Hcv複製子穿梭載體的製作方法

2023-05-07 20:20:01

專利名稱：Hcv複製子穿梭載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的HCV複製子穿梭載體，它們可用於篩選、測試以及評估HCV聚合酶抑制劑。
背景技術：
C型肝炎病毒是嚴重的健康問題，並且是遍及世界的慢性肝病的主要致因(Boyer，N.等人J.Hepatol.2000 3298-112)。感染了HCV的患者有發展為肝硬化繼之以肝細胞癌的風險，因此HCV是肝移植的主要指標。
據世界衛生組織所說，全世界有多於2億感染者，其中每年有至少300萬-400萬人被感染。一旦被感染，大約20％的人能清除此病毒，其餘的人會終生攜帶HCV。10-20％的慢性感染者最終發展為破壞肝臟的硬化或癌症。這種病毒性疾病通過汙染的血液和血製品、汙染的針頭腸胃外傳播，或者性傳播以及由感染或攜帶病毒的母親垂直傳染給她們的後代。當前對HCV感染的療法受限於單獨用重組幹擾素-α或聯合核苷類似物病毒唑進行的免疫療法，這種療法在臨床上具有有限的益處，對於基因型1尤為如此。現在急需能有效抗擊慢性HCV感染的改進的治療劑。
HCV已被歸為包括黃病毒屬、瘟病毒屬和包括C型肝炎病毒的肝炎病毒屬的黃病毒科成員(Rice，C.M.，FlaviviridaeThe viruses and theirreplication.InFields Virology，編輯Fields，B.N.，Knipe，D.M.和Howley，P.M.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，Pa.，第30章，931-959頁，1996)。HCV是有包膜病毒，其含有約9.4kb的正義單鏈RNA基因組。所述病毒基因組由5』非翻譯區(UTR)、編碼約3011胺基酸的多蛋白前體的長開放閱讀框和短的3』UTR組成。所述5』UTR是HCV基因組中最為高度保守的部分，且對於起始和控制多蛋白翻譯非常重要。
對HCV的遺傳分析鑑定出了六種主要的基因型，它們在DNA序列上顯示出大於30％的趨異性。每種基因型包含一系列更加密切相關的亞型，它們在核苷酸序列上顯示出20-25％的趨異性(Simmonds，P.2004 J.Gen.Virol.853173-88)。已經區分出了多於30種亞型。在美國大約70％的感染者具有1a型和1b型感染。在亞洲1b型最為普遍。(X.Forns和J.Bukh，Clinics in Liver Disease 1999 3693-716；J.Bukh等人，Semin.Liv.Dis.1995 1541-63)。不幸的是，就對當前療法的敏感性而言，1型感染比2型或3型基因型更差(N.N.Zein，Clin.Microbiol.Rev.，2000 13223-235)。
瘟病毒和肝炎病毒開放閱讀框的非結構蛋白質部分的遺傳結構和多蛋白加工非常類似。這些正鏈RNA病毒具有單一的、大的、編碼病毒複製所必需的全部病毒蛋白質的開放閱讀框(ORF)。這些蛋白質作為多蛋白表達，通過細胞和病毒編碼的蛋白酶進行翻譯中或翻譯後加工，從而形成成熟的病毒蛋白質。負責病毒基因組RNA複製的病毒蛋白質位於羧基末端。三分之二的開放閱讀框被稱之為非結構(NS)蛋白質。對於瘟病毒和肝炎病毒，成熟的非結構蛋白質從此非結構蛋白質編碼區的氨基末端到此開放閱讀框的羧基末端依次包含p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。
瘟病毒和肝炎病毒的NS蛋白質享有特異性蛋白質功能所特有的序列結構域。例如，這兩類病毒的NS3蛋白都具有絲氨酸蛋白酶和解旋酶所特有的胺基酸序列基序(Gorbalenya等人Nature 1988 33322；Bazan和Fletterick Virology 1989 171637-639；Gorbalenya等人Nucleic Acid Res.1989 17.3889-3897)。類似地，瘟病毒和肝炎病毒的NS5B蛋白具有RNA指導的RNA聚合酶所特有的基序(Koonin，E.V.和Dolia，V.V.Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.1993 28375-430)。
瘟病毒和肝炎病毒的NS蛋白質在病毒生命周期中的實際角色和功能完全類似。在這兩種(病毒的)情況下，NS3絲氨酸蛋白酶負責水解加工在開放閱讀框中位於其下遊的多蛋白前體的所有的蛋白(Wiskerchen和Collett Virology 1991 184341-350；Bartenschlager等人J.Virol.1993673835-3844；Eckart等人Biochem.Biophys.Res.Comm.1993 192399-406；Grakoui等人J.Virol.1993 672832-2843；Grakoui等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993 9010583-10587；Ilijikata等人J.Virol.1993 674665-4675；Tome等人J.Virol.1993 674017-4026)。在這兩種(病毒的)情況下，NS4A蛋白充當NS3絲氨酸蛋白酶的輔因子(Bartenschlager等人J.Virol.1994685045-5055；Failla等人J.Virol.1994 683753-3760；Xu等人J.Virol.19977153 12-5322)。這兩種病毒的NS3蛋白還有解旋酶的功能(Kim等人Biochem.Biophys.Res.Comm.1995 215160-166；Jin和Peterson Arch.Biochem.Biophys.1995，32347-53；Warrener和Collett J.Virol.1995691720-1726)。最後，瘟病毒和肝炎病毒的NS5B蛋白具有推測的依賴於RNA的RNA聚合酶活性(Behrens等人EMBO 1996 1512-22；Lechmann等人J.Virol.1997 718416-8428；Yuan等人Biochem.Biophyys.Res.Comm.1997 232231-235；Hagedorn，PCT WO 97/12033；Zhong等人J.Virol.1998729365-9369)。
目前存在有限數量的已被承認的療法可用於HCV感染的治療。治療HCV和抑制HCV NS5B聚合酶的新的和現存的方法已被綜述於以下文獻中R.G.Gish，Sem.Liver.Dis.，1999 195；Di Besceglie，A.M.和Bacon，B.R.，Scientific American，1999年10月，80-85；G.Lake-Bakaar，Current andFuture Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease，Curr.Drug Targ.Infect Dis.2003 3(3)247-253；P.Hoffman等人，Recent patents onexperimental therapy for hepatitis C virus infection(1999-2002)，Exp.Opin.Ther.Patents 2003 13(11)1707-1723；F.F.Poordad等人Developments inHepatitis C therapy during 2000-2002，Exp.Opin.Emerging Drugs 20038(1)9-25；M.P.Walker等人，Promising Candidates for the treatment ofchronic hepatitis C，Exp.Opin.investing.Drugs 2003 12(8)1269-1280；S.-L.Tan等人，Hepatitis C TherapeuticsCurrent Status and Emerging Strategies，Nature Rev.Drug Discov.2002 1867-881；R.De Francesco等人，Approaching a new era for hepatitis C virus therapyinhibitors of the NS3-4Aserine protease and the NS5B RNA-dependent RNA polymerase，AntiviralRes.2003 581-16；Q.M.Wang等人，Hepatitis C virus encoded proteinstargets for antiviral therapy，Drugs of the Future 2000 25(9)933-8-944；J.A.Wu和Z.Hong，Targeting NS5B RNA-Dependent RNA Polymerase forAnti-HCV Chemotherapy，Cur.Drug Targ.-Inf.Dis.2003 3(3)207-219。
儘管在理解病毒的基因組結構和病毒蛋白質的功能方面取得進展，HCV複製和發病機理的基本原理仍然未知。獲得HCV複製的實驗途徑的主要挑戰在於缺乏能生產有感染性的病毒顆粒的高效細胞培養系統。儘管已經報導過原代細胞培養物和某些人類細胞系的感染，但是那些系統所生產的病毒量和HCV複製水平太低而不容許詳細分析。
有人曾經報導過在人肝細胞瘤細胞系Hub-7中以最低效率複製的具有選擇性的亞基因組HCV RNA的構建。Lohman等人報導了通過缺失蛋白質編碼區的C-p7或C-NS2區構建的衍生自克隆的全長HCV共有基因組(基因型1b)的複製子(I377/NS3-3′)(Lohman等人，science 1999 285110-113)。此複製子包含如下元件(i)融合到衣殼編碼區12個胺基酸的HCV5′-UTR；(ii)新黴素磷酸轉移酶基因(NPTII)；(iii)來源於腦心肌炎病毒(EMCV)的內核糖體進入位點(IRES)，插入到NPTII基因的下遊，指導HCV蛋白質NS2或NS3至NS5B的翻譯；以及(iv)3′-UTR。轉染Hub-7細胞後，只有支持HCV RNA複製的那些細胞表達NPTII蛋白，並且出現藥物G418的抗性。雖然來源於這種G418抗性菌落的細胞系包含豐富的RNA複製子和病毒蛋白質，但是只有百萬分之一轉染的Hub-7細胞支持HCV複製。
基於HCV-H基因型1a感染克隆構建過類似的具有選擇性的HCV複製子(Blight等人，Science 2000 2901972-74)。衍生自HCV-H的複製子不能建立起有效的HCV複製，這暗示上述Lohmann(1999)早期構建的複製子依賴於那些實驗中所使用的特定的基因型1b的共有cDNA克隆。上述的Blight等人(2000)通過進行基於PCR的基因裝配操作再現了上述Lohmann(1999)等人所構建的複製子，並且獲得了抗G418的Huh-7細胞群體。測序獨立的G418抗性細胞群體以確定高水平的HCV複製是否需要複製子對宿主細胞進行適應。鑑定出在HCV非結構蛋白質NS5A中成簇的多種獨立的適應突變。這些突變在體外賦予增強的複製能力，與本領域早期構建的複製子(例如，I377/NS3-3′複製子轉導效率為0.0001％)相比，轉染細胞的轉導效率在0.2％到10％範圍內。

發明內容
本發明的特徵在於發展了一種新的HCV複製子穿梭載體，其中在NS5B基因的5′和3′末端引入獨特的限制酶切位點，以使來源於HCV感染患者樣品的NS5B序列能夠克隆入此穿梭載體，並且生成的複製子能用於評估對HCV聚合酶抑制劑的複製適合度和敏感性。由於HCV感染的個體患者通常包含由NS5B RNA聚合酶的高錯誤率所導致的遺傳多樣性病毒群，使用本發明的穿梭載體將能夠表徵特定患者來源的NS5B變體以及這些變體對藥物治療的敏感性或抗性。
因此，本發明提供了包含HCV多核苷酸序列的HCV複製子穿梭載體，其中HCV多核苷酸序列按照順序包括編碼NS3蛋白的多核苷酸序列、編碼NS4A蛋白的多核苷酸序列、編碼NS4B蛋白的多核苷酸序列、編碼NS5A蛋白的多核苷酸序列、識別位於距離編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列5』端1-20個核苷酸之間的AsiSI或SnaBI的限制酶序列、編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列以及識別位於距離編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列3』端1-20個核苷酸之間的SacII或RsrII的限制酶序列。在本發明的一個實施方案中，HCV多核苷酸序列衍生自HCV基因型1a或1b。在本發明的另一個實施方案中，對編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列進行了修飾，從而使NS5B蛋白沒有功能。又在本發明的另一個實施方案中，HCV複製子穿梭載體包含選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的HCV多核苷酸序列。
本發明的另一實施方案提供了評估HCV聚合酶抑制劑控制受試者HCV感染的效力的方法，此方法包括如下步驟提供感染HCV的受試者樣品，PCR擴增來自樣品中眾多HCV準種的編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列(使用包含識別AsiSI或SnaBI的限制酶序列的有義鏈引物以及包含識別SacII或RsrII的限制酶序列的反義鏈引物)，將PCR擴增的多核苷酸序列克隆到HCV複製子穿梭載體中以生成嵌合HCV複製子質粒，線性化所述嵌合HCV複製子質粒並對線性化的質粒進行體外轉錄從而生產嵌合HCV複製子RNA，用所述HCV複製子RNA轉染Huh7細胞系，並測量所述HCV複製子RNA在HCV聚合酶抑制劑存在或不存在情況下的複製水平。
本發明的另一個實施方案提供了評估HCV聚合酶抑制劑控制受試者的HCV感染的效力的方法，此方法包括如下步驟提供感染HCV的受試者樣品，PCR擴增來自樣品中眾多HCV準種的編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列(使用包含識別AsiSI或SnaBI的限制酶序列的有義鏈引物以及包含識別SacII或RsrII的限制酶序列的反義鏈引物)，將所述PCR擴增的多核苷酸序列克隆到HCV複製子穿梭載體中以生成嵌合HCV複製子質粒，將所述質粒轉化到細胞中以產生眾多轉化細胞群體，合併這些群體並且從中分離嵌合HCV複製子質粒，線性化所述嵌合HCV複製子質粒，並對線性化的質粒進行體外轉錄從而生產嵌合HCV複製子RNA，用所述HCV複製子RNA轉染Huh7細胞系，並測量所述HCV複製子RNA在HCV聚合酶抑制劑存在或不存在情況下的複製水平。
考慮到下文本發明的詳細描述，結合所附的闡明典型實施方案的實施例，本發明前述的以及其它的優點和特徵，以及實現所述優點和特徵的方法，將變得更加明顯。
附圖的簡短說明

圖1為HCV複製子穿梭載體以及能夠將患者來源的NS5B序列克隆到載體中的限制酶位點(顯示為AsiSI和RsrII限制性位點)引入位置的圖示。
圖2提供了把患者來源的NS5B PCR樣品克隆到複製子穿梭載體以及檢測生成的複製子的實驗設計圖示。
圖3顯示與參照複製子(對於基因型1b參照複製子為Con 1，而基因型1a為H77)的敏感性相比較，遺傳多樣性的並且是初次治療的臨床分離群對HCV聚合酶抑制劑噻吩-2-羧酸和苯並噻二嗪的敏感性差異。
定義術語「HCV複製子」是指來源於C型肝炎病毒的能夠指導產生自身拷貝的核酸。如本文中所用的，術語「複製子」包括RNA和DNA，以及它們的雜合體。例如，HCV基因組的雙鏈DNA形式能用於產生構成HCV複製子的單鏈RNA轉錄本。HCV複製子可以包含全長HCV基因組或HCV亞基因組構建體(又稱作「亞基因組複製子」)。例如此處所描述的HCV亞基因組複製子包含大部分病毒非結構蛋白質基因，但是缺失大部分編碼結構蛋白質的基因。亞基因組複製子能夠指導病毒亞基因組複製、亞基因組複製子複製所必需的所有病毒基因的表達，但不會生成病毒顆粒。
基本的HCV複製子是亞基因組構建體，含有HCV 5』-非翻譯區(UTR)、HCV NS3-NS5B多蛋白編碼區以及HCV 3』-UTR。也可以存在其它核酸區，如提供HCV NS2、HCV結構蛋白質和非HCV序列的那些核酸區。
HCV 5』-UTR區為蛋白質翻譯和複製所需元件提供內核糖體進入位點(IRES)。HCV 5』-UTR區包括天然存在的延伸入HCV核心編碼區約36個核苷酸的HCV 5』-UTR以及其功能衍生物。5』-UTR區可以存在於不同位置上，如處於編碼選擇蛋白、報告蛋白、蛋白質或HCV多蛋白的序列下遊的位點。
除HCV 5』-UTR-PC區之外，非HCV IRES元件也可以存在於複製子中。非HCV IRES元件可以存在於不同位置上，包括編碼HCV多蛋白區域的緊鄰上遊。可用的非HCV IRES元件的實例是EMCV IRES、脊髓灰質炎病毒IRES和牛病毒性腹瀉病毒IRES。
HCV 3』-UTR幫助HCV複製。HCV 3』-UTR包括天然存在的HCV 3』-UTR及其功能衍生物。天然存在的3』-UTR包括多聚尿苷束以及大約100個核苷酸的額外區域。
NS3-NS5B多蛋白編碼區提供可以在細胞中加工為不同蛋白質的多蛋白。可能成為複製子一部分的適當的NS3-NS5B多蛋白序列包括導致NS3-NS5B加工從而形成功能性複製機器的存在於不同HCV株中的序列及其功能等價物。可以通過測定諸如依賴於NS5B RNA的RNA聚合酶來測量適當的加工。
可以用本領域眾所周知的技術測量NS5B蛋白提供RNA聚合酶活性的能力。當NS5B蛋白的RNA聚合酶活性實質上不可測量時，此蛋白變為「無功能的」，這可以通過諸如引入核苷酸取代、插入或缺失「修飾」NS5B蛋白的多核苷酸序列而實現。
「載體」是一段DNA，如質粒、噬菌體或粘粒，其上可以連接另一段DNA片段，從而實現所連DNA片段的複製、表達或整合。「穿梭載體」是指這樣的載體，其中可以將DNA片段在特定的限制酶位點上插入到載體中或自載體中切下。插入穿梭載體的DNA片段通常編碼目的多肽或RNA，並且設計限制酶位點以確保DNA片段在正確的閱讀框內插入以用於轉錄和翻譯。
可以用多種載體表達核酸分子。這樣的載體包括染色體型載體、附加型載體和病毒來源的載體，例如，來源於細菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件(包括酵母人工染色體)、病毒(如杆狀病毒、乳頭狀多瘤空泡病毒(如SV40)、牛痘病毒、腺病毒、痘病毒、偽狂犬病病毒、皰疹病毒以及逆轉錄酶病毒)的載體。載體還可來源於這些來源的組合，例如來源於質粒和噬菌體遺傳元件的那些載體，如粘粒和噬菌粒。原核生物和真核生物宿主的適當的克隆和表達載體描述於Sambrook等人，(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual.第2版.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA。
可以用已知的技術將包含適當核酸分子的載體導入適當的宿主細胞中進行繁殖或表達。宿主細胞可以包括細菌細胞(包括但不限於大腸桿菌(E.coli)、鏈黴菌(Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))、真核細胞(包括，但不局限於酵母、昆蟲細胞(如果蠅)、動物細胞(如Huh-7、Hela、COS、HEK 293、MT-2T、CEM-SS和CHO細胞)以及植物細胞)。
載體通常包含能夠選擇包含重組體載體構建體的細胞亞群的選擇標記。標記可以包含於含有此處所述的核酸分子的同一載體中或者不同的載體中。對於原核宿主細胞，標記包括四環素或氨苄青黴素的抗性基因，對於真核宿主細胞，標記包括二氫葉酸還原酶或新黴素抗性。不過，任何提供表型性狀選擇的標記都將是有效的。
「多核苷酸」或「核酸分子」通常指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，可以是未經修飾的RNA或DNA或者修飾的RNA或DNA。「多核苷酸」包括但不限於單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA、單鏈和雙鏈區混合的RNA、包含DNA和RNA的雜合分子(可以是單鏈，或更通常為雙鏈，或單鏈和雙鏈區的混合體)。此外，「多核苷酸」還指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者都含有的三鏈區。「多核苷酸」還包括相對較短的多核苷酸，經常稱之為寡核苷酸。
此外，術語「DNA分子」僅僅指分子的一級和二級結構，並且不限制為任何特定的三級結構形式。因此，此術語包括雙鏈DNA，尤其是在線性DNA分子(如限制性片段)、病毒、質粒和染色體中所見的雙鏈DNA。在討論特定雙鏈DNA分子結構的時候，在此處可以按照正常的慣例描述序列，即僅僅給出沿DNA非轉錄鏈(即具有同源於mRNA的序列的鏈)5』到3』方向的序列。
「RNA分子」指核糖核苷酸的多聚形式，或者為單鏈形式，或者為雙鏈螺旋形式。在討論特定RNA分子結構的時候，在此處可以按照正常的慣例按照5』到3』方向描述給出的序列。
術語「限制酶序列」指由分別在特定核酸序列處或其附近切割雙鏈DNA的細菌的酶所識別和切割的特定雙鏈DNA序列。限制酶「AsiSI」識別序列5』GCGATCGC 3』並且在識別序列的T殘基後(顯示為▲)切割雙鏈3』CGC▲TAGCG 5』DNA。限制酶「SnaBI」識別序列5』TACGTA 3』並在所示的核酸位置3』ATG▲CAT 5』切割。類似地，「SacII」識別和切割5』CCGCGG 3』，3』GG▲CGCC 5』而「RsrII」識別和切割5』CGGACCG 3』或5』CGGTCCG 3』3』GCCTG▲GC 5』 3』GCCAG▲GC 5』。
本文所用術語「引物」指當被置於適宜的環境中時能夠作為依賴模板的核酸合成的起始子功能性地起作用的寡核苷酸，其可以為RNA或DNA；可以為單鏈或雙鏈；可以來自生物系統，由限制酶消化產生，或者是合成製備。當與合適的核酸模板、適當的核酸的核苷三磷酸前體、聚合酶、適當的輔因子以及適當的條件(如適當的溫度和pH)同時存在時，引物可以通過聚合酶的作用在其3』末端添加核苷酸而被延長(延伸)，或通過相似活性產生引物延伸產物。可以視應用的特定條件和需求而定來改變引物長度。例如，在PCR反應中，引物通常長度為15-25或更多的核苷酸。引物必須與期望的模板充分互補以引發期望的延伸產物的合成，即，引物能夠與期望的模板鏈以這樣的方式退火，從而足以保證引物的3』羥基部分合適地並置，以用於通過聚合酶或類似的酶起始合成。引物序列並不需要呈現與期望模板的精確互補。例如，非互補的核苷酸序列(如限制酶識別序列)可以被連接在另外的互補引物的5』端。備選地，只要引物序列與期望的模板鏈的序列充分互補，足以為延伸產物的合成功能性地提供引物-模板複合物，非互補的鹼基就可以被散布在寡核苷酸引物序列中。
本文所用術語「嵌合」是指由融合或剪接在一起的兩個或多個不同來源的DNA所產生的DNA分子。
本文所用術語「準種」是指超優勢HCV基因組序列(即基因型)微變體的集合，由於HCV複製過程中的高突變性，所述微變體在單個感染個體中，或者甚至在單個細胞克隆中形成。
本文所用術語「受試者」是指脊椎動物、哺乳動物物種的特定成員，包括但不限於齧齒動物、兔、地鼠(shrew)以及靈長類，後者包括人。
術語「樣品」是指從受試者中分離出的組織或液體樣品，例如，包括但不限於血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚表面部分、呼吸道、腸道及泌尿生殖道、淚液、唾液、乳液、血細胞、腫瘤、器官以及體外細胞培養組分的樣品(包括但不限於培養細胞生長所產生的條件培養基、推斷的病毒感染細胞、重組細胞和細胞成分)。
當外源或異源DNA或RNA導入細胞內之後，則細胞被它們「轉化」或「轉染」。轉化或轉染的DNA或RNA可以或不可以整合(共價連接)入染色體DNA組成的細胞基因組。例如，在原核生物、酵母和哺乳動物細胞中，轉化的DNA可以維持在附加體元件(如質粒)中。至於真核細胞，穩定轉化的細胞中轉化DNA整合入染色體中，從而通過染色體複製遺傳給子代細胞。真核細胞建立起的由包含轉化DNA的子代細胞群所組成的細胞系或克隆證實了這種穩定性。在如本發明所描述的轉化哺乳動物細胞的HCV複製子情況下，RNA分子如HCV RNA分子，具有半自主複製的能力。通過選擇標誌的存在或存在於複製子中的報告基因可以檢測到攜帶HCV複製子的Huh-7細胞。
「克隆」是指通常通過有絲分裂來源於單個細胞或共同祖先的細胞群落。
實施例給出如下的製備過程和實施例以便本領域的技術人員能更加清楚地理解和實施本發明。不應當把它們看作是限制本發明的範圍，而應當僅僅看作是其說明性和代表性的實例。
實施例1質粒的構建瞬時HCV基因型1b Con1複製子載體rep PI-luc/ET如圖1所示。該載體從R.Bartenschlager獲取，含有從5』-UTR、NS3至NS5B蛋白到3』-UTR的公布於GenBank登錄號AJ238799的HCV多核苷酸序列。它還包括控制螢火蟲螢光素酶基因翻譯的脊髓灰質炎病毒內核糖體進入位點(IRES)。在螢火蟲螢光素酶基因的下遊，來源於腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES控制HCV非結構基因(NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的翻譯。
用pUC18骨架代替pBR322骨架以修飾瞬時複製子repPI-luc/ET載體，從而產生複製子pPI-luc/ET/SC(SEQ ID NO1)。在測試分析中，pPI-luc/ET/SC與repPI-luc/ET(參見表1)複製水平類似。
瞬時HCV基因型1a H77複製子載體pSS-1通過連接來源於PPI-luc/ET/SC的SpeI-BsrGI片段和來源於HCV基因型1a H77(Yanagi等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997 948738-8743；GenBank編號AF011751)的BsrGI-SpeI片段生成，其中pPI-luc/ET/SC的SpeI-BsrGI片段包含pUC18骨架核酸序列、5』-UTR、脊髓灰質炎病毒IRES、螢火蟲螢光素酶、EMCV IRES和NS3基因(基因型1b-Con1)5』末端75個胺基酸，HCV基因型1a H77的BsrGI-SpeI片段包含NS3基因的其餘部分至3』-UTR，還包含NS5A基因中的S2204I適應突變(Blight等人2000)。pSS-1的全長核酸序列如SEQ ID NO2所示。
為了達到定點誘變的目的，創建包含pPI-luc/ET/SC或pSS-1片段中間載體(pSLP)，該片段包括亞克隆到pBSKII+載體的NS5A 3』末端區、NS5B編碼區和3』-UTR(XhoI-SpeI片段)。用Quick Change定點誘變試劑盒按照製造商的說明(Stratagene，La Jolla，CA，USA)在中間載體pSLP中引入突變，並且通過雙鏈DNA測序加以確認。在中間載體pSLP中創建此處所描述的定點突變體，然後將突變體片段XhoI-SpeI亞克隆入複製子載體(pPI-luc/ET/SC或pSS-1)。
為了創建用於表型分析的HCV複製子穿梭載體，用中間載體pSLP在位於NS5B基因起點5』端1-20個核苷酸的NS5A基因3』末端以及位於NS5B基因終點3』端1-20個核苷酸的3』-UTR中引入酶的限制性位點。在pSLP載體中創建了這兩個位置上限制性位點的幾種組合，然後亞克隆到複製子穿梭載體中。用pPI-luc/ET/SC載體作為模板以合成基因型1b穿梭載體pSC_1b_NS5B_5』AsiSI_3』RsrII(SEQ ID NO3)和pSC_1b_NS5B_5』AsiSI_3』SacII(SEQ ID NO4)。用pSS-1作為模板載體以合成基因型1a穿梭載體pSS-1_1a_NS5B_5』AsiSI_3』RsrII(SEQ ID NO7)。
pSC_1b_NS5B_5』AsiSI_3』SacII用於創建NS5B基因中兩個BglII位點之間的缺失，去除1.044kb的片段以生成複製子穿梭載體pSC_1b_delNS5B_5』AsiSI_3』SacII(SEQ ID NO5)。由於缺失功能性NS5B蛋白(參見表1)，缺失複製子的複製能力被破壞。
還構建了非自我複製型HCV複製子穿梭載體，其中用大約1.0kb的包含lacZ啟動子和來源於質粒pAmCyan(Clontech Laboratories Inc.)的海葵Anemonia majano青色螢光蛋白(AmCyan)基因的核苷酸序列片段代替pSC_1b_NS5B_5』AsiSI_3』RsrII和pSS-1_1a_NS5B_5』AsiSI_3』RsrII內的NS5B核酸序列，從而分別產生穿梭載體pSC_1b_5』AsiSI_lacZAmC_3』RsrII(SEQ ID NO6)和pSS-1_1a_5』AsiSI_lacZAmC_3』RsrII(SEQ ID NO8)。
用實施例3中所描述的表型分析評估了若干這些穿梭載體的複製能力，結果如表1所示。
實施例2將從感染患者中擴增的NS5B PCR樣品克隆到pSC_1b_NS5B_5』AsiSI_3』SacII和pSC_1b_delNS5B_5』AsiSI_3』SacII中圖2提供了把患者來源的NS5B PCR樣品克隆到複製子穿梭載體以及檢測生成的複製子的實驗設計圖示。簡言之，通過PCR直接從感染HCV患者的血漿或從血漿中擴增的DNA生成編碼NS5B蛋白的DNA序列，使用變性引物或患者特異性引物，其中有義鏈引物包含AsiSI限制性位點序列，而反義鏈引物含有SacII限制性位點序列。所用的有義鏈AsiSI引物包括5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCTTGCTCAATGTCCTA-3』
(SEQ ID NO9)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCTTGCTCAATGTCTTA-3』(SEQ ID NO10)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCTTGCTCRATGTCCTA-3』(SEQ ID NO11)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCCTGCTCAATGTCTTA-3』(SEQ ID NO12)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCCTGCTCAATGTCCTA-3』(SEQ ID NO13)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCTTGCTCRATGTCTTA-3』(SEQ ID NO14)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCYTGYTCAATGTCTTA-3』(SEQ ID NO15)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCCTGCTCGATGTCTTA-3』(SEQ ID NO16)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCCTGTTCGATGTCCTA-3』(SEQ ID NO17)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCCTGCTCRATGTCCTA-3』(SEQ ID NO18)5』-GGAGGCTAGTGAGGACGCGATCGCCTGCTCGATGTCCTA-3』(SEQ ID NO19)所用的反義鏈SacII引物包括5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCCGCGGTCATCGGTTGGGGTA-3』(SEQ ID NO20)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCCGCGGTCAYCGGTTGGGGAG-3』(SEQ ID NO21)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCCGCGGTCATCGGTTGGGAAG-3』(SEQ ID NO22)
5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCCGCGGTCAACGGTTGGGAAG-3』(SEQ ID NO23)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCCGCGGTCATCGGTTGGGAAG-3』(SEQ ID NO24)用Accuprime Pfx(KOD聚合酶，Invitrogen)以確保高保真性和高產量。退火溫度取決於患者樣品和引物組合在60℃-68℃的範圍內。然後用Qiagen PCR純化柱純化PCR擴增的患者NS5B DNA，用限制性內切酶SgfI(AsiSI的同裂酶)和SacII(Promega)雙酶切消化，用Qiagen凝膠提取試劑盒(Gel Extraction Kit)進行凝膠純化。
通過用限制性內切酶SgfI和SacII(Promega)雙酶切消化製備穿梭複製子載體pSC_1b_NS5B_5』AsiSI_3』SacII或缺失的穿梭複製子載體pSC_1b_delNS5B_5』AsiSI_3』SacII。用1％瓊脂糖電泳和Qiagen’s GelExtraction Kit凝膠純化把載體從消化的插入物中分離出來。然後用蝦鹼性磷酸酶(Roche Applied Science)處理純化的載體。
用T4 DNA連接酶(Roche Applied Science)使25ng穿梭載體與消化的患者擴增子在14-16℃連接過夜。通常載體與插入物的比率為1∶2到1∶4。過夜連接後，將5μl反應產物轉化入100μl DH5αMaximum EfficiencyCells(Invitrogen)中，並且在37℃表型表達一小時後鋪板。當用多於20％的轉化混合物鋪板時，第二天將獲取充足的菌落。
精選96個獨立的菌落，接種到200μl的補充50μg/ml氨苄青黴素的Terrific Broth(TB)中。這種96孔「母」板於37℃過夜孵育。第二天用此板製備一個複製板。用48格複印工具將板複製到兩個補充100μg/ml羧苄青黴素的LB板上。96個獨立的200μl培養物還轉入用於製備DNA的補充50μg/ml氨苄青黴素的TB培養基中。37℃過夜孵育後，在複製板上塗抹6ml LB，以獲得96個克隆的雜合庫，此雜合庫用於小量製備DNA。37℃過夜搖床後，離心沉澱96個獨立的1.5ml TB培養物，傾出上清，用Qiagen’s Qiaprep 96 Turbo Mini-DNA試劑盒提取質粒DNA。對這些用於複製子表型分析的代表混合的96個庫的獨立的分子克隆進行測序反應。
把質粒DNA雜合克隆庫進行測序以確定患者樣品的身份，並在體外轉錄反應前篩選潛在的汙染DNA。對獨立的分子克隆進行測序，用於後續深入分析以獲得表型複製子分析結果和患者NS5B序列之間的認識。通常用0.5μg質粒DNA和8pmol測序引物。
實施例3將從感染患者中擴增的NS5B PCR樣品克隆到pSC_1b_NS5B_5』AsiSI_3』RsrII、pSC_1b_5』AsiSI_lacZAmC_3』RsrII，pSS-1_1a_NS5B_5』AsiSI_3』RsrII和pSS-1_1a_5』AsiSI_lacZAmC_3』RsrII中用實施例2所描述的操作把NS5B PCR樣品克隆到在NS5B基因的3』末端包含RsrII的載體中，不同之處在於使用如下包含RsrII限制性位點的反義鏈引物PCR擴增患者NS5B5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCATCGRTTGGGGAG-3』(SEQ ID NO25)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCACCGGTTGGGGAG-3』(SEQ ID NO26)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCAYCGGTTGGGGAG-3』(SEQ ID NO27)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCATCGGTTGGGAAG-3』(SEQ ID NO28)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCAACGGTTGGGAAG-3』(SEQ ID NO29)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCAACGGTTGGGGTA-3』(SEQ ID NO30)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCATCGGTTGGGRAG-3』(SEQ ID NO31)5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCATCGGTTGGGGTA-3』(SEQ ID NO32)
5』-GGCCTGGAGTGTTTAGCTCGGACCGTCATCGGTTGGGAAG-3』(SEQ ID NO33)實施例4複製子表型分析A.體外轉錄RNA的製備用Sca I限制酶(Roche)把5μg DNA質粒線性化。37℃過夜消化後，用Qiagen PCR純化試劑盒純化DNA。按照製造商的方案(Ambion)用T7Mega script試劑盒對1μg線性化的DNA進行體外轉錄。37℃孵育2小時後，在37℃用DNAase處理30分鐘以除去DNA模板。然後用按照製造商的方案(Ambion)用NucAway旋轉柱來純化體外轉錄的RNA。
B.肝細胞瘤細胞繫於37℃在含5％CO2的潮溼空氣中用補充GlutamaxTM和100mg/ml丙酮酸鈉(Cat#10569-010)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培養基培養治癒的肝細胞瘤細胞系Huh7。培養基還補充有10％(v/v)FBS(Cat#16000-036)和1％(v/v)青黴素/鏈黴素(Cat#15140-122)。所以試劑都來源Invitrogen/Gibco。
C.瞬時複製子複製水平的確定用電穿孔法把5μg體外轉錄的RNA轉染400萬治癒的Huh7細胞。然後將細胞重懸於含5％FBS的7.2ml DMEM中，並且按照50000細胞/孔(終體積90μl)鋪於96孔板中。轉染24小時後加入抑制劑，抑制劑稀釋三倍，在DMSO中的終濃度為1％，加入抑制劑72小時後用LuciferaseAssay系統(Promega，cat#E1501)讀取螢火蟲螢光素酶報告信號。評估IC50值為與不加入化合物時相比螢火蟲螢光素酶的信號報告水平減少50％時的抑制劑濃度。化合物2』-C-甲基-胞嘧啶核苷對pSS-1_1a_NS5B_5』AsiSI_3』RsrII和具有患者來源NS5S序列的複製子複製的抑制效應的檢測結果顯示於表2。
為了測試遺傳多樣性的並且是初次治療的臨床分離群對HCV聚合酶抑制劑的敏感性，擴增了來源於所述分離群的NS5B編碼區並克隆到複製子穿梭複製子(來源於基因型1a的臨床分離群克隆入pSS-1_1a_5』AsiSI_lacZAmC_3』RsrII，來源於基因型1b的臨床分離群克隆入pSC_1b_5』AsiSI_lacZAmC_3』RsrII)中。對於每種臨床分離群合併96個分子克隆。對合併的DNA進行體外轉錄。然後按照上文描述在不存在和存在聚合酶抑制劑的情況下把體外轉錄的RNA電轉化到Huh-7細胞中，從而確定IC50。圖3顯示與參照複製子Con1(基因型1b)和H77(基因型1a)相比，在NS5B臨床分離群中的HCV聚合酶抑制劑噻吩-2-羧酸和苯並噻二嗪所表現出來的可變效力。
D.NS5B測序在瞬時分析過程中，為了確定來源於患者的哪些NS5B序列能夠複製，瞬時轉染3天後用RNeasy Qiagen試劑盒分離全細胞RNA。進行RT-PCR和NS5B區的直接測序。然後將來源於轉染Huh7細胞的NS5B核酸序列與來源於96份克隆庫的NS5B核酸序列以及對患者樣品的HCV核苷酸直接測序所得到的序列進行比較。
表1

aRLU代表複製72小時後所觀察到的螢火蟲螢光素酶信號。每一欄的數字代表來源於獨立實驗的不同數據。
b複製水平與野生型載體(未引入限制性位點)相比較。
表2

a2』-C-甲基-胞嘧啶核苷對瞬時HCV複製子RNA複製(包含來源於基因型1a臨床分離群的NS5B，插入在穿梭載體pSS-1_1a_NS5B_5』AsiSI_3』RsrII中)的抑制；平均IC50值和標準平均誤差至少由n＝3次實驗決定。
序列表110弗·哈夫曼-拉羅切有限公司120HCV複製子穿梭載體1302354316033170PatentIn version 3.2210121111518212DNA213人工序列220
223質粒pPI-luc/ET/SC的核苷酸序列4001cctgcaggta atacgactca ctatagccag cccccgattg ggggcgacac tccaccatag 60atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt 120atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaa 180ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatca acccgctcaa 240tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa 300aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccg 360tgcaccgttt aaacccccgt gctgctggaa gtcgatttca ggcttagggt aaccgtggac 420ctcgaaaaca gacgcacaaa accaagttca atagaagggg gtacaaacca gtaccaccac 480gaacaagcac ttctgtttcc ccggtgatgt cgtatagact gcttgcgtgg ttgaaagcga 540cggatccgtt atccgcttat gtacttcgag aagcccagta ccacctcgga atcttcgatg 600cgttgcgctc agcactcaac cccagagtgt agcttaggct gatgagtctg gacatccctc 660accggtgacg gtggtccagg ctgcgttggc ggcctaccta tggctaacgc catgggacgc 720tagttgtgaa caaggtgtga agagcctatt gagctacata agaatcctcc ggcccctgaa 780tgcggctaat cccaacctcg gagcaggtgg tcacaaacca gtgattggcc tgtcgtaacg 840cgcaagtccg tggcggaacc gactactttg ggtgtccgtg tttcctttta ttttattgtg 900
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223質粒pSS-1的核苷酸序列4002
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223用於PCR擴增患者NS5B的AsiSI有義鏈引物40017ggaggctagt gaggacgcga tcgcctgttc gatgtccta 392101821139212DNA213人工序列220
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220
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223用於PCR擴增患者NS5B的RsrII反義鏈引物40033ggcctggagt gtttagctcg gaccgtcatc ggttgggaag40
權利要求
1.包含HCV多核苷酸序列的HCV複製子穿梭載體，所述HCV多核苷酸序列依次包含(a)編碼NS3蛋白的多核苷酸序列；(b)編碼NS4A蛋白的多核苷酸序列；(c)編碼NS4B蛋白的多核苷酸序列；(d)編碼NS5A蛋白的多核苷酸序列；(e)識別位於距編碼NS5B蛋白的多核苷酸5』端1-20個核苷酸處的AsiSI或SnaBI的限制酶序列；(f)編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列；和(g)識別位於距編碼NS5B蛋白的多核苷酸3』端1-20個核苷酸處的SaeII或RsrII的限制酶序列；
2.權利要求1的HCV複製子穿梭載體，其中HCV多核苷酸序列來源於HCV基因型1a或基因型1b。
3.權利要求1的HCV複製子穿梭載體，其中編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列被修飾，從而使NS5B蛋白無功能。
4.包含選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的HCV多核苷酸序列的HCV複製子穿梭體載體。
5.評估HCV聚合酶抑制劑控制受試者HCV感染的效力的方法，包括如下步驟(a)提供來源於感染HCV的受試者的樣品；(b)PCR擴增來源於樣品中眾多HCV準種的編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列，使用包含識別AsiSI或SnaBI的限制酶序列的有義鏈引物和包含識別SaeII或RsrII的限制酶序列的反義鏈引物；(c)將所述PCR擴增的多核苷酸序列克隆到HCV複製子穿梭載體中，從而產生嵌合HCV複製子質粒；(d)線性化所述嵌合HCV複製子質粒並對所述線性化的質粒進行體外轉錄，從而產生嵌合HCV複製子RNA；和(e)用所述HCV複製子RNA轉染Huh7細胞系，並在HCV聚合酶抑制劑存在或不存在時測量所述HCV複製子RNA的複製水平。
6.權利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求1中的HCV複製子穿梭載體。
7.權利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求2中的HCV複製子穿梭載體。
8.權利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求3中的HCV複製子穿梭載體。
9.權利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求4中的HCV複製子穿梭載體。
10.評估HCV聚合酶抑制劑控制受試者HCV感染的效力的方法，包括如下步驟(a)提供來源於感染HCV的受試者的樣品；(b)PCR擴增來源於樣品中眾多HCV準種的編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列，使用包含選自SEQ ID NO9到SEQ ID NO19的有義鏈引物和包含選自SEQ ID NO20到SEQ ID NO33的反義鏈引物；(c)將所述PCR擴增的多核苷酸序列克隆到HCV複製子穿梭載體中，從而產生嵌合HCV複製子質粒；(d)線性化所述嵌合HCV複製子質粒並對所述線性化的質粒進行體外轉錄，從而產生嵌合HCV複製子RNA；和(e)用所述HCV複製子RNA轉染Huh7細胞系，並在HCV聚合酶抑制劑存在或不存在時測量所述HCV複製子RNA的複製水平。
11.權利要求10的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求1中的HCV複製子穿梭載體。
12.權利要求10的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求2中的HCV複製子穿梭載體。
13.權利要求10的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求3中的HCV複製子穿梭載體。
14.權利要求10的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求4中的HCV複製子穿梭載體。
15.評估HCV聚合酶抑制劑控制受試者HCV感染的效力的方法，包括如下步驟(a)提供來源於感染HCV的受試者的樣品；(b)PCR擴增來源於樣品中眾多HCV準種的編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列，使用包含識別AsiSI或SnaBI的限制酶序列的有義鏈引物和包含識別SacII或RsrII的限制酶序列的反義鏈引物；(c)將所述PCR擴增的多核苷酸序列克隆到HCV複製子穿梭載體中，從而產生嵌合HCV複製子質粒；(d)將所述質粒轉化入細胞中以產生眾多的轉化細胞群落；(e)合併所述群落並從合併的群落中分離嵌合HCV複製子質粒；(f)線性化來源於步驟(e)的嵌合HCV複製子質粒並對所述線性化的質粒進行體外轉錄，從而產生嵌合HCV複製子RNA；和(g)用所述HCV複製子RNA轉染Huh7細胞系，並且在HCV聚合酶抑制劑存在或不存在時測量所述HCV複製子RNA的複製水平。
16.權利要求15的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求1中的HCV複製子穿梭載體。
17.權利要求15的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求2中的HCV複製子穿梭載體。
18.權利要求15的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求3中的HCV複製子穿梭載體。
19.權利要求15的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求4中的HCV複製子穿梭載體。
20.評估HCV聚合酶抑制劑控制受試者HCV感染的效力的方法，包括如下步驟(a)提供來源於感染HCV的受試者的樣品；(b)PCR擴增來源於樣品中眾多HCV準種的編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列，使用包含選自SEQ ID NO9到SEQ ID NO19的有義鏈引物和包含選自SEQ ID NO20到SEQ ID NO33的反義鏈引物；(c)將所述PCR擴增的多核苷酸序列克隆到HCV複製子穿梭載體中，從而產生嵌合HCV複製子質粒；(d)將所述質粒轉化入細胞中以產生眾多的轉化細胞群落；(e)合併所述群落並從合併的群落中分離嵌合HCV複製子質粒；(f)線性化來源於步驟(e)的嵌合HCV複製子質粒並對所述線性化的質粒進行體外轉錄，從而產生嵌合HCV複製子RNA；和(g)用所述HCV複製子RNA轉染Huh7細胞系，並且在HCV聚合酶抑制劑存在或不存在時測量所述HCV複製子RNA的複製水平。
21.權利要求20的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求1中的HCV複製子穿梭載體。
22.權利要求20的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求2中的HCV複製子穿梭載體。
23.權利要求20的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求3中的HCV複製子穿梭載體。
24.權利要求20的方法，其中步驟(c)的HCV複製子穿梭載體包含權利要求4中的HCV複製子穿梭載體。
全文摘要
本發明提供了新的HCV複製子穿梭載體，可用於克隆來源於感染HCV患者樣品的HCV多核苷酸序列以及測試所形成複製子的藥物敏感性。
文檔編號C12Q1/68GK1986815SQ20061016924
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月21日 優先權日2005年12月21日
發明者P·S·迪特裡希, A·H·科薩卡, S·勒波甘, I·納傑拉 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司