及 IOOmM 氯化鉀(KC1)2 μ l、AmpIiTaq DNA 聚合酶、斯託菲爾片段(美國應用生物系統公司，美國Applied BioSystems，USA) I單元、4種dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200 μ M、5mM 氯化鎂(MgCl2)、正向引物(SEQ ID NO :8) 5pmole 及作為反向引物的TSG引物(SEQ ID勵6)5 111016的2(^1的最終體積實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR);將含有上述反應混合物的管位於實時熱循環儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);在95°C下對上述反應混合物進行2分鐘變性後，在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的過程實施了 40次。由此檢測了在各循環的退火步驟(55°C )中產生的信號。如圖11所示，在利用一系列稀釋的金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因組DNA實施實時聚合酶鏈式反應(PCR)的情況下，在稀釋到IOOfg時也檢測出靶核酸序列(No. I-No.4)。實施例4:藉助利用具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的TSG引物5』 -末端部位的5』 -切割反應的信號產生本發明者發現藉助模板-依賴性核酸聚合酶的5』 一 3』核酸酶活性，在與靶核酸序列雜交的標記引物的5』 -末端部位發生5』 -切割反應，上述5』 -切割反應被巧妙地應用到靶核酸序列的檢測來產生對於靶序列的信號(參考PCT/KR2009/007064)。因此，本發明者對藉助具有5』 一3』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶在TSG引物5』 -末端部位發生5』 -切割反應，由此能否產生信號的情況進行了實驗。為了對此評價進行實驗，本發明者為了確保實驗的方便，將肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)作為祀,將對於肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)基因的合成寡核苷酸用作模板。對報導分子及猝滅分子之間隔開的程度不同的兩個TSG引物分別進行了實驗。將6-羧基突光素(6-FAM,6-carboxyfluorescein)用作突光報導分子，並置於TSG引物的5』 -末端。將黑洞猝滅劑(BHQ-l，Black Hole Quencher I)用作猝滅分子。反覆進行變性、雜交及引物延長來實施了核酸合成反應。在各反覆的雜交步驟中測定了信號。將不具有5』一 3』 外切核酸酶活性的斯託菲爾片段(Stoffel fragment)及有5』 一 3』外切核酸酶活性的TaqDNA聚合酶用作DNA聚合酶。在本實施例中利用的合成模板及TSG引物的序列如下SP_T1055，-TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTTCGCGAAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAGTTTGAAGGACAAACC-3』 (SEQ ID NO :1)SP_TSG(9)5，-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ-l)]GTGGATTTGGGTGT-3，(SEQ ID NO :2)SP_TSG (21) 5』-[6-FAM] TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG [T(BHQ-I) ]GT-3』 (SEQ ID NO:3)(括號內的數字9或者21意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核苷酸數量。)A.利用不具有5』一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶，反覆進行變性、雜交及引物延長的核酸合成反應以含有模板(SEQID NO :1) 2pmole、IOX 斯託菲爾緩衝液(Stoffel buffer)含有IOOmM三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH 8. 3)及IOOmM氯化鉀(KCl)2 μ I、AmpliTaq dna聚合酶、斯託菲爾片段(美國應用生物系統公司，美國AppiiedBioSystems, US) I 單元、4 種 dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200μΜ、5πιΜ 氯化鎂(MgCl2)及TSG引物(SEQ ID NO 2或者3) 5pmole的20 μ I的最終體積實施了核酸合成反應；將含有上述反應混合物的管位於實時熱循環儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);在95°〇下對上述反應混合物進行2分鐘變性後，將在94°C下30秒、在50°C下60秒的過程實施了 40次。由此檢測了在各循環的退火步驟(50°C)中產生的信號。正常化(normalization)之後的結果如圖12所示,在將不具有5』 一 3』外切核酸酶活性的斯託菲爾片段(Stoffel fragment)用作DNA聚合酶的情況下，即使有模板也未出現 目號的差異(No. I及No. 5)。這種結果顯示，僅依靠雜交及引物延長產生的信號的強度不隨著反應循環的增加而發生變化，這是因為在核酸反應期間模板未被擴增的原因。因此，在核酸合成反應的循環反覆中可知，僅依靠TSG引物的雜交及引物延長，SP使存在靶核酸序列也不會累積可檢測的信號(No. I及No. 5)。B.利用具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶反覆進行變性、雜交及引物延長的核酸合成反應以含有模板(SEQ ID NO :1) 2pmole、2XDiaStarTaq PCR主混合液(索爾傑恩特公司，韓國(Solgent,Korea))含有 12mM氯化續(MgCl2)、DiaStarTaq PCR緩衝液、DiaStarTaqDNA聚合酶2U及dNTP混合液10 μ I及TSG引物(SEQ ID NO 2或者3) 5pmole的20 μ I的最終體積實施了核酸合成反應；將含有上述反應混合物的管位於實時熱循環儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);在95°C下對上述反應混合物進行15分鐘變性後，將在94°C下30秒、在50°C下60秒的過程實施了 40次。由此檢測了在各循環的退火步驟(50°C)中產生的信號。如圖12所示，在將具有5』 一 3』外切核酸酶活性的Taq DNA聚合酶用作DNA聚合酶的情況下，觀察到了對於肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)的信號的差異(No. 3及No. 7)。這種結果顯示，利用具有5』一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性聚合酶可在TSG引物5』 -末端部位上引起5』 -切割反應。因此，在每個循環中，信號從TSG引物放出的標·記片段產生，並被累積，最終會導致能夠表示靶核酸序列存在的可觀察的信號(No. 3及No.7)。另一方面，比起在從猝滅分子隔開21核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQID :3)，在從猝滅分子隔開9核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID :2)呈現出了更低的Ct值。這種結果顯示，對猝滅程度而言，TSG引物的報導及猝滅之間的距離越短，比起報導及猝滅之間的距離遠時，在5』 -切割反應前後呈現出較大的差異。實施例5:在用於靶核酸檢測的實時聚合酶鏈式反應(PCR)條件下，利用具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶的TSG引物的實驗對利用具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶，本發明的TSG引物在實時聚合酶鏈式反應(PCR)期間，能否產生充分檢測靶核酸序列的信號的情況進行了評價。為了對此評價進行實驗，本發明者除了具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶及反應條件以外，利用了與在實施例2中所利用的相同的模板及引物。A.用於檢測肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)的實時聚合酶鏈式反應(PCR)以含有肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)基因組 DNA 10ng、2X DiaStarTaq PCR 主混合液10μ I(索爾傑恩特公司，韓國(Solgent，Korea))含有12mM氯化鎂(MgCl2)、DiaStarTaqPCR緩衝液、DiaStarTaq DNA聚合酶2U及dNTP混合液、正向引物(SEQ ID NO 7) 5pmole及作為反向引物的TSG引物(SEQ ID勵2或者3)5 111016的2(^1的最終體積實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR);將含有上述反應混合物的管位於實時熱循環儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);在95°C下對上述反應混合物進行15分鐘變性後，將在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的過程實施了 30次。由此檢測了在各循環的退火步驟(55°C)中產生的信號。如圖13所示,在有肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)模板的情況下觀察到了對於肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)的螢光信號(No. I及No. 3)，相反在沒有模板的陰性對照組中則沒有出現螢光信號(No. 2及No. 4)。並且，比起在從猝滅分子隔開9核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ IDNO :2)，在從猝滅分子隔開21核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :3)呈現出了更低的Ct值和更高的螢光強度(RFU)值。B.用於檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)的實時聚合酶鏈式反應(PCR)除了模板(S. aureus)、正向引物(SEQ ID NO :8)及作為反向引物的TSG引物(SEQID NO 5或者6)以外，通過在檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)時所利用的方案實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR)。如圖14所示，在有金黃色葡萄球菌(S. aureus)模板的情況下觀察到了對於金黃色葡萄球菌(S. aureus)的螢光信號(No. I及No. 3)，相反在沒有模板的陰性對照組中則沒有出現螢光信號(No. 2及No. 4)。並且，比起在從猝滅分子隔開6核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :5),在從粹滅分子隔開21核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :6)呈現出了更低的Ct值和更高的螢光強度(RFU)值。C.用於檢測淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的實時聚合酶鏈式反應(PCR)
除了模板淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)、正向引物(SEQ ID NO :9)及作為反向引物的TSG引物(SEQ ID NO 10或者11)以外，通過在檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)時所利用的方案實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR)。如圖15所示,在有淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)模板的情況下觀察到了對於淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)的突光信號(No. I及No. 3),相反在沒有模板的陰性對照組中則沒有出現螢光信號(No. 2及No. 4)。並且，比起在從猝滅分子隔開4核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO: 10)，在從猝滅分子隔開22核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :11)呈現出了更低的Ct值和更高的螢光強度(RFU)值。D.用於檢測腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的實時聚合酶鏈式反應(PCR)除了模板(N. meningitidis)、反向引物(SEQ ID NO :12)及作為正向引物的TSG弓丨物(SEQ ID NO 13或者14)以外，通過在檢測肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)時所利用的方案實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR)。如圖16所示，在有腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)模板的情況下觀察到了對於腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的螢光信號(No. I及No. 3)，相反在沒有模板的陰性對照組中則沒有出現螢光信號(No. 2及No. 4)。並且，比起在從猝滅分子隔開7核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :13)，在從猝滅分子隔開20核苷酸的位置具有報導分子的TSG引物(SEQ ID NO :14)呈現出了更低的Ct值和更高的螢光強度(RFU)值。結論性地，在利用具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性DNA聚合酶的情況下，可通過兩種不同的方式呈現用於表示靶核酸序列存在的信號(i)藉助根據與靶核酸序列的雜交產生的結構變化引起的TSG引物上的相互作用性標記系統的信號不猝滅(unqunching)的信號產生；以及(ii )藉助利用具有5』一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的TSG引物5』 -末端部位上的5』 -切割反應的信號產生。實施例6:為了檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)利用TSG引物及具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶的實時聚合酶鏈式反應(PCR)的靈敏度通過檢測金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因的靶核酸序列，確認了利用TSG引物及具有5』 一 3』外切核酸酶活性的DNA聚合酶的實時聚合酶鏈式反應(PCR)的靈敏度。為了對此評價進行實驗，本發明者除了具有5』 一 3』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶及反應條件以外，利用了與實施例3中所利用的相同的模板及引物。
以含有連續稀釋的金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因組DNA(從IOOpg稀釋到IOfg ；分別稀釋為10倍)、2X QuantiTect多重PCR主混合液(凱傑公司=Qiagen)含有IlmM氯化鎂(MgCl2)、QuantiTect多重PCR緩衝液、HotstartTaq DNA聚合酶以及dNTP混合液10μ I、正向引物(SEQ ID NO :8)5pmole及作為反向引物的TSG引物(SEQ ID NO 6)5pmole的20 μ I的最終體積實施了實時聚合酶鏈式反應(PCR);將含有上述反應混合物的管位於實時熱循環儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);在95°C下對上述反應混合物進行15分鐘變性後，將在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的過程實施了 40次。由此檢測了在各循環的退火步驟(55°C)中產生的信號。圖17如同圖11所示，在利用連續稀釋的金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因組DNA實施實時聚合酶鏈式反應(PCR)的情況下，在稀釋到IOOfg時也能檢測出靶核酸序列(No.I-No. 4)。實施例7:用於檢測晶片上的靶核酸序列的TSG引物評價
將肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)基因的祀核酸序列作為模板利用時,在本實施例中利用的合成模板及TSG引物的序列如下SP_T1055，-TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTTCGCGAAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAGTTTGAAGGACAAACC-3』 (SEQ ID NO :1)SP_TSG(21)_S5，-[氨基AminoC6]TTTTT[T (螢光 % =Fluoresceine)]CCTTCAAACTGTGGATTTGGG[T(BHQ-1)]GT(SEQ ID NO : 15)(括號內的數字21意味著報導分子及猝滅分子之間的隔開的核苷酸數量。)A.晶片載玻片上的TSG引物的固定化用I型傑諾拉馬(Genorama)測定點位溶液溶解TSG引物(SEQ ID NO :15)，以使該TSG引物的最終濃度達到50 μ M0在常溫下，以70%的相對溼度，將溶解後的TSG引物在玻璃載玻片(傑諾拉馬Genorama,愛沙尼亞Estonia)上進行測定點位(spotting)。在37°C的恆溼器中對載玻片進行兩個小時培養。之後將載玻片放在1%氨溶液10分鐘，在常溫下用蒸餾水進行清洗。B.晶片上的核酸合成反應以含有模板(SEQ ID NO :1) 2pmole、IOX斯託菲爾緩衝液(Stoffelbuffer)含有IOOmM三羥甲基氨基甲烷(Tris-HClXpH 8. 3)及 IOOmM氯化鉀(KCl)2 μ I,AmpliTaq DNA聚合酶、斯託菲爾片段(美國應用生物系統公司，美國Applied BioSystems, US) I單元、4 種 dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200 μ M 以及 5mM 氯化鎂(MgCl2)的 20 μ I 的最終體積實施了核酸合成反應；將上述反應混合物移至載玻片。將上述載玻片位於原位(insitu)PCR儀(基因擴增儀原位GeneAmp in situ,鉬金埃爾默Perkin Elmer);為了實現變性，在95°C下對上述載玻片進行2分鐘培養，在50°C下培養40分鐘。核酸合成反應後清洗上述載玻片(在70°C下),利用微陣列掃描儀(ScanArray4000,鉬金埃爾默Perkin Elmer)檢測載玻片的信號，並對圖像進行了分析。對本發明的優選實例進行了詳細記述，可以進行根據本發明的原理的變形及修正，本發明的範圍藉助所附的權利要求和與其均等的內容而定義，這對於本發明所屬的技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
權利要求
1.一種利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於， 包括以下的步驟 步驟(a)，使上述靶核酸序列與上述靶信號產生引物進行雜交，上述靶信號產生引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)報導分子及猝滅分子；在上述靶信號產生引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述靶信號產生引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅從上述報導分子發出的信號；在上述靶信號產生引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述靶信號產生引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅從上述報導分子發出的信號，由此能夠得到表示上述靶核酸序列存在的信號； 步驟(b)，在引物延長條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述靶信號產生引物的3』 -末端發生3』 -延長反應；以及 步驟(C)，對表示上述靶核酸序列存在的信號進行檢測，由此，上述信號表示在DNA或者核酸混合物中存在靶核酸序列。
2.根據權利要求I所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶具有5』 一3』核酸酶活性，上述靶信號產生引物的3』 -末端藉助上述模板-依賴性核酸聚合酶的聚合酶活性而延長，上述靶信號產生引物的5』 -末端由上述模板-依賴性核酸聚合酶的5』 一3』核酸酶活性所切割，由此，從上述靶信號產生引物放出上述報導分子或上述猝滅分子，並產生用於表示靶核酸序列存在的信號。
3.根據權利要求2所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述方法在反覆循環之間包括變性過程，還包括至少反覆進行兩次上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)_步驟(C)的步驟，以便擴增用於表示靶核酸序列存在的信號。
4.根據權利要求1、2或3所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述步驟(c)的信號檢測以實時方式、終-點方式或者預定時間間隔方式來實施。
5.根據權利要求I所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶為不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶。
6.根據權利要求I所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物，具有以下通式I的雙重引發寡核苷酸結構 .5，-Xp-Yq-ZrJ (I) 上述通式中，Xp為具有與靶核酸互補的雜交核苷酸序列的5』 -第一次引發部位；Yq為包含三個以上的通用鹼基的分離部位；&為具有與靶核酸互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發部位；P、q以及r表示核苷酸的數量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5』 -第一次引發部位的Tm高於3』 -第二次引發部位的Tm，上述分離部位在上述三個區域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5』 -第一次引發部位從上述3』 -第二次引發部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性藉助上述5』 -第一次引發部位以及上述3』 -第二次引發部位來雙重性地決定，其結果，使上述靶信號產生引物的整體退火特異性得到提高。
7.根據權利要求I或2所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子或上述猝滅分子位於5』 -末端或者從5』 -末端隔開1-5核苷酸的位置。
8.根據權利要求7所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子或上述猝滅分子位於5』 -末端。
9.根據權利要求I所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物在其5』-末端還包含與上述靶核酸序列非-互補的非-雜交核苷酸序列，上述非-雜交核苷酸序列不形成髮夾-環結構。
10.根據權利要求9所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子及上述猝滅分子中的一個位於非-雜交核苷酸序列，另一個位於雜交核苷酸序列。
11.根據權利要求I所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述猝滅分子為螢光，在步驟(c)中檢測的表示靶核酸序列存在的信號為從上述螢光猝滅分子發出的信號。
12.根據權利要求I所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶為具有3』 一 5』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶。
13.根據權利要求12所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物在其3』 -末端部位具有至少一個錯配核苷酸，該錯配核苷酸包含對上述模板-依賴性核酸聚合酶的3』 一 5』外切核酸酶活性具有耐性的主鏈。
14.根據權利要求I所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述方法在液相或固相中實施。
15.根據權利要求14所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述方法在固相中實施，上述靶信號產生引物通過其5』 -末端在固相基質的表面實現固定化。
16.根據權利要求I或15所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶信號產生引物包含至少兩種引物。
17.根據權利要求I或15所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。
18.根據權利要求I或15所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
19.一種通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於， 包括以下步驟步驟(a)，使包含作為能夠對上述靶核酸序列進行擴增的正向引物以及反向引物的兩個引物的一對引物與上述靶核酸序列進行雜交；在上述兩個引物中至少一個是靶信號產生引物；上述靶信號產生引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)報導分子及猝滅分子；在上述靶信號產生引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述靶信號產生引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅從上述報導分子發出的信號；在上述靶信號產生引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述靶信號產生引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅從上述報導分子發出的信號，由此能夠得到表示上述靶核酸序列存在的信號； 步驟(b)，在引物延長條件下，將步驟(a)的結果物與模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，在上述兩個引物的3』 -末端發生3』 -延長反應； 步驟(c)，使步驟(b)的結果物發生變性； 步驟(d)，至少反覆兩次上述步驟(a)-步驟(c)，對上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的信號均進行擴增；以及 步驟(e)，用於檢測表示上述靶核酸序列存在的信號；上述信號檢測在步驟(d)的上述反覆的各循環中、在步驟(d)的上述反覆的終點或者上述反覆期間的各個預定時間間隔內實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。
20.根據權利要求19所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶具有5』 一 3』核酸酶活性，上述靶信號產生引物的3』 -末端藉助上述模板-依賴性核酸聚合酶的聚合酶活性而延長，上述祀信號產生引物的5』 -末端由上述模板-依賴性核酸聚合酶的5』 一 3』核酸酶活性所切割，由此，從上述靶信號產生引物放出上述報導分子或上述猝滅分子，並產生用於表7]^祀核酸序列存在的信號。
21.根據權利要求19所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶是不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶。
22.根據權利要求19所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，在上述兩個引物中，至少一個引物具有以下通式I的雙重引發寡核苷酸結構 5，-Xp-Yq-ZrI，(I) 上述通式中，Xp為具有與靶核酸互補的雜交核苷酸序列的5』 -第一次引發部位；Yq為包含三個以上的通用鹼基的分離部位；&為具有與靶核酸互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發部位；P、q以及r表示核苷酸的數量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5』 -第一次引發部位的Tm高於3』 -第二次引發部位的Tm，上述分離部位在上述三個區域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5』 -第一次引發部位從上述3』 -第二次引發部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性藉助上述5』 -第一次引發部位以及上述3』 -第二次引發部位來雙重性地決定，其結果，使上述靶信號產生引物的整體退火特異性得到提高。
23.根據權利要求19或20所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子或上述猝滅分子位於5』 -末端或者從5』 -末端隔開1-5核苷酸的位置。
24.根據權利要求23所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子或上述猝滅分子位於5』 -末端。
25.根據權利要求19所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物在其5』 -末端還包含與上述核酸序列非-互補的非-雜交核苷酸序列，上述非-雜交核苷酸序列不形成髮夾-環結構。
26.根據權利要求25所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子及上述猝滅分子中的一個位於非-雜交核苷酸序列，另一個位於雜交核苷酸序列。
27.根據權利要求19所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述猝滅分子為螢光，在步驟(e)中檢測的表示靶核酸序列存在的信號為從上述螢光猝滅分子發出的信號。
28.根據權利要求19所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶為具有3』 一 5』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶。
29.根據權利要求28所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶信號產生引物在其3』 -末端部位具有至少一個錯配核苷酸，該錯配核苷酸包含對上述模板-依賴性核酸聚合酶的3』 一 5』核酸酶活性具有耐性的主鏈。
30.根據權利要求19所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述方法在液相或固相中實施。
31.根據權利要求30所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述方法在固相中實施，上述兩個引物中的至少一個通過其5』 -末端在固相基質的表面實現固定化，上述實現固定化的引物為靶信號產生引物。
32.根據權利要求19或31所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述引物對包含至少兩個引物對，在各引物對中的至少一個引物為靶信號產生引物。
33.根據權利要求19或31所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。
34.根據權利要求19或31所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
35.根據權利要求34所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述引物對為用於嵌套擴增的引物對。
36.根據權利要求19或31所述的通過利用靶信號產生引物的擴增反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特徵在於，上述擴增根據聚合酶鏈式反應實施。
37.一種利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於， 包括 Ca)靶信號產生引物；上述靶信號產生引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)報導分子及猝滅分子；在上述靶信號產生引物不與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述靶信號產生引物中三維地互相鄰近，上述猝滅分子猝滅從上述報導分子發出的信號；在上述靶信號產生引物與靶核酸序列雜交的情況下，上述報導分子及上述猝滅分子在上述靶信號產生引物中三維地隔開，上述猝滅分子不猝滅從上述報導分子發出的信號，由此能夠得到表示上述靶核酸序列存在的信號；以及 (b)模板-依賴性核酸聚合酶；上述模板-依賴性核酸聚合酶作用於上述IE信號產生引物和上述靶核酸序列間的雜交結果物，由此能夠在上述靶信號產生引物的3』 -末端引起3』 -延長反應。
38.根據權利要求37所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述試劑盒包含一對引物，該一對引物包含能夠對上述靶核酸序列進行擴增的作為正向引物以及反向引物的兩個引物；在上述兩個引物中至少一個為上述革G信號產生引物。
39.根據權利要求37或38所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶具有5』 一 3』核酸酶活性，藉助其聚合酶活性在靶信號產生引物的3』 -末端發生3』 -延長反應，以及藉助其5』 一3』核酸酶活性在靶信號產生引物的5』 -末端均發生5』 -切割反應。
40.根據權利要求37或38所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶為不具有5』 一 3』核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶。
41.根據權利要求37或38所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶信號產生引物或上述兩個引物中的至少一個，具有以下通式I的雙重引發寡核苷酸結構 5，-Xp-Yq-ZrI，(I) 上述通式中，Xp為具有與靶核酸互補的雜交核苷酸序列的5』 -第一次引發部位；Yq為包含三個以上的通用鹼基的分離部位；&為具有與靶核酸互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發部位；P、q以及r表示核苷酸的數量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5』 -第一次引發部位的Tm高於3』 -第二次引發部位的Tm，上述分離部位在上述三個區域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5』 -第一次引發部位從上述3』 -第二次引發部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性藉助上述5』 -第一次引發部位以及上述3』 -第二次引發部位來雙重性地決定，其結果，使上述靶信號產生引物的整體退火特異性得到提高。
42.根據權利要求37至39中任一項所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子或上述粹滅分子位於5』 -末端或者從5』 -末端隔開1-5核苷酸的位置。
43.根據權利要求42所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子或上述猝滅分子位於-5，-末端ο
44.根據權利要求37或38所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶信號產生引物在其5』 -末端還包含與上述核酸序列非-互補的非-雜交核苷酸序列，上述非-雜交核苷酸序列不形成髮夾-環結構。
45.根據權利要求44所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶信號產生引物的上述報導分子及上述猝滅分子中的一個位於非-雜交核苷酸序列，另一個位於雜交核苷酸序列。
46.根據權利要求37或38所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述模板-依賴性核酸聚合酶為具有3』 一 5』外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶。
47.根據權利要求46所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶信號產生引物在其3』 -末端部位具有至少一個錯配核 苷酸，該錯配核苷酸包含對模板-依賴性核酸聚合酶的3』 一 5』核酸酶活性具有耐性的主鏈。
48.根據權利要求37或38所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述試劑盒用於液相反應或固相反應。
49.根據權利要求37所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述試劑盒用於固相反應，上述靶信號產生引物通過5』 -末端在固相基質的表面實現固定化。
50.根據權利要求38所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述試劑盒用於固相反應，上述兩個引物中的至少一個通過-5』 -末端在固相基質的表面實現固定化，上述實現固定化的引物為靶信號產生引物。
51.根據權利要求37或49所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶信號產生引物包含至少兩種引物。
52.根據權利要求38或50所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述引物對包含至少兩個引物對，在各引物對中至少一個引物為靶信號產生引物。
53.根據權利要求37、38、49以及50中的任一項所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。
54.根據權利要求37、38、49以及50中的任一項所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
55.根據權利要求54所述的利用靶信號產生引物從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特徵在於，上述權利要求38或50所述的引物對為用於嵌套擴增的引物對。
全文摘要
本發明涉及一種利用靶信號產生引物進行的靶檢測。本發明通過在聚合酶鏈式反應(PCR)中使用的引物內引入雙重相互作用性標記，使靶以及信號均得到擴增，並無需使用複雜的寡核苷酸，利用聚合酶鏈式反應(PCR)也可進行實時靶檢測。本發明擺脫以往的實時聚合酶鏈式反應(PCR)方法的頑固的問題以及缺點。本發明僅利用標記引物成功地進行實時靶檢測。並且，本發明不僅在液相還可以在固相中得到表示靶核酸序列存在的強信號。
文檔編號C12N15/11GK102762744SQ201080064263
公開日2012年10月31日 申請日期2010年3月26日 優先權日2009年12月21日
發明者千鍾潤, 黃仁澤 申請人:Seegene株式會社