針對短表位的數位化抗體組以及其使用方法

2023-07-14 04:41:11

專利名稱：針對短表位的數位化抗體組以及其使用方法
技術領域：
本發明總體上涉及針對短表位的數位化抗體(digital antibody)組，以及其在蛋白質分析方法中的用途。
關於聯合資助研究或研發的聲明未申請。
背景技術：
蛋白質組學涉及在蛋白質水平上測量基因活性。目前，蛋白質組研究最常用的工具是二維凝膠電泳與質譜測量的組合(2D-MS)。該系統具有一些限制。第一，2D電泳的檢測靈敏性和解析度低。第二，使用質譜分析顯著增加成本。最後，2D電泳是費時的。裝備非常精良的實驗室每周僅能夠進行大約200-400次2D凝膠電泳。因此，需要改善蛋白質分析的方法。
細菌或病毒感染的檢測和表徵在臨床微生物學的實踐中和環境測試如食品安全和生物公害安全測試中都是至關重要的。考慮其表現型和基因型，微生物是非常多樣的，例如，葡萄球菌屬(staphylococci)包括32個種和15個亞種。然而，目前的診斷方法通常僅能夠檢測單一微生物或病毒，為了檢測和描述微生物或病毒的特性，必須使用多次特定的測試。因此，需要新的方法用於檢測和表徵(包括鑑定)蛋白質樣品，其中所述蛋白質樣品包括含有細菌和/或病毒的樣品或由其來源的樣品。
基於癌症的組織類型和部位能夠對其進行分類。基於大部分瘤塊的大小和其是否已侵入其它器官，能夠進一步將每種類型的癌症劃分為不同的期。例如，利用目前的方法前列腺癌可以劃分為從T0到T4期。在另一個例子中，基於諸如瘤塊結構組成和/或細胞分化的水平，也能夠將癌症劃分為不同的級。然而這些形態學和/或組織學上的分類通常不能很好地與臨床治療相關，並且常常不能鑑定早期癌症或癌前細胞。因此，需要新的方法以檢測和表徵(包括鑑定)包含或來源於癌樣細胞和/或組織的蛋白質樣品。
此處引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物，全部引用作為參考。
發明概述本發明提供了多組數位化抗體，和包括使用數位化抗體的方法。
因此，一方面，本發明提供了多組數位化抗體，其中一組包含至少大約15種數位化抗體，其中每種數位化抗體結合不同的表位，並且其中每種數位化抗體結合由3個連續胺基酸或4個連續胺基酸組成的表位。在一些實施方案中，一組數位化抗體包含至少大約任意20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000種或更多的抗體。在一些實施方案中，一組數位化抗體包含100種與由3個連續胺基酸組成的表位結合的數位化抗體。在其它實施方案中，一組數位化抗體進一步包含100種與由4個連續胺基酸組成的表位結合的數位化抗體。也在其它實施方案中，一組數位化抗體包含100種與由5個連續胺基酸組成的表位結合的數位化抗體。在其它實施方案中，一組數位化抗體包含至少大約100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000種數位化抗體，其中每種數位化抗體結合不同的表位，並且其中每種數位化抗體結合由3個連續胺基酸、4個連續胺基酸或5個連續胺基酸組成的表位。也在其它實施方案中，一組數位化抗體包含至少1000種與由4個連續胺基酸組成的表位結合的數位化抗體。也在其它實施方案中，一組數位化抗體進一步包含至少100種與由5個連續胺基酸組成的表位結合的數位化抗體。在其它實施方案中，一組數位化抗體進一步包含至少100種與由3個連續胺基酸組成的表位結合的數位化抗體。可以將「不同的表位」理解為包括具有重疊胺基酸序列的表位以及具有非重疊胺基酸序列的表位。
另一方面，本發明提供包含此處所述的任一數位化抗體組的陣列。產生這些陣列的方法在本領域中是眾所周知的，並在此進一步進行描述。
另一方面，本發明提供產生蛋白質結合譜的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將樣品與此處所述的任意一數位化抗體組相接觸；(b)任選地除去未結合蛋白質(在一些實施方案中，除去非特異性結合的蛋白質)；和(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜。
另一方面，本發明提供了產生蛋白質結合譜的方法，所述方法包括檢測蛋白質與數位化抗體組的結合，從而產生蛋白質結合譜，其中蛋白質與數位化抗體組的結合是通過包括(a)將樣品與此處所述的任一數位化抗體組相接觸；和(b)任選地去除未結合蛋白質的方法產生的。
另一方面，本發明提供了產生蛋白質結合譜的方法，所述方法包括(a)從與樣品接觸的一組數位化抗體中分離未結合蛋白質；和(b)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜，其中來自與樣品相接觸的一組數位化抗體的未結合蛋白質是通過包括將樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸步驟的方法產生的。
顯然，一個步驟或更多步驟可以進行組合和/或相繼進行(通常以任意順序，只要能夠形成所需要的產物)，並且，很明顯，本發明包括此處所述步驟的多種組合。如此處所述也很明顯的是，本發明包括其中最初步驟或第一步是此處所述的任一步驟的那些方法。本發明的方法包括其中較後的「下遊」步驟是第一步的一些實施方案。
另一方面，本發明提供產生蛋白質結合譜的方法，所述方法包括(a)孵育反應混合物，所述反應混合物包含(i)任意此處所述的數位化抗體組；和(ii)樣品；其中孵育是在允許結合的條件下進行的；(b)任選地分離未結合蛋白質；和(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜。
另一方面，本發明提供了產生蛋白質結合譜的方法，所述方法包括檢測蛋白質與一組數位化抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜，其中蛋白質與一組數位化抗體的結合是通過包括孵育反應混合物步驟的方法產生的，所述反應混合物包含(i)任意此處所述的數位化抗體組；和(ii)樣品；其中孵育在允許結合的條件下進行；(b)任選地分離未結合蛋白質。
對於本領域的技術人員很明顯的是，關於組合和孵育所得到混合物的方面也包括一些方法實施方案，其包括孵育多種混合物(以多種組合和/或亞組合)從而形成預期產物。
在一些實施方案中，產生蛋白質結合譜的方法進一步包括用蛋白質裂解劑處理樣品的步驟，從而產生多肽片段。在步驟(a)即在允許結合的條件下將樣品與該組數位化抗體相接觸之前，可用蛋白質裂解劑處理樣品。蛋白質裂解劑可以是酶(例如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)或化學試劑(例如溴化氰)。
可以理解蛋白質結合譜包括關於缺乏數位化抗體和蛋白質之間結合的信息。進一步可以理解產生蛋白質結合譜不需要具備有關所分析蛋白質的身份(identity)的先驗知識，並且已知的和未知的蛋白質都可以檢測。因此，在一些實施方案中，蛋白質結合譜可以用於鑑定和/或檢測以前未知的因子，諸如新的病原體。
檢測可以是定性的和/或定量的。在一些實施方案中，檢測一組中至少大約95％、至少大約90％、至少大約75％、至少大約50％、至少大約30％抗體的結合。在一些實施方案中，檢測一組中每種抗體的結合。在一些實施方案中，檢測結合的標記蛋白質的存在或缺乏和/或其量。在一些實施方案中，如此處進一步描述的，檢測了標記的競爭劑多肽。通常，在涉及使用競爭劑多肽的實施方案中，這些方法進一步包括將該組數位化抗體與競爭劑多肽相接觸(與樣品組合和/或與樣品相繼使用)。
另一方面，本發明提供產生蛋白質結合譜文庫的方法，包括步驟(a)在允許結合的條件下將樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質(在一些實施方案中，去除非特異性結合的蛋白質)；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)用至少兩個不同樣品重複步驟(a)至(c)。
另一方面，本發明提供產生蛋白質結合譜文庫的方法，包括彙編一組兩個或多個蛋白質結合譜，其中蛋白質結合譜是按照任意此處所述的產生蛋白質結合譜的方法進行製備的。
另一方面，本發明提供了蛋白質結合譜文庫，其中文庫是使用任意此處所述的方法進行製備的。
在一些實施方案中，文庫可以包含至少大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或更多(諸如1000、2000、3000、4000或更多)結合譜。
另一方面，本發明提供根據本發明的方法使用所產生的蛋白質結合譜(包括蛋白質結合譜文庫)的方法。因此，本發明提供表徵測試樣品(例如懷疑包含目的樣品的測試樣品)的方法；檢測存在或缺乏和/或鑑定測試樣品的方法；表徵細胞、細菌和/或病毒的方法；鑑定測試蛋白質的方法；表徵、檢測存在和/或缺乏和/或鑑定蛋白質複合體的方法；和如此處進一步所述的篩選方法。本發明進一步提供檢測存在或缺乏和/或表徵包含或來源於細胞，例如原核細胞(諸如細菌)、真核細胞、哺乳動物細胞(包括人類和非人類哺乳動物如鼠科動物)、癌症或癌前細胞、或微生物諸如病毒的樣品的方法，以及如此處進一步所述的檢測和/或診斷其它疾病和/或異常(諸如癌症的型或期、或鑑定癌前細胞)的方法。
一方面，本發明提供表徵測試樣品(例如懷疑包含目的樣品的測試樣品)的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)比較測試樣品的蛋白質結合譜和參照樣品的蛋白質結合譜，從而通過比較表徵測試樣品。
另一方面，本發明提供表徵測試樣品的方法，所述方法包括將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較表徵測試樣品；其中蛋白質結合譜通過下述方法進行製備，該方法包括(a)在允許結合的條件下將樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜。
另一方面，本發明提供表徵測試樣品(例如懷疑包含目的樣品的測試樣品)的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與通過此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較表徵測試樣品。
另一方面，本發明提供表徵測試樣品的方法，所述方法包括將測試樣品的蛋白質結合譜與蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較表徵測試樣品；其中蛋白質結合譜是通過包括以下步驟的方法製備的，該方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；並進一步通過任意此處所述的方法產生蛋白質結合譜文庫。
在一些實施方案中，表徵樣品中的細胞、細菌或病毒(包括來源於細胞、細菌和/或病毒的蛋白質或蛋白質級分)的特性。在另一些實施方案中，表徵樣品中細胞的分類，例如癌樣的或癌前的，或表徵樣品中細菌的分類(例如致病的或非致病的、和/或分類學上的分類)。在一些實施方案中，確定了癌症的類型、期、級、和/或其它相關診斷(和/或預後)特徵。
另一方面，本發明提供確定目的樣品存在或缺乏和/或鑑定目的樣品的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將懷疑包含目的樣品的測試樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)比較測試樣品的蛋白質結合譜和參照樣品的蛋白質結合譜，從而通過比較確定目的樣品的存在或缺乏和/或鑑定目的樣品。
另一方面，本發明提供確定目的樣品存在或缺乏和/或鑑定目的樣品的方法，所述方法包括比較懷疑包含目的樣品的測試樣品的蛋白質結合譜和參照樣品的蛋白質結合譜，從而通過比較確定目的樣品的存在或缺乏和/或鑑定目的樣品；其中蛋白質結合譜通過包括以下步驟的方法產生，該方法包括(a)在允許結合的條件下將樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜。
另一方面，本發明提供確定目的樣品存在或缺乏和/或鑑定目的樣品的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將懷疑包含目的樣品的測試樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與通過此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較確定測試樣品中目的樣品的存在或缺乏和/或鑑定目的樣品。
另一方面，本發明提供確定目的樣品存在或缺乏和/或鑑定目的樣品的方法，所述方法包括將懷疑包含目的樣品的測試樣品的蛋白質結合譜與通過此處所述的任意方法產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較確定測試樣品中目的樣品的存在或缺乏和/或鑑定目的樣品；其中測試樣品的蛋白質結合譜通過包括以下步驟的方法產生，該方法包括(a)在允許結合的條件下將懷疑包含目的樣品的測試樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；並且利用此處所述的任意方法產生蛋白質結合譜文庫。
另一方面，本發明提供確定測試樣品中細胞、細菌和/或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較確定測試樣品中細胞、細菌或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定。
另一方面，本發明提供確定細胞、細菌和/或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括將懷疑包含細胞、細菌和/或病毒的測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較確定細胞、細菌或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定；其中蛋白質結合譜通過包括以下步驟的方法產生，該方法包括(a)在允許結合的條件下將樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜。
另一方面，本發明提供確定測試樣品中細胞、細菌和/或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與通過此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較確定測試樣品中細胞、細菌或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定。
另一方面，本發明提供檢測細胞、細菌和/或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括將懷疑包含細胞、細菌和/或病毒的測試樣品的蛋白質結合譜與通過此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較確定細胞、細菌或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定；其中測試樣品的蛋白質結合譜通過包括以下步驟的方法產生，該方法包括(a)在允許結合的條件下將懷疑包含目的樣品的測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；並且通過此處所述的任意方法產生蛋白質結合譜文庫。
另一方面，本發明提供鑑定測試蛋白質的方法，所述方法包括(a)將包含測試蛋白質的樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測該組中蛋白質與抗體的結合存在或缺乏，其中至少大約6種數位化抗體結合蛋白質；其中結合的存在表明在蛋白質中至少存在大約6個表位，其中至少大約6個表位的身份(即線性胺基酸序列)用於鑑定蛋白質。
另一方面，本發明提供鑑定測試蛋白質的方法，所述方法包括檢測蛋白質與任意此處所述的數位化抗體組結合的存在或缺乏，其中至少大約6種數位化抗體結合蛋白質，其中結合的存在表明在蛋白質中至少存在大約6個表位，其中這至少大約6個表位的身份(即線性胺基酸序列)用於鑑定蛋白質；其中蛋白質的結合通過包括以下步驟的方法產生，該方法包括(a)將包含測試蛋白質的樣品與任意此處所述的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測該組中蛋白質與抗體的結合的存在或缺乏。在一些實施方案中，測試蛋白質長度由大約500個胺基酸組成。
另一方面，本發明提供鑑定測試蛋白質的方法，所述方法包括基於被至少6種數位化抗體所識別的至少大約6個表位的身份鑑定測試蛋白質，其中蛋白質與抗體的結合通過包括以下步驟的方法檢測，該方法包括(a)將包含測試蛋白質的樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與該組中抗體結合的存在或缺乏，其中至少大約6種數位化抗體結合蛋白質。
在一些實施方案中，大約7種、大約8種、大約9種、大約1 0種、約11種、約12種、約13種、約14種、約15種、約20種、約25種、約30種、或更多種(例如大約40、50、60或更多種)數位化抗體的結合和表位身份用於鑑定測試蛋白質。在一些實施方案中，方法進一步包括將表位身份信息(即被抗體結合的線性胺基酸序列)與包含蛋白質序列信息(例如核苷酸或胺基酸序列)的資料庫進行比較。在一些實施方案中，樣品包含純蛋白質。在另一些實施方案中，樣品包含基本純的蛋白質。
另一方面，如此處進一步所描述，本發明提供了篩選的方法，並提供了表徵、檢測蛋白質複合體的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法。
抗體可以包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體蛋白質的融合蛋白質、以及包含所需特異性的抗原識別位點的任一其它多肽。抗體可以是小鼠、大鼠、兔、雞、人或任意其它來源(包括人源化抗體)的抗體。
如此處所使用，「樣品」包括多種樣品類型和/或來源，例如血液或生物來源的其它液體樣品、諸如活組織檢查樣品或組織培養物或由其得到細胞及其子代細胞的實體組織樣品。術語「樣品」包括臨床樣品、並且還包括培養的細胞、細胞上清液、細胞裂解液、血清、血漿、生物學液體、以及來源於任意這些樣品的純的或富集的細菌或病毒樣品，例如為了增加、富集和/或基本上純化由其得到的細菌或病毒樣品(或者，在一些實施方案中，為了增加包含細菌和/或病毒的樣品的量)而對樣品進行培養。樣品可以來源於微生物，例如細菌、酵母、病毒、類病毒、黴菌、真菌、植物、動物(包括哺乳動物，例如人類)。樣品可以包含單一細胞或非單一細胞。通過本領域熟知的方法，例如裂解、分離、純化(包括親和純化、FACS、雷射捕獲顯微切割(LCM)或等密度離心)能夠製備這些樣品。在一些實施方案中，亞細胞分離法用於產生富集的細胞或亞細胞成分，例如亞細胞細胞器，包括細胞核、線粒體、高爾基體、內質網、葉綠體、重膜和輕膜以及細胞質。在一個實施方案中，樣品包含基本上完整的蛋白質複合體。在一些實施方案中，蛋白質複合體是由諸如核酸相關受體(如雌激素受體)或膜相關受體(如表皮生長因子受體、IL-6受體、應激/凋亡途徑、趨化因子途徑、MMP轉錄途徑)或細胞周期途徑製備得到的受體相關蛋白質複合體或信號轉導相關蛋白質複合體另一方面，本發明提供了產生數位化抗體的雜交瘤，其中所述雜交瘤選自雜交瘤2.04、2.03或2.11。在一些實施方案中，本發明提供由雜交瘤2.04、2.03或2.11產生的數位化抗體。在另一些實施方案中，本發明提供包含由雜交瘤2.04、2.03和/或2.11產生的數位化抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的抗體。也在其它實施方案中，本發明提供包含由雜交瘤2.04、2.03和/或2.11產生的數位化抗體的一個或多個CDR(例如2、3、4、5和/或全部6個CDR)的抗體。
另一方面，本發明提供包含此處所述的任意數位化抗體組的組合物。在一些實施方案中，組合物用於此處所述的任意方法。在一個實施方案中，本發明提供包含蛋白質與此處所述的任意數位化抗體組的複合體的組合物。在另一個實施方案中，本發明提供包含任意此處所述的數位化抗體組和樣品的組合物。在一些實施方案中，抗體固定化(連接和/或吸附)於固體或半固體表面，例如陣列。在其它實施方案中，抗體是標記的抗體。在一些實施方案中，本發明提供了包含此處所述的數位化抗體組、樣品和一組競爭劑多肽的組合物，其中所述競爭劑多肽包含數位化抗體組中一種或多種數位化抗體的關連胺基酸序列(cogante amino acid sequence)。在一些實施方案中，競爭劑多肽是標記的。
本發明進一步提供包含此處所述的任意數位化抗體組的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒進一步包括此處所述任意方法的指導說明。在一些實施方案中，抗體固定化(連接和/或吸附)於固體或半固體表面，例如陣列。在其它實施方案中，抗體是標記的抗體。也在其它實施方案中，試劑盒包含此處所述的任意蛋白質結合譜文庫。也在其它實施方案中，試劑盒進一步包含標記。也在其它實施方案中，試劑盒包含一組競爭劑多肽，其中所述競爭劑多肽包含數位化抗體組中一種或多種數位化抗體的關連胺基酸序列。在一些實施方案中，競爭劑多肽是標記的競爭劑多肽。
附圖簡述

圖1分別顯示了對用於組2和組5小鼠的免疫多肽序列使用繪製多肽所跨越序列的反應模式。
圖2描述利用一組100種計算機模擬數位化抗體製備計算機模擬的蛋白質結合譜。X軸對應於100種數位化抗體中的每一種，且Y軸表示結合蛋白質的量。形成蛋白質結合譜的每個條柱對應於每種數位化抗體所結合的蛋白質的量。
圖3描述利用計算機模擬的一組100種不同數位化抗體，從包含一個或多個病毒蛋白質的模擬樣品(圖3A)和模擬的對照樣品(圖3B)製備計算機模擬的蛋白質結合譜。X軸對應於100種數位化抗體中的每一種，且Y軸代表結合蛋白質的量。每個條柱對應每種數位化抗體所結合的蛋白質的量。圖3C描述從病毒樣品蛋白質結合譜減去對照蛋白質結合譜之後的蛋白質結合譜。
圖4顯示本發明數位化抗體微陣列的一個圖解說明性實施方案。為了適應通用的自動化高通量系統，使用標準的96-孔微孔板。將100到200種數位化抗體一式兩份包被於每個單一孔上，在每個微孔內形成抗體陣列。將螢光素或酶標記的單一或多重表位抑制劑多肽與胰蛋白酶消化的蛋白質樣品混合，並且然後以競爭性抗體-抗原相互作用方式與抗體進行孵育。立即在螢光儀下觀察信號或者通過加入增加靈敏性的酶標抗螢光素抗體進一步擴大。
發明詳述本發明源自這樣的發現，即組合使用識別小多肽表位的抗體(在本領域中通常稱為「交叉反應抗體」)在產生抗體組中的抗體和樣品中的蛋白質之間結合的特徵模式方面是有用的，其中蛋白質結合模式稱為蛋白質結合譜，可以用於表徵或「指紋」蛋白質樣品。本發明源自這樣的觀察，即交叉反應抗體(即識別小表位的抗體，並因此預期其結合多種蛋白質)可以組合使用以產生足夠特異的蛋白質結合譜以至於可以表徵、專門鑑定(包括鑑定樣品中一個或多個成分)和/或區別樣品。因此，通過數位化抗體組與樣品中蛋白質的結合(從而產生特異蛋白質結合譜)，而不是通過如本領域中通常用於特異性檢測的結合一種或幾種蛋白質的單一抗體的結合，賦予來自抗體結合的結果和信息的特異性。一般而言，蛋白質結合模式包含關於樣品中蛋白質結合的存在(或缺乏)和/或每種數位化抗體和蛋白質之間蛋白質結合的強度(量)的信息。蛋白質結合譜能夠用於諸如鑑定蛋白質樣品的來源(如來自病原體；來自癌細胞)，或者可以用於鑑定或檢測先前未知的因子，例如新病原體。
識別小肽表位的數位化抗體結合(一般而言，特異性結合)由3個連續胺基酸、4個連續胺基酸或5個連續胺基酸組成的小線性肽表位，其中該組中的每種抗體結合至不同的小線性肽表位。由於被數位化抗體識別的表位小(即3個連續胺基酸、4個連續胺基酸或5個連續胺基酸)，基於在多種被結合蛋白質內存在小的關連表位(cognate small epitope)，單一數位化抗體通常結合多種蛋白質(在一些實施方案中，結合大量蛋白質)。因此，蛋白質與每種數位化抗體的結合通常反映多種蛋白質的結合，每種蛋白質擁有一個或多個小的關連表位序列的拷貝。同樣，基於蛋白質內存在多個小表位序列，多種數位化抗體可以結合單一蛋白質。一般而言，被給定數位化抗體識別的表位的身份是已知的，並且該信息在諸如鑑定如此處進一步所述的蛋白質的方法中是有用的。
因此，一方面，本發明提供了結合(通常是特異性結合)由3個連續胺基酸、4個連續胺基酸或5個連續胺基酸組成的小線性肽表位的抗體組(稱為「數位化抗體」)，其中該組中的每種抗體結合至不同的小線性肽表位。可以理解「不同的表位」包括具有重疊胺基酸序列的表位和具有不同胺基酸序列的表位。在一些實施方案中，抗體組包括至少大約15種數位化抗體，其中每種數位化抗體結合不同的表位，並且其中每種數位化抗體結合由3個連續胺基酸、4個連續胺基酸或5個連續胺基酸組成的表位。在一些實施方案中，抗體組包含至少大約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000種或更多種抗體。在其它實施方案中，抗體組包含至少大約100種抗體。在其它實施方案中，抗體組包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位(也稱為3mer表位)的數位化抗體。在一些實施方案中，抗體組包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，以及至少大約100種識別由4個連續胺基酸組成的表位(也稱為4mer表位)的數位化抗體。在一些實施方案中，抗體組包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，至少大約100種識別由4個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，以及至少大約100種識別由5個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。在另一個實施方案中，抗體組包含至少大約1000種識別由4個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。此處進一步描述了數位化抗體和製備數位化抗體的方法。
另一方面，本發明提供了包含此處所述的任意數位化抗體組的陣列。產生這些陣列的方法在本領域是熟知的，並且在此處進一步進行描述。
另一方面，本發明進一步提供了使用這些數位化抗體組的方法。總的來看，涉及利用此處所述的任意數位化抗體組產生樣品的蛋白質結合譜的方法包括將樣品與一組數位化抗體相接觸，以及如果需要檢測樣品蛋白質和抗體之間形成的抗體-蛋白質複合體。檢測抗體-蛋白質複合體提供了關於結合量(強度)的信息。使用本領域熟知的方法進行檢測，並且在此處進行進一步描述。因此，產生蛋白質結合譜的方法通常包括(a)在允許結合的條件下將樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質(在一些實施方案中，去除非特異性結合的蛋白質)；和(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜。通常，檢測抗體組中多種抗體的結合。在一些實施方案中，檢測到抗體組中至少大約95％、至少大約90％、至少大約75％、至少大約50％、至少大約30％抗體的結合。在一些實施方案中，檢測到抗體組中每種抗體的結合。檢測可以是定性的和/或定量的。在一些實施方案中，蛋白質結合譜可以包括(被數位化抗體結合的小表位是已知的這一範圍內)關於該組數位化抗體中存在的數位化抗體所結合的蛋白質的胺基酸含量的信息。如此處進一步所討論，蛋白質結合譜可與涉及樣品的信息諸如樣品的來源(例如諸如細菌和/或病毒的病原體來源、癌細胞或腫瘤來源)相關並且可以被記錄並儲存於蛋白質結合譜文庫(例如資料庫)中。
在一些實施方案中，產生蛋白質結合譜的方法進一步包括用蛋白質裂解劑處理樣品的步驟，從而產生多肽片段。在允許結合的條件下將樣品與該組數位化抗體相接觸之前，可以用蛋白質裂解劑處理樣品。蛋白質裂解劑可以是酶(例如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)或化學製劑(例如溴化氰)。蛋白質裂解劑和用蛋白質裂解劑處理的方法是本領域熟知的並在此處進一步進行描述。
通過彙編2個或多個不同樣品(例如致病的或非致病的細菌樣品)的蛋白質結合譜能夠產生蛋白質結合譜文庫。為了辨別蛋白質結合模式的相似性和/或不同性，可將蛋白質結合譜彼此之間定性或者定量地進行比較。文庫中的蛋白質結合譜也能夠用於一些方法，這些方法包括對不同來源(例如來自不同組織或細胞類型、疾病狀況或不同微生物)樣品的蛋白質結合譜的比較鑑定。例如，如此處進一步所描述，蛋白質結合譜文庫可用於表徵蛋白質樣品的方法中、診斷細菌或病毒感染的方法中和/或細胞、細菌或傳染劑的檢測和/或分類學上分類的方法中。例如，由未經確定的樣品製備的蛋白質結合譜可以用於通過與蛋白質結合譜文庫(例如已知細菌性病原體的文庫)進行比較表徵和/或鑑定樣品。
因此，另一方面，本發明提供了產生蛋白質結合譜文庫的方法，包括步驟(a)在允許結合的條件下將樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質(在一些實施方案中，去除非特異性結合的蛋白質)；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)用至少兩個不同的樣品重複步驟(a)至(c)。在一些實施方案中，文庫包含至少大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或更多(例如1000、2000、3000、4000或更多)結合譜。另一方面，本發明提供了蛋白質結合譜文庫，其中文庫是使用此處所述的任意方法進行製備的。
另一方面，本發明提供了使用根據本發明方法所產生的蛋白質結合譜(包括蛋白質結合譜文庫)的方法，包括涉及不同來源(例如，來自不同組織或細胞類型、疾病狀況或不同微生物)樣品的蛋白質結合譜的比較鑑定的方法。因此，如此處進一步所描述，本發明提供了表徵測試樣品(例如懷疑包含目的樣品的測試樣品)的方法；檢測存在或缺乏測試樣品和/或對其進行鑑定的方法；表徵細胞、細菌和/或病毒的方法；鑑定測試蛋白質的方法；表徵、檢測蛋白質複合體的存在和/或缺乏和/或對其進行鑑定的方法；以及篩選的方法。在一些實施方案中，這些方法包括將由測試樣品產生的蛋白質結合譜與參照蛋白質結合譜(例如從對照樣品產生的蛋白質結合譜或正常值)，或根據此處所述的任意方法所產生的譜的文庫進行比較。
本發明還提供了使用(a)由包含蛋白質的樣品產生的蛋白質結合譜；和(b)被結合樣品蛋白質的數位化抗體所識別的表位的胺基酸序列來鑑定蛋白質的方法，從而一組數位化抗體(通常，大約6種數位化抗體)的結合提供了足夠的有關蛋白質胺基酸含量的信息以至於可以鑑定該蛋白質。通過舉例的方式表明，識別表位QAP、TPG、LTG、VSR和WDQ的數位化抗體同時結合至測試蛋白質可鑑定該蛋白質為HCV NS3，因為HCVNS3蛋白質是唯一已知的包含這六個3mer胺基酸序列的蛋白質。因此，一方面，本發明提供了鑑定測試蛋白質的方法，所述方法包括(a)將包含測試蛋白質的樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與該組抗體結合的存在或缺乏，其中至少大約6種數位化抗體結合蛋白質；其中結合的存在表明在該蛋白質中存在至少大約6個表位，其中至少大約6個表位的身份(即線性胺基酸序列)用於鑑定蛋白質。在一些實施方案中，與大約7、大約8、大約9、大約10、大約11、大約12、大約13、大約14、大約15、大約20、大約25、大約30或更多(例如大約40、50、60或更多)種數位化抗體的結合和表位身份用於鑑定測試蛋白質。在一些實施方案中，這些方法進一步包括將表位身份信息(即抗體所結合的線性胺基酸序列)與包含蛋白質序列信息(例如核苷酸或胺基酸序列)的資料庫進行比較。在一些實施方案中，樣品包含純蛋白質。在其它實施方案中，樣品包含基本上純的蛋白質。
另一方面，如此處進一步所描述，本發明提供了篩選的方法和用於表徵、檢測蛋白質複合體的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法。
顯然，一個或多個步驟可以進行組合和/或依次進行(通常以任意順序，只要能夠形成所需要的產物)，並且，很明顯本發明包括此處所述步驟的多種組合。並且如此處所述，也很明顯本發明包括其中初始或第一步是此處所述的任意步驟的方法。本發明的方法包括其中較後的「下遊」步驟是初始步驟的實施方案。
另一方面，本發明提供了包含此處所述的任意數位化抗體組的組合物。在一些實施方案中，這些組合物用於此處所述的任意方法。在一個實施方案中，本發明提供了包含蛋白質與此處所述的任意數位化抗體組形成的複合體的組合物。在另一個實施方案中，本發明提供了包含此處所述的任意數位化抗體組和樣品的組合物。在一些實施方案中，抗體固定化(連接和/或吸附)於固體或半固體表面，例如陣列。在其他實施方案中，抗體是標記的抗體。在一些實施方案中，本發明提供了包含此處所述的數位化抗體組、樣品和一組競爭劑多肽的組合物，其中所述競爭劑多肽包含數位化抗體組中一種或多種數位化抗體的關連胺基酸序列。在一些實施方案中，競爭劑多肽是標記的。
本發明進一步提供了包含此處所述的任意數位化抗體組的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒進一步包含此處所述任意方法的指導說明。在一些實施方案中，抗體固定化(連接和/或吸附)於固體或半固體表面，例如陣列。在其它實施方案中，抗體是標記的抗體。也在其它實施方案中，試劑盒包含此處所述的任意蛋白質結合譜文庫。也在其它實施方案中，試劑盒進一步包含標記物。也在其它實施方案中，試劑盒包含一組競爭劑多肽，其中所述競爭劑多肽包含數位化抗體組中一種或多種數位化抗體的關連胺基酸序列。在一些實施方案中，競爭劑多肽是標記的競爭劑多肽。
抗體結合和檢測抗體結合的方法和條件在本領域中是熟知的並在此處進一步進行描述。在一些實施方案中，與數位化抗體組接觸是依次進行的(即一個抗體與樣品接觸，然後去除，另一個抗體再與樣品相接觸，等等)。在其它實施方案中，與數位化抗體組接觸是平行的，例如，將一組抗體同時與樣品相接觸。在一些實施方案中，幾組2種或多種抗體依次與樣品相接觸，例如，組1接觸並去除，組2接觸並去除，等等。
抗體可以包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白質、以及包含所需特異性的抗原識別位點的任意其它多肽。抗體可以是小鼠、大鼠、兔、雞、人類或任意其它來源的抗體(包括人源化抗體)。
如在定義中所註明，此處所使用的「樣品」包括多種蛋白質樣品類型，包括從個體(包括人類和非人類個體)獲得的蛋白質。樣品也可以從食物、水或空氣獲得。在一些實施方案中，樣品是蛋白質樣品，例如全細胞蛋白質提取物或全細胞提取物的亞分離級分(例如可溶蛋白質、膜結合蛋白質、胞質蛋白質等等)。在其它實施方案中，樣品包括完整的蛋白質複合體，例如受體相關蛋白質複合體。在一些實施方案中，樣品是純(或基本上純)的蛋白質，因此需要進行鑑定。此處進一步描述了用於本發明方法的適當的樣品。在一些實施方案中，樣品包含例如從細胞分離和/或基本上純化的蛋白質複合體。在一些實施方案中，在允許結合的條件下將樣品與數位化抗體組進行接觸的步驟之前可以用蛋白質裂解劑處理樣品。蛋白質裂解劑可以是酶(例如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)或化學製劑(例如溴化氰)。蛋白質裂解劑和用蛋白質裂解劑處理的方法在本領域是熟知的並在此處進一步進行描述。
一般技術除非另外指出，本發明的實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學常規技術，這些技術均包括在本領域的技術之內。此類技術在文獻中進行了充分地說明，例如分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(M.J.Gait編著，1984)；分子生物學方法(Methods in MolecularBiology)，Humana出版社；細胞生物學實驗室手冊(Cell BiologyALaboratory Notebook)(J.E.Cellis編著，1998)，Academic Press；動物細胞培養(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney編著，1987)；細胞核組織培養導論(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)，Plenum Press；細胞和組織培養實驗室規程(Cell andTissue CultureLaboratory Procedures)(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell編著，1993-8)；J.Wiley和Sons；酶學方法(Methods inEnzymology)(Academic Press，Inc.)；實驗免疫學手冊(Handbook ofExperimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell編著)；哺乳動物細胞的基因轉移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos編著，1987)；分子生物學最新實驗方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等編著，1987)；PCR聚合酶鏈式反應(PCRThe Polymerase Chain Reaction)(Mullis等編著，1994)；免疫學最新方案(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等編著，1991)；分子生物學簡短方法(Short Protocols in MolecularBiology)(Wiley和Sons，1999)；免疫生物學(Immunobiology)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗體(Antibodies)(P.Finch，1997)；抗體操作方法(Antibodiesa practical approach)(D.Catty編著，IRL Press，1988-1989)；單克隆抗體操作方法(Monoclonal antibodiesa practicalapproach)(P.Shepherd和C.Dean編著，牛津大學出版社，2000)；使用抗體實驗室手冊(Using antibodiesa laboratory manual)(E.Harlow和D.Lane)(冷泉港實驗室出版社，1999)；以及抗體(Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra編著，Harwood Academic Publishers，1995)。
定義「抗體」是通過位於免疫球蛋白分子可變區內的至少一個抗原識別位點能夠特異性結合靶標例如碳水化合物、多核苷酸、脂類、多肽等等的免疫球蛋白分子。如此處所使用，該術語不僅包括完整的多克隆抗體或單克隆抗體，還包括其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白質、以及包含所需特異性抗原識別位點的免疫球蛋白分子任意其它經修飾的構型。抗體包括任意類的抗體，例如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，並且抗體不必是任一特定的類型。根據其重鏈恆定結構域的抗體胺基酸序列，免疫球蛋白能夠歸為不同的類。有5類主要免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這幾類可以進一步分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同類免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結構和立體構型是眾所周知的。
「Fv」是含有全部抗原識別和結合位點的抗體片段。在雙鏈Fv種類中，該區域為由一條重鏈和一條輕鏈可變結構域組成的緊密非共價結合的二聚體。在單鏈Fv種類，一條重鏈和一條輕鏈可變結構域可通過柔韌多肽接頭進行共價連接，以至於輕鏈和重鏈相結合形成與雙鏈Fv種類類似的二聚體結構。正是在該構型中，每個可變結構域的3個CDR相互作用以限定VH-VL二聚體表面的抗原結合特異性。然而，甚至單一可變結構域(或僅包含抗原特異的3個CDR的Fv部分的一半)也具有識別和結合抗原的能力，儘管通常比全部結合位點具有較低親和性。
「單克隆抗體」指同種抗體總體，其中單克隆抗體包含參與抗原選擇性結合的胺基酸(天然存在的或非天然存在的)。單克隆抗體群體(與多克隆抗體相反)是高度特異性的，也就是說它們直接針對單一抗原性位點。術語「單克隆抗體」不僅包括完整單克隆抗體和全長單克隆抗體，還包括其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白質、以及免疫球蛋白分子的任意其它經修飾的構型，其中所述免疫球蛋白分子包含所需特異性的抗原識別位點並具有結合抗原的能力(見抗體的定義)。對關於抗體的來源或其製備的方式(例如通過雜交瘤、噬菌體篩選、重組表達、轉基因動物等)無意進行限制。
「數位化抗體」是結合(通常特異性結合)由3個連續胺基酸、4個連續胺基酸或5個連續胺基酸組成的小線性多肽表位的抗體。
術語「多肽」、「寡肽」、「肽」和「蛋白質」在此處可替換使用，指任意長度的胺基酸聚合物。聚合物可以是線性的或分枝的，它可以包含經修飾的胺基酸，並且它可以由非胺基酸所打斷。該術語也包括已經天然或通過介入進行了修飾的胺基酸聚合物；這種介入為例如二硫鍵形成、糖基化作用、脂化作用、乙醯化作用、磷酸化作用或任意其它操作或修飾，例如與標記成分相連接。例如含有一個或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)和本領域已知的其它修飾的多肽也包括於該定義範圍內。
「特異地結合」或「優先地結合」(此處可替換使用)至抗體的表位是本領域熟知的術語，並且測定此種特異性或優先性結合的方法也是本領域眾所周知的。如果一個分子與特定細胞或底物反應，或結合比與其它細胞或底物反應或結合更加頻繁、更加快速、持續時間更長和/或親和性更高，稱該分子呈現「特異地結合」或「優先地結合」。如果抗體與一種底物結合比與其它底物結合具有更高的親和性、親合力、更加容易和/或持續時間更長，稱該抗體「特異地結合」或「優先地結合」至靶標。例如，特異性或優先性結合至表位的抗體是與該表位結合比與其它表位結合具有更高親和性、親合力、更加容易和/或持續時間更長的抗體。通過閱讀該定義還可以理解，例如，特異性或優先性結合至第一個靶標的抗體(或部分或表位)可以或者不可以特異性或優先性結合至第二個靶標。像這樣，「特異性結合」或「優先性結合」不是必須需要(儘管可以包括)專一性結合。通常而言，但不是必定的是，談及結合時意思是指優先結合。
「樣品」包括各種樣品類型，包括從個體獲得的那些樣品。該定義包括生物學來源的血或其它液體樣品、諸如活檢標本或組織培養物的實體組織樣品或由其來源的細胞、以及其後代。樣品可以來自諸如細菌、酵母、病毒、類病毒、黴菌、真菌的微生物、植物、動物包括諸如人類、嚙齒類(例如小鼠和大鼠)和猴子(以及其它靈長類)。樣品可以包括單一細胞或多於單一細胞。該定義還包括在其獲得之後以任意方式處理了的樣品，例如通過用試劑處理、增溶作用或富集某種成分諸如蛋白質或多核苷酸。術語「樣品」包括臨床樣品，並且還包括培養的細胞、細胞上清和細胞裂解液。在文中描述了其它形式的樣品。
「檢測」指鑑定所檢測蛋白質的存在、缺乏和/或其量。
此處所使用的結合「缺乏的」或「缺乏」以及「沒檢測到產物」包括無意義的或最低的水平。
數位化抗體「陣列」是一種或多種抗體在物理基質上有序的空間排列。由於在製備和評價此類排列時的相對簡單性，排和列的排列是優選的。然而，空間排列本質上可以是由使用者所選擇的任意形式，並且優選地，但非必須地是該模式。
如此處所使用，除非另外指明，單數形式「一」和「該」包括其複數參照。例如， 「一種」抗體包括一種或多種抗體並且「一種蛋白質」意思是指一種或多種蛋白質。
本發明的數位化抗體組本發明提供了數位化抗體組，其中數位化抗體組包含至少大約15種數位化抗體，其中每種數位化抗體識別不同的小線性肽表位。如此處所使用，「數位化抗體」是結合(通常特異性結合)由3個連續胺基酸、4個連續胺基酸或5個連續胺基酸組成的小線性肽表位的抗體。本發明源自這樣一種觀察，即將識別小的、頻繁存在的多肽表位的抗體(在本領域中通常稱為「交叉反應抗體」)組合使用以產生蛋白質結合模式(例如結合至抗體的模式和/或結合至抗體的強度)。由於表位的特異性，數位化抗體通常識別包含抗體結合小表位的多種蛋白質。因此，結合模式的特異性是通過樣品中數位化抗體組與蛋白質的結合產生的，而不是如在本領域中通常用於特異性檢測那樣通過僅結合一個或少數幾個蛋白質的單一抗體的結合產生的。在抗體結合小表位是已知的範圍內，通過數位化抗體的結合提供了關於數位化抗體所結合蛋白質的胺基酸含量的信息。在此處進一步討論了數位化抗體和製備數位化抗體的方法並在實施例中進行舉例說明。
在一些實施方案中，抗體組包含至少約15種數位化抗體，其中每種數位化抗體結合不同的表位，並且其中每種數位化抗體結合3個連續胺基酸或4個連續胺基酸組成的表位。可以理解，「不同的表位」包括具有重疊胺基酸序列的表位以及具有不同(非重疊)胺基酸序列的表位。在一些實施方案中，抗體組包含至少大約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多種抗體。在其它實施方案中，抗體組包含至少大約100種抗體。在其它實施方案中，抗體組包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位(也稱為3mer表位)的數位化抗體。在一些實施方案中，抗體組包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，和至少大約100種識別由4個連續胺基酸組成的表位(也稱為4mer表位)的數位化抗體。在一些實施方案中，抗體組包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，至少大約100種識別由4個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，和至少大約100種識別由5個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。在另一個實施方案中，抗體組包含至少大約1000種識別由4個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。數位化抗體和製備數位化抗體的方法在此處進一步進行描述。
抗體可以包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等)、單鏈抗體(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白質、以及包含所需特異性抗原識別位點的任意其它多肽(包括抗體模擬物，見例如Xu等，Chem Biol.2002年8月，9(8)933-42)。抗體可以是小鼠、大鼠、兔、雞、人或任意其它來源的抗體(包括人源化抗體)。
如此處所述，數位化抗體結合3、4或5個連續(相繼的)胺基酸的短線性肽表位。在一些實施方案中，數位化抗體結合由3個相繼胺基酸(稱為3mer)、4個相繼胺基酸(稱為4mer)或5個相繼胺基酸(稱為5mer)組成的表位。在其它實施方案中，數位化抗體結合小的不連續線性肽序列，例如線性肽序列YCxC或YxCC，其中「x」代表20種天然胺基酸中的任意一種。另外「x」可以限於2種或多種胺基酸的亞組。可以理解，形成表位的胺基酸可以是線性的或分枝的，並且可以包括已經天然或通過介入修飾的胺基酸；例如通過二硫鍵形成、糖基化作用、脂化作用、乙醯化作用、磷酸化作用或任意其它操作或修飾，例如與標記成分連接。形成表位的胺基酸可以進一步包括例如胺基酸的一個或多個類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及本領域已知的其它修飾。
以前已經描述了結合小線性肽表位的抗體，如表2中所示，見下文。
在一些實施方案中，數位化抗體以至少大約10-7M、至少大約10-8M或至少大約10-9M或更低的親和性結合其關連表位。在一些實施方案中，結合相互作用將鑑定出反應中通過至少2倍、至少5倍、至少10倍至至少100倍或更高的親和性而偶然發生的結合相互作用。
可以理解，除了此處所述的數位化抗體組，還可以使用其它蛋白質結合劑(例如非數位化抗體的抗體)。
顯然，數位化抗體組中數位化抗體的數量取決於所考慮的用途和應用。被數位化抗體所識別的關連胺基酸表位的序列和/或長度的知識允許進行關於該組內數位化抗體所識別的表位的預期頻率的評價。如表1中所示，3mer、4mer和5mer線性肽序列分別具有總數為8,000(203)、160,000(204)和3,200,000(205)的隨機組合。考慮到蛋白質平均長度為500個胺基酸，通過單一抗3mer抗體檢測的可能性為0.0625，當使用15種抗3mer抗體時可能性增加至大約1，並且當使用100種抗3mer抗體時可能性增加至6.25。此類計算是常規的。
表1.短線性胺基酸肽的分布特性
因此，可以理解本發明中所需要的數位化抗體的數量取決於多種因素，包括用途、應用、樣品複雜性(根據預期的或估計的或先前測定的蛋白質的數目，包括諸如剪接變體的蛋白質變體)、樣品中蛋白質的平均大小、樣品中關連表位出現或預測其將要出現的頻率；結合親和性和/或數位化抗體特異性；對靶蛋白質的認識；以及數位化抗體的穩定性。此類因素在本領域中是眾所周知的並在此處進一步進行討論。
可以理解數位化抗體所結合的表位的身份(序列)可以與此處所述的任意方法組合使用以用於例如鑑定蛋白質。通常而言，為了鑑定蛋白質，必須獲得至少約15個至約18個胺基酸的表位信息。因此，在一些實施方案中，必須結合至少大約6種抗3mer數位化抗體、至少大約5種抗4mer數位化抗體、或至少大約4種抗5mer數位化抗體以至於得到至少大約15-18個胺基酸的胺基酸表位信息。在一些實施方案中，至少大約6種數位化抗體用於結合平均長度為大約500個胺基酸的蛋白質。
使用本領域熟知的方法可以產生數位化抗體。以前已經描述了結合小線性肽表位的抗體，以表2所示。
表2.已公開的短抗體表位序列
*DAF和DSF。
**指DGYA、DGYG、SGYA和SGYG。
另一方面，並且如實施例中所例證，通過使用表達一個或多個小肽表位例如由3、4或5個胺基酸組成的小線性肽表位的免疫原可以製備數位化抗體(例如人抗體、人源化抗體、小鼠抗體、嵌合抗體)。
合成多肽的方法在本領域中是眾所周知的。在一些實施方案中，將多肽免疫原合成為多重抗原多肽(multiple antigen polypeptide)或MAP。
如此處進一步所描述，免疫宿主動物的途徑和方案通常與已建立的抗體刺激和產生的常規技術相一致。產生人、小鼠、兔和雞抗體的一般技術在本領域中是已知的並在此處進行描述。一般，用一定量免疫原(包括此處所述的)腹膜內接種宿主動物。
使用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256495-497所述的一般性體細胞雜交技術或使用由Buck，D.W.等，(1982)In Vitro，18377-381改進的技術能夠從淋巴細胞或永生化骨髓瘤細胞製備雜交瘤。可獲得的骨髓瘤細胞系包括但不限於X63-Ag8.653和來自美國加利福尼亞聖地牙哥SalkInstitute，Cell Distribution Center的那些細胞，可以用於雜交。一般而言，該技術涉及使用諸如聚乙二醇促融劑或通過本領域技術人員熟知的電激方法將骨髓瘤細胞和淋巴細胞融合。融合之後，從融合培養基中分離細胞並使其生長於選擇培養基如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養基中以消除未雜交的親本細胞。任意此處所述添加或不添加血清的培養基能夠用於培養分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為另一種可選擇的細胞融合技術，EBV永生化的B細胞可以用於產生本發明的數位化抗體。如果期望，將雜交瘤進行擴增並亞克隆化，並且通過常規免疫測定程序(例如放射免疫測定法、酶免疫測定法或螢光免疫測定法)測定上清液的抗免疫原活性。
可以用作抗體來源的雜交瘤包括產生數位化抗體(例如單克隆抗體)或其部分的親本雜交瘤的所有衍生體、子代細胞。
使用已知的程序，可以使產生此種抗體的雜交瘤在體外或體內生長。通過常規免疫球蛋白純化程序，例如硫酸銨沉澱、凝膠電泳法、透析、層析，並且如果期望還可進行超濾，可以從培養基或體液中分離單克隆抗體。如果存在不希望的活性，例如通過在由吸附於固相上的免疫原製成的吸附劑上進行製備並從免疫原上洗脫或釋放預期的抗體能夠將其去除。用人或其它物種的小表位受體、或者人或其它物種的小表位受體的片段、或含有使用雙功能劑或衍生劑偶聯至在被免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質上的靶的人或其它物種的小表位受體或片段對宿主動物進行免疫能夠產生大量抗體(例如單克隆抗體)，其中所述在被免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質諸如匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑，其中所述雙功能劑或衍生劑例如馬來醯亞胺苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，這裡R和R1是不同的烷基。
如果期望，可以對目的數位化抗體(單克隆或多克隆)進行測序並且然後可以將多核苷酸序列克隆入表達或增殖載體。編碼目的抗體的序列可以存在於宿主細胞中的載體中並且然後可以擴增宿主細胞並凍存以供將來使用。另外，多核苷酸序列可以用於遺傳操作以「人源化」抗體或提高抗體的親和性或其它特性。例如，恆定區可以設計加入更多類似的人恆定區以避免當抗體用於人類臨床試驗或治療時產生的免疫反應。可以期望對抗體序列進行遺傳操作以獲得對小表位更高的親和性和/或對小表位更高和/或改變的特異性。對於本領域的任一技術人員，顯然能夠對數位化抗體進行一個或多個多核苷酸的改變而仍然保持其對小表位的結合能力。
已經描述了大量包含非人免疫球蛋白來源的抗原結合位點的「人源化」抗體分子，包括具有齧齒動物或經修飾的齧齒動物V區以及它們的融合至人恆定區的相關互補決定區(CDR)的嵌合抗體。參見，例如Winter等.Nature 349293-299(1991)、Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 864220-4224(1989)、Shaw等，Immunol.1384534-4538(1987)和Brown等，Cancer Res.473577-3583(1987)。其它參考文獻描述了在與適當的人抗體恆定結構域融合之前已移植入人支持構架區(FR)的齧齒動物CDR。參見，例如，Riechmann等，Nature 332323-327(1988)、Verhoeyen等，Science2391534-1536(1988)和Jones等，Nature 321522-525(1986)。另一篇參考文獻描述了由重組的組合(veneered)齧齒動物框架區所支持的齧齒動物CDR。參見，例如，歐洲專利申請號519,596。將這些「人源化」分子設計為使不需要的針對齧齒動物抗人抗體分子的免疫應答降到最低，這種免疫應答會限制那些分子在人類接受著中治療性應用的持續時間和效果。例如可對抗體恆定區進行設計，從而使其成為免疫惰性的(例如，不引發補體裂解)。參見，例如，PCT/GB99/01441；英國專利申請號9809951.8。對單克隆抗體人源化存在4個通用步驟，它們是(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的胺基酸序列，(2)設計人源化抗體，例如確定人源化過程中所使用的抗體構架區，(3)進行人源化的確切方法/技術和(4)人源化抗體的轉染和表達。參見，例如，美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089和6,180,370。其它還可以使用的人源化抗體的方法公開於Daugherty等，Nucl.Acids Res.192471-2476(1991)和美國專利號6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671；6,350,861和PCT申請號WO01/27160。
另外，通過使用商業可得的已經進行工程操作而表達特異性人免疫球蛋白蛋白質的小鼠可以獲得完全的人抗體。經過設計產生更加期望(例如完全人抗體)或更強免疫應答的轉基因動物也可以用於產生人源化的或人抗體。此種技術的實例為Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM和Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse和TC MouseTM。
另外，使用任意本領域已知的方法可以重組製備和表達抗體。另外，通過噬菌體展示技術可以重組製備抗體。參見，例如，美國專利號5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；以及Winter等，Annu.Rev.Immunol.12433-455(1 994)。
另外，噬菌體展示技術(McCafferty等，Nature 348552-553(1990))能夠用於從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結構域基因庫(repertoires)在體外產生人抗體和抗體片段。例如，針對大的合成多肽集合，可以對現有抗體噬菌體展示文庫進行平行淘洗。根據該技術，將抗體V域基因結構內(in-frame)克隆入絲狀噬菌體例如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，並作為功能性抗體片段展示於噬菌體顆粒表面。由於絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基於抗體功能特性的篩選也導致可篩選編碼展示這些特性的抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示能夠以多種形式進行；綜述參見，例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinionill Structural Biology 3，564-571(1993)。幾種來源的V-基因片段能夠用於噬菌體展示。Clackson等，Nature 352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因小隨機組合文庫分離到抗噁唑酮抗體的多種陣列。可構建來自未免疫人供者的V基因所有組分並且根據Mark等，JMol.Biol.222581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述的技術能夠基本上分離針對不同抗原(包括自身抗原)陣列的抗體。在天然免疫反應中，抗體基因積累高頻率的突變(體細胞高度突變)。所導入的一些變化將賦予更高的親和力，並且呈現高親和力表面免疫球蛋白的B細胞在隨後的抗原激發免疫反應過程中優先進行複製和分化。通過應用已知的「鏈改組(chain shuffling)」技術(Marks等，BiolTechnol.10779-783(1992))能夠模擬該天然過程。在該方法中，通過用未免疫供體來源的V結構域基因的所有天然存在的變體(所有組分)連續替換重鏈和輕鏈V區基因，能夠提高由噬菌體展示獲得的「原代(primary)」人抗體的親和力。該技術允許產生在pM-nM範圍內具有親和性的抗體或抗體片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.212265-2266(1993)已經描述了製備非常大的噬菌體抗體庫(也稱為「一切文庫的根源」)的策略。基因改組(gene shuffling)也可用於從齧齒動物抗體產生人抗體，此時人抗體具有與起始齧齒動物抗體相似的親和性和特異性。按照該方法(該方法也稱為「表位指紋」)用人V結構域基因庫替換通過噬菌體展示技術獲得的齧齒動物抗體的重鏈或輕鏈V結構域基因，產生齧齒動物-人嵌合抗體。對抗原的篩選導致分離能夠恢復功能性抗原結合位點的人可變區，即表位控制(顯著影響)配體的選擇。當為了替換剩餘的齧齒動物V域而重複該操作時，獲得了人抗體(參見PCT公開號WO 93/06213，1993年4月1日公布)。與常規的通過CDR移接進行齧齒動物抗體人源化不同，該技術完整地提供了人抗體，這些抗體沒有構架或齧齒動物來源的CDR殘餘。顯然，儘管上述討論是關於人源化抗體的，但所討論的一般原則也適用於製備用於諸如狗、貓、靈長類、馬和牛的抗體。
通過首先分離從宿主動物製備的抗體、獲得基因序列並利用該基因序列在宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表達抗體，可以重組製備抗體。可以被應用的另一種方法是在植物(例如菸草)、轉基因奶牛或其它生物體中表達抗體序列。已經描述了在植物或奶牛中重組表達抗體的方法。參見，例如，Peeters等(2001)Vaccine 192756；Lonberg，N.和D.Huszar(1995)Int.Rev.Immunol 1365；和Pollock等(1999)J Immunol Methods231147。製備抗體衍生物例如人源化抗體、單鏈抗體等的方法是本領域熟知的。
免疫測定和諸如螢光激活細胞分選術(FACS)的流式細胞儀分選技術也能夠應用於分離對目的小表位特異的抗體。
可將抗體結合到多種不同的載體上。載體可以是活性的和/或惰性的。眾所周知的載體的例子包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、澱粉酶、玻璃、天然和經修飾的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁珠。用於本發明目的載體的性質可以是可溶的或者不溶的。本領域的技術人員知道用於結合抗體的其它適當的載體，或者能夠使用常規試驗確定此類載體。
如本領域中已知，可以分離編碼數位化抗體的DNA並進行序列分析。一般而言，抗體(例如單克隆抗體)易於分離並可使用常規程序進行序列分析(例如，通過使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞可用作此種cDNA優選的來源。一旦分離後，可以將DNA置於表達載體，然後將其轉染入宿主細胞，諸如大腸桿菌(E.coli)細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或者不另外產生免疫球蛋白蛋白質的骨髓瘤細胞，以獲得在重組宿主細胞中單克隆抗體的合成。該DNA也可以是經修飾的，例如用人重鏈和輕鏈恆定結構域編碼序列替換同源的小鼠序列(Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.816851(1984))，或者通過將全部或部分非免疫球蛋白多肽編碼序列共價連接至免疫球蛋白編碼序列上。以該方式，製備了具有此處數位化抗體(例如單克隆抗體)結合特異性的「嵌合」或「雜交」抗體。
使用本領域眾所周知的方法可以表徵數位化抗體，其中一些方法描述於實施例中。例如，一個方法是鑑定其結合的表位，包括弄清楚抗體-抗原複合體的晶體結構、競爭作用測定、基因片段表達分析、以及基於合成多肽的測定，例如Harlow和Lane在Using Antibodies，a Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，紐約，1999)一書的第11章描述的。在另一個實例中，表位圖譜能夠用於確定數位化抗體結合的序列。表位圖譜可從多種來源商業獲得，例如，Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad，The Netherlands)。能夠分離或合成(例如重組)不同長度的多肽並將其與抗數位化抗體用於結合測定。在另一個實例中，利用來自小表位細胞外序列的重疊多肽並測定通過數位化抗體的結合，能夠在系統性篩選中確定數位化抗體所結合的表位。如在本領域中眾所周知，利用展示在噬菌體顆粒表面的隨機多肽序列的大文庫(噬菌體文庫)也能夠鑑定某些表位。
競爭作用測定能夠用於確定2個抗體是否通過識別相同的或空間上重疊的表位而結合相同的表位。一般是，將抗原固定於多孔板上並測定未標記抗體阻斷已標記抗體的結合的能力。此類競爭作用測定的通用標記物是放射性標記物或酶標記物。
數位化抗體可以連接於試劑(例如生物素、寡核苷酸、apatmer)、標記劑(也可稱為「標記物」)，例如螢光分子(例如半抗原或螢光珠)、固體支持物(例如珠或基質，包括微點陣或多孔板)；或者本領域已知的任意其它製劑。連接可以是共價的或非共價的。將抗體連接至此類製劑的方法在本領域中是眾所周知的。參見，例如，Kennedy等(Clin.Chim.Acta701-31(1976))和Schurs等(Clin.Chim.Acta 811-40(1977))(描述了偶聯技術，包括戊二醛方法、高碘酸鹽方法、二馬來醯亞胺方法、間馬來醯亞胺苯甲基-N-羥基-琥珀醯亞胺酯方法，這些方法全部在此處引用作為參考)。此處進一步描述了檢測方法，包括使用適當的標記物。
適於固定化、結合和/或連接抗體(以及進行修飾使固體支持物適於固定化抗體)的固體或半固體支持物在本領域中是眾所周知的。固體支持物的例子包括珠子(包括磁化珠)、微孔板、蛋白質微點陣(例如，Zyomyx，Inc.所擁有的技術，參見，例如美國專利號6,365,418)。因此，例如，包附在二氧化矽外殼中的CdSe-CdS核心殼納晶體易於衍生化以偶聯生物分子。Bruchez等(1998)Science 2812013-2016。同樣，將強螢光量子點(具硫化鋅帽的硒化鎘)共價偶聯於生物分子以用於超靈敏的生物學檢測。Warren和Nie(1998)Science 2812016-2018。從Luminex和Quantum Dot可以購買到螢光標記的珠子。另外，襯墊、薄膜、納米孔或微流通道(microfluid channel)也能夠用作固體支持物。在一些實施方案中，將數位化抗體固定於、結合於或連接於固體或半固體表面，例如聚偏二氟乙烯、硝化纖維素、瓊脂糖和/或聚丙烯醯胺凝膠墊。也能夠使用用醛、多聚賴氨酸或同功能(homofunctional)交聯劑活化的載玻片。在一些實施方案中，可將數位化抗體排列成三維陣列，例如在Mirzabekov等，Nucleic Acids Res24(15)2998-3004(1996)中所描述的三維聚丙烯醯胺凝膠墊微點陣。
使用數位化抗體組的方法產生蛋白質結合譜的方法另一方面，本發明進一步提供了使用數位化抗體組的方法。本發明源自這樣的發現，即組合使用識別小多肽表位的抗體(本領域中通常命名為「交叉反應抗體」)以在抗體組中的抗體和樣品中的蛋白質之間產生特殊結合模式，其中蛋白質結合模式稱為蛋白質結合譜，可以用於表徵或「指紋」蛋白質樣品。因此，如通常用於領域中的特異性檢測，通過數位化抗體組與樣品中蛋白質的結合(從而產生特異的蛋白質結合譜)，而不是通過單一抗體與一個或幾個蛋白質的結合，賦予了由抗體結合產生的結果和信息的特異性。
總體來看，涉及利用此處描述的任意數位化抗體組產生樣品的蛋白質結合譜的方法，包括(a)將樣品與數位化抗體組相接觸，和(b)如果可形成複合體的話，檢測在樣品中的蛋白質和每種數位化抗體之間形成的抗體-蛋白質複合體。檢測抗體-蛋白質複合體可以是直接檢測，或者通過間接檢測，例如使用競爭測定法。適當的檢測方法在本領域中是眾所周知的並且在此處進行了描述。檢測提供了關於結合存在或缺乏、以及結合量(結合的強度)的信息。一般而言，蛋白質結合譜包含關於蛋白質結合的存在(或缺乏)和/或由每種數位化抗體結合的蛋白質強度(量)。圖2描述了利用計算機模擬的一組100種不同的數位化抗體而製備的計算機模擬蛋白質結合譜。X軸對應100種數位化抗體的每一種，而Y軸代表所結合的蛋白質的量。每個條形柱對應由每種數位化抗體所結合的蛋白質的量。另外的計算機模擬蛋白質結合譜示於圖3。
相應地，在一些實施方案中，本發明提供了產生樣品的蛋白質結合譜的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質(在一些實施方案中，去除非特異性結合的蛋白質)；和(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜。應該理解蛋白質結合譜包括關於缺乏數位化抗體與蛋白質之間的結合的信息。檢測可以是定性的和/或定量的。在一些實施方案中，蛋白質是標記的，並且檢測包括使用本領域眾所周知的方法檢測與蛋白質上標記物結合的存在或缺乏和/或量(強度)，並在此處進行了描述。在其它實施方案中，使用競爭測定，其中標記的肽(或肽混合物)用於競爭與蛋白質樣品結合的抗體。一般而言，在涉及競爭劑多肽使用的實施方案中，這些方法進一步包括將數位化抗體與競爭劑多肽相接觸(與樣品組合和/或與樣品依次使用)。檢測方法在本領域中是眾所周知的，並在此處進一步進行描述。
一般而言，產生蛋白質結合譜的方法進一步包括用蛋白質裂解劑處理樣品的步驟，從而產生多肽片段。在步驟(a)在允許結合的條件下將樣品與一組數位化抗體相接觸之前，可用蛋白質裂解劑處理樣品。蛋白質裂解劑可以是酶(例如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)或化學試劑(例如溴化氰)。蛋白質裂解劑和用蛋白質裂解劑進行處理的方法在本領域中是眾所周知的並在此處進一步進行描述。
如此處進一步所討論，蛋白質結合譜可以與關於樣品諸如樣品來源(例如諸如細菌和/或病毒來源)的信息具有相關性。例如，如果對於細菌家族的幾個成員已經確定蛋白質結合模式，則可將新產生的模式迅速進行比較以判斷該模式是否是該家族的成員或者是否代表新的成員。如此處進一步所討論，蛋白質結合譜可以進行記錄並存儲於蛋白質結合譜文庫(例如資料庫)。
另一方面，本發明提供了使用此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜。
應該理解不必具有關於所要分析的蛋白質的同一性的先驗知識也可以產生蛋白質結合譜，並且已知的和未知的蛋白質都可以進行檢測。由於不需要關於蛋白質樣品含量的信息，蛋白質結合譜也可以用於鑑定或檢測先前未知的因子，例如新病原體。例如，與先前已經見到的蛋白質結合譜不同的蛋白質結合譜表示一種先前未知的因子。
抗體結合的方法和條件在本領域中是眾所周知的並在此處進一步進行描述。在一些實施方案中，與2種或多種抗體相接觸是相繼進行的(如一個抗體先與樣品接觸，然後去除該抗體，將另一個抗體與樣品接觸並去除，等等)。在其它實施方案中，與數位化抗體組相接觸是平行的，例如，一組抗體同時與樣品相接觸。在一些實施方案中，幾組數位化抗體組連續與樣品相接觸，例如，組1接觸並去除，組2接觸並去除，等等。
檢測蛋白質-抗體結合的方法和條件在本領域中是眾所周知的。結合至數位化抗體的蛋白質的檢測可以是定性的或定量的。可檢測一組中多種(通常，大量)抗體的結合。在一些實施方案中，檢測到一組抗體中至少大約95％、至少大約90％、至少大約75％、至少大約50％或至少大約30％抗體的結合。在一些實施方案中，檢測到一組抗體中每種抗體的結合。檢測抗體結合的方法在本領域中是眾所周知的並且包括例如ELISA、螢光免疫測定法、Western和斑點印跡、免疫沉澱、使用競爭劑多肽的競爭測定法和局部免疫測定法。通過對測試和對照樣品進行平行測試並記錄樣品之間結果的任何差別，能夠確定蛋白質結合譜中的改變。例如，ELISA的結果可與存在的蛋白質的量直接相關。在一些實施方案中，蛋白質是標記的，並且標記物是可檢測的。在其它實施方案中，競爭劑多肽(如此處進一步所描述)是標記了的，並且競爭劑多肽的結合是可檢測的。適當的標記物在本領域中是眾所周知的，並且在此處進一步進行描述。
產生蛋白質結合譜文庫的方法通過彙編2個或多個不同樣品例如致病的或非病原體細菌樣品的蛋白質結合譜能夠產生蛋白質結合譜文庫。為了辨別蛋白質結合模式中的相似性和/或差別，能夠將蛋白質結合譜彼此進行定性或定量比較。文庫中的蛋白質結合譜也能夠用於涉及不同來源(例如，來自不同組織或細胞、疾病狀態或不同微生物)樣品蛋白質結合譜的比較鑑定的方法。如此處進一步所描述，例如，蛋白質結合譜文庫用於表徵蛋白質樣品的方法、診斷細菌或病毒感染的方法、和/或細菌或傳染原的檢測和/或分類學上分類的方法。例如，由未鑑定樣品製備的蛋白質結合譜可以用於通過與已知細菌病原體的蛋白質結合譜文庫進行比較來表徵和/或鑑定樣品。
因此，另一方面，本發明提供了產生蛋白質結合譜文庫的方法，包括步驟(a)在允許結合的條件下將樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質(在一些實施方案中，去除非特異性結合的蛋白質)；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)用至少2個不同的樣品重複步驟(a)至(c)。在一些實施方案中，文庫包含至少大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或更多(例如1000、2000、3000、4000或更多)個結合譜。在一些實施方案中，方法進一步包括在步驟(a)在允許結合的條件下將數位化抗體組與樣品相接觸之前用蛋白質裂解劑處理樣品的步驟。在一些實施方案中，文庫進一步包含如此處所述的表位身份信息。
另一方面，本發明提供了蛋白質結合譜文庫，其中文庫是利用此處所述的任意方法製備的。
應該理解，蛋白質結合譜文庫可以包含在不同時間、通過不同個體和/或用不同設備產生的結合譜。在一些實施方案中，結合譜是在相同時間或不同時間產生的，並且隨後集合成不同的文庫。隨著新結合譜的產生，可對結合譜文庫不斷進行更新。
如本領域中眾所周知，結合譜文庫能夠用軟體進行處理並存儲於資料庫中。隨著對更多樣品進行分析且更多結合譜的產生，資料庫可不斷進行更新。結合譜能夠通過多種方法加以分類，例如通過樣品來源、結合譜的相似性，等等。例如，細菌樣品的結合譜基於其表現型或基因型可以進行集合。另外，現有分類學的分類可能依賴於結合譜的分型。在一些實施方案中，文庫包含從含有或源自原核細胞，例如細菌；真核細胞，例如癌或癌前細胞；和/或其它微生物，例如病毒(包括細菌或病毒感染的診斷)，的樣品所產生的蛋白質結合譜。
另一方面，本發明提供了使用此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫。
使用蛋白質結合譜的方法另一方面，本發明提供了使用根據本發明方法所產生的蛋白質結合譜(包括蛋白質結合譜文庫)的方法。因此，如此處進一步所描述，本發明提供了表徵測試樣品(例如懷疑包含目的樣品的測試樣品)的方法；檢測存在或缺乏測試樣品和/或對其進行鑑定的方法；表徵細胞、細菌和/或病毒的方法；鑑定測試蛋白質的方法；表徵、檢測蛋白質複合體存在和/或缺乏和/或對其進行鑑定的方法；以及篩選的方法。
使用蛋白質結合譜和表位胺基酸序列鑑定蛋白質的方法本發明還提供了使用(a)從包含該蛋白質的樣品產生的蛋白質結合譜；和(b)由結合樣品蛋白質的數位化抗體所識別的表位的胺基酸序列來鑑定蛋白質的方法，由此與大約5種或更種(例如大約6、大約7、大約8種或更多種)抗體的一組數位化抗體的結合(通常提供大約15-18個胺基酸序列信息)提供了足夠的關於蛋白質胺基酸含量的信息，以至於可以鑑定該蛋白質。通過舉例的方式表明，識別表位QAP、TPG、LTG、VSR和WDQ的數位化抗體同時結合至測試蛋白質上鑑定出該蛋白質為HCV NS3蛋白質，因為HCV NS3蛋白質是唯一已知的包含這6種3mer胺基酸序列的蛋白質。
相應地，另一方面，本發明提供了鑑定測試蛋白質的方法，所述方法包括(a)將包含測試蛋白質的樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與該組中的抗體結合的存在或缺乏，其中至少大約5種數位化抗體結合蛋白質；其中結合的存在表明該蛋白質中至少大約5個表位的存在或缺乏，其中至少大約5個表位的身份(即線性胺基酸序列)(並且，在一些實施方案中，至少大約5個表位的量)用於鑑定蛋白質。在一些實施方案中，與大約6種、大約7種、大約8種、大約9種、大約10種、大約11種、大約12種、大約13種、大約14種、大約15種、大約20種、大約25種、大約30種或更多種(例如大約40、50、60或更多種)數位化抗體的結合和表位身份用於鑑定測試蛋白質。
在一些實施方案中，這些方法進一步包括將表位身份數據與包含蛋白質序列信息(例如核苷酸或胺基酸序列)的資料庫進行比較。資料庫可以包括已表達序列標誌(EST)的核苷酸或胺基酸序列。另外，資料庫可以由核苷酸或胺基酸水平的基因序列組成。資料庫可包括但不限於核苷酸序列、胺基酸序列或包含於任意物種基因組中的核苷酸序列的翻譯序列的集合。關於蛋白質信息(例如核苷酸或胺基酸序列)的資料庫一般通過電腦程式或任選地由計算機執行的查找算法進行分析。將來自序列資料庫的信息與由本發明方法獲得的數據和信息(參見，例如，Yates(1998)J.Mass Spec.331-19；Yates等，美國專利號5,538,897；Yates等，美國專利號6,017,693)進行最佳匹配的查找。用於查找資料庫的任意適當的算法或電腦程式均能夠被使用。查找算法和資料庫是在不斷更新的，並且根據本發明將使用此類更新的版本。程序或資料庫的例子能夠發現於環球網(WWW)http//base-peak.wiley.com/、http//mac-mann6.embl-heidelberg.de/MassSpec/Software.html、http//www.mann.embl-eidelberg.de/Services/PeptideSearch/Peptide SearchIn-tro.html、ftp//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/和http//donatello.ucsf.ed-u。美國專利號5,632,041；5,964,860；5,706,498和5,701,256也描述了用於序列比較的算法和方法。資料庫的其它例子包括Genpept資料庫、GenBank資料庫(描述於Burks等(1990)Methods in Enzymology 1833-22)、EMBL數據文庫(描述於Kahn等(1990)Methods in Enzymology18323-31)、蛋白質序列資料庫(描述於Barker等(1990)Methods inEnzymology 18331-49)、SWISS-PROT(描述於Bairoch等(1993)NucleicAcids Res.，213093-3096)和PIR-International(描述於(1993)Protein Seg.Data Anal.567-192)。在一些實施方案中，本發明還提供了確定蛋白質身份的方法，其中程序控制的數位化計算機用於訪問含有一個或多個蛋白質序列資料庫的資料庫。在一些實施方案中，資料庫進一步包含表位序列信息(即由數位化抗體組識別的小關連表位的序列)。另一方面，本發明提供了包含表位序列信息的資料庫，以用於此處所述的鑑定蛋白質的任意方法。
蛋白質樣品可以包含純蛋白質，或者，在一些實施方案中，包含基本上純的蛋白質。通常應該理解，蛋白質樣品可以是由此處所述的多種來源製備得到的蛋白質樣品。在一些實施方案中，將從懷疑包含目的蛋白質(例如，細菌或病毒蛋白質)的測試樣品產生的蛋白質結合譜與從參照樣品(即對照樣品)產生的蛋白質結合譜相比較，並且兩個譜之間的差別用於分析如上述的表位結合和表位身份信息，其中目的蛋白質被鑑定。作為實例，圖3描述了使用計算機模擬的一組100種不同數位化抗體，從包含一種或多種病毒蛋白質的樣品(圖3A)和對照樣品(圖3B)製備得到的計算機模擬蛋白質結合譜。X軸對應100種數位化抗體的每一種，而Y軸代表所結合蛋白質的量。每個條形柱對應由每種數位化抗體所結合的蛋白質的量。圖3C描述了從病毒樣品蛋白質結合譜減去對照蛋白質結合譜之後的蛋白質結合譜。
包括檢測的方法本發明提供了檢測(包括診斷)、確定目的樣品例如包含或來源於諸如原核細胞(例如細菌，如致病菌)；真核細胞；哺乳動物細胞(例如癌或癌前細胞)的樣品的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，或者提供了檢測和/或診斷其它傳染、汙染、疾病和/或異常的存在或缺乏的方法(包括癌的類型和/或期的檢測、或癌前細胞的鑑定)。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物(例如人)細胞。在其它實施方案中，細胞是非人類哺乳動物(例如奶牛、馬或狗)細胞。在一些實施方案中，細胞是人、小鼠或靈長類細胞。
一般而言，這些方法包括產生懷疑包含目的樣品的測試樣品的蛋白質結合譜，其中測試樣品為例如懷疑包含細胞、細菌和/或病毒的樣品，或者期望檢測細胞(例如哺乳動物細胞，如人)、細菌和/或病毒的存在或缺乏的樣品。將測試樣品的蛋白質結合譜與已知細胞、細菌和/或病毒的蛋白質結合譜相比較，和/或與結合譜文庫例如已知細菌和/或病毒的結合譜文庫相比較。測試結合譜與對照結合譜(在一些實施方案中，是結合譜文庫的成員)之間存在顯著相似性(包括匹配)表明目的樣品的存在和/或特性。缺乏匹配可以表明存在先前未鑑定的樣品例如先前未鑑定的致病微生物，和/或樣品中缺乏特定細菌和/或病毒。如此處所使用，「缺乏」包括最低和/或結合的背景水平。
因此，另一方面，本發明提供了確定目的樣品存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將懷疑包含目的樣品的測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較確定目的樣品的存在或缺乏和/或對其進行鑑定。
另一方面，本發明提供了檢測目的樣品存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將懷疑包含目的樣品的測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與通過此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較確定測試樣品中目的樣品的存在或缺乏和/或對其進行鑑定。
一方面，本發明提供了確定測試樣品中細胞、細菌或病毒存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較確定測試樣品中細胞、細菌或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定。
另一方面，本發明提供了檢測測試樣品中細胞、細菌和/或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與與通過此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較確定測試樣品中細胞、細菌或病毒的存在或缺乏和/或對其進行鑑定。
另一方面，本發明提供了鑑定蛋白質的方法，所述方法包括將測試蛋白質的蛋白質結合譜與參照蛋白質的蛋白質結合譜相比較，其中參照蛋白質的蛋白質結合譜與參照蛋白質的身份相關；其中測試蛋白質的身份是通過比較確定的；並且其中已經使用此處所述的產生蛋白質結合譜的任意方法產生了蛋白質結合譜。
在診斷疾病、預測即將到來的衛生公害、監測儲藏食品和穀物中潛在的汙染、調整生物工藝操作和識別環境汙染包括使用生物武器的汙染方面，快速和準確的微生物鑑定是關鍵性的。在一些實施方案中，細菌和/或病毒是致病的。在其它實施方案中，細菌和/或病毒是非致病的。在其它實施方案中，細菌和/或病毒是新的或者是先前已鑑定的細菌和/或病毒的變體。
在一些實施方案中，對細菌的型、亞型、變體、門、綱、目、科、屬和/或種進行鑑定。如本領域中眾所周知，微生物蛋白質表達的研究可以用於確定同屬的成員之間的關係和不同屬的成員之間的進化關係。在一些實施方案中，可建立種之間和不同屬的成員之間有用的同源性和親緣性。例如，可對不同微生物物種的蛋白質結合譜進行組合和比較，並且結果可以輸入資料庫並用於產生基於它們的蛋白質結合譜的家族關係樹徑記錄圖。顯然，一旦建立家族關係樹徑記錄圖，新的微生物樣品能夠基於其蛋白質結合譜進行分類。
在其它實施方案中，微生物菌株的蛋白質結合譜可以鑑定呈現新表現型的菌株，對於例如呈現化學抗性、改變的致病模式、或改變的應激反應、營養限制或遺傳操作，可通過蛋白質結合譜比較，從而與這些情況相關的相對蛋白質豐富度相互關聯。
在其它實施方案中，測試樣品蛋白質結合譜和已知蛋白質結合譜之間缺乏顯著相似性和/或匹配可以鑑定新菌株或新變體。也在其它實施方案中，基於該結合譜與其它結合譜的相似性程度能夠對新菌株/變體進行分類。
樣品的製備和作為例子的樣品在此進行了描述並且在本領域中是眾所周知的。應該理解，能夠從其來源(例如，個體、食品、空氣、水，以及其它環境樣品)中取出包含細菌和/或病毒的樣品；在培養物中生長，從而在製備蛋白質樣品之前使細菌和/或病毒繁殖、富集和/或純化(在一些實施方案中，為基本上純化的)。在一些實施方案中，蛋白質是從全細胞提取物製備得到的。在其它實施方案中，通過亞細胞定位(例如，膜和細胞質)或不同的物理和功能特性，能夠將蛋白質預先分為不同級分。蛋白質也能夠從培養物上清中提取得到。在一些實施方案中，病毒蛋白質樣品是從血清和/或血漿和/或任意其它適當的體液製備的。
在一些實施方案中，本發明的方法用於檢測、確定癌細胞和/或組織的存在或缺乏和/或對其進行鑑定，包括(在一些實施方案中)檢測(診斷)癌類型、期和/或分化水平。在一些實施方案中，檢測了癌前細胞。
因此，一方面，本發明提供了確定(診斷)測試樣品中癌細胞或組織存在或缺乏和/或對其進行鑑定(包括鑑定癌的類型和/或癌的期)的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較確定測試樣品中癌細胞或組織的存在或缺乏和/或對其進行鑑定。
另一方面，本發明提供了檢測測試樣品中癌細胞或組織的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與通過此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較確定測試樣品中癌細胞或組織的存在或缺乏和/或對其進行鑑定。
表徵樣品的方法蛋白質結合譜可以用於表徵樣品，這通常涉及不同來源樣品(例如，來自不同組織或細胞類型、疾病狀況、進行不同處理的細胞或不同微生物)蛋白質結合譜的比較鑑定。在一些實施方案中，這些方法包括將由測試樣品產生的蛋白質結合譜與參照蛋白質結合譜(例如從對照樣品產生的蛋白質結合譜或正常值)相比較，或者使用此處所述任意方法所產生的譜的文庫相比較。
因此，一方面，本發明提供了表徵測試樣品(懷疑包含目的樣品)的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較表徵測試樣品。
另一方面，本發明提供了表徵測試樣品(例如懷疑包含目的樣品的測試樣品)的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與通過此處所述的任意方法所產生的蛋白質結合譜文庫進行比較，從而通過比較表徵測試樣品。在一些實施方案中，表徵包括對樣品中細菌或病毒的分類(例如門、綱、目、科、屬、種和/或其任意亞型、變體和/或亞類)。在其它實施方案中，表徵包括對樣品中細胞如癌或癌前細胞的分類。在一些實施方案中，確定了癌的類型、期、級和/或其他相關診斷特性。
表徵蛋白質結合複合體的方法和篩選的方法特異的蛋白質-蛋白質相互作用對於絕大部分細胞功能都是重要的。通常，這些蛋白質-蛋白質相互作用改變對應於細胞外刺激。細胞中蛋白質-蛋白質相互作用的測量能夠促進驗證相互作用的生理學意義，並且有助於鑑定對應於生理學刺激(包括由於使用藥物或其它化學藥品而產生的刺激)在細胞或有機體內發生的改變。因此，一方面，本發明提供了表徵蛋白質複合體的方法。通常而言，表徵蛋白質複合體的方法涉及產生蛋白質複合體的蛋白質結合譜的方法。作為一般概況，蛋白質複合體(例如受體相關的蛋白質複合體或信號轉導相關的蛋白質複合體)是通過本領域已知的方法進行製備的，並且通過此處所述的任意方法產生經分離的變性或天然狀態的蛋白質複合體和蛋白質結合譜。
從經分離的蛋白質複合體產生的蛋白質結合譜可以用於此處所述的任意方法中，例如用於表徵樣品(在該情況下，樣品包含蛋白質複合體)的方法中，以及用於檢測樣品的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法中。
另一方面，發明提供了能夠用於測試化學組合物以確定該化學組合物是否促進和/或阻斷蛋白質複合體中一種或多種相互作用的方法。認為能夠促進和/或阻斷蛋白質-蛋白質相互作用的化學組合物可以構成有用的醫藥品。而且，將來對於複合體中成分減少、增加、當正常應存在時其缺乏、或當正常應缺乏時其存在的複合體中成分進行的表徵或鑑定可以提供關於潛在的藥物靶標的信息。
認為可以將一個細胞或細胞群與測試化學組合物、從細胞製備的蛋白質進行接觸，並使用此處所述的任意方法製備並分析蛋白質結合譜。因此，一方面，本發明提供了篩選改變樣品蛋白質組成的化學組合物的方法，所述方法包括(a)用化學組合物處理樣品；(b)在允許結合的條件下將用化學組合物處理的測試樣品(或從測試樣品製備和/或富集和/或純化的蛋白質)與此處所述的任意數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將用化學組合物處理的測試樣品的蛋白質結合譜與未用化學組合物處理的參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較表徵化學組合物。
小分子化學組合物的文庫和其它集合在本領域中是眾所周知的。
在一些實施方案中，篩選方法用於研究多種情況下任意蛋白質-蛋白質相互作用，包括功能轉錄複合體(例如雌激素受體複合體)的形成、信號轉導通路、細胞骨架組建(例如微管聚合作用)、多肽激素受體-配體結合、多亞基酶複合體組建，等等，都是特別有興趣的。
在一些實施方案中，通過諸如柱層析法的常規方法，基於蛋白質複合體的大小或活性對其進行分離。在其它實施方案中，當分析DNA/RNA-結合蛋白質複合體時，結合至複合體的DNA/RNA序列能夠用於分離該蛋白質複合體。
在一些實施方案中，複合體中的蛋白質之一是已知的或已鑑定的。然後已知的/已鑑定的蛋白質能夠作為誘餌分離其結合配偶體(partner)。理想地是，如果存在抗體或其它試劑，則內源性蛋白質能夠作為誘餌，這將允許特異性分離帶有其結合配偶體的蛋白質，例如，通過親和層析方法或免疫沉澱方法。更加通用的方法是用被抗體或標籤特異的配體快速識別的序列「標記」已知的或已鑑定的蛋白質。通用的親和標記物在本領域中是已知的，並且包括穀胱甘肽S-轉移酶、His6、鈣調蛋白結合肽、血細胞凝集素、myc和FLAG標籤。
組合物另一方面，本發明提供了包含此處所述的任意數位化抗體組的組合物。在一些實施方案中，組合物用於此處所述的任意方法(例如產生蛋白質結合譜的方法)。在一些實施方案中，組合物用於產生蛋白質結合譜的方法(包括產生蛋白質結合譜文庫的方法)。如此處進一步所描述，在其它實施方案中，組合物用於表徵測試樣品(例如懷疑包含目的樣品的測試樣品)的方法；檢測存在或缺乏測試樣品和/或對其進行鑑定的方法；表徵細胞、細菌和/或病毒的方法；鑑定測試蛋白質的方法；表徵、檢測蛋白質複合體的存在和/或缺乏和/或對其進行鑑定的方法；以及篩選的方法。
在一些實施方案中，本發明提供了包含帶有此處所述的任意數位化抗體組的蛋白質複合體的組合物。在一些實施方案中，數位化抗體組是陣列化的。也在其它實施方案中，抗體和/或蛋白質是標記的。在一些實施方案中，抗體固定化(連接和/或吸附)於固體或半固體表面，例如陣列。在其它實施方案中，抗體是標記的抗體。在其它實施方案中，蛋白質是標記的。也在其它實施方案中，抗體和蛋白質是標記的。在一些實施方案中，本發明提供了包含此處所述任意數位化抗體組、樣品和一組競爭劑多肽的組合物，其中所述競爭劑多肽包含該數位化抗體組中一種或多種數位化抗體的關連胺基酸序列。在一些實施方案中，競爭劑多肽是標記的。
試劑盒本發明還提供了包含此處所述任意數位化抗體組的試劑盒。因此，在一些實施方案中，本發明提供了包含至少大約15種數位化抗體的試劑盒，其中每種數位化抗體結合不同的表位，並且其中每種數位化抗體結合由3個連續胺基酸、4個連續胺基酸或5個連續胺基酸組成的表位。在一些實施方案中，試劑盒包含至少大約任意20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000個或更多種抗體。在其它實施方案中，試劑盒包含至少大約100種抗體。在其它實施方案中，試劑盒包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位(也稱為3mer表位)的數位化抗體。在一些實施方案中，試劑盒包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，和至少大約100種識別由4個連續胺基酸組成的表位(也稱為4mer表位)的數位化抗體。在一些實施方案中，試劑盒包含至少大約100種識別由3個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，至少大約100種識別由4個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體，和至少大約100種識別由5個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。在另一個實施方案中，試劑盒包含至少大約1000種識別由4個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。抗體可以固定化和/或連接(吸附)於表面，例如陣列。在一些實施方案中，試劑盒進一步包含標記物(例如用於標記蛋白質的標記物)。也在其它實施方案中，抗體是標記的。也在其它實施方案中，試劑盒包含競爭劑多肽。一般而言，競爭劑多肽包含被數位化抗體組所識別的一個或多個關連表位的胺基酸序列。在一些實施方案中，競爭劑多肽是標記的。在一些實施方案中，競爭劑多肽是MAP。
在一些實施方案中，數位化抗體試劑盒進一步包含在此處所述的任意方法(例如產生蛋白質結合譜的方法，包括產生蛋白質結合譜文庫的方法)中使用數位化抗體的說明書。在一些實施方案中，說明書用於表徵測試樣品(例如懷疑包含目的樣品的測試樣品)的方法；檢測測試樣品的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法；表徵細胞、細菌和/或病毒的方法；鑑定測試蛋白質的方法；表徵、檢測蛋白質複合體的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法；以及篩選的方法。在其它實施方案中，說明書用於檢測(包括診斷)、確定目的樣品，例如包含或來源於原核細胞(例如細菌，如致病菌)；真核細胞(例如癌或癌前細胞)的存在或缺乏和/或對其進行鑑定的方法，或者檢測和/或診斷其它傳染、汙染、疾病和/或異常的存在或缺乏的方法(包括癌的類型和/或期的檢測，或者癌前細胞的鑑定)。本發明試劑盒中提供的說明書通常是在標籤或包裝說明書(例如試劑盒內包括的紙張)上書寫的說明書，但是也可以是可機讀的說明書(例如，在磁碟或光碟上保存的說明書)。
在一些實施方案中，試劑盒包含數位化抗體陣列，所述陣列包含此處所述的任意數位化抗體組。在一些實施方案中，抗體固定化(連接或吸附)於固體或半固體表面，例如陣列。在其它實施方案中，抗體是標記的抗體。
也在其它實施方案中，試劑盒包含此處所述的任意蛋白質結合譜文庫。在一些實施方案中，試劑盒包含參照蛋白質結合序列。
也在其它實施方案中，試劑盒進一步包含標記物。在一些實施方案中，標記物用於標記蛋白質。
也在其它實施方案中，試劑盒包含一組競爭劑多肽，其中所述競爭劑多肽包含該數位化抗體組中一種或多種數位化抗體的關連胺基酸序列。在一些實施方案中，競爭劑多肽是標記的競爭劑多肽。
本發明的試劑盒是適當包裝的。適當的包裝包括但不限於管、瓶、罐、可變形包裝(例如，密封的聚酯薄膜或塑料包)，等等。試劑盒可以任選地提供額外的成分，例如緩衝液和說明信息。
反應混合物和成分樣品如此處所使用，「樣品」包括多種樣品類型和/或來源，例如生物來源的血液或其它液體樣品、諸如活檢標本或組織培養物的實體組織樣品或由其來源的細胞及其後代。該定義還包括在獲得這些樣品之後已經以任意方式進行操作的樣品，例如通過用試劑、溶解作用進行處理或富集諸如蛋白質亞類的某些成分。術語「樣品」包括臨床樣品、並且還包括培養的細胞、細胞上清液、細胞裂解液、血清、血漿、生物液體、以及來源於任意這些樣品的純或富集的細菌或病毒樣品，例如為了增加、富集和/或基本上純化由其來源的細菌或病毒樣品(或者，在一些實施方案中，為了增加包含細菌和/或病毒的樣品的量)而進行培養的樣品。樣品可以來源於例如細菌、酵母、病毒、類病毒、黴菌、真菌的微生物、植物、動物包括諸如人類的哺乳動物。樣品可以包含單一細胞或多於一個細胞。
通過本領域已知的方法，例如裂解、分離、純化(包括親和純化)、FACS、雷射捕獲顯微切割(LCM)或等密度離心能夠製備這些樣品。在一些實施方案中，亞細胞分離方法用於產生富集的細胞或亞細胞部分例如亞細胞器，包括細胞核、線粒體、高爾基體、內質網、葉綠體、重膜和輕膜和細胞質。
在一個實施方案中，樣品包含基本上完整的蛋白質複合體。在一些實施方案中，蛋白質複合體是由例如核酸相關的受體(例如雌激素受體)，或膜相關受體(例如表皮生長因子受體、IL-6受體、應激/凋亡途徑、趨化因子途徑、MMP轉錄途徑)或細胞周期途徑製備得到的受體相關的蛋白質複合體或信號轉導相關的蛋白質複合體。製備此類複合體的方法在本領域中是眾所周知的。
在一些實施方案中，樣品包含或來源於(或懷疑包含)致病菌，例如志賀氏菌屬(Shigella)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、纏繞彎曲桿菌(Helicobacter jejuni)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和百日咳桿菌(Bordetella pertussis)(百日咳)、霍亂弧菌、和大腸桿菌(E.coli)，包括致腹瀉大腸桿菌(Diarrheagenic E.Coli)、腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregative E.coli)(EaggEC)、腸出血性大腸桿菌(enterohaemorrhagic E.coli)(EHEC)、腸侵染性大腸桿菌(enteroinvasive E.coli)(EIEC)、致腸病大腸桿菌(enteropathogenic E.coli)(EPEC)和腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenic E.coli)(ETEC)、致腎盂腎炎大腸桿菌(Uropathogenic E.coli)(UPEC)，以及新生兒腦膜炎大腸桿菌(neonatal meningitis E.coli)(NMEC)。其它致病菌包括炭疽芽孢桿菌(Bacilus anthracis)、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridium botulinum)、野兔熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、假鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)、Coxiellaburnetti(Coxiellaburnetti)、布魯氏菌屬(Brucella)物種、鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia mallei)、葡萄球菌(Staphylococcus)、抗藥鏈球菌(drug-resistent Streptococcus)、普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii)、志賀氏菌屬物種、沙門氏菌(Salmonella)、單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jehni)和小腸結腸炎耶爾森氏菌。
在其它實施方案中，樣品包含或來源於(或懷疑包含)病毒，例如C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)、B型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)和巨細胞病毒(Cytomegalovirus)。病毒也可以是食品和水攜帶的病毒，例如杯狀病毒(Caliciviruses)和A型肝炎病毒(Hepatitis A viruses)。其它目的病毒包括但不限於大天花(Variola major)(天花)和其它痘病毒、沙粒病毒(Arenaviruses)(包括淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCM)、阿根廷出血熱病毒(Junin viruses)、馬丘坡病毒(Machupo viruses)、瓜納瑞託病毒(Guanarito viruses)、拉沙熱病毒(Lassa Fever viruses))、布亞病毒(Bunyaviruses)(包括漢坦病毒(Hantaviruses)、立夫特山谷熱病毒(Rift Valley Fever viruses))、黃病毒(Flaviruses)(包括登革熱病毒(Dengue viruses))、線狀病毒(Filoviruses)(包括伊波拉病毒(Ebolaviruses)和馬爾堡病毒(Marburg viruses))、蜱傳播的出血熱病毒(包括克裡米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic feverviruses))、蜱傳播的腦炎病毒(Tickborne encephalitis viruses)、黃熱病病毒(yellow fever viruses)、流感病毒(influenza viruses)、狂犬病病毒(Rabies virus)、西尼羅河病毒(West Nile Viruses)、拉克羅斯病毒(La Crosse viruses)、加利福尼亞腦炎病毒(California encephalitisviruses)、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(Venezuelan Equine Encephalomyelitisviruses)、東方馬腦脊髓炎病毒(Eastern Equine Encephalomyelitisviruses)、西部馬腦脊髓炎病毒(Western Equine Encephalomyelitisviruses)、日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Viruses)和賈薩努爾森林病毒(Kyasanur Forest Viruses)。
應該理解，能夠從其來源(例如，個體、食品、空氣、水和其它環境樣品)處取出包含例如細菌和/或病毒的樣品；培養生長，從而在製備蛋白質樣品之前使細菌和/或病毒繁殖、富集和/或純化(在一些實施方案中，為基本上純化)。同樣，應該理解，可以從其天然環境中取出真核細胞，例如癌細胞，並在分析之前在體外進行培養或增殖。
在一些實施方案中，樣品包含(來源於)哺乳動物細胞(在一些實施方案中為脊推動物細胞)，例如人、小鼠、靈長類或齧齒動物的細胞。在一些實施方案中，細胞是非人哺乳動物細胞(在一些實施方案中，是非人脊椎動物細胞)。
在一些實施方案中，蛋白質是由全細胞提取液製備得到的。在其它實施方案中，通過亞細胞定位(例如，細胞膜和細胞質)或不同的物理和功能特性能夠預分級蛋白質。還能夠從培養物上清液中提取蛋白質。在一些實施方案中，病毒蛋白質樣品是從血清和/或血漿和/或任意其它適當的體液製備得到的。在一些實施方案中，使用數位化抗體進行分析之前耗竭懷疑包含細菌和/或病毒的血清中的大部分血清蛋白質。耗竭、減少和/或去除大部分血清蛋白質的方法在本領域中是眾所周知的。
將樣品與數位化抗體組接觸之前，樣品也可以用能夠變性和/或溶解蛋白質的試劑例如去汙劑(離子型和非離子型)、促溶劑和/或還原劑進行處理。此類製劑在本領域中是已知的。也能夠將樣品加熱以變性蛋白質。蛋白質的變性允許蛋白質上的小表位暴露出來，從而使蛋白質易於與數位化抗體結合。
在其它實施方案中，樣品直接應用於數位化抗體而不需要首先變性。例如，對天然蛋白質結合譜的分析將允許研究蛋白質表面上的小表位，從而提供關於蛋白質三維結構的信息。
將樣品與數位化抗體相接觸將抗體與樣品中蛋白質相接觸的方法和條件在本領域中是眾所周知的。抗體可以一次一種抗體與樣品相接觸，或者數位化抗體組的一組抗體同時與樣品接觸。在一些實施方案中，接觸是連續的(相繼的或反覆的)，例如，單一抗體或一組抗體與樣品接觸；分離；然後第二抗體或抗體組與樣品相接觸，並且分離，等等。在其它實施方案中，接觸是平行的，例如，一組抗體與樣品接觸，並分離。應該理解接觸可以是平行的和連續的，如當不同的抗體組連續與樣品相接觸時。抗體組在組合物中可以是重疊的(例如，組1＝抗體A、B、C、D；組2＝抗體B、C、D、E等等)或在組合物中是不同的。
在一個實施方案中，在將數位化抗體組與樣品相接觸之前，先將數位化抗體組與封閉劑相接觸。封閉劑負責封閉非特異性結合位點，從而通過降低背景信號增加檢測敏感性。
在一些實施方案中涉及平行接觸，期望數位化抗體是各自可分離的，例如，通過使用各自分離的結合配體將抗體連接至可檢測的不同珠子上、使用抗體陣列將抗體固定化於微孔板不同的孔中，等等。在抗體所結合的小表位是已知的情況下，被數位化抗體所結合提供了關於數位化抗體所結合蛋白質的胺基酸含量的信息。在其中想得到小關連表位知識的實施方案中，可以方便地分別分離小抗體(以至於每種數位化抗體所結合的蛋白質保持分離)。然而，並不是在每個實施方案中都需要各自分離或具有可分性。例如，數位化抗體可以組合成2個或多個抗體的小庫，這些小庫具有重疊的抗體組分，例如(1)抗體ABC；(2)抗體CDE；(3)抗體FGH和(4)抗體HIJ。基於特定組中的成員關係，可以推斷出關於特定小表位存在或缺乏的信息。
在一些實施方案中，可以包括適當的對照以例如增加結合和/或增加結合強度檢測的精確度。例如，此種對照可以包括加入蛋白質的特異性抗體，該蛋白質的水平是已知的並在樣品中保持恆定。由於對照蛋白質的結合強度是相同的，從而能夠標準化所存在的蛋白質的量。
適於固定化(連接)抗體的固體載體(和提供適於固定化抗體的固體載體的修飾)在本領域中是眾所周知的。固體載體的例子包括珠子(包括磁化珠)、微孔板和蛋白質微點陣(例如Zyomyx，Inc擁有的技術。參見，例如美國專利號6,365,418)。因此，例如，包封於二氧化矽外殼中的CdSe-CdS核心-外殼納晶體能夠容易地進行衍生使其偶聯於生物分子上。Bruchez等(1998)Science 2812013-2016。同樣，高螢光量子點(具硫化鋅帽的硒化鎘)已經共價偶聯於生物分子上以用於超靈敏的生物學檢測。Warren和Nie(1998)Science 2812016-2018。從Luminex和Quantum Dot公司可以購得螢光標記的珠子。將抗體連接於此類試劑上的方法在本領域中是眾所周知的。參見，例如Kennedy等(Clin.Chim.Acta 701-31(1976))和Schurs等(Clin.Chim.Acta 811-40(1977))(描述偶聯的技術，包括戊二醛方法、高碘酸鹽方法、二馬來醯亞胺方法、間馬來醯亞胺苯甲基-N-羥基-琥珀醯亞胺酯方法，所有這些方法此處引用作為參考)。
與蛋白酶裂解劑接觸在一些實施方案中，本發明的方法進一步包括用蛋白質裂解劑處理樣品，從而產生多肽片段的步驟。在涉及從抗體-蛋白質複合體分離蛋白質步驟的實施方案中，可在將樣品與數位化抗體組接觸之前用蛋白質裂解劑處理樣品。
蛋白質裂解試劑處理產生蛋白質裂解片段(例如多肽)，這使得易於隨後進行蛋白質的量的質譜分析和樣品中蛋白質的鑑定。具體而言，使用蛋白質裂解試劑處理使得易於分析其分子量超過25 kDa的蛋白質。蛋白質裂解試劑處理還可以促進數位化抗體對關連表位的易接近性和/或接近。蛋白質裂解劑在本領域中是眾所周知的，並且在此處進一步進行論述。在一些實施方案中，使用了一種蛋白質裂解劑。在其它實施方案中，使用了一種以上蛋白質裂解劑。用蛋白質裂解劑處理的條件在本領域中是眾所周知的。
多肽裂解試劑可以是蛋白酶。能夠用作多肽裂解試劑的蛋白酶的例子包括但不限於胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶(arg、lys裂解序列)、嗜熱菌蛋白酶(phe、leu、iso、val裂解序列)、V8蛋白酶、內蛋白酶Glu-C、內蛋白酶Asp-N、內蛋白酶Lys-C、內蛋白酶Arg-C、內蛋白酶Arg-N、因子Xa蛋白酶、凝血酶、腸肽酶、V5蛋白酶，以及菸草蝕刻病毒(tobaccoetch virus)蛋白酶。用於本發明方法的蛋白酶能夠進行遺傳工程操作和/或進行化學改性以避免自溶。應該理解，酶蛋白質裂解試劑(例如蛋白酶)能夠進行修飾以利於在多肽裂解後從多肽裂解產物中去除蛋白酶。此類修飾在本領域中是已知的並且包括(1)珠子(例如，橡膠、二氧化矽或磁珠)結合的蛋白酶，(2)半抗原化蛋白酶，(3)親和耗竭蛋白酶(使用例如珠結合的抗蛋白酶抗體或珠結合的不可裂解底物)和/或(4)分子篩析色譜法。
多肽裂解試劑也可以包括裂解多肽和肽鍵的化學物質和化合物，例如溴化氰(在蛋氨酸殘基處裂解)、羥胺(在Asn和Gly殘基之間裂解)和酸性pH(能夠裂解Asp-Pro鍵)(參見例如，Ausubel等，見上)。多肽裂解試劑的活性能夠通過使用加熱、蛋白酶抑制劑、金屬螯合劑(例如EGTA、EDTA)等等處理而抑制。
也在其它實施方案中，磷酸酶(例如，鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、蛋白絲氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白蘇氨酸磷酸酶等等)、脂肪酶以及其他酶能夠應用作為蛋白質裂解試劑。
蛋白質結合模式的檢測和蛋白質結合模式的比較使用本領域已知的任意方法能夠檢測樣品中結合數位化抗體組的蛋白質。在一些實施方案中，蛋白質是使用本領域已知的任意方法標記的。術語「標記物」是指通過分光光度、光化學、生物化學、免疫化學或化學方法可檢測的組合物。例如，靶蛋白質可以用一個或多個標記部分進行標記以允許檢測蛋白質-抗體複合體並且通過在比較樣品中此種複合體缺乏的比較進行檢測。標記部分可以包括通過光化學、分光光度、生物化學、免疫化學、化學、光學、電學、生物電學等等方法能夠檢測的組合物。例如，有用的蛋白質標記物包括32p、35S、螢光染料、高電子密度試劑、酶(例如通常用於ELISA的酶)、生物素、洋地黃毒苷或者可以得到其抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白質。多種標記物和偶聯技術都是已知的並且廣泛報導於科學文獻和專利文獻中，並且一般適用於本發明以標記蛋白質。適當的標記物包括放射性核苷酸、酶、底物、輔因子、抑制劑、螢光部分、化學發光部分、磁性顆粒，等等。標記試劑任選地包括例如單克隆抗體、多克隆抗體、蛋白質、或者其它聚合物例如親和基質、碳水化合物或脂類。所標記蛋白質的檢測可以通過大量方法中的任一種進行，包括免疫印跡法、放射性或生物發光標記示蹤法或其它基於大小、電荷或親和力跟蹤分子的方法。所使用的特定標記物或可檢測部分和特殊測定方法不是本發明的關鍵方面。可檢測部分可以是具有可檢測物理或化學特性的任意材料。在凝膠、柱和固體底物領域中此類可檢測標記物已經得到很好的研發，並且一般而言，用於此類方法的標記物也能夠應用於本發明。因此，標記物是通過分光光度、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法可檢測的任意組合物。本發明中使用的標記物包括螢光染料(例如，螢光異硫氰酸鹽、德克薩斯紅、羅丹明等等)、放射性標記物(例如3H、125I、35S、14C或32p)、酶(例如LacZ、CAT、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶和其它通常用作可檢測酶的酶，它們或者作為標記基因產物或者用於ELISA中)。
應該認識到螢光標記物不限於單一種類的有機分子，而是包括無機分子、有機和/或無機分子的多分子混合物、晶體、雜聚物等等。因此，例如，包裹於二氧化矽外殼中的CdSe-CdS核心-殼納晶體易於衍生，以用於偶聯生物分子。Bruchez等(1998)Science 2812013-2016。同樣，高螢光量子點(具硫化鋅帽的硒化鎘)已經共價偶聯於生物分子上以用於超靈敏生物學檢測。Warren和Nie(1998)Science 2812016-2018。
按照本領域眾所周知的方法將標記物直接或間接偶聯於蛋白質上。將標記物吸附和/或連接於(共價或非共價、直接或間接例如通過接頭連接)蛋白質上的方法在本領域中是眾所周知的。如上面所指出，可以使用多種標記物，標記物的選擇取決於所要求的敏感性、易於化合物的偶聯、穩定性的需求、可使用的儀器以及處理要求。非放射性標記物通常通過間接方法進行連接。在一些實施方案中，配體分子(例如生物素)共價連接於聚合物上。然後配體連接至抗配體(例如鏈親和素)分子上，該分子或者是天然可檢測的或者是共價連接於信號系統上，所述配體分子例如為可檢測酶、螢光化合物或化學發光化合物。可以使用大量配體和抗配體。如果配體具有天然抗配體，例如配體為生物素、甲狀腺素和皮質醇，該配體能夠用於與標記的抗配體偶聯。另外，任意半抗原或抗原性化合物能夠與抗體組合使用。
標記物也能夠直接偶聯於產生信號的化合物上，例如，通過與酶或螢光基團偶聯。作為標籤的目的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或者是氧化還原酶，特別是過氧化物酶。螢光化合物包括螢光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹醯、傘形酮、綠色螢光蛋白等等。化學發光化合物包括螢光素和2，3-二氫二氮雜萘二酮，例如氨基苯二醯肼。
在一些實施方案中，樣品是經標記的。在其它實施方案中，抗體是標記的。也在其它實施方案中，蛋白質和抗體是標記的。檢測標記物的方法是本領域技術人員眾所周知的。因此，例如，如果標記物是放射性標記物，檢測方法包括閃爍計數器、近程計數器(proximity counter)(加入閃爍液的微量滴定板)或放射自顯影法中的照相膠片。如果標記物是螢光標記物，可通過用適當波長的光激發螢光染料對其進行檢測並且通過顯微鏡、目檢、通過照相膠片、通過使用諸如電荷耦合器件(CCDS)或光電倍增器的電子檢測器等等對所得螢光進行檢測。同樣，通過給酶提供適當的底物並檢測所得反應產物可以對酶標記物進行檢測。最後，單純的色度標記物通常通過簡單的觀察與標記物相關的顏色進行檢測。因此，在多種檢測測定法中，偶聯的金通常顯示粉紅色，而各種偶聯的珠子顯示珠子的顏色。
在一些實施方案中，如本領域中眾所周知，將競爭免疫測定法用於檢測。具體而言，可將測試樣品與標記的小表位肽(即，含有被測定中所用的數位化抗體組的一個或多個成員識別的一個或多個小關連表位的多肽)混合併將其與數位化抗體相接觸。然後可對結合信號進行檢測。檢測之前能夠進一步放大信號以增加敏感性。用於本發明方法的標記物在本領域中是已知的，並且包括化學發光分子、磁性標記物、生物素等等。在涉及使用競爭劑多肽的實施方案中，產生蛋白質結合譜的方法(和使用蛋白質結合譜的方法)通常進一步包括將數位化抗體組與競爭劑多肽相接觸(與樣品組合和/或與樣品相繼使用)。
在一個實施方案中，在競爭免疫測定中使用了多表位抑制劑(例如MAP)。此處所使用的「多表位抑制劑」指合成肽或通過蛋白質消化產生的肽，它包括多個數位化抗體表位。因此，這些多表位抑制劑將結合至數位化抗體從而與蛋白質樣品競爭。使用多表位抑制劑減少了競爭免疫測定法中所需要的肽的數量。
在另一個實施方案中，將數位化抗體包被於或連接於固體表面，蛋白質(包括來自樣品的蛋白質片段)是標記的，例如在與抗體接觸之前用生物素標記，將蛋白質與抗體接觸，去除未結合蛋白質，以及然後使用連接有鏈親和素的酶、螢光染料和/或納晶體用於檢測結合至數位化抗體的蛋白質。
在另一個實施方案中，進行競爭測定，例如，通過將數位化抗體包被或連接於固體表面，並將來自樣品的蛋白質(例如蛋白質片段)和一個或多個標記的合成肽一起加入或相繼加入至數位化抗體。每種合成肽包含2種或多種所使用的數位化抗體的結合表位，並且合成肽混合物包含全部所使用的數位化抗體(在一些實施方案中，為基本上全部使用的數位化抗體)的表位。因此合成肽混合物與樣品中含有陣列中數位化抗體結合表位的蛋白質(例如蛋白質片段)競爭結合。可使用納晶體、酶和/或螢光染料標記合成肽(也稱為競爭肽)。在一些實施方案中，標記物可以是生物素或鏈親和素，並且然後使用親和素、鏈親和素或生物素偶聯的酶放大信號，螢光染料或納晶體(nanocrystal)將用於證明競爭性結合的結果。圖4圖解說明了數位化抗體陣列的實施方案並描述了使用競爭劑多肽的檢測實施方案。
使用適當的方法(例如，視覺上地、通過計算機地等等)能夠分析通過檢測蛋白質結合所產生的數據。在一個實施方案中，使用可編程序的數位化計算機分析數據。數據分析可以包括確定信號強度的步驟。信號強度能夠進行標準化，從而相對一些參照值校準信號強度。例如，參照可以是結合的本底噪音。另外，參照可以是對照抗體的蛋白質結合強度。
在一些實施方案中，每種數位化抗體結合樣品中蛋白質的強度能夠進行數位化以產生一個數字。如此處所使用的術語「數位化」是指將結合信號轉化成數位化數據的過程。然後能夠逐一列出代表每種數位化抗體結合強度的數字以產生代表數位化抗體與該樣品結合的多數字數。在另一個實施方案中，通過與條線圖相似的繪圖表述表示結合譜。在該實施方案中，每個條形或條線圖的位置代表特異的數位化抗體，並且「條」的高度和寬度代表結合的存在和/或缺乏和/或程度或強度。這些數或繪圖表述的產生允許迅速存儲關於大樣品組的信息。而且，2個數或繪圖表述的比較提供了關於2個目的樣品不一致程度的信息。
通過任意合適的方法能夠進行蛋白質結合譜的比較。例如，能夠進行模式的視覺比較以確定與毒性不同類型相關的模式。更加方便地是，通過計算機，使用前面部分所討論的資料庫程序之一，能夠進行相關性分析。優選地是，通過計算機使用神經網絡程序進行相關性分析，因為神經網絡程序是針對模式識別而專門設計的。利用大量本領域已知的方法能夠進行蛋白質結合譜的比較。通常，從計算得到的圖表能夠儲存於例如文件夾等中，並且通常通過視覺檢測以辨別與對照相比共同的表達模式和不同的表達模式。然而，方便地是，數據能夠儲存並通過計算機進行比較。
標準資料庫程序，例如Enterprise Data Management(美國網絡產品公司，Emeryville，CA)或Oracle8或9(Oracle公司，Redwood Shores，CA)，能夠用於儲存和比較信息。另外，以專門設計的可獲得程序，例如來自Partek有限公司(St.Charles，MO)的可獲得程序，能夠記錄數據或分析數據，或記錄數據和分析數據。
另外，銷售集成分析系統例如質譜分析儀的公司與儀器一起提供集成軟體用於記錄結果。此類公司包括Finnigan公司(San Jose，CA)、Perkin-Elmer公司(Norwalk CT)、Ciphergen Biosystems有限公司(PaloAlto CA)和Hewlett Packard公司(Palo Alto，CA)。
在一個優選的實施方案中，通過神經網絡技術能夠記錄和分析數據。神經網絡是複雜的特異為數據組中的模式識別而設計的非線性模型方程式。一個此種程序是來自Ward Systems Group有限公司(Frederick，MD)的NeuroShell Classifier分類運算法。其它神經網絡程序可以從例如Partek有限公司、BioComp Systems有限公司(Redmond WA)和Z Solutions，LLC(Atlanta，GA)獲得。
生物材料的保藏以下材料已經保藏於美國典型培養物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia，USA(ATCC)
提供以下實施例闡述本發明，但不用於限制本發明。
實施例實施例1數位化抗體的製備和表徵如表4中所示設計了多抗原性肽(MAPs)形式的5個免疫肽。由於相同序列以不同的位置包含於不同MAP中，這些序列的組合也用於評價所誘導的抗體的交叉反應。使用標準方法用每種免疫肽免疫4隻Balb/C小鼠。
表4免疫肽的設計
表4的注釋肽MAP1HSLFHPEDTGQV來自PSA，胺基酸#79-89。KKTTNV來自腦膜炎球菌(Meningococcal)Opa蛋白質，含有KTT，一個已公布的3 mer抗體表位(Malorny，Morelli等，1998)。
肽MAP2MAP1的可互換序列。
肽MAP3LTPKKPSA的基序1(Nagasaki，Watanabe等，1999)。KKTTNVLTVPTNIPG來自腦膜炎球菌Opa蛋白質，含有2個已公布的3mer抗體表位KTT和NIP，並含有一個4mer表位TNIP(Morelli等，(1997)Mol Microbiol 25(6)1047-64。
肽MAP4LTPKK來自PSA，與肽MAP3相同。LTQENQNRGTH通過DNAStar電腦程式選擇的α-1-ACT的免疫原性序列。IYNQ來自腦膜炎球菌Opa蛋白質的4個胺基酸，含有一個2mer表位IY以及一個5mer表位TIYNQ，和一個7mer表位TPTIYNQ(Marelli等，同前)。
肽MAP5 TIYNTNIPG來自腦膜炎球菌Opa蛋白質(Marelli等，同前)。LTQENQNRGTH與肽MAP4相同。
設計了兩組篩選肽(1)5C-末端生物素化的具有與免疫肽相同的序列(示於表5)；和(2)43個10mer生物素化的肽，具有淘洗全部5個免疫肽的序列(示於表6)。
表5生物素化的篩選肽(大約90％的純度)
表643個10mer生物素化的製圖肽(mapping peptide)(大約70％的純度)
標準階段免疫之後，使用標準方法從每隻小鼠收集免疫血清，並且使用如下ELISA法進行測試用100μl/孔或50μl/孔的鏈親和素(Sigma目錄號S4762或類似產品，5μg/ml溶於50 mM碳酸鹽緩衝液，pH 9.6)包被ELISA板(Corning 3369或類似的板)。將板子在4℃孵育過夜或在室溫孵育2小時。孵育之後，用PBS+0.05％吐溫-20(PBST緩衝液)洗滌板3次。洗滌之後，用250μl/孔PBST封閉板子，並在室溫孵育1小時，或4℃孵育過夜。去除PBST，並加入100μl/孔或50μl/孔的5μg/ml選自表5的測試生物素化肽(稀釋於PBS)。在室溫孵育板大約30-60分鐘。孵育之後，用PBST洗板3次。然後加入100μl/孔或50μl/孔的測試血清(即來自測試血)，並室溫孵育1小時，或4℃孵育過夜。為了滴定免疫反應性，測試之前通常將血清稀釋為1∶500、1∶2000、1∶8000或1∶32000。孵育之後，用PBST洗板3次。為了檢測抗體結合，在每個孔中加入1∶10,000稀釋的山羊抗小鼠IgG(和IgM)-HRP偶聯物(Jackson Immuno訂貨號No.115-036-071，或類似產品)。將板在室溫另外孵育1小時，然後用PBST洗板5次。加入HRP底物(Sigma Fast OPD，目錄號No.P-9187)並在暗處室溫孵育30-60分鐘。如果不終止HRP反應則用96-孔比色檢測儀在OD450處讀板。另外，用1.25M硫酸終止HRP反應，並在OD492處讀板。
測試了來自組1、2和3小鼠的12份測試血。在組1和3的小鼠中未觀察到免疫反應，並且這些小鼠未進行進一步的研究。組2中的全部4隻小鼠呈現針對篩選肽Pep2-0的強免疫反應(＞1∶32,000)。此外，來自組2中4隻小鼠其中2隻(小鼠#2-1和#2-4)的免疫血清與為組1和3設計的篩選肽呈現交叉反應，這是因為MAP2和MAP1/MAP3之間的序列同源性。這些結果與表達抗體的小鼠#2-1和#2-4是一致的，其中所述抗體識別在ELISA測定中所使用的一個以上篩選抗原中所存在的不同簡單的表位。#2-1和#2-4血清對涵蓋用於組1、2和3小鼠的全部3個免疫肽的序列的23個10mer生物素化肽的測試也顯示了寬的交叉反應性。
通過ELISA測試了來自組4-5的8份測試血。組4小鼠顯示了對它們相關的篩選肽Pep4-0具有適中的反應，而與為組3設計的篩選肽Pep3-0呈現強交叉反應。組4小鼠不呈現對Pep5-0的實質的交叉反應，儘管在Pep4-0和Pep5-0之間存在顯著的序列同一性。相反，組5的4隻小鼠中的3隻小鼠(小鼠5-2、5-3、5-4)對其篩選肽Pep5-0和相關篩選肽Pep4-0都呈現強烈的免疫反應。組5中應答性小鼠的血清證明對Pep3-0沒有實質的交叉反應，儘管存在5個胺基酸區的序列同一性。#5-2和#5-3血清對涵蓋用於組4和5小鼠的全部3個免疫肽的序列的23個10mer生物素化肽的測試證明了2個寬的但與涵蓋組4和5小鼠免疫肽序列的製圖肽不同的反應模式。
如表7和圖2中所概括，組2小鼠#1和#4，以及組5小鼠#2和#3顯示最強的免疫反應。選擇這些小鼠用於雜交瘤融合。
表7.組2和5中選擇的小鼠對篩選肽1-5的免疫反應性和交叉反應性。
選擇組2小鼠組#1和#4以及組5小鼠#2和#3用於雜交瘤融合。處死動物，採集淋巴結和脾臟，然後使用標準方法產生使用P3小鼠骨髓瘤細胞系作為融合配偶體的B細胞雜交瘤融合。篩選之前將融合物鋪板並孵育11-14天。
在第一輪篩選中，基本上如上所述，使用相應篩選肽2-0和5-0，通過在96孔板中進行ELISA分析了來自組2和5小鼠的雜交瘤。幾輪篩選之後，鑑定出48株陽性雜交瘤細胞系並將其轉移至24孔板以進行擴增和另外的表徵，包括表位製圖。在48株陽性雜交瘤細胞系中，33株來自接受MAP2免疫原的組2動物而其餘15株源自組5動物。絕大部分雜交瘤細胞系(～94％)是從脾臟收穫的B細胞的融合產物。48株雜交瘤細胞系中的13株表達IgG，25株表達IgM，其餘10株雜交瘤細胞系表達IgG和IgM兩者或者均不表達IgG或IgM並且因此表達IgA或IgE。
在第二輪篩選中，對選擇用於擴增的雜交瘤針對相關篩選肽(肽2-0或肽5-0)進行重複測試。24孔板擴增期後表徵的48株雜交瘤中的13株呈現對篩選肽2-0的序列特異性結合。其它雜交瘤非特性結合(即，結合多種寡肽序列)、不結合(反應或者是假陽性或者克隆不穩定並且在轉移和隨後24孔板中增殖期間的失去)或結合含有BSA的對照孔。
使用如上所述的ELISA對特異性結合至篩選肽2-0的13株雜交瘤進行表位製圖，使用不同的3組10mer C-末端生物素化的製圖肽肽1-1至1-5；2-1至2-9和3-1至3-9(見表6)。12株雜交瘤細胞系中的10株與單一製圖肽2-1呈現最大反應性，並且雜交瘤2.03和2.11對不同的重疊製圖肽組肽2-1至2-3和肽2-7至2-9呈現強結合性。因為這些數據顯示了絕大多數雜交瘤細胞系對單一製圖肽的強反應性，我們考慮這種可能性，即與製圖肽固定化(具體而言，是生物素-親和素固定化)相關的空間位阻阻止抗體結合至關連的10mer系列中存在的表位上，從而可能偏離ELISA表位圖結果。因此，我們使用競爭性結合測定評估表位特異性。
評價了各個製圖肽抑制抗體結合至吸附於鏈親和素包被的96孔板上的2-0篩選肽的能力。以這種形式，10mer製圖肽不被限制於鏈親和素的結合袋內並且空間上將不被阻礙與13株雜交瘤組內存在的反應性抗體相互作用。使用標準方法進行抑制試驗，所用2-0篩選肽固定於鏈親和素包被的96孔板並在每個孔中加入10mer製圖肽。
使用競爭結合測定，確定了被13株雜交瘤中的10株所識別的表位。8個雜交瘤對表位PEDTG特異，雜交瘤2.03對表位DTG特異且雜交瘤2.11被表位KTTN所識別。在競爭抑制試驗中雜交瘤2.31、1.02和2.12呈現差的辨別力。對雜交瘤2.03(也稱為DA001-2.03)、2.04(也稱為DA001-2.04)和2.11(也稱為DA001-2.11)進行製備以保藏於ATCC。該分析的結果概括於表8。
表8通過競爭抑制預測的表位
儘管為了清楚理解，已經通過闡述和實施例的方式對前述發明進行了詳細描述，但說明書和實施例將不構成對本發明範圍的限制。
權利要求
1.一組數位化抗體，其中該數位化抗體組包含至少大約15種數位化抗體，其中每種數位化抗體結合不同的表位，並且其中每種數位化抗體結合由3個連續胺基酸或4個連續胺基酸組成的表位。
2.根據權利要求1所述的數位化抗體組，其中該數位化抗體組包含100種結合由3個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。
3.根據權利要求2所述的數位化抗體組，其中該數位化抗體組進一步包含100種結合由4個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。
4.根據權利要求3所述的數位化抗體組，其中該數位化抗體組進一步包含100種結合由5個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。
5.根據權利要求1所述的數位化抗體組，其中該數位化抗體組包含至少大約100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000種數位化抗體。
6.根據權利要求1所述的數位化抗體組，其中該數位化抗體組包含至少1000種結合由4個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。
7.根據權利要求6所述的數位化抗體組，其中該數位化抗體組進一步包含至少100種結合由5個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。
8.根據權利要求7所述的數位化抗體組，其中該數位化抗體組進一步包含至少100種結合由3個連續胺基酸組成的表位的數位化抗體。
9.根據權利要求1所述的數位化抗體組，其中數位化抗體固定於表面。
10.根據權利要求4所述的數位化抗體組，其中數位化抗體固定於表面。
11.根據權利要求9或10所述的數位化抗體組，其中表面是陣列。
12.產生蛋白質結合譜的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；和(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜。
13.權利要求12的方法，其中該方法進一步包括在步驟(a)即在允許結合的條件下將樣品與數位化抗體組相接觸之前用蛋白質裂解劑處理樣品的步驟。
14.產生蛋白質結合譜文庫的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(e)用至少2個樣品重複步驟(a)至(c)。
15.權利要求14的方法，其中方法進一步包括在步驟(a)即在允許結合的條件下將樣品與數位化抗體組相接觸之前用蛋白質裂解劑處理樣品的步驟。
16.蛋白質結合譜文庫，其中文庫是使用權利要求14的方法製備的。
17.表徵測試樣品的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較表徵測試樣品。
18.權利要求17的方法，其中步驟(d)的比較是與蛋白質結合譜文庫進行比較，其中蛋白質結合譜文庫是使用包括以下步驟的方法產生的(i)在允許結合的條件下將樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(ii)任選地去除未結合蛋白質；(iii)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(iv)用至少2個樣品重複步驟(i)至(iii)。
19.確定樣品中細菌、病毒或細胞的存在或缺乏的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較確定測試樣品中細菌、病毒或細胞的存在或缺乏。
20.權利要求19的方法，其中步驟(d)的比較是與蛋白質結合譜文庫進行比較，其中蛋白質結合譜文庫是使用包括以下步驟的方法產生的(i)在允許結合的條件下將樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(ii)任選地去除未結合蛋白質；(iii)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(iv)用至少2個樣品重複步驟(i)至(iii)。
21.鑑定細菌、病毒或細胞的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將測試樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(d)將測試樣品的蛋白質結合譜與參照樣品的蛋白質結合譜進行比較，從而通過比較確定測試樣品中的細菌、病毒或細胞。
22.權利要求21的方法，其中步驟(d)的比較是與蛋白質結合譜文庫進行比較，其中蛋白質結合譜文庫是使用包括以下步驟的方法產生的(i)在允許結合的條件下將樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(ii)任選地去除未結合蛋白質；(iii)檢測蛋白質與抗體的結合，從而產生蛋白質結合譜；和(iv)用至少2個樣品重複步驟(i)至(iii)。
23.鑑定測試蛋白質的方法，所述方法包括(a)在允許結合的條件下將包含測試蛋白質的樣品與根據權利要求1的數位化抗體組相接觸；(b)任選地去除未結合蛋白質；(c)檢測存在或缺乏蛋白質與該組中抗體的結合，其中至少大約6種數位化抗體結合蛋白質；其中結合的存在表明蛋白質中存在至少大約6個表位，其中這至少大約6個表位的身份用於鑑定蛋白質。
24.權利要求23的方法，其中至少大約7種、大約8種、大約9種、大約10種、大約11種、大約12種、大約13種、大約14種、大約15種、大約20種或大約25種數位化抗體結合蛋白質。
25.權利要求12、14、17、19、21或23中任意一項所述的方法，其中樣品包含細胞蛋白質或細胞蛋白質的亞級分。
26.根據權利要求12、14、17、19、21或23中任意一項所述的方法，其中樣品是細胞或病毒樣品。
27.權利要求17、19、21或23中任意一項所述的方法，其中所述方法進一步包括在步驟(a)即在允許結合的條件下將樣品與數位化抗體組相接觸之前用蛋白質裂解劑處理樣品的步驟。
28.試劑盒，其包含根據權利要求1的數位化抗體組。
全文摘要
本發明總體上涉及針對短表位的數位化抗體組，並涉及其在蛋白質分析方法中的用途。
文檔編號C07K16/00GK1726394SQ200380106234
公開日2006年1月25日 申請日期2003年10月15日 優先權日2002年10月15日
發明者J·J·王, W·H·胡 申請人:阿伯麥特裡科斯公司