用於診斷和治療用途的純化的C型肝炎病毒外被蛋白的製作方法

2023-08-08 04:20:31 2

專利名稱：用於診斷和治療用途的純化的C型肝炎病毒外被蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組蛋白表達、重組蛋白純化、合成肽、HCV感染診斷、對HCV感染進行預性防治療的一般領域，並且涉及患有慢性肝炎個體的治療的臨床效果的預測/監測治療效果，或預測/監測天然疾病。
更具體地講，本發明涉及純化C型肝炎病毒外被蛋白的純化方法，按照本發明所披露的方法所純化的HCV外被蛋白在診斷、預防或治療中的用途，以及單個的或特異性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白在監測疾病、和/或診斷疾病、和/或治療疾病的測定方法中的用途。本發明還涉及E1和/或E2外被蛋白表位，以及它的單克隆抗體及其在診斷、預防或治療中的用途。
背景技術：
按照本發明所披露的方法，從細胞裂解物中純化的E2蛋白能夠與大約95％的患者的血清起反應。這種反應性類似於由CHO細胞中分泌的E2所獲得的反應性(Spaete等，1992)。不過，細胞內表達形式的E2可能更接近於天然病毒外被蛋白，因為它含有高含量的甘露糖碳水化合物基序，而由CHO細胞中分泌的E2蛋白，由半乳糖和唾液酸糖成分進行過進一步的修飾。當E2的氨基末端部分是在杆狀病毒系統中表達時，只能在來自若干患者組的大約13-21％的血清中檢測到(Inoue等。1992)。在用大腸桿菌表達E2之後，HCV血清的反應性甚至更低，在14(Yokosuka等，1992)-17％(Mita等，1992)範圍內。使用本發明的純化的、疫苗表達的重組E1蛋白，大約有75％的HCV血清(以及95％的慢性患者)是抗E1陽性的，與Kohara等(1992)和Hsu等(1993)的結果形成了鮮明的對比。Kohara等使用痘苗病毒表達的E1蛋白，並且在7-23％的患者體內檢測到抗E1抗體，而Hsu等使用杆狀病毒表達的E1檢測了14/50(28％)的血清。
以上結果表明，為了獲得所述外被蛋白與人類患者血清的高的反應性，不僅需要好的表達系統，而且還需要好的純化方法。這一目的可以通過使用本發明的正確的表達系統和/或純化方法而實現，該方法能確保保持所述蛋白的天然摺疊，並且本發明的純化方法可以確保消除汙染性蛋白，它能保持HCV外被蛋白的構象，並因此保持其反應性。診斷性篩選測定所需要的純化HCV外被蛋白的量為每年數克。對於疫苗用途來說，可能需要更大量的外被蛋白。因此，可以利用所述痘苗病毒系統篩選最佳的表達構建體，並且用於有限的擴大表達，並且，在用若干酵母菌株表達時，可以實現大規模表達和純化含有高甘露糖碳水化合物的單個的或特異性的寡聚外被蛋白。例如，對於B型肝炎來說，與酵母產生的B型肝炎疫苗相比，用哺乳動物細胞生產H BsAg的成本更高。
本發明的目的本發明的一個目的是提供一種純化重組表達的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的新方法，以便能夠以不含雜質的單個的或特異性寡聚重組蛋白形式而不是凝聚體的形式，將所述重組蛋白直接用於診斷和疫苗接種目的。
本發明的另一個目的是提供含有純化的(單個的或特異性寡聚的)重組E1和/或E2和/或E1/E2糖蛋白的組合物，所述糖蛋白含有來自HCV的E1和/或E2和/或E1/E2結構域的構象表位。
本發明的另一個目的是提供用於重組表達E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的新的重組載體構建體，以及用所述載體構建體轉化過的宿主細胞。
本發明的另一個目的是提供一種用於生產並純化重組HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的方法。
本發明的另一個目的是提供本發明的重組HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的診斷和免疫原用途，以及提供將含有本發明的任意一種重組HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的用於診斷目的的試劑盒、疫苗或治療劑。
本發明的另一個目的是提供將E1和/或E2和/或E1/E2蛋白或其適當的部分用於監測/預測對患有HCV感染的患者進行治療(例如，用幹擾素治療)的反應的新的用途。
本發明的另一個目的是提供將本發明的重組E1和/或E2和/或E1/E2蛋白用於HCV篩選和證實抗體測定的用途。
本發明的另一個目的是提供可用於診斷HCV感染並用於製備抗體的E1和/或E2肽。所述肽還可用於分離人單克隆抗體。
本發明的另一個目的是提供單克隆抗體，尤其是人單克隆抗體或人源化的小鼠單克隆抗體，這種抗體能與肽或重組蛋白中的構象表位所包含的E1和/或E2表位特異性地起反應。
本發明的另一個目的是提供將抗E1或抗E2單克隆抗體用於HCV抗原檢測或用於慢性HCV感染治療的可能的用途。
本發明的再一個目的是提供用於監測/預測對患有HCV感染的患者進行治療(例如，用幹擾素治療)的反應或監測/預測所述疾病的後果的試劑盒。
本發明的所有目的都可以通過下面所提供的實施方案而實現。
定義下面的定義用於解釋在本發明中所使用的不同的術語和表達形式。
術語『C型肝炎病毒單個外被蛋白』表示含有一種胺基酸序列(和/或胺基酸類似物)的多肽或其類似物(例如，模擬表位)，該序列確定了E1或E2區的至少一個HCV表位。所述單個外被蛋白在其廣義的含義上可以是單體或同型寡聚物形式的、重組表達的外被蛋白。通常，限定所述表位的序列相當於HCV的E1或E2區的胺基酸序列(相同或者通過用天然胺基酸殘基類似物取代而不會破壞該表位)。一般，表位限定序列的長度為3個或3個以上胺基酸，更優選5個或5個以上胺基酸，更優選8個或8個以上胺基酸，更優選10個或10個以上胺基酸。對於構象表位來說，所述表位限定序列的長度可以有較大的改變，因為確信這種表位是由抗原的三維形狀形成的(例如，摺疊)。因此，限定所述表位的胺基酸的數量可以比較少，而且廣泛分布在該分子的長度上，通過摺疊形成正確的表位構象。位於限定表位的殘基之間的抗原部分，對於該表位的構象的結構來說可能並不重要。例如，只要保留了對表位構象重要的序列(例如，與二硫鍵結合有關的半胱氨酸，糖基化位點等)，缺失或取代這些間插序列可能不會影響該構象表位。構象表位還可以通過同型寡聚物或異源寡聚物的亞基的兩個或兩個以上關鍵區而形成。
本發明的HCV抗原包括來自HCV的E1和/或E2(外被蛋白)結構域的構象表位，被認為對應於病毒外被蛋白的E1結構域，目前估計跨越HCV多蛋白的192-383號胺基酸(Hijikada等，1991)。在哺乳動物系統中進行表達(糖基化的)時，通過SDS-PAGE測定相信具有大約35kDa的分子量。據信以前被稱為NS1的E2蛋白跨越HCV多蛋白的384-809或384-746號胺基酸(Grakoui等，1993)，並且它也是一種外被蛋白，在疫苗系統中表達時(糖基化的)據信它具有大約72kDa的表觀凝膠分子量。相信這些蛋白的終點是大致的(例如，E2的羧基末端可能位於730-820號胺基酸片段中的某一位置上，例如，以730、735、740、742、744、745號胺基酸為終點，優選以746、747、748、750、760、770、780、790、800、809、810、820號胺基酸為終點)。所述E2蛋白還可以與E1、P7(747-809號胺基酸)、NS2(810-1026號胺基酸)、NS4A(1658-1711號胺基酸)或NS4B(1712-1972號胺基酸)一起表達。與上述其他HCV蛋白一起表達，對於獲得正確的蛋白摺疊來說是重要的。
還應當理解的是，在本發明的實施例部分所使用的分離物不是要用來限定本發明範圍的，並且來自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10型或任何其他新基因型的HCV的任何HCV分離物都是用於實施本發明的E1和/或E2序列的合適來源。
用於本發明的E1和E2抗原可以是完整長度的病毒蛋白，其基本為全長的形式，或其功能性片段(例如，沒有缺少形成或保留表位所必須的序列的片段)。另外，本發明的HCV抗原還可以包括不會妨礙或抑制形成感興趣的構象表位的其他序列。通過用一種抗體(所述構象表位的多克隆或單克隆血清)篩選所述感興趣的抗原，並且將它的反應性與僅僅保留了線性表位(如果有的話)的所述抗原的變性形式的反應性進行比較，可以方便地確定構象表位的存在與否。在所述用多克隆抗體進行的篩選中，優選首先用變性的抗原吸附所述多克隆血清，並觀察是否能保留感興趣抗原的抗體。
本發明的HCV抗原可以通過能提供感興趣的表位的任何重組方法製備。例如，對於天然HCV抗原來說，在哺乳動物或昆蟲細胞中進行重組細胞內表達是提供具有「天然」構象的糖基化E1和/或E2抗原的優選方法。酵母細胞和突變型酵母菌株(例如，mnn9突變體(Kniskern等，1994)或通過礬酸鹽抗性篩選所產生的糖基化變體(Ballou等，1991))很適合生產分泌的高甘露糖型糖類；而由哺乳動物細胞分泌的蛋白可能含有包括半乳糖或唾液酸在內的修飾，這種修飾對於某些診斷或疫苗用途來說可能是不需要的。不過，對於某些用途來說是可行的並且是足夠的，因為對蛋白來說，已知可以在其他重組宿主(如大腸桿菌)中表達所述抗原，並且在回收之後對該蛋白進行復性。
術語『融合多肽』是指這樣一種多肽，其中，HCV抗原是單個的連續胺基酸鏈的一部分，該胺基酸鏈不是天然存在的。所述HCV抗原可以通過肽鍵直接彼此連接，或者通過間插胺基酸序列分開。所述融合多肽還可以含有對於HCV來說是外源的胺基酸序列。
術語『固相』是指一種固體物質，單個的HCV抗原或由HCV抗原組成的融合多肽通過共價結合或諸如疏水性吸附的非共價性結合形式與它連接。
術語『生物學樣品』是指哺乳動物個體(例如，類人猿、人)的體液或組織，它通常含有由所述個體所產生的抗體，尤其是抗HCV的抗體。所述體液或組織還可以含有HCV抗原。所述成分為本領域所公知，並且包括，但不限於血液、血漿、血清、尿液、腦脊液、淋巴液、呼吸道、腸道或泌尿生殖道的分泌物、眼淚、唾液、乳汁、白細胞和骨髓。身體成分包括生物學液體。術語『生物學液體』是指從一種生物體內獲得的體液。某些生物學體液被用作其他製品的來源，如凝血因子(例如，因子VIII；C)、血清白蛋白、生長激素等。在這種情況下，重要的是生物學液體的來源沒有受到諸如HCV的病毒的汙染。
術語『免疫學反應性』表示有關抗原能夠與存在於來自HCV感染過的個體的身體成分中的抗HCV抗體特異性地反應。
術語『免疫複合物』是指當抗體與抗原上的表位結合以後所形成的組合物。
本文所說的『E1』是指在HCV多蛋白的前400個胺基酸內表達的蛋白或多肽，有時候是指E、ENV或S蛋白。其天然形式是一種35kDa的糖蛋白，發現它與膜緊密結合。在大多數天然HCV菌株中，E1蛋白是在病毒多蛋白中緊隨C(核心)蛋白之後編碼的。E1蛋白從所述完整長度多蛋白的大約192號胺基酸延伸至383號胺基酸。
本文所使用的術語『E1』還包括能與天然E1發生免疫交叉反應的類似的或截短的形式，並且包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10基因型或任何其他新鑑定的HCV類型或亞型的E1蛋白。
本文所說的『E2』是指在HCV多蛋白的前900個胺基酸內表達的蛋白或多肽，有時候是指NS1蛋白。其天然形式是一種72kDa的糖蛋白，發現它與膜緊密結合。在大多數天然HCV菌株中，E2蛋白是在所述病毒多蛋白中緊隨E1蛋白之後編碼的。E2蛋白分布在大約384胺基酸至746號胺基酸之間，另一種形式的E2延伸到809號胺基酸。本文所使用的術語『E2』還表示能與天然E2發生免疫交叉反應的類似的或截短的形式。例如，Kato等(1992)業已報導了在383和384號密碼子之間插入多個密碼子，以及缺失384-387號胺基酸。
本文所使用的『E1/E2』表示含有至少一個E1成分和至少一個E2成分的外被蛋白的寡聚物形式。
術語『特異性寡聚』E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白表示重組表達的E1和/或E2外被蛋白的非凝聚的所有可能的寡聚形式。E1和/或E2特異性寡聚外被蛋白還稱作同型寡聚E1或E2外被蛋白(參見下文)。
術語『單個的或特異性寡聚』E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白表示單個的單體E1和/或E2蛋白(在該術語的嚴格含義上是單個的)以及特異性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2重組表達的蛋白。本發明的所述單個的或特異性寡聚外被蛋白還可以通過以下公式定義(E1)x(E2)y，其中，x可以是0-100之間的數，而y可以是0-100之間的數，前提是x和y不能同時為0。當x＝1，而y＝0時，所述外被蛋白包括單體E1。
本文所使用的術語『同型寡聚物』是指含有一個以上E1或E2單體的E1和/或E2的複合物，例如，E1/E1二聚體、E1/E1/E1三聚體、E1/E1/E1/E1四聚體和E2/E2二聚體、E2/E2/E2三聚體、E2/E2/E2/E2四聚體、E1五聚體和六聚體、E2五聚體和六聚體、或E1或E2的任何更高數目的同型寡聚物，都是該定義範圍內的『同型寡聚物，。所述寡聚物可以含有來自不同類型或亞型C型肝炎病毒的E1或E2的一個、二個或數個不同的單體，例如，包括在本申請人的國際專利申請公開文件WO94/25601和歐洲專利申請號94870166.9中所披露的寡聚物，所述混合的寡聚物仍然屬於本發明範圍內的同型寡聚物，並且可以對HCV進行更通用的診斷、預防或治療。
本文中用於蛋白上的術語『純化的』是指一種組合物，其中，所需要的蛋白至少佔該組合物中總蛋白成分的35％。所述需要的蛋白優選佔總蛋白成分的至少40％，更優選至少約50％，更優選至少約60％，更優選至少約70％，更優選至少約80％，更優選至少約90％，最優選至少約95％。所述組合物還可以含有不會影響測定本文所使用的純度百分比的其他化合物，如碳水化合物、鹽類、脂類和溶劑等。『分離的』HCV蛋白是指純度至少為35％的HCV蛋白組合物。
術語『基本上純化的蛋白』是指純化過的蛋白，以便可將其用於體外診斷方法並且用作治療化合物。這種蛋白基本上不含細胞蛋白、載體衍生的蛋白或其他HCV病毒成分。通常，這些蛋白被純化到均質，至少80％的純度，優選90％，更優選95％，更優選97％，更優選98％，更優選99％，更優選99.5％，最優選純化到通過諸如SDS-PAGE和銀染色的常規方法檢測不到汙染蛋白的程度。
在本發明中所使用的術語『重組表達』是指本發明的蛋白是通過重組表達方法在下面所披露的原核生物或低等或高等真核生物中生產的。
術語『低等真核生物』是指諸如酵母和真菌之類的宿主細胞。低等真核生物通常是(但不一定是)單細胞。優選的低等真核生物有酵母，特別是糖酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬(例如，巴斯德畢赤酵母)、漢遜酵母屬(例如，多型漢遜酵母)、Yarowia、許盛酵母屬、裂殖酵母屬和接合酵母屬等屬內的種。釀酒酵母、卡爾酵母和乳克魯維酵母是最常用的酵母宿主，並且是常見的真菌宿主。
術語『原核生物』是指諸如大腸桿菌、乳桿菌、乳球菌、沙門氏菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌或鏈黴菌等宿主。這些宿主同樣可用於本發明中。
術語『高等真核生物』是指來自諸如哺乳動物、爬行動物和昆蟲之類的高等動物的宿主細胞。本發明優選的高等真核生物宿主細胞來自中國倉鼠(例如，CHO)、猴(例如，COS和Vero細胞)、幼倉鼠腎(BHK)、豬腎(PK15)、兔腎13細胞(RK13)、人骨肉瘤細胞系143B、人細胞系HeLa，以及諸如Hep G2的人肝癌細胞系和昆蟲細胞系(例如，草地貪夜蛾)。所述宿主細胞可以以懸浮液或燒瓶培養物、組織培養物和器官培養物之類的形式提供。另外，所宿主細胞還可以是轉基因動物。
術語『多肽』是指胺基酸聚合物，而且不表示特定長度的產物；因此，肽、寡肽和蛋白都包括在多肽的定義範圍內。該術語也不表示或排除對所述多肽的表達後修飾，例如，糖基化、乙醯化和磷酸化等。例如，該定義包括含有一個或多個胺基酸類似物的多肽(例如，包括非天然胺基酸，PNA等)、具有取代過的鍵的多肽，以及本領域已知的其他修飾，包括天然發生的和非天然發生的形式。
術語『重組多核苷酸或核酸』表示來自基因組、cDNA、半合成或合成來源的多核苷酸或核酸，由於其來源或操作(1)它不與在天然狀態下與它結合的多肽的全部或一部分結合，(2)與天然狀態下不與它連接的多核苷酸連接，或(3)在天然狀態下不存在。
術語『重組宿主細胞』、『宿主細胞』、『細胞』、『細胞系』、『細胞培養物』以及其他作為單細胞實體培養的表示微生物或高等真核細胞系的諸如此類的術語，是指可以是或者曾經被用作重組載體或其他轉移多核苷酸的受體的細胞，並且包括轉染過的原始細胞的後代。可以理解的是，由於天然、意外或人為突變，所述單個親本細胞的後代不一定在形態上或者在基因組或總DNA互補上與原始親本完全相同。
術語『複製子』是任何遺傳因子，例如，質粒、染色體、病毒、粘粒等，它在細胞內的表現就如同自主性核苷酸複製單元；即能夠在它自己的控制之下複製。
術語『載體』是一種另外包括提供所需要的開放讀框複製和/或表達的序列的複製子。
術語『控制序列』表示實現與它連接的編碼序列表達所必需的多核苷酸序列。所述控制序列的性質根據宿主生物而有所不同；在原核生物中，所述控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和終止子；在真核生物中，所述控制序列通常包括啟動子、終止子以及在某些場合下包括增強子。術語『控制序列』意在最低限度包括表達時所需要存在的所有成分，並且還可以包括其他成分，這些成分的存在是有利的，例如，能控制分泌的前導序列。
術語『啟動子』是由共有序列所組成的核苷酸序列，它使得RNA聚合酶能夠以這樣的方式與DNA模板結合在相鄰的結構基因的正常轉錄起始位點上開始產生mRNA。
短語『可操作地連接』表示一種並列，其中，有關成分的相互關係使得它們能夠以預期的方式起起用。控制序列『可操作地連接』於編碼序列是這樣一種連接，該編碼序列的表達是在與該控制序列相容的條件下實現的。
『開放讀框』(ORF)是一段多核苷酸序列，它編碼一種多肽，並且不含終止密碼子；該片段可以是編碼序列的一部分或者是整個編碼序列。
『編碼序列』是在適當的調控序列控制下能轉錄成mRNA和/或翻譯成多肽的多核苷酸序列。所述編碼序列的邊界是由位於5』末端的翻譯起始密碼子和位於3』末端的翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可以包括，但不限於mRNA、DNA(包括cDNA)以及重組多核苷酸序列。
在本文中，『表位』或『抗原決定族』表示具有免疫活性的胺基酸序列。通常，一個表位由至少3-4個胺基酸，更常見的是至少5或6個胺基酸組成，有時候所述表位由約7-8個，或者甚至是大約10個胺基酸組成。在本文中，特定多肽的表位表示具有與所述特定多肽的表位相同的胺基酸序列的表位及其免疫學等同物。所述等同物還包括菌株、亞型(＝基因型)或類型(組)特異性變體，例如，屬於1a、1b、1c、1d、1e、1f、2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g、2h、2i、3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、4k、4l、5a、5b、6a、6b、6c、7a、7b、7c、8a、8b、9a、9b、10a或任何其他新確定的HCV(亞)型的目前已知的序列或菌株。可以理解的是，構成所述表位的胺基酸不一定是線性序列的一部分，而且可以由任何數量的胺基酸間隔開，因此形成一種構象表位。
術語『免疫原性』表示一種物質在有或沒有佐劑的情況下，單獨或者與一種載體結合時，能導致體液和/或細胞應答的能力。『中和』表示能部分或完全抑制一種感染劑的感染性的免疫應答。『疫苗』是能夠部分或全面誘導針對HCV的保護作用的免疫原性組合物。疫苗還可用於治療個體，在這種情況下，它又被稱為治療性疫苗。
術語『治療性』是指一種能治療HCV感染的組合物。
術語『有效量』表示足以在給予它的個體體內誘導免疫應答或者在其預期的系統(例如，免疫測定)中產生可檢測的免疫反應的具有表位的多肽的量。所述有效量優選足以實現上文所定義的治療。所需要的確切的用量會根據用途有所不同。例如，對於疫苗用途或對於製備多克隆抗血清/抗體的用途來說，所述有效量可能根據物種、年齡、個體的一般狀況、要治療的狀況的嚴重程度、以及所選擇的特定多肽及其給藥方式等而有所不同。另外，相信所述有效量可以在相對較大的非關鍵範圍內。僅僅通過常規實驗，就可以方便地確定合適的有效量。用於預防HCV疾病的E1和/或E2和/或E1/E2單個的或特異性寡聚外被蛋白的優選範圍是0.01-100微克/劑，優選0.1-50微克/劑。為了獲得足夠的免疫應答，以及隨後預防HCV病，每個個體可能需要若干個劑量。
發明詳述更具體地講，本發明涉及一種用於分離或純化選自E1和/或E2和/或E1/E2的重組HCV單個的或特異性寡聚外被蛋白的方法，其特徵在於在裂解轉化過的宿主細胞以便分離重組表達的蛋白時，用一種二硫鍵裂解劑完成一個二硫鍵裂解或還原步驟。
本發明的所述『單個的或特異性寡聚』外被蛋白的實質是，它們不含汙染性蛋白，並且，它們不通過二硫鍵與汙染物連接。
本發明的蛋白是在低等或高等真核細胞或原核細胞中重組表達的。本發明的重組蛋白優選是糖基化的，並且可以含有高甘露糖型、雜合型或複雜的糖基化。所述蛋白優選是由在實施例部分詳細披露的哺乳動物細胞系表達的，或者是諸如同樣在實施例部分詳細披露的突變型酵母菌株等酵母中表達的。
本發明的蛋白可以是分泌的或者在細胞的成分，如ER或高爾基體內表達。不過，本發明的蛋白優選具有高甘露糖型糖基化，並且保留在哺乳動物細胞的ER或高爾基體中，或者保留在酵母細胞中或者從酵母細胞中分泌出來，優選是由諸如mnn9突變體的酵母突變菌株(Kniskern等，1994)，或通過礬酸鹽抗性篩選過的突變體(Ballou等，1991)分泌。
在表達HCV外被蛋白時，本發明人證實半胱氨酸的某些游離的巰基沒有參與細胞內或細胞間二硫橋，與宿主或表達系統產生的(例如，痘苗)蛋白或其他HCV外被蛋白(單個的或寡聚物的)的半胱氨酸起反應，並形成一種特殊的分子間橋。這會導致HCV外被蛋白與汙染蛋白一起形成『凝聚物』。在WO92/08734中還證實了『凝聚物』是在純化之後獲得的，不過，該文獻沒有披露與哪一種蛋白相互作用有關。在專利申請WO92/08734中由痘苗病毒系統表達的重組E1/E2蛋白是部分純化的凝聚物，並且發現它的純度僅僅為70％，使得這種純化的凝聚物不能用於診斷、預防或治療目的。
因此，本發明的一個主要目的是從汙染的蛋白中分離單個的或特異性寡聚HCV外被蛋白，並將純化的蛋白(＞95％的純度)用於診斷、預防和治療目的。為達到以上目的，本發明人業已能夠提供在二硫橋和非共價蛋白-蛋白相互作用基礎上形成了凝聚的蛋白複合物(凝聚物)的證據。因此，本發明提供了一種用於在特定情況下選擇性地裂解二硫鍵並且用於從能極大幹擾診斷、預防和治療用途的汙染蛋白中分離蛋白的方法。為了防止再次形成二硫鍵，可以封閉(可逆的或不可逆的)游離的巰基基團，或者對它進行氧化並與其他外被蛋白寡聚化(參見同型寡聚物的定義)。可以理解的是，所述蛋白寡聚物基本上不同於在WO92/08734和WO94/01778中所披露的凝聚物，因為它的汙染蛋白的含量是檢測不到的。
所述二硫鍵的裂解可以通過以下方法實現(1)通過半胱磺酸進行的過甲酸氧化，在這種情況下，半胱氨酸殘基被修飾成半胱磺酸(Moore等，1963)。
(2)例如，通過亞硫酸鹽(SO2-3)與諸如銅離子的適當的氧化劑一起進行亞硫酸分解(R-S-S-R-2R-SO3)，在這種情況下，半胱氨酸被修飾成S-磺基-半胱氨酸(Bailey和Cole，1959)。
(3)由諸如二硫蘇糖醇(DDT)、β-巰基乙醇、半胱氨酸、穀胱甘肽紅、ε-巰基乙胺或巰基乙酸的硫醇進行的還原，其中，DTT和β-巰基乙醇是常用的(Cleland，1964)，它是本發明的優選方法，因為該方法可以在水環境中進行，並且因為半胱氨酸保持未被修飾。
(4)通過膦(例如，Bu3P)進行還原(Ruegg和Rudinger，1977)。
因此，上述所有化合物都被認為是本發明用於裂解二硫鍵的製劑或手段。
本發明的所述二硫鍵裂解(或還原)步驟，優選是一個部分二硫鍵裂解(還原)步驟(在部分裂解或還原條件下進行)。
本發明的優選的二硫鍵裂解或還原製劑是二硫蘇糖醇(DTT)，部分還原是通過使用低濃度的所述還原劑而實現的，即，對於DTT來說，例如，在大約0.1-大約50mM的濃度範圍內，優選大約0.1大約20mM，優選大約0.5-大約10mM，優選高於1mM，高於2mM或高於5mM，更優選大約1.5mM，大約2.0mM，大約2.5mM，大約5mM或大約7.5mM。
所述二硫鍵裂解步驟還可以在存在諸如DecylPEG、EMPIGEN-BB、NP-40、草酸鈉、Triton X-100的能裂解所表達的蛋白的合適的洗滌劑(作為裂解二硫鍵的例子或與裂解劑組合)的條件下進行。
所述還原或裂解步驟(優選部分還原或裂解步驟)優選在有(含)洗滌劑的條件下進行。本發明優選的洗滌劑是Empigen-BB。諸如Empigen-BB的洗滌劑的用量優選在1-10％的範圍內，優選高於3％，更優選大約3.5％。
用於實現二硫鍵裂解的特別優選的方法採用了上述常規二硫鍵裂解製劑和洗滌劑(同樣如上文所述)的組合。正如在實施例部分所提到的，低濃度DTT(1.5-7.5mM)和大約3.5％Empigen-BB的特定組合，被證明是用於純化重組表達的E1和E2蛋白的還原劑和洗滌劑的特別優選的組合。在進行凝膠過濾層析時，發現所述部分還原會導致產生可能的二聚體E1蛋白，並且從導致免疫測定時產生假反應性的汙染蛋白中分離這種E1蛋白。
不過，同樣可以理解的是，使得半胱氨酸更容易接近的本領域已知的任何還原劑與本領域已知的任何洗滌劑或其他方式的任何其他組合，同樣屬於本發明的範圍，只要所述組合能夠達到與本發明所披露的優選組合相同的二硫鍵裂解目的就行。
除了還原二硫鍵之外，本發明的二硫鍵裂解方式還可以包括本領域已知的任何二硫鍵交換製劑(有機類或蛋白類競爭性製劑，例如，參見Creighton，1988)，這種製劑能夠導致發生以下反應
*R1、R2蛋白凝聚物的化合物R3SH競爭性製劑(有機類、蛋白類)術語『二硫橋交換製劑』被理解為包括二硫鍵再生成劑以及二硫鍵抑制劑。
本發明還涉及用於純化或分離上述HCV單個或特異性寡聚外被蛋白的方法，包括利用本領域已知的任何SH基團抑制劑或結合製劑，如選自下面所列舉的製劑穀胱甘肽5，5』-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)或雙-(3-羧基-4-硝基苯基)-二硫化物(DTNB或Ellman’s製劑)(Elmann，1959)N-乙基馬來醯亞胺(NEM；Benesch等，1956)N-(4-二甲基氨基-3，5-二硝基苯基)馬來醯亞胺或Tuppy’s馬來醯亞胺，它能為蛋白提供顏色P-氯代苯甲酸汞(Grassetti等，1969)4-乙烯吡啶(Friedman和Krull，1969)，可以在通過酸水解反應之後釋放出來乙腈，可以在通過酸水解之後釋放出來(Weil和Seibles，1961)NEM-生物素(例如，購自Sigma B1267)2.2』-二硫代吡啶(Grassetti和Murray，1967)4.4』-二硫代吡啶(Grassetti和Murray，1967)6.6』-二硫代二煙酸(DTDAN；Brown和Cunigham，1970)2.2』-二硫代雙-(5』-硝基吡啶)(DTNP；US3597160)或其他二硫代雙(雜環衍生物)化合物(Grassetti和Murray，1969)綜合所引用的文獻可以發現，通常用於巰基基團的不同的製劑會與同一種蛋白或酶分子的不同數量的硫醇基團起反應。人們可能會認為所述硫醇基團在反應性方面的變化可能是由於該基團的空間環境所導致的，如所述分子的形狀和原子周圍的基團及其電荷，以及所述製劑分子或離子的大小、形狀和電荷。通常，足夠濃度的諸如十二烷基硫酸鈉、尿素或鹽酸胍的變性劑的存在，會導致蛋白分子具有足夠的非摺疊，使得所有的製劑都能同樣接觸硫醇基團。通過改變變性劑的濃度，可以控制非摺疊的程度，並且通過這種方法可以發現具有不同程度反應性的硫醇基團。儘管到目前為止，所報導的大部分研究都是用p-氯代苯甲酸汞、N-乙基馬來醯亞胺和DTNB進行的，其他最近開發出的製劑可能會被證明同樣有用。由於它們具有不同的結構，事實上，很有可能它們會對硫醇基團的空間環境的改變產生不同的反應。
另外，用於抑制游離的SH基團氧化，並因此抑制在重組表達和純化E1和E2(外被)蛋白時形成大的分子間凝聚物的諸如低的pH(優選低於pH6)的條件也屬於本發明的範圍。
本發明的優選的SH基團封閉製劑是N-乙基馬來醯亞胺(NEM)。所述SH基團封閉製劑可以在重組宿主細胞裂解期間，並且在上述部分還原過程之後或者在用於裂解二硫橋的任何其他過程之後使用。所述SH基團封閉製劑還可以用能夠提供可檢測的標記的任何基團和/或有助於將所述重組蛋白固定在固體底物上的任何基團，例如，生物素化的NEM進行修飾。
Darbre(1987)，Means和Feeney(1971)以及Wong(1993)還披露了用於裂解半胱氨酸橋和封閉游離的半胱氨酸的方法。
如上文所述的本發明的純化單個的或特異性寡聚重組蛋白E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的方法的特徵還在於包括以下步驟-優選在有諸如N-乙基馬來醯亞胺(NEM)的SH基團封閉製劑，以及可能存在的合適的洗滌劑，優選Empigen-BB的條件下，裂解重組E1和/或E2和/或E1/E2表達宿主細胞，-通過親和純化回收所述HCV外被蛋白，例如，通過凝集素層析純化，如lentil凝集素層析、或用抗E1和/或抗E2特異性單克隆抗體進行的免疫親和層析，然後-用諸如DTT的二硫鍵裂解製劑還原或裂解二硫鍵，同樣優選在有諸如NEM或生物素-NEM的SH基團封閉製劑的情況下進行，以及-通過諸如凝膠過濾(大小排阻層析或分子篩)的方法回收所述還原的HCV E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白。隨後還可以進行額外的Ni2+-IMAC層析以及脫鹽步驟。
應當理解的是，上述回收步驟還可以用本領域技術人員所公知的任何其他合適的技術完成。
優選的凝集素層析系統包括雪花蓮凝集素(GAN)-層析，或兵豆凝集素(LCA)(lentil)凝集素層析，正如在實施例部分所披露的。其他有用的凝集素包括那些能識別高甘露糖型糖類的凝集素，如黃水仙凝集素(NPA)、豌豆凝集素(PSA)或熊蔥凝集素(AUA)。
優選將上述方法用於純化按上述方法在細胞內產生的單個的或特異性寡聚HCV外被蛋白。
對於分泌型E1或E2或E1/E2寡聚物來說，諸如蓖麻凝集素I(RCAI)的凝集素結合複合糖是優選的凝集素。
更具體地講，本發明涉及選自E1和/或E2和/或E1/E2的基本上純化的重組單個的或特異性寡聚HCV外被蛋白，其特徵是通過上述方法分離或純化的。
更具體地講，本發明涉及純化或分離由諸如痘苗的重組哺乳動物細胞表達的重組單個的或特異性寡聚HCV外被蛋白。
本發明還涉及純化或分離由重組酵母細胞表達的重組外被蛋白。
本發明同樣涉及純化或分離由重組細菌(原核生物)細胞表達的重組外被蛋白。
本發明還涉及一種重組載體，該載體包括一個載體序列，一個合適的原核生物、真核生物或病毒或合成的啟動子序列，隨後是一個可以表達本發明的單個的或特異性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2的核苷酸序列。
具體地講，本發明涉及一種重組載體，該載體包括一個載體序列，一個合適的原核生物、真核生物或病毒或合成的啟動子序列，隨後是一個可以表達本發明的單個的E1或E1的核苷酸序列。
具體地講，本發明涉及一種重組載體，該載體包括一個載體序列，一個合適的原核生物、真核生物或病毒或合成的啟動子序列，隨後是一個可以表達本發明的單個的E1或E2的核苷酸序列。
插入所述載體序列中的編碼需要的E1和/或E2序列的HCV cDNA片段，可以與一個信號序列連接。所述信號序列可以是來自非HCV來源的信號序列，例如，用於在哺乳動物細胞中表達的IgG或組織纖溶酶原激活物(tpa)前導序列，或用於在酵母細胞中表達的α交配因子序列，不過，本發明特別優選的構建體含有出現在HCV基因組上位於E1和E2蛋白的相應的起始位點前面的信號序列。插入所述載體序列中的編碼需要的E1和/或E2序列的HCV cDNA片段還可以包括缺失，例如，在實施例部分所披露的疏水性結構域的缺失，或E2高可變區I的缺失。
具體地講，本發明的重組載體包括具有編碼所述多蛋白的HCVcDNA片段的核酸，該片段始於HCV多蛋白的1號和192號胺基酸位點之間，並且止於250-400號位點之間的部分，更優選止於250-341號位點之間的部分，更優選止於290-341號位點之間的部分，以便表達HCV單個的E1蛋白。最優選的是，本發明的重組載體包括具有編碼部分HCV多蛋白的HCV cDNA片段的重組核酸，該片段始於117-192位置之間的部分，並且止於263-326號位置之間的任意位點，以便表達HCV單個的E1蛋白。缺失了第一個疏水性結構域(264-293號位置加或減8個胺基酸)的形式，或添加了5』末端ATG密碼子和3』末端終止密碼子的形式，或添加了因子Xa裂解位點和/或3-10個，優選6個組氨酸密碼子的形式同樣屬於本發明的範圍。
更具體地，本發明的重組載體包括具有編碼所述多蛋白的HCVcDNA片段的核酸，該片段始於290-409號胺基酸位點之間的部分，並且止於HCV多蛋白的600-820號位點之間的部分，更優選始於322-406號位點之間的部分，更優選始於347-406號位點之間的部分，更優選始於364-406號位點之間的部分，以便表達HCV單個的E2蛋白。最優選的是本發明的重組載體包括具有編碼所述多蛋白的HCV cDNA片段的重組核酸，該片段始於290-406號位置之間的部分，並且止於623、650、673、710、715、720、746或809號位置中的任意一個位置，以便表達HCV單個的E2蛋白。添加了5』末端ATG和3』末端終止密碼子的形式，或添加了因子Xa裂解位點和/或3-10個，優選6個組氨酸密碼子的形式同樣屬於本發明的範圍。
有多種載體可用於實現本發明的HCV單個的或特異性的寡聚外被蛋白的重組表達。諸如酵母或糖基化突變菌株的低等真核生物通常是用質粒轉化的，或者是用重組病毒轉化的。所述載體可以在所述宿主內獨立複製，或者也可以整合到宿主細胞基因組中。
高等真核生物可以用載體轉化，或者可以用重組病毒轉染，例如用重組痘苗病毒轉染。用於將外源DNA插入痘苗病毒中的方法和載體為本領域所熟知，並且使用諸如同源重組的方法。在本領域可以獲得哺乳動物表達所需要的多種病毒啟動子序列，可能需要的終止子序列和聚腺苷酸添加序列，可能的增強子序列以及可能的擴增序列。痘苗是特別優選的，因為痘苗能抑制宿主細胞蛋白的表達。痘苗同樣是非常優選的，因為它能在用活的重組痘苗病毒免疫的細胞或個體中表達HCV的E1和E2蛋白。對於人類免疫接種來說，禽痘病毒和Ankara修飾病毒(AMV)是特別優選的載體。
另外，已知源於杆狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的昆蟲表達轉移載體是輔助依賴型病毒表達載體。源於該系統的表達載體通常使用強的病毒多角體蛋白基因啟動子驅動異源基因的表達。本領域技術人員可以獲得用於將異源DNA導入杆狀病毒的理想位點以便進行杆狀病毒表達的不同的載體和方法。由昆蟲細胞識別的用於翻譯後修飾的不同的信號在本領域中同樣是公知的。
本發明還包括用於生產純化的重組單個的或特異性寡聚HCV E1或E2或E1/E2蛋白的方法，其中，參與凝聚物形成的半胱氨酸殘基在核酸序列水平上被其他殘基所取代，以便抑制凝聚物的形成。由攜帶所述突變的E1和/或E2蛋白編碼核酸的重組載體所表達的所述重組蛋白同樣屬於本發明的範圍。
本發明還涉及重組E1和/或E2和/或E1/E2蛋白，其特徵在於業已去掉了它們的至少一個糖基化位點，並因此被稱為糖基化變體。正如在實施例部分所述，為了診斷(篩選、證實、預測等)和抑制有關患者的HCV診斷和預防有關患者的HCV疾病，可能需要不同的糖基化變體。例如，業已發現缺乏GLY4的E2蛋白糖基化變體在診斷中能改善某些血清的反應性。所述糖基化變體優選是按照本發明所披露的方法純化的。本發明還涉及具有編碼諸如E1和/或E2和/或E1/E2糖基化變體的核酸插入片段的重組載體，以及用所述重組載體轉化過的宿主細胞。
本發明還涉及包括同樣構成本發明的一部分的多核苷酸的重組載體。本發明特別涉及如SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47和49所示出的重組核酸或其部分。
本發明還涉及用上述重組載體轉化過的宿主細胞，其中，所述載體包括編碼上述HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的核酸序列，另外還包括可操作地連接在所述HCV E1和/或E2和/或E1/E2序列上的，並且能夠調控所述HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白表達的調控序列。
真核宿主包括在定義部分所披露的低等和高等真核宿主。低等真核宿主包括本領域所熟知的酵母細胞。高等真核宿主主要包括本領域所公知的哺乳動物細胞系，並且包括可以從ATCC獲得的很多永生化細胞系，包括HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、PK15、PK13和多種其他細胞系。
本發明特別涉及由含有上述重組載體的上述宿主細胞所表達的重組E1和/或E2和/或E1/E2蛋白。所述重組蛋白特別是用本發明的方法純化過的。
上述用於分離或純化HCV外被蛋白的優選方法的特徵還在於至少包括以下步驟-在合適的培養基中生長用本發明的重組載體或能表達E1和/或E2和/或E1/E2 HCV外被蛋白的重組載體轉化過的上述宿主細胞，-在合適的條件下使所述載體序列表達，以及-優選在有諸如N-乙基馬來醯亞胺(NEM)的SH基團封閉製劑，以及可能存在的合適的洗滌劑，優選Empigen-BB的條件下裂解所述轉化過的宿主細胞，-通過親和層析回收所述HCV外被蛋白，例如，通過凝集素親和層析或使用抗E1和/或抗E2特異性單克隆抗體的免疫親和層析，所述凝集素優選是lentil-凝集素或GNA，然後-用諸如DTT的二硫鍵裂解製劑溫育以上步驟的洗脫物，優選隨後用諸如NEM或生物素NEM的SH基團封閉製劑進行溫育，-通過諸如凝膠過濾的方法分離HCV單個的或特異性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2蛋白，隨後還可以進行額外的Ni2+-IMAC層析以及脫鹽步驟。
正如在實施例部分所披露的，上述過程的結果是，以從含有載體來源的成分和/或凝膠過濾柱或IMAC柱的空隙體積中的細胞成分的大的凝聚物中差異洗脫的形式生產出了E1和/或E2和/或E1/E2蛋白。由於存在宿主和/或表達系統產生的蛋白，所述二硫鍵裂解步驟，優選還消除了假的反應性。在裂解細胞期間NEM和合適的洗滌劑的存在已經部分或者甚至是完全抑制了HCV外被蛋白和汙染物之間的凝聚。
正如Janknecht等1991和Hochuli等1998所披露的，優選將Ni2+-IMAC層析和隨後的脫鹽步驟用於具有(His)6的構建體。
本發明還涉及用於在諸如小鼠和大鼠的小動物中生產單克隆抗體的方法，以及利用本發明的HCV單個的或特異性寡聚外被蛋白篩選並分離能識別抗HCV抗體的人B-細胞的方法。
本發明還涉及一種含有在表3中所列舉的至少一種下列E1肽的組合物跨越核心/E1 V1區的181-200號胺基酸的E1-31(SEQ ID NO56)，跨越E1區的193-212號胺基酸的E1-33(SEQ ID NO57)，跨越E1 V2區的205-224號胺基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO58)，跨越E1 V2區的208-227號胺基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO59)，跨越E1區的192-228號胺基酸(V1、C1、和V2區(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO53)，跨越E1區301-320號胺基酸的E1-51(SEQ ID NO66)，跨越E1C4區的313-332號胺基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO67)，跨越E1的325-344號胺基酸的E1-55(SEQ ID NO68)，本發明還涉及含有在表3中所列舉的至少一種下列E2肽的組合物；跨越E2區的397-418號胺基酸(表位A，由單克隆抗體2F10H10識別，參見

圖19)的Env67或E2-67(SEQ ID NO72)，跨越E2區的409-428號胺基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO73)，跨越E2區的583-602號位置(表位E)的Env23或E2-23(SEQ IDNO86)，跨越E2區的595-614號位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO87)，跨越E2區的607-626號位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO88)，跨越E2區的547-586號位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO83)，跨越E2區的523-542號位置(表位C；由單克隆抗體16A6E7識別，參見圖19)的Env13B或E2-13B(SEQ ID NO82)。
本發明還涉及含有至少一種下列E2構象表位的組合物。
由單克隆抗體15C8C1、12D11F1和8G10D1H9單克隆抗體識別的表位F，由單克隆抗體9G3E6識別的表位G，由單克隆抗體10D3C4和4H6B2識別的表位H(或C)，由單克隆抗體17F2C2識別的表位I。
本發明還涉及通過用一種肽或蛋白組合物免疫所產生的E1或E2特異性抗體，所述抗體能夠與上述任意一種多肽或肽特異性地反應，並且所述抗體優選是單克隆抗體。
本發明還涉及通過本領域公知的方法從質粒或噬菌體中可變鏈文庫中或者從人B細胞群體中篩選的E1或E2特異性抗體，所述抗體能夠與上述任意一種多肽或肽起反應，並且所述抗體優選是單克隆抗體。
在一方面，本發明的E1或E2特異性單克隆抗體可以通過用本發明的HCV多肽或肽免疫過的動物，特別是小鼠或大鼠脾細胞，通過常規方法形成的任意一種雜交瘤產生，另一方面，可以由骨髓瘤細胞系的細胞產生，可以根據雜交瘤產生能識別起初用於免疾所述動物的多肽的單克隆抗體的能力進行選擇。
本發明所涉及到的抗體可以通過酶促、螢光、或放射性類型的合適的標記物進行標記。
本發明的該優選實施方案的單克隆抗體，可以是通過重組DNA技術製備的人源化形式的小鼠單克隆抗體，脫離了部分來自編碼H和L鏈的cDNA或基因組克隆的編碼H和L鏈的小鼠和/或人基因組DNA序列。
另外，本發明的該優選實施方案的單克隆抗體可以是人單克隆抗體。本發明的該實施方案的抗體還可以來自受HCV感染的或對HCV有免疫力的患者的人外周血淋巴細胞。
例如，所述人單克隆抗體是通過使人外周血淋巴細胞(PBL)重新集中於重度合併性免疫缺陷(SCID)小鼠而製備的(最新的綜述參見Duchosal等，1992)。
本發明還涉及利用本發明的蛋白或肽通過所有成分克隆的方法篩選重組抗體(Persson等，1991)。
針對來自特定基因型的肽或單個的或特異性寡聚的外被蛋白的抗體可以被用作藥物，更具體地講，用於檢測HCV基因型的免疫測定中(用於檢測HCVE1或E2抗原的存在)，用於預測/監測HCV疾病，或者用作治療劑。
另外，本發明還涉及利用上述任意一種E1或E2特異性單克隆抗體製備用於檢測生物學樣品中E1或E2抗原存在的免疫測定試劑盒，用於製備預測/監測HCV疾病的試劑盒或用於製備HCV藥物。
本發明還涉及一種用於體外診斷或檢測生物學樣品中HCV抗原存在的方法，至少包括以下步驟(i)在能夠形成免疫複合物的合適條件下，讓所述生物學樣品與上述任意一種E1和/或E2特異性單克隆抗體接觸，優選固定化形式的單克隆抗體，(ii)清除未結合的成分，(iii)在合適的條件下，溫育由異源抗體形成的免疫複合物，它能特異性地結合存在於要分析的樣品中的抗體，在所述異源抗體上結合了一種可檢測的標記，(iv)通過肉眼或機械方法(例如，通過密度測定、螢光測定、比色測定)檢測所述免疫複合物的存在。
本發明還涉及用於體外診斷存在於生物學樣品中的HCV抗原的試劑盒，包括-至少一種上述單克隆抗體，所述單克隆抗體優選固定在一種固體基質上，-生產使得所述抗體和存在於所述生物學樣品中的HCV抗原之間的結合反應能夠進行的緩衝液所需要的緩衝物或成分，-一種用於檢測在上述結合反應中所形成的免疫複合物的裝置，-還可能包括一個用於根據所觀察到的結合形式推測存在於所述樣品中的HCV抗原的自動化掃描和翻譯裝置。
本發明還涉及被用作藥物的含有用本發明的方法純化過的E1和/或E2和/或E1/E2重組HCV蛋白的組合物，或含有上述至少一種肽的組合物。
更具體地講，本發明涉及含有上述至少一種外被肽的組合物或上述重組外被蛋白組合物，將該組合物用作疫苗對哺乳動物，優選人類進行HCV免疫，包括給予足夠量的所述組合物，還可以同時給予可以藥用的佐劑，以便產生免疫應答。
更具體地講，本發明還涉及將上述任意一種組合物用於製備上述疫苗。
另外，本發明涉及一種用於對哺乳動物，優選人類進行HCV免疫的疫苗，它含有來自上述E1和/或E2區的HCV單個的或特異性寡聚蛋白或肽。
可以按照本領域公知的方法製備免疫原性組合物。本發明的組合物含有免疫原量的上述重組E1和/或E2和/或E1/E2單個的或特異性寡聚蛋白或上述E1或E2肽，通常與一種可以藥用的載體組合，優選還含有一種佐劑。
預計本發明的E1和/或E2和/或E1/E2單個的或特異性寡聚外被蛋白能夠提供特別有用的疫苗抗原，因為形成抗E1或E2的抗體比形成抗其他外被蛋白的抗體更理想，並且由於E2蛋白在HCV類型之間有交叉反應，而且E1蛋白是類型特異性的。含有來自若干種基因型的1型E2蛋白和E1蛋白的混合物可能是特別有利的。含有摩爾數過量的E1與E2或E2與E1的混合物可能同樣是特別有用的。可以給動物給予免疫原性組合物，以便誘導抗體的產生，從而提供抗體的來源或在所述動物體內誘導保護性免疫性。
可以藥用的載體包括任何載體，它本身不會誘導對接受該組合物的個體有害的抗體的產生。合適的載體通常是大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物；以及無活性的病毒顆粒。所述載體為本領域普通技術人員所熟知。
能增強所述組合物效果的優選佐劑包括，但不限於披露於US4606918中的氫氧化鋁(明礬)、N-乙醯-肉桂醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)，N-乙醯-正肉桂醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(nor-MDP)、N-乙醯肉桂醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺-L-丙氨酸-2-(1』-2』-二棕櫚醯-sn-甘油-3-羥基磷氧基)-乙胺(MTP-PE)和RIBI，在2％角鯊烯/Tween80乳液中含有三種從細菌中提取的成分-單磷脂A、海藻糖二黴菌酸酯、以及細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。MPL、TDM或CWS這三種成分中的任意一種都可以單獨使用或者兩兩組合使用。另外，還可以使用諸如Stimulon(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或SAF-1(Syntex)的佐劑。另外，可將完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)用於非人用途和研究目的。
所述免疫原性組合物通常含有可以藥用的載體，如水、鹽水、甘油、乙醇等。另外，在所述載體中可以包括輔助性物質，如溼潤劑或乳化劑，pH緩衝物質和防腐劑等。
通常，所述免疫原性組合物是作為可以注射的液體溶液或懸浮液形式製備的；還可以製備適合在注射之前溶解在或懸浮在液體載體中的固體形式。所述製劑還可以乳化在或膠囊化在脂質體中，以便增強佐劑的效果。E1和E2蛋白還可以與諸如Quil A的皂苷一起結合在免疫刺激複合物中(ISCOMS)。
被用作疫苗的免疫原性組合物含有『足夠量的』或『免疫有效量的』本發明的外被蛋白，以及根據需要含有上述任何其他成分。『免疫有效量的』表示作為單個劑量或作為一系列劑量的一部分給予這一用量就能實現上述有效治療。所述用量根據接受治療的個體的健康和體能狀況、接受治療的個體的分類類型(例如，非人靈長類、靈長類等)、所述個體的免疫系統合成抗體的能力、需要保護的程度、疫苗的配方、治療醫師對醫學狀況的評估、感染HCV的菌株、以及其他相關因素而有所不同。預計，所述用量落在一個較寬的範圍內，該範圍可以通過常規實驗確定。通常，所述用量在0.01-1000微克/劑之間，更優選0.1-100微克/劑。
所述單個的或特異性寡聚外被蛋白還可以用作疫苗載體，以與B型肝炎表面抗原相同的方式呈遞同源的(例如，來自核心、NS2、NS3、NS4或NS5區的T細胞表位或B細胞表位)或異源的(非HCV)半抗原(參見歐洲專利申請174444)。在這一用途中，外被蛋白提供了一種能夠刺激對與所述凝聚物結合的半抗原或抗原的免疫應答的免疫原性載體。所述抗原可以通過常規化學方法連接，或者可以克隆到編碼E1和/或E2的基因的相當於該蛋白的親水性區的位點上。所述親水區包括V1區(包括191-202號胺基酸)、V2區(包括213-223號胺基酸)、V3區(包括230-242號胺基酸)、V4區(包括230-242號胺基酸)、V5區(包括294-303號胺基酸)和V6區(包括329-336號胺基酸)。另一種可用於插入半抗原的位點是疏水區(包括264-293號胺基酸)。在本發明中證實，該區可以缺失，而不會影響缺失了的E1蛋白與血清的反應性。因此，可以將半抗原插在所述缺失位點上。
所述免疫原性組合物通常是通過注射方式經腸胃外途徑給予的，例如，皮下或肌內注射。適合其他給予方法的其他製劑包括口服製劑和栓劑。劑量治療可以是單個劑量方案或多劑量方案。所述疫苗可以與其他免疫調控劑組合使用。
本發明還涉及一種用於體外檢測存在於生物學樣品中的HCV抗體的含有上述肽或多肽的組合物。
本發明還涉及將上述組合物用於製備用來檢測存在於生物學樣品中的HCV抗體的免疫測定試劑盒的用途。
本發明還涉及一種用於體外診斷存在於生物學樣品中的HCV抗體的方法，該方法至少包括以下步驟(i)在能夠形成免疫複合物的合適條件下，讓所述生物學樣品與含有上述任意一種上述外被肽或蛋白的組合物接觸，優選固定化形式的組合物，其中，所述肽或蛋白可以是通過鏈黴親和素或親和素複合物與一種固體基質共價結合的生物素化的肽或蛋白，(ii)清除未結合的成分，(iii)在合適的條件下，溫育由異源抗體形成的免疫複合物，所述異源抗體上結合了可檢測的標記，(iv)通過肉眼或機械方法(例如，通過密度測定、螢光測定、比色測定)檢測所述免疫複合物的存在。
另外，本發明還涉及競爭性免疫測定製劑，其中，將上文所披露的重組生產的單個的或特異性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2蛋白與E1和/或E2蛋白組合使用，以便競爭存在於生物學樣品中的HCV抗體。
本發明還涉及一種用於確定HCV抗體在生物學樣品中的存在的試劑盒，包括-上述至少一種肽或蛋白組合物，有可能與來自HCV或其他類型HCV的其他的多肽或肽組合，所述肽或蛋白優選固定在一種固體基質上，更優選固定在同一塊ELISA平板上的不同的微孔上，更優選固定在同一個膜片上，-生產使得所述多肽或肽與所述存在於所述生物學樣品中的抗HCV的抗體之間的結合反應能夠進行的緩衝液所需要的緩衝物或成分，-用於檢測在上述結合反應中所形成的免疫複合物的裝置，-還可能包括一個用於根據所觀察到的結合形式推測存在於所述樣品中的HCV基因型的自動化掃描和翻譯裝置。
本發明的免疫測定方法使用來自E1和/或E2結構域的單個的或特異性寡聚抗原，該抗原保留了由存在於來自受HCV感染的個體的血清中的抗體識別的線性(對於肽來說)和構象表位(單個的或特異性寡聚蛋白)。例如，使用單個的或特異性寡聚抗原、二聚體抗原、以及單個的或特異性寡聚抗原的組合也屬於本發明的範圍。本發明的HCVE1和E2抗原實際上可應用於採用已知的抗原檢測抗體的任何測定方案中。當然，應當避免或改進使HCV構象表位變性的方案。上述所有測定的共同特徵是，在所述抗原能夠結合存在於所述成分中的任何所述抗體的條件下，讓所述抗原與被懷疑含有HCV抗體的身體成分接觸。所述條件通常是使用過量抗原時的生理學溫度、pH和離子強度。在將所述抗原與所述樣品一起溫育之後，檢測包括所述抗原的免疫複合物。
免疫測定的設計可以有很大的不同，並且許多方案為本領域所公知。例如可以使用固體支持物或免疫沉澱的方案。大多數測定包括使用標記過的抗體或多肽；所述標記可以是，例如，酶促、螢光、化學發光、放射性、或染料分子。用於放大來自所述免疫複合物的信號的測定同樣是公知的；其例子有利用生物素和親和素或鏈黴親和素的測定，以及未標記的和介導的免疫測定，如ELISA測定。
所述免疫測定可以是，但不限於標準類型或競爭類型的異源或同源方案。在異源方案中，所述多肽通常與一種固體基質或支持物結合，以便有利於在溫育之後將所述樣品與所述多肽分離。可以使用的固體支持物的例子有硝酸纖維素(例如，薄膜形式或微量滴定孔形式)，聚氯乙烯(例如，片材或微量滴定孔)，聚丙乙烯乳膠(例如，小球或微量滴定板)，聚偏氟乙烯(被稱為ImmunolonTM)，重氮化紙、尼龍膜、活性的小球、以及蛋白A小球。例如，在異源方案中可以使用Dynatech ImmunolonTM1或ImmunolonTM2微量滴定板或0.25英寸聚苯乙烯小球(精密塑料球)。在與測試樣品分離之後，並且在檢測結合的抗體之前，通常要洗滌含有所述抗原性多肽的固體支持物。標準方案和競爭性方案都是本領域所公知的。
在同源方案中，所述測試樣品在溶液中與抗原的組合一起溫育。例如，可以在能使所形式的任何抗原-抗體複合物沉澱的條件下溫育。用於這種測定的標準方案和競爭方案為本領域所公知。
在標準方案中，直接監測抗體-抗原複合物中HCV抗體的量。這一目的可以通過測定能識別抗HCV抗體上的一個表位的標記過的抗異源(例如，抗人)抗體是否會因為複合物的形成而結合來實現。在競爭方案中，通過監測結合所述複合物中已知量的標記過的抗體(或其他競爭配體)的競爭效應推測樣品中HCV抗體的量。
根據所述方案，通過多種已知方法中的任意一種檢測所形成的含有抗HCV抗體的複合物(或者對於競爭測定來說，檢測競爭抗體的量)。例如，所述複合物中的未標記過的HCV抗體可以利用與一種標記物(例如，酶標記物)複合的抗異源IgG的綴合物檢測。
在免疫沉澱或凝聚測定方案中，HCV抗原和抗體之間的反應形成了一個從溶液或懸浮液中沉澱出來的網絡，並形成一個肉眼可見沉澱層或膜。如果在測試樣品中不存在抗HCV抗體，就不會形成可見的沉澱。
目前有三種特殊類型的顆粒凝聚(PA)測定。這些測定被用於檢測塗在一種支持物上的各種抗原的抗體。上述一種類型的測定是利用紅細胞(RBCs)進行的凝血測定，所述紅細胞通過在RBC上被動吸附抗原(或抗體)而被敏化。通過添加特殊抗原，存在於身體成分中的抗體(如果有的話)會導致用純化的抗原包衣的RBCs發生凝聚。
為了消除血凝聚測定中潛在的非特異性反應，可以用兩種人工載體取代PA中的RBC。最常見的是乳膠顆粒。不過，也可以使用凝聚顆粒。使用上述任意一種載體的測定都是基於用純化抗原包衣的顆粒的被動凝聚。
包括構象表位的本發明的HCV單個的或特異性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2抗原通常以試劑盒進行包裝，用於上述免疫測定。該試劑盒通常包括獨立的容器，分別裝有天然HCV抗原、對照抗體製劑(陽性和陰性)標記過的抗體(如果該測定方案需要這種抗體)，以及信號發生試劑(例如，酶底物)(如果所述標記不能直接產生一種信號)。所述天然HCV抗原可能已經與一種固體基質，或者與用於將它結合在所述基質上的製劑分開。在該試劑盒中通常還包括實施該測定的說明書(例如，文字、磁帶、CD-ROM等)。
採用天然HCV抗原的免疫測定可用於篩選血液，以便製備缺乏潛在的傳染性HCV的血液供應物。用於製備血液供應物的方法包括以下步驟。讓本發明的HCV E1和/或E2蛋白與來自供血個體的身體成分，優選血液或血液成分起反應，以便發生HCV抗體(如果有的話)和HCV抗原之間的免疫反應。檢測是否因為上述反應形成了HCV抗體-HCV抗原複合物。作為血液供應物的血液來自不存在天然HCV抗原E1或E2抗體的供體。
如果出現了對HCV抗原的陽性反應，優選重複所述免疫測定，以便降低假陽性的可能性。例如，在大規模篩選血液以便生產血液製品(例如，輸血用血、血漿、因子VIII、免疫球蛋白等)時，『篩選』測試通常以犧牲特異性為代價來提高靈敏度(以便確保沒有汙染的傳染物，即提高了假陽性的比例)。因此，通常僅僅是推遲進一步檢測『反覆反應』的供體，即在對供體樣品進行兩輪或兩輪以上的免疫測定時都是陽性。不過，為了證實HCV陽性，通常要進行『驗證』實驗，以犧牲靈敏度為代價來提高特異性(以便確保不會確認假陽性樣品)。因此，本發明所披露的用於純化E1和E2的方法非常有利於將單個的或特異性寡聚外被蛋白包括在HCV診斷測定中。
所選擇的固相可以包括聚合物小球或玻璃小球、硝酸纖維素、微顆粒、反應平板的微孔、試管和磁性小球。信號發生化合物可以包括酶、發光化合物、生色劑、放射性元素和化學發光化合物。酶的例子包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶和β-半乳糖苷酶。增強化合物的例子包括生物素、抗生物素和親和素。增強化合物結合成分的例子包括生物素、抗生物素和親和素。為了抑制類風溼因子樣物質的作用，要用足以抑制類風溼因子樣物質的作用的條件對測試樣品進行處理。所述條件包括讓所述測試樣品與一定量的抗人IgG接觸，以便形成一種混合物，並且在處理形成基礎上不含類風溼因子樣物質的反應混合物的條件下溫育所述混合物一段時間。
本發明還涉及將E1蛋白或其部分，更具體說是上述HCV單個的或特異性寡聚E1蛋白用於體外監測HCV疾病或預測患有HCV感染的患者對治療(例如用幹擾素治療)的反應的用途，包括-在能夠形成免疫複合物的條件下將來自感染了C型肝炎的患者的生物學樣品與E1蛋白或其合適的部分一起溫育。
-除去未結合的成分，-計算存在於所述樣品中的抗E1效價(例如，在(幹擾素)治療開始和/或期間測定)。
-監測HCV疾病的天然過程，或者根據在治療開始和/或治療期間出現在所述樣品中的抗E1效價的量預測所述患者對治療的反應。
與最初的抗E1效價相比，表現出效價降低了2、3、4、5、7、10、15或優選降低了20倍以上的患者被認為是HCV治療，尤其是幹擾素治療的長期的、持續的反應者。在實施例部分說明了抗E1測定一般是非常有利於預測對IFN治療的長期反應，或者對C型肝炎病毒疾病治療的長期反應。
更具體地講，在表3中所列舉的以下E1肽可用於體外監測HCV疾病或預測對患有HCV感染的患者進行幹擾素治療的反應。
跨越核心/E1 V1區的181-200號胺基酸的E1-31(SEQ ID NO56)，跨越E1區的193-212號胺基酸的E1-33(SEQ ID NO57)，跨越E1 V2區的205-224號胺基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO58)，跨越E1 V2區的208-227號胺基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO59)，跨越E1區的192-228號胺基酸(V1、C1和V2區(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO53)，跨越E1區的301-320號胺基酸的E1-51(SEQ ID NO66)，跨越E1 C4區的313-332號胺基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO67)，跨越E1區的325-344號胺基酸的E1-55(SEQ ID NO68)。
可以理解的是，上述肽的更小的片段也屬於本發明的範圍。通過化學合成可以方便地製備所述較小的片段，並且可以檢測其用於在上文和在實施例部分所述的測定中使用的能力。
本發明還涉及用於監測HCV疾病或預測患有HCV感染的患者對治療(例如用幹擾素治療)的反應的試劑盒，包括-至少一種E1蛋白或E1肽，更具體地講，上述E1蛋白或E1肽，-用於生產所述蛋白或肽和存在於生物學樣品中的抗E1抗體之間發生結合反應的緩衝液所需要的緩衝物或成分，-用於檢測在上述結合反應中所形成的免疫複合物的裝置，-可能還包括用於了解在治療進行期間抗E1效價降低的自動化掃描和翻譯裝置。
可以理解的是，本發明的E2蛋白和肽也可用於在一定程度上監測/預測HCV治療，正如上面針對E1蛋白或肽所說明，因為與其他HCV抗原的抗體相比，抗E2水平也會降低。不過，應當理解的是，還可以確定E2區中的某些表位，這些表位可能適用於監測/預測HCV疾病的實驗。
本發明還涉及血清分類測定，用於檢測存在於生物學樣品中的HCV的一種或多種血清學類型，特別是用於檢測要中和在一個測定方案中檢測的不同類型的HCV抗體，至少包括以下步驟(i)在能夠形成免疫複合物的合適條件下，讓需要分析是否存在一種或多種血清學類型的HCV抗體的生物學樣品與上述至少一種E1和/或E2和/或E1/E2蛋白組合物或至少一種E1和/或E2肽組合物接觸，優選固定化形式的組合物，(ii)清除未結合的成分，(iii)在合適的條件下，將與異源抗體形成的免疫複合物與所述可檢測標記結合的異源抗體一起溫育，(iv)通過肉眼或機械方法(例如，通過密度測定、螢光測定、比色測定)檢測所述免疫複合物的存在，並且根據所觀察到的結合形式了解一種或多種HCV血清學類型的存在。
應當理解的是，用於該方法中的蛋白或肽的組合物是重組表達的類型特異性外被蛋白或類型特異性肽。
本發明還涉及一種用於對存在於生物學樣品中的一種或多種血清類型的HCV進行血清分類，尤其是用於檢測所述血清類型的HCV的抗體的試劑盒，包括-至少一種上述E1和/或E2和/或E1/E2蛋白或E1或E2蛋白，-用於生產使得所述蛋白或肽和存在於所述生物學樣品中的抗E1抗體發生結合反應的緩衝液所需要的緩衝物或成分，-用於檢測在上述結合反應中所形成的免疫複合物的裝置，-還可能包括一個用於根據所觀察到的結合形式檢測一種或多種血清類型的存在的自動化掃描和翻譯裝置。
本發明還涉及將上述肽或蛋白組合物固定在一種固體基質上，並且用於反相雜交測定，優選用於作為對照系固定在膜片的固體支持物上，用於按照上述方法測定HCV的存在或基因型。與來自其他HCV多蛋白區的類型特異性抗原的組合也屬於本發明的範圍。
本發明提供了一種用於純化選自通過重組方法生產的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的重組HCV單個的或特異性寡聚外被蛋白的方法，包括讓所述蛋白與一種二硫鍵裂解或還原製劑接觸，本發明的該方法的接觸可以在部分裂解或還原的條件下進行。所述二硫鏈裂解製劑優選是二硫蘇糖醇(DTT)，其濃度範圍優選為0.1-50mM，優選0.1-20mM，更優選0.5-10mM。另外，所述二硫鍵裂解製劑還可以諸如Empigen-BB(它是含有N-十二烷基-N，N-二甲基甘油作為主要成分的混合物)的洗滌劑，其濃度優選為1-10％，更優選3.5％。還可以使用洗滌劑，二硫鍵裂解製劑和/或還原製劑的混合物。在一種實施方案中，利用諸如N-乙基馬來醯亞胺(NEM)或其衍生物的SH基團封閉製劑抑制二硫鍵的形成。在一種優選實施方案中，所述二硫鍵再形成是通過使用低的pH條件抑制的。
本發明還提供了一種本文所披露的方法，該方法還包括以下步驟在選擇性地存在諸如N-乙基馬來醯亞胺(NEM)的SH封閉基團的條件下，裂解重組E1和/或E2和/或E1/E2表達宿主細胞；通過親和純化回收所述HCV外被蛋白，如通過凝集素層析，如lentil凝集素層析，或通過使用抗E1和/或抗E2特異性單克隆抗體的免疫親和；同樣優選在存在於NEM或生物素-NEM的SH封閉製劑的條件下，用諸如DTT的二硫鍵裂解製劑還原或裂解二硫鍵；乙基，通過凝膠過濾回收還原的E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白，並且選擇性地進行額外的Ni2+-IMAC層析和脫鹽步驟。
本發明提供了一種含有選自E1和/或E2和/或E1/E2的基本上分離的和/或純化的，和/或分離的和/或純化的重組HCV單個的或特異性寡聚外被蛋白的組合物，所述蛋白是用本文所披露的方法分離的。在一種優選實施方案中，本發明的重組HCV外被蛋白是在哺乳動物細胞中表達的，如疫苗、重組酵母細胞。
本發明提供了一種重組載體，它含有可操作地結合在一起的載體序列，原核、真核或病毒啟動子序列，以及可以表達單個的或特異性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的核苷酸序列。在一種實施方案中，所述載體的核苷酸序列編碼單個的HCV E1蛋白，該蛋白始於1-192號胺基酸之間的部分，並且止於250-400號胺基酸之間的部分，特別是止於250-341號位置之間的部分，更優選止於290-341號位置之間的部分。在另一種實施方案中，所述載體的核苷酸序列編碼單個的HCV E1蛋白，該蛋白始於117-192號胺基酸之間的部分，並且止於263-400號胺基酸之間的部分，特別是止於250-326號位置之間的部分。在另一種實施方案中，所述載體的核苷酸序列編碼單個的HCV E1蛋白，該蛋白缺失了293號位置之間的第一個疏水性結構域，加或減8個胺基酸。在另一種實施方案中，所述載體的核苷酸序列編碼單個的HCV E2蛋白，該蛋白始於290-406號胺基酸之間的部分，並且止於600-820號胺基酸之間的部分，特別是始於322-406號位置之間的部分，更優選始於347-406號位置之間的部分，最優選始於346-406號位置之間的部分；並且優選止於623、650、661、673、710、715、720、746或809中任意一個胺基酸位置。在一種實施方案中，本發明的載體含有可操作地連接於所述核苷酸序列上的5』末端ATG密碼子和3』末端終止密碼子。在一種實施方案中，所述載體還包括一個因子Xa裂解位點和/或添加在所述編碼區3』末端的3-10，優選6個組氨酸密碼子。本發明的載體選擇性地包括一個核苷酸序列，其中，業已在核酸水平上去掉了存在於E1或E2蛋白上的至少一個糖基化位點。
本發明提供了含有SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47和49中的任意一種或其部分的核酸。本發明的載體優選含有一種核苷酸序列，該序列含有包括SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47和49中的任意一種或其部分的核酸。
本發明的組合物還含有重組HCV外被蛋白，該蛋白是由上述載體表達或者是該載體的表達產物。
本發明提供了一種上述至少一種重組載體轉化過的宿主細胞，其中，所述載體含有本文所披露的編碼HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的核苷酸序列，此外還包括能夠在該宿主細胞中起作用並且能夠調控HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白表達的調控序列。另外，本發明提供了一種由本發明的宿主細胞表達的重組E1和/或E2和/或E1/E2蛋白。
本發明還提供了一種本文所披露的方法，該方法包括以下步驟在合適的培養基中生長用本文所披露的重組載體轉化過的本文所披露的宿主細胞；在合適的條件下使本文所披露的載體核苷酸序列表達；優選在存在諸如N-乙基馬來醯亞胺(NEM)的SH基團封閉製劑的條件下裂解轉化過的宿主細胞；通過親和層析回收所述HCV外被蛋白，如通過凝集素層析或使用抗E1和/或抗E2特異性單克隆抗體進行免疫親和層析，所述凝聚素優選是lentil凝聚素，然後將上一步驟所獲得的洗脫物與DTT的二硫鍵裂解劑一起溫育，同樣優選在存在諸如NEM或生物素NEM的SH基團封閉製劑的條件下進行；以及，通過凝膠過濾分離HCV單個的或特異性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2蛋白，還可以通過額外的Ni2+-IMAC層析和脫鹽步驟分離。
本發明提供了一種含有至少一種下列E1和/或E2肽的組合物跨越核心/E1 V1區的181-200號胺基酸的E1-31(SEQ ID NO56)，跨越E1區的193-212號胺基酸的E1-33(SEQ ID NO57)，跨越E1 V2區的205-224號胺基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO58)，跨越E1 V2區的208-227號胺基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO59)，跨越E1區的192-228號胺基酸(V1、C1和V2區(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO53)，跨越E1區的301-320號胺基酸的E1-51(SEQ ID NO66)，跨越E1 C4區的313-332號胺基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO67)，跨越E1區的325-344號胺基酸的E1-55(SEQ ID NO68)。
跨越E2區的397-418號胺基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO72)，跨越E2區的409-428號胺基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO73)，跨越E2區的583-602號位置(表位E)的Env23或E2-23(SEQ IDNO86)，跨越E2區的595-614號位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO87)，
跨越E2區的607-626號位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO88)，跨越E2區的547-586號位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO83)，跨越E2區的523-542號位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO82)，本發明提供了一種含有至少一種下列E2構象表位的組合物由單克隆抗體15C8C1、12D11F1和8G10D1H9識別的表位F由單克隆抗體9G3E6識別的表位G，由單克隆抗體10D3C4和4H6B2識別的表位H(或C)，由單克隆抗體17F2C2識別的表位I。
本發明提供了用上述組合物免疫接種所產生的E1和/或E2特異性單克隆抗體，例如，本發明的抗體可以被用作藥物，使用在免疫測定試劑盒中，用於檢測HCV E1或E2抗原的存在，用於預測/監測HCV疾病或用於HCV治療。本發明提供了將本文所披露的E1和/或E2特異性單克隆抗體用於製備用來檢測HCV E1或E2抗原的免疫測定試劑盒，用於製備用來預測/監測HCV疾病的試劑盒或用於製備HCV藥物。
本發明提供了一種用於體外診斷存在於生物學樣品中的HCV抗原的方法，至少包括以下步驟(i)在能夠形成免疫複合物的合適條件下，讓所述生物學樣品與本文所披露的E1和/或E2特異性單克隆抗體接觸，優選固定化形式的單克隆抗體，(ii)清除未結合的成分，(iii)在合適的條件下，溫育與異源抗體形成的免疫複合物，所述異源抗體與一種可檢測的標記結合，(iv)通過肉眼或機械方法檢測所述免疫複合物的存在。
本發明提供了一種用於確定存在於生物學樣品中的HCV抗原的存在的試劑盒，該試劑盒至少包括以下部分至少一種本文所披露的E1和/或E2特異性單克隆抗體，優選是固定在固體基質上的形式，生產使得所述抗體和存在於生物學樣品中的HCV抗原之間能發生結合反應的緩衝液所需要的緩衝物或成分，以及選擇性地包括用於檢測在上述結合反應中所形成的免疫複合物的裝置。
本發明的化合物能夠以藥物形式提供。
本發明提供了一種組合物，如本文所述，該組合物被用作疫苗，對哺乳動物，優選人類進行HCV免疫，所述免疫包括給予有效量的所述組合物，並選擇性地同時給予可以藥用的佐劑，以便產生免疫反應。
本發明提供了一種利用本文所披露的組合物製備用於對哺乳動物，優選人類進行HCV免疫的疫苗的方法，包括給予有效量的所述組合物，並選擇性地給予可以藥用的佐劑，以便產生免疫反應。
本發明提供了一種對哺乳動物，優選人類進行HCV免疫的疫苗組合物，該組合物包含有效量的含有本文所披露的E1和/或E2的組合物，並選擇性地含有可以藥用的佐劑。
本發明的組合物可以體外檢測存在於生物學樣品中的HCV抗體的形式提供。本發明還提供了一種製備用於檢測存在於生物學樣品中的HCV抗體的免疫測定試劑盒的方法，以及利用本發明的試劑盒檢測存在於生物學樣品中的HCV抗體的方法，以便診斷存在於生物學樣品中的HCV抗體。本發明的上述方法至少包括以下步驟(i)在能夠與所述生物學樣品中的HCV抗體形成免疫複合物的合適條件下，讓所述生物學樣品與本文所披露的組合物接觸，優選固定化形式的組合物，(ii)清除未結合的成分，(iii)在合適的條件下，溫育與異源抗體形成的免疫複合物，所述異源抗體與一種可檢測的標記結合，(iv)通過肉眼或機械方法檢測所述免疫複合物的存在。
本發明提供了一種用於確定存在於生物學樣品中的HCV抗體的存在的試劑盒，包括至少一種本文所披露的肽或蛋白組合物，優選是固定在固體基質上的固定化形式的；生產使得所述蛋白或肽和抗存在於生物學樣品中的HCV的抗體之間能發生結合反應的緩衝液所需要的緩衝物或成分；以及選擇性地包括用於檢測在上述結合反應中所形成的免疫複合物的裝置。
本發明提供了一種體外監測HCV疾病或診斷患有HCV感染的患者對治療、優選用幹擾素治療的反應的方法，該方法包括在能形成免疫複合物的條件下將來自受到HCV感染的患者的生物學樣品與E1蛋白或其合適的部分一起溫育；除去未結合的成分。計算在治療開始時和治療期間存在於所述樣品中的抗E1效價；監測HCV疾病的自然進程，或根據在治療開始時和/或在治療期間存在於所述樣品中的抗E1效價的量診斷患者對治療的反應。
本發明提供了一種用於監測HCV疾病或預測患有HCV感染的患者對治療，特別是用幹擾素治療的反應的試劑盒，其中，所述試劑盒包括-至少一種E1蛋白或E1肽，特別是本文所披露的E1蛋白或E1肽；-用於生產使得所述蛋白或肽與所述存在於所述生物學樣品中的抗E1抗體之間的能發生結合反應的緩衝液所需要的緩衝物或成分；-並且選擇性地包括用於檢測在上述結合反應中所形成的免疫複合物的裝置；-還選擇性地包括用於了解在治療過程中抗E1效價降低的自動化掃描和翻譯裝置。
本發明還提供了一種血清分類測定，用於檢測存在於生物學樣品中的一種或多種血清類型的HCV，特別是用於檢測需要組合在一個測定方案中檢測的不同類型的HCV抗體，至少包括以下步驟(i)在能夠形成免疫複合物的合適條件下，讓需要分析一種或多種血清類型的HCV抗體的存在的所述生物學樣品與至少一種本文所披露的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白組合物或至少一種本文所排版的E1和/或E2肽組合物接觸，優選固定化形式的組合物；(ii)清除未結合的成分，(iii)在合適的條件下，溫育與異源抗體形成的免疫複合物，所述異源抗體與一種可檢測的標記結合；以及選擇性地(iv)通過肉眼或機械方法(例如，通過密度測定、螢光測定、比色測定)檢測所述免疫複合物的存在，並且根據所觀察到的結合形式了解一種或多種HCV血清類型的存在。
本發明提供了一種用於對存在於生物學樣品中的一種或多種血清類型的HCV進行血清分類的試劑盒，尤其是用於檢測所述血清類型的HCV的抗體的試劑盒，包括至少一種本文所披露的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白或本文所披露的E1或E2肽；用於生產使得所述蛋白或肽與所述存在於所述生物學樣品中的抗E1抗體之間能夠發生結合反應的緩衝液所需要的緩衝物或成分；選擇性地包括用於檢測在上述結合反應中所形成的免疫複合物的裝置，另外還選擇性地包括用於根據所觀察到的結合形式檢測一種或多種血清類型的存在的自動化掃描和翻譯裝置。
本發明還提供了本文所披露的肽或蛋白組合物，用於固定在固體基質上，並且用於反相雜交測定中，優選用於固定在諸如膜片的固體支持物上作為對照系，用於按照本文所披露的方法確定HCV的存在或基因型。
本發明還提供了一種治療用疫苗組合物，該組合物含有治療有效量的以下成分含有選自E1蛋白和E2蛋白的至少一種純化的重組HCV單個的或特異性寡聚重組外被蛋白的組合物；以及選擇性地含有可以藥用的佐劑。本發明疫苗的HCV外被蛋白可以選擇性地由重組哺乳動物細胞或重組酵母細胞生產。本發明提供了一種含有治療有效量的含有至少一種下列E1和E2肽的組合物的治療用疫苗組合物跨越核心/E1 V1區的181-200號胺基酸的E1-31(SEQ ID NO56)，跨越E1區的193-212號胺基酸的E1-33(SEQ ID NO57)，跨越E1 V2區的205-224號胺基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO58)，跨越E1 V2區的208-227號胺基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO59)，跨越E1區的192-228號胺基酸(V1、C1和V2區(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO53)，跨越E1區的301-320號胺基酸的E1-51(SEQ ID NO66)，跨越E1 C4區的313-332號胺基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO67)，跨越E1區的325-344號胺基酸的E1-55(SEQ ID NO68)。
跨越E2區的397-418號胺基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO72)，跨越E2區的409-428號胺基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO73)，跨越E2區的583-602號位置(表位E)的Env23或E2-23(SEQ IDNO86)，跨越E2區的595-614號位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO87)，跨越E2區的607-626號位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO88)，跨越E2區的547-586號位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO83)，和跨越E2區的523-542號位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO82)。
本發明提供了一種治療諸如人類受HCV感染的哺乳動物的方法，包括給予有效量的本文所披露的組合物，如上述疫苗，並選擇性地給予可以藥用的佐劑。在一種實施方案中，本發明的組合物與抗病毒治療組合給予或在抗病毒治療時給予，所述抗病毒治療是在給予本發明的組合物之前或之後或同時進行。
本發明提供了一種含有選自E1蛋白和E2蛋白至少一種純化的重組HCV重組外被蛋白的組合物，並且選擇性地含有一種佐劑。在一種優選實施方案中，所述組合物至少含有一種下面的E1和E2肽跨越核心/E1 V1區的181-200號胺基酸的E1-31(SEQ ID NO56)，跨越E1區的193-212號胺基酸的E1-33(SEQ ID NO57)，跨越E1 V2區的205-224號胺基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO58)，跨越E1 V2區的208-227號胺基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO59)，跨越E1區的192-228號胺基酸(V1、C1和V2區(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO53)，跨越E1區的301-320號胺基酸的E1-51(SEQ ID NO66)，跨越E1 C4區的313-332號胺基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO67)，跨越E1區的325-344號胺基酸的E1-55(SEQ ID NO68)。
跨越E2區的397-418號胺基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO72)，
跨越E2區的409-428號胺基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO73)，跨越E2區的583-602號位置(表位E)的Env23或E2-23(SEQ IDNO86)，跨越E2區的595-614號位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO87)，跨越E2區的607-626號位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO88)，跨越E2區的547-586號位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO83)，和跨越E2區的523-542號位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO82)。
本發明提供了一種誘導HCV特異性抗體的治療組合物，該組合物含有治療有效量的含有由純化的重組HCV單個的或特異性寡聚重組E1或E2蛋白形成的E1/E2複合物的組合物；並且選擇性地含有可以藥用的佐劑。本發明的重組HCV外被蛋白可以用重組哺乳動物細胞生產，或者重組HCV外被蛋白是用重組酵母細胞生產的。本發明提供了一種治療諸如人類的受HCV感染的哺乳動物的方法，包括給予有效量的本文所披露的組合物，並選擇性地給予可以藥用的佐劑。本發明提供了一種用於誘導HCV特異性抗體的組合物，該組合物含有治療有效量的含有選自E1和E2蛋白的至少一種純化的重組HCV單個的或特異性寡聚重組外被蛋白的組合物；並選擇性地含有可以藥用的佐劑。
附圖和表格的說明圖1質粒pgptATA18的限制2質粒pgsATA18的限制3質粒pMS66的限制4質粒pvHCV-11A的限制5對IFN治療無反應者體內的抗E1水平圖6對IFN臺療有反應者體內的抗E1水平圖7對IFN治療有完全反應的患者體內的抗E1水平圖8對IFN治療有不完全反應的患者體內的抗E1水平圖9對IFN治療無反應者體內的抗E2水平圖10對IFN治療有反應者體內的抗E2水平圖11對IFN治療有完全反應的患者體內的抗E2水平圖12對IFN治療有不完全反應的患者體內的抗E2水平圖13與肽競爭的人抗E1反應性圖14抗E1單克隆抗體與肽反應性的競爭圖15對IFN治療無反應者體內的抗E1(表位1)水平圖16對IFN治療有反應者體內的抗E1(表位1)水平圖17對IFN治療無反應者體內的抗E1(表位2)水平圖18對IFN治療有反應者體內的抗E1(表位2)水平圖19抗E2單克隆抗體與肽反應性的競爭圖20與肽競爭的人抗E2反應性圖21本發明的核酸序列。本發明的編碼E1或E2蛋白的核酸序列可以翻譯(SEQ ID NO3-13，21-31，35和41-49是在從1號殘基開始的讀框中翻譯的，SEQ ID NO37-39是在從2號殘基開始的讀框中翻譯的)成序列表中所示出的相應E1或E2蛋白的胺基酸序列。
圖22由受到vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)和vvHCV63(5a型)感染的細胞裂解物的四種不同的E1純化物的lentil凝集素層析洗脫物級份所獲得的ELISA的結果。
圖23根據圖22所示出的值由四種不同的E1結構所獲得的lentil凝集素層析的洗脫曲線。
圖24由受到vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)和vvHCV63(5a型)感染的細胞裂解物的四種不同的E1純化物的凝膠過濾層析級份所獲得的ELISA的結果。
圖25由純化的1b型(1)、3a型(2)和5a型(3)E1蛋白(來自分別用vvHCV39、vvHCV62和vvHCV63感染過的RK13細胞；按照例5.2-5.3所述用lentil凝集素純化並還原)和標準物(4)獲得的曲線。峰值用『1』、『2』和『3』表示，它表示純的E1蛋白峰(參見圖24，E1反應性主要存在於26-30號級份中)。
圖26按例4所述方法對SDS-PAGE進行銀染色，E1 HWCV40(1b型)的粗製裂解物(泳道1)vvHCV40的凝膠過濾收集物1相當於圖25中所示的級份10-17(泳道2)，vvHCV40的凝膠過濾收集物2相當於圖25中所示的級份18-25(泳道3)，和E1收集物(級份26-30)(泳道4)。
圖27E1構建體39(1b型)和62(3a型)的凝膠過濾級份的鏈黴親和素-鹼性磷酸酶的印跡。用NEM-生物素標記蛋白。泳道1開始的凝膠過濾構建體39，泳道2級份26構建體39，泳道3，級份27構建體39，泳道4，級份28構建體39，泳道5，級份29構建體39，泳道6，級份30構建體39，泳道7，級份31構建體39，泳道8，分子量標記，泳道9，開始的凝膠過濾構建體62，泳道10級份26構建體62，泳道11級份27構建體62，泳道12級份28構建體62，泳道13級份29構建體62，泳道14級份30構建體62，泳道15級份31構建體62。
在與圖26相同條件下進行的vvHCV-39(E1s，1b型)和vvHCV-62(E1s，3a型)的凝膠過濾級份的SDS-PAGE凝膠的銀染色。泳道1開始的凝膠過濾構建體39，泳道2級份26構建體39，泳道3，級份27構建體39，泳道4，級份28構建體39，泳道5，級份29構建體39，泳道6，級份30構建體39，泳道7，級份31構建體39，泳道8，分子量標記，泳道9，開始的凝膠過濾構建體62，泳道10級份26構建體62，泳道11級份27構建體62，泳道12級份28構建體62，泳道13級份29構建體62，泳道14級份30構建體62，泳道15級份31構建體62。
用抗E1小鼠單克隆抗體5E1A10進行的Western印跡分析，提供了該純化方法的完整的概述。泳道1粗製裂解物，泳道2lentil層析的流通物，泳道3在lentil層析之後用Empigen-BB洗滌，泳道4lentil層析的洗脫物，泳道5在濃縮lentil洗脫物期間流通物，泳道6在大小排阻層析(凝膠過濾)之後的E1合併物。
圖30在來自受vvHCV44感染的RK13細胞的E2蛋白的lentil凝集素層析的OD280曲線(連續的曲線)。點劃線表示通過ELISA檢測的E2反應性(如實施例6所述)。
圖31A在來自受vvHCV44感染的RK13細胞的lentil-凝集素凝膠過濾層析E2蛋白收集物的OD280曲線(連續的曲線)，其中，所述E2收集物被馬上加樣到凝膠過濾柱上(非還原條件)。點劃線表示通過ELISA檢測的E2反應性(如實施例6所述)。
圖31B在來自受vvHCV44感染的RK13細胞的lentil-凝集素凝膠過濾層析E2蛋白收集物的OD280曲線(連續的曲線)，其中，按照實施例5.3的方法還原或封閉E2收集物(還原條件)。點劃線表示通過ELISA檢測的E2反應性(如實施例6所述)。
圖32在凝膠過濾之後，在圖31B的還原條件下，由vvHCV44表達的E2蛋白的Ni2+-IMAC層析和ELISA反應性。
圖33通過圖32中所示的Ni2+-IMAC層析的200mM咪唑洗脫步驟(泳道2)和30mM咪唑洗滌(泳道1)步驟所回收的0.5微克純化的E2蛋白的SDS-PAGE的銀染色。
圖34通過圖33所示的200mM咪唑洗脫所回收的純化的E2蛋白的脫鹽步驟的OD曲線，意在去除咪唑。
圖35A在治療期間以及在治療之後6-12個月的時間內通過LIAscan方法測定的NR和LTR的針對不同的HCV抗原(核心1、核心2、E2HCVR、NS3)的抗體含量。平均值用帶有空心方框的曲線表示。
圖35B在治療期間以及在治療之後6-12個月的時間內通過LIAscan方法測定的NR和LTR的針對不同的HCV抗原(NS3、NS5、E1和E2)的抗體含量。平均值用帶有空心方框的曲線表示。
圖36LTR和NR組中的平均E1抗體(E1Ab)和E2抗體(E2Ab)含量。
圖371b型和3a型非反應者(NR)和長期反應者(LTR)的平均E1抗體(E1Ab)水平。
圖38抗E2單克隆抗體的相對作圖位置。
圖39HCV E1外被蛋白的部分脫糖基化。按照生產商的說明，將vvHCV10A-感染過的RK13細胞的裂解物與不同濃度的糖苷酶一起溫育。右側圖片糖肽酶F(PNGase F)。左側圖片內切糖苷酶H(EndoH)。
圖40HCV E2外被蛋白的部分脫糖基化。按照生產商的說明，將vvHCV64-感染過的(E2)和vvHCV41-感染過的(E2s)RK13細胞的裂解物與不同濃度的糖肽酶F(PNGase F)按照生產商的說明一起溫育。
圖41HCV E1糖蛋白的體外誘變。誘變序列的作圖和新的限制位點的產生。
圖42AHCV E1糖蛋白的體外誘變(第一部分)。PCR的擴增的第一個步驟。
圖42BHCV E1糖蛋白的體外誘變(第二部分)。重疊延伸和嵌套PCR。
圖43HCV E1糖蛋白的體外誘變。在第一個擴增步驟中合成的PCR誘變片段(GLY#和OVR#)的作圖。
圖44A通過Western印跡分析在HeLa(左側)和RK13(右側)細胞中表達的E1糖蛋白變體。泳道1野生型VV(痘苗病毒)，泳道2原始E1蛋白(vvHCV-10A)，泳道3E1變體Gly-1(vvHCV-81)，泳道4E1變體Gly-2(vvHCV-82)，泳道5E1變體Gly-3(vvHCV-83)，泳道6E1變體Gly-4(vvHCV-84)，泳道7E1變體Gly-5(vvHCV-85)，泳道8E1變體Gly-6(vvHCV-86)。
圖44B通過PCR擴增/限制分析E1糖基化變體痘苗病毒。泳道1E1(vvHCV-10A)BspEI，泳道2E1.GLY-1(vvHCV-81)，BspEI，泳道4E1(vvHCV-10A)，SacI，泳道5E1.GLY-2(vvHCV-82)，SacI，泳道7E1(vvHCV-10A)，SacI，泳道8E1.GLY-3(vvHCV-83)SacI，泳道10E1(vvHCV-10A)，StuI，泳道11E1.GLY-4(vvHCV-84)，StuI，泳道13E1(vvHCV-10A)，SmaI，泳道14E1.GLY-5(vvHCV-85)，SmaI，泳道15E1(vvHCV-10A)，StuI，泳道17E1.GLY-6(vvHCV-86)，StuI，泳道3-6-9-12-15低分子量標記，pBluescript II SK+，MspI。
圖45在釀酒酵母中表達的重組E2的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳。使接種物在亮氨酸選擇培養基中生長72小時，並且用完全培養基以1/15的比例稀釋。在28℃下培養10天之後，取培養基樣品。將通過speedvac濃縮的相當於200微升培養上清液加樣到所述凝膠上。分析兩個獨立的轉化體。
圖46在糖基化缺陷型釀酒酵母變體中表達的重組E2的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳。將接種物在亮氨酸選擇培養基中生長72小時，並且用完全培養基以1/15的比例稀釋。在28℃下培養10天之後，取培養基樣品。將通過離子交換層析濃縮的相當於350微升培養上清液加樣到所述凝膠上。
圖47黑猩猩的特徵和免疫方案。
圖48在經過3次免疫接種後的細胞應答。
圖49在充分進行E1免疫接種時細胞應答的演化。
圖50在經過NS3免疫接種時的細胞應答。
表1用於擴增構建實施例1中所示的不同形式的E1蛋白的相應的克隆和引物的特徵表2抗E1測定的總結表3用於競爭研究的合成肽表4外被抗體水平隨時間的變化表5LTR和NR之間的差別表6鼠E2單克隆抗體之間的競爭實驗表7用於構建E1糖基化變體的引物表8通過ELISA分析E1糖基化變體表9使用過佐劑的E1 Balb/c小鼠的特徵表10體液應答不同的E1抗體水平所需要的免疫接種次數。
例1C型肝炎病毒E1蛋白的克隆和表達1.構建痘苗病毒重組載體pgptATA18痘苗重組質粒是pATA18的修飾形式(Stunnenberg等，1988)，其中額外插入了含有受痘苗病毒13中間啟動子控制的大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因的片段(圖1)。質粒pgsATA18是通過將在3個開放讀框內含有終止密碼子的具有SEQ IDNO1/94的寡核苷酸接頭插入PstI和HindIII切斷的pATA18載體上而構建的。由此產生了一個額外的PacI限制位點(圖2)。沒有恢復原有的HindIII位點。具有SEQ ID NO1/94的寡核苷酸接頭5′ G GCATGC AAGCTT AATTAATT3′3′ ACGTC CGTACG TTCGAA TTAATTAA TCGA5′PstI SphI HindIII Pac I(HindIII)為了有利於通過融合在重組蛋白上的工程產生的組氨酸片段的Ni2+螯合方法快速而有效地進行純化，可以將疫苗重組載體pMS66設計成能表達具有一個額外的羧基末端組氨酸標記的分泌型蛋白。用以下方式合成含有通過三種限制酶產生平端(SmaI、StuI和PmlI/BbrPI)的獨特位點的具有SEQ ID NO2/95的寡核苷酸接頭，任何cDNA的羧基末端都可以插入具有一個編碼蛋白酶因子Xa裂解位點的序列的框內，隨後是一個編碼6個組氨酸和2個終止密碼子的核苷酸序列(在3』末端下遊還形成了一個PacI位點)。將具有SEQ ID NO2/95的寡核苷酸插入pgptATA18的XmaI和PstI位點之間(圖3)。
具有SEQ ID NO2/95的寡核苷酸接頭5′CCGGG GAGGCCTGCACGTGATCGAGGGCAGACACCATCACCACCATCACTAATAGTTAATTAA CTGCA3′3′ C CTCCGGACGTGCACTAGCTCCCGTCTGTGGTAGTGGTGGTAGTGATTATCAATTAATT GXmaI PstI業已按照布達佩斯條約將包含在大腸桿菌MC1061(λ)中的質粒pgptATA18保存在BCCM/LMBP(比利時微生物協調保藏中心/Laboratorium voor Moleculaire Biologie Plasmidencollectie，Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat35B-9000 Ghent，Belgium)，保藏號為LMBP4486。所述保藏是在2002年1月9日進行的。
實施例2.構建HCV重組質粒2.1編碼不同形式的E1蛋白的構建體通過以前所披露的RNA製備，隨後進行逆轉錄和PCR(Stuyver等，1993b)從血清樣品中獲得聚合酶鏈式反應(PCR)產物。表1表示用於擴增相應的克隆和引物的特徵。將所述PCR片段克隆到SmaI裂解過的pSP72(Promega)質粒上。選擇以下克隆插入痘苗重組載體上HCCI9A(SEQ ID NO3)、HCCI10A(SEQ ID NO5)、HCCI11A(SEQID NO7)、HCCI12A(SEQ ID NO9)、HCCI13A(SEQ ID NO1)和HCCI17A(SEQ ID NO13)，如圖21所示。通過用EcoRI和HindIII限制裂解將含有編碼E1區的cDNA片段從相應的pSP72質粒上裂解下來，並插入EcoRI/HindIII裂解過的pgptATA18疫苗重組載體上(如例1所述)，位於11K痘苗病毒晚期啟動子的下遊。相應的質粒被命名為pvSCV-9A，pvSCV-10A，pvSCV-11A，pvSCV-12A，pvSCV-13A和pvSCV-17A，在圖7中示出了其中了pvSCV-11A。
2.2疏水區E1缺失變體按以下方法製備含有密碼子Asp264-Va1287缺失的克隆HCCI37(790-861號胺基酸，編碼疏水性結構域I的片段)用引物對HCPr52(SEQ ID NO16)/HCPr107(SEQ ID NO19)和HCPr108(SEQ IDNO20)和HCPr54(SEQ ID NO18)由克隆HCCI10A製備兩種PCR片段。所述引物如圖21所示。在電泳之後從瓊脂糖凝膠中純化以上兩種PCR片段，並將1納克每一種片段同時用作模板，通過引物HCPr52(SEQ ID NO16)和HCPr54(SEQ ID NO18)進行PCR。將所得到的片段克隆到SmaI裂解過的pSP72載體上，並且能很方便地鑑定含有所述缺失的克隆，因為缺失了24個密碼子(72個鹼基對)。篩選含有克隆HCCI37(SEQ ID NO15)的質粒pSP72-HCCI37。通過將所述缺失周圍的HCV序列(通過XmaI和BamHI從載體pSP72-HCCI37裂解的片段)插入疫苗質粒pvHCV-10A上的XmaI和BamHI位點上構建含有缺乏疏水性結構域I的完整長度E1 cDNA的重組疫苗質粒。所得到的質粒被命名為pvHCV-37。在驗證性測序之後，將含有所述內部缺失的氨基末端片段從載體pvHCV-37上分離下來(用EcoRI和BstEII裂解)，並重新插入EcoRI和BstEII裂解過的pvHCV-11A質粒上。預計該構建體能表達缺失了兩個疏水性結構域E1蛋白，並命名為pvHCV-38。克隆HCCI38的E1編碼區如SEQ ID NO23所示。
由於在構建體pvHCV-38上不包括完整的位於E1羧基末端的親水區(理論上講延伸到337-340號胺基酸周圍)，通過EcoRI/BamHI裂解從pvHCV-37質粒上分離了較大的缺乏疏水結構域I的E1片段，並將其克隆到EcoRI/BamHI裂解過的pgsATA-18載體上。所得到的質粒被命名為pvHCV-39，並且含有克隆HCCI39(SEQ ID NO25)。通過BamHI(其中的粘性末端用KlenowDNA聚合酶I(Boehringer)補平)隨後用EcoRI(5』末端)消化將相同的片段從pvHCV-37載體上裂解下來。將該序列插入EcoRI和BbrPI裂解過的載體pMS-66上。由此得到了包含在質粒pvHCV-40上的克隆HCCI40(SEQ ID NO27)，它在其羧基末端含有6個組氨酸尾巴。
2.3其他基因型的E1克隆HCCI62(SEQ ID NO29)來自3a型感染的慢性C型肝炎患者(在WO94/25601中披露為血清BR36，克隆BR36-9-13，SEQ ID NO18，並且還可以參見Stuyver等，1993a)，而HCCI63(SEQ ID NO31)來自5a型感染的輸血後感染肝炎的兒童(在WO94/25601中披露為血清BE95，克隆PC-4-1，SEQ ID NO45)。
2.4E2構建體利用Stuyver等，1993b所披露的RNA製備、逆轉錄和PCR技術通過引物HCPr109(SEQ ID NO33)和HCPr72(SEQ ID NO34)由血清BE11(基因型b)獲得HCV E2 PCR片段22，並將該片段克隆到SamI裂解過的pSP72載體上。用NcoI/AlwNI或通過BamHI/AlwNI裂解克隆HCCI22A(SEQ ID NO35)，並將該片段的粘性末端補平(用KlenowDNA聚合酶I(Boehringer)補平NcoI和BamHI位點，用T4DNA聚合酶(Boehringer)補平AlwNI位點)。將所述BamHI/AlwNI cDNA片段插入疫苗pgsATA18載體上，該載體業已通過EcoRI和HindIII裂解線性化，並且用KlenowDNA聚合酶(Boehringer)將其粘性末端補平。所得到的質粒被命名為pvSCV-41，並且編碼從胺基酸Met347到Gln673的E2區，包括E1蛋白的37個胺基酸(從Met347到Gly383)，該片段可能起著信號序列的作用。將相同的HCV cDNA插入EcoRI/BbrPI裂解過的載體pMS-66上，隨後用KlenowDNA聚合酶將末端補平，所述的質粒被命名為pvSCV-42，並且同樣編碼347-683號胺基酸。用類似方法將NcoI/AlwNI片段插入pgsATA18(pvSCV-43)或pMS-66疫苗載體(pvSCV-44)的相同位點上。pvSCV-4和pvSCV-444編碼多蛋白的346-673號胺基酸，其中來自E1蛋白的天然羧基末端區的364-383號胺基酸編碼E2信號序列，以及成熟E2蛋白的384-673號胺基酸。
2.5製備重組HCV-痘苗病毒兔腎RK13細胞(ATCC CCL37)、人骨肉瘤143B胸苷激酶缺陷型(TK-)(ATCC CRL8303)HeLa(ATCC CCL2)和Heb G2(ATCC HB8065)細胞系是從美國模式培養物保藏所(ATCC，Rockville，Md，美國)獲得的。在Dulbecco’s改進的Eagle培養基(DMEM)上生長所述細胞，用於生長RK13和143B(TK-)的培養基補充了10％的胎牛血清和Earle’s鹽(EMEM)，而用於Hep G2細胞生長的培養基補充了葡萄糖(4克/升)。按以前披露的方法(PanicaliPaoletti，1982；Piccini等，1987；Mackett等，1982，1984和1986)在143B或RK13細胞中常規增殖所述痘苗病毒WR菌株(Western Reserve，ATCC VR119)。用野生型痘苗病毒0.1的感染複數(m.o.i.)(0.1噬斑形成單位(PFU)/細胞)感染153B細胞的鋪滿的單層。2小時之後，以含有500納克質粒DNA的磷酸鈣共沉澱形式將所述疫苗重組質粒轉染到受感染的細胞中，以便進行同源重組(Grahamvan de Eb，1973；Makett等，1985)。在用選擇培養基(含有25微克/毫升黴酚酸(MPA)、250微克/毫升黃嘌呤和15微克/毫升次黃嘌呤的EMEM；Falkern和Moss，1988；Janknecht，1991)培養的兔腎RK13細胞上選擇表達大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶(gpt)蛋白的重組病毒。在選擇培養基的0.9％瓊脂糖疊層下面的新的RK13細胞新的單層上純化單個的重組病毒。篩選胸苷激酶缺陷型(TK-)重組病毒，然後在有25微克/毫升5-溴-2』-脫氧尿苷的條件下在新的人143B細胞(TK-)單層上純化噬斑。通過以0.05的m.o.i.感染人143B或兔RK13細胞製備純化的重組HCV-痘苗病毒原種(Mackett等，1988)。在經過MPA選擇之後，通過利用用於克隆相應的HCV片段的引物(參見表1)進行PCR，用一份細胞裂解物樣品(50微升)證實所述HCV cDNA片段插入了重組痘苗病毒上。所述重組疫苗HCV病毒按照疫苗重組質粒編碼進行命名，例如，重組痘苗病毒vvHCV-10A來自野生型WR菌株與pvHCV-10A的質粒的重組。
實施例3用重組痘苗病毒感染細胞用實施例2中所披露的重組HCV痘苗病毒以3的感染複數感染RK13細胞的鋪滿的單層。為了進行感染，用磷酸緩衝的鹽溶液pH7.4(PBS)洗滌所述細胞單層2次，並用MEM培養基稀釋所述重組痘苗病毒原種。向每106細胞中添加200微升病毒溶液，使得感染複數為3，並在24℃下培養45分鐘。吸出所述病毒溶液，並向每106細胞中添加2毫升完整的生長培養基(參見例2)。在37℃下培養所述細胞24小時，在此期間進行了HCV蛋白的表達。
實施例4通過Western印跡分析重組蛋白用PBS洗滌感染過的細胞2次，直接用裂解緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，100mM氯化鈉，1％Triton X-100，5mM氯化鎂，1微克/毫升抑蛋白酶肽(Sigma，Bornem，比利時))直接裂解或通過在50mMTris-HCl pH7.5/10mMEDTA/150mM氯化鈉培養5分鐘與燒瓶分離，並通過離心收集(1000g，5分鐘)。然後將細胞沉澱物每106細胞重新懸浮在200微升裂解緩衝液(50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，150mM氯化鈉，5mM氯化鎂，抑蛋白酶肽，1％Triton X-100)以14000rpm的速度在Eppendorf離心機中離心5分鐘使細胞裂解物澄清，以便除去不溶性的碎片。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離20微升裂解物的蛋白。然後用冷卻到4℃的Hoefer HIS轉移裝置將所述蛋白從所述凝膠上轉移到硝酸纖維素膜(Amersham)上，在轉移緩衝液中(25mM Tris-HCl，pH8.0，192mM甘氨酸，20％(v/v)甲醇)以100V的穩定電壓轉移2小時。用Blotto(用PPS製備的5％(w/v)脫脂速溶奶粉；Johnson等，1981)封閉硝酸纖維素膜，並且與用Blotto/0.1％Tween-20稀釋的一級抗體一起培養。通常將人類陰性對照血清或感染了HCV的患者的血清稀釋200倍，並且在室溫下與稀釋200倍的野生型痘苗病毒感染的細胞裂解物一起預培養1小時，以便減弱非特異性結合。在用Blotto/0.1％Tween-20洗滌之後，將所述硝酸纖維素膜與用Blotto/0.1％Tween-20稀釋的鹼性磷酸酶底物溶液一起培養。用由PBS配置的0.1％Tween-20洗滌，然後將所述濾膜與鹼性磷酸底物溶液(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM氯化鈉，5mM氯化鎂，0.38微克/毫升淡蘭四唑，0.165微克/毫升5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)一起培養。除了電轉移步驟之後，所有步驟都是在室溫下進行的。
實施例5純化重組E1或E2蛋白5.1裂解用磷酸緩衝的鹽溶液(PBS)洗滌感染過的RK13細胞(具有E1或E2構建體)2次，並通過在含有10mM EDTA的PBS中培養將其從培養受體上分離下來。分離的細胞用PBS洗滌2次，並為每105細胞添加4℃的1毫升裂解緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM氯化鈉，1％Triton X-100，5mM氯化鎂，1微克/毫升抑蛋白酶肽(Sigma，Bornem，比利時)，含有2mM生物素化的N-乙基馬來醯亞胺(生物素-NEM)(Sigma))。用B型douncer對該裂解物進行勻漿，並在室溫下放置0.5小時。將另外5倍體積的含有10mM N-乙基馬來醯亞胺(NEM，Aldrich，Bornem，比利時)的裂解緩衝液添加到所述原始裂解物中，並將該混合物在室溫下放置15分鐘。在4℃下通過在Beckman JA14轉子中以14000rpm的速度(最大速度為30100g)離心1小時將不溶性細胞碎片從該溶液中清除。
5.2凝集素層析以1毫升/分鐘將澄清的細胞裂解物加樣到0.8×10釐米的lentil-凝集素Sepharose 4B柱(Pharmacia)上，該柱用5倍柱體積的裂解緩衝液以1毫升/分鐘的流速平衡過。用5-10倍柱體積的緩衝液1(0.5M磷酸鉀，pH7.3，500mM氯化鉀，5％甘油，1mM6-NH2-己烷酸，1mM氯化鎂，和1％圭基PEG(KWANT，Bedum，荷蘭))洗滌所述lentil-凝集素柱。在某些實驗中，隨後用10倍柱體積的含有0.5％Empigen-BB(Calbiochem，San Diego，CA，USA)而不是1％圭基PEG的緩衝液1洗滌該柱。通過使用洗脫緩衝液(10mM磷酸鉀，pH7.3，5％甘油，1mM己烷酸，1mM氯化鎂，0.5％Empigen-BB，和0.5Mα-甲基-甘露糖吡喃糖苷)洗脫結合的材料。分離洗脫的材料，並通過例6所述的ELISA篩選級份中E1或E2蛋白的存在。圖22表示由用vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)和vvHCV63(5a型)感染過的細胞裂解物的四種不同的E1純化物的lentil凝集素洗脫物級份所獲得的ELISA的結果。圖23表示由圖22所示出的值所獲得的曲線。以上結果表明凝集素親和層析可用於不同類型HCV的外被蛋白。
5.3濃縮和部分還原通過在4℃下，在Beckman JA20轉子中以5000rpm的速度離心3小時收集E1或E2陽性級份，在Centricon30kDa(Amicon)上濃縮。在某些實驗中，E1或E2陽性級份是通過氮氣蒸發收集並濃縮的。將相當於3×108細胞的量濃縮到大約200微升。為了進行部分還原，將30％的Empigen-BB(Calbiochem，San Diego，CA，USA)添加到這200微升樣品中，使最終濃度為3.5％，隨後添加用水配製的1M DTT，使最終濃度為1.5-7.5mM，並在37℃下培養30分鐘。隨後添加NEM(用二甲基亞碸配製成1M濃度)至50mM的最終濃度，並在37℃下讓它們再反應30分鐘，以便封閉游離的巰基基團。
5.4凝膠過濾層析用3倍柱體積的PBS/3％Empigen-BB平衡Superdex-200HR10/20柱(Pharmacia)。將還原的混合物注入Smart系統(Pharmacia)的500微升樣品迴路中，並添加PBS/3％Empigen-BB緩衝液，進行凝膠過濾。收集從V0至Vt的250微升的級份。按例6所述方法篩選所述級份中E1或E2蛋白的存在。圖24表示由受到vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)和vvHCV63(5a型)感染的細胞裂解物的四種不同的E1純化物的凝膠過濾層析級份所獲得的ELISA的結果。圖25表示由純化的1b型(1)、3a型(2)和5a型(3)E1蛋白(來自分別用vvHCV39、vvHCV62和vvHCV63感染過的RK13細胞；按照例5.2-5.3所述用lentil凝集素純化並還原)和標準物(4)獲得的曲線。峰值用『1』、『2』和『3』表示，它表示純的E1蛋白峰(參見圖24，E1反應性主要存在於26-30號級份中)。這些峰表示大約為70kDa的非常接近的分子量，相當於二聚體蛋白。在這三條曲線上的其他峰表示痘苗病毒和/或細胞蛋白，這些蛋白只所有能與E1分離，僅僅是因為在例5.3中所述的還原步驟，並且因為隨後在有適當的洗滌劑的條件下進行的凝膠過濾步驟。如圖26所示，收集物1(表示10-17號級份)和收集2(表示18-25號級份)含有不存在於E1收集物(26-30號級份)中的汙染性蛋白。將E1峰級份在SDS-PAGE上分離，並按例4所述方法吸印。按圖27所示通過圖27所示的鏈黴親和素-鹼性磷酸酶檢測用NEM-生物素標記過的蛋白。不難看出，在凝膠過濾層析之前所存在的29kDa和45kDa的汙染蛋白(泳道1)僅以非常低的含量出現在26-30號級份中。大約65kDa的帶表示E1二聚體形式，這種二聚體形式不能完全裂解成單體E1形式。3aE1蛋白獲得了類似結果(泳道10-15)，它在SDS-PAGE上表現出更快的遷移速度，因為僅存在5個碳水化合物而不是6個。圖28表示以與圖26相同的條件進行的SDS-PAGE凝膠電泳的銀染色。在圖29中提供了該純化方法的完整的綜述。
通過在例4所披露的Western印跡進一步證實了純化E1蛋白的存在。二聚體E1蛋白似乎是非凝聚的，並且不含雜質。用477Perkins-Elmer測序儀對按照上述方法從用vvHCV-40感染過的細胞中純化的亞型1b E1蛋白的氨基末端進行測序，並證實它的第一個殘基是酪氨酸。由此證實了所述E1蛋白業已在正確的位置上(A191和Y192之間)通過信號肽酶裂解與它的信號序列分離。這一結果證實了Hijikata等(1991)的發現，即成熟的E1蛋白的氨基末端始於192號胺基酸位置。
5.5純化E2蛋白按照例5.1-5.4所述方法從用vvHCV-44感染過的RK13細胞中純化E2蛋白(384-673號胺基酸)。圖30表示lentil凝集素層析的OD280曲線(連續的曲線)。點劃線表示通過ELISA檢測的E2反應性(如例6所述)。圖31表示通過lentil凝集素E2蛋白收集物的凝膠過濾層析所獲得的相同的曲線(參見圖30)，其中的一部分是按照例5.3所述方法還原並封閉的，而另一部分被馬上加樣到所述柱上。這兩部分E2收集物在獨立的凝膠過濾柱上過濾。可以證實，如果沒有進行還原的話，E2能與汙染性蛋白形成共價連接的凝集物。在還原和封閉之後，汙染性蛋白的主要部分分離成V0級份。與E2蛋白一起純化的其他汙染性蛋白不再與E2蛋白共價連接，因為這些汙染物可以在隨後的步驟除去。圖32表示為了E2蛋白純化而進行的額外的Ni2+-IMAC純化步驟。該親和素純化步驟採用了由vvHCV44所表達的添加在E2蛋白上的6個組氨酸殘基。汙染性蛋白要麼可以從所述柱中流過，或者通過30mM咪唑洗滌清除。圖33表示0.5微克純化的E2蛋白的銀染色的SDS-PAGE和30mM的咪唑洗滌。通過200Mm的咪唑洗脫步驟可以輕易地回收純的E2蛋白。圖34表示用於除去咪唑的額外的脫鹽步驟，並可以轉移到需要的緩衝液中，例如，PBS、碳酸鹽緩衝液、鹽水。
在例5.1-5.5中所述的方法以大約50000平方釐米的RK13細胞為原材料(用於生產E1的細胞用vvHCV11A(或vvHCV40)感染過，或為了生產E2蛋白所述細胞用vvHCV41、vvHCV42、vvHCV43或vvHCV44感染過)，可以純化大約1.3毫克E1蛋白和0.6毫克E2蛋白。
還應當指出的是，分泌型E2蛋白(佔細胞內形式的大約30-40％，60-70％)的特徵是形成凝聚物(與預期結果相反)。因此純化分泌型E2存相同的問題。可以按上述方法純化分泌型E2。
實施例6用於檢測抗E1或抗E2抗體或用於檢測E1或E2蛋白的ELISA以每孔1倍體積(例如50微升或100微升或200微升)的用PBS配製的5微克/毫升鏈黴親和素溶液(Boehringer Mannheim)對Maxisorb微孔平板(Nunc，Roskilde，丹麥)進行包衣，在4℃下進行16小時或者在37℃下進行1小時。或者，用1倍體積的用50mM碳酸鈉緩衝液pH9.6配製的5微克/毫升雪花蓮凝集素(GAN)所述孔進行包衣，4℃下進行16小時或者在37℃下進行1小時。在用GAN進行包衣時，用400微升Innotes HCV Ab III試劑盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利時)的洗滌溶液將所述平板洗滌2次。用1.5-2倍體積的封閉溶液(用PBS配製的0.1％酪蛋白和0.1％氮化鈉)封閉未結合的包衣表面，在37℃下進行1小時或者在4℃下進行16小時。吸出封閉溶液。將純化的E1或E2稀釋到100-1000納克/毫升(濃度是在A＝280nm的波長下測定的)或者篩選柱級份中的E1或E2(參見例5)，或將未純化過的細胞裂解物中的E1或E2(例5.1)用封閉溶液稀釋20倍，並將1倍體積的E1或E2溶液添加到每一個孔中，並在37℃下在鏈黴親和素或GAN包衣的平板上培養1小時。用1倍體積的Innotes HCV Ab III試劑盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利時)洗滌溶液將所述微孔洗滌3次。用Innotes HCV Ab III試劑盒的樣品稀釋劑將血清樣品稀釋20倍，或者將單克隆抗E1或抗E2抗體稀釋到20納克/毫升的濃度，並讓1體積的溶液與E1或E2蛋白在37℃下反應1小時。用100微升Innotes HCV Ab III試劑盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利時)的洗滌溶液洗滌所述微孔5次。按上述方法檢測結合的抗體在37℃下用由1體積的Innotes HCV Ab III試劑盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利時)的綴合稀釋劑稀釋1/80000倍的山羊抗人或抗小鼠IgG、過氧化物酶結合的二級抗體(DAKO，Glostrup，丹麥)培養每一個孔1小時，用400微升Innotes HCV AbIII試劑盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利時)的洗滌溶液洗滌所述平板3次之後，通過添加用1體積的Innotes HCV Ab III試劑盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利時)底物溶液稀釋100倍的Innotes HCV Ab III試劑盒的底物(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利時)在24℃下反應30分鐘實現顯色。
實施例7用不同的臨床特徵隨訪患者組7.1監測抗E1和E2抗體業已開發出了用於篩選並證實HCV抗體存在的現有的C型肝炎病毒(HCV)診斷測定方法。所述測定方法似乎不能提供用於監測疾病治療或預測治療結果的信息。不過，對於B型肝炎來說，檢測並定量抗外被蛋白抗體在臨床實踐上可能更為有用。為了研究利用抗E1抗體效價和抗E2抗體效價作為預測C型肝炎疾病的後果的標記，將一系列用IFN-α治療的具有長期持續的反應(被定義為在治療之後至少1年時間內，在血液中具有正常的轉氨酶水平和陰性HCV-RNA測試(在5』非編碼區上進行的PCR)的患者)與表現出物反應或表現出在治療結束時具有延遲的生物化學反應的患者進行比較。
將一組8個具有長期持續反應的IFN-α治療過的患者(LTR，隨訪1-3.5年，3個3a型和5個1b型)與9個對治療表現出不完全反應的患者(NR，隨訪1-4年，6個1b型和3個3a型)進行比較。1b型(vvHCV-39，參見例2.5)和3a E1(vvHCV-62，參見例2.5)蛋白是由痘苗病毒系統表達的(參見例3和4)，並純化至均勻(例5)。檢驗來自受1b型C型肝炎病毒感染的患者的樣品與純化的1b型1E蛋白的反應性。同時通過例6所示的ELISA檢驗受3a型感染的樣品與抗3aE1型抗體的反應性。通過Inno-LiPA基因型分類測定(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利時)確定感染不同患者的C型肝炎病毒的基因型。圖5表示在幹擾素治療期間觀測到的以及在治療之後的時間內觀測到的所述患者的抗E1信噪比。LTR例子中，一致性地表現出抗E1水平的迅速下降(在所有三個例子中都是陰性的)，而NR例子的抗E1水平大體上保持穩定。所獲得的某些抗E1數據在表2中是以平均S/N比例±SD的形式表示的(平均抗E1效價)。可以根據表5、6、7和8中所示的信噪比推測出抗E1效價。
在治療結束時，就已經能夠觀察到兩組之間的顯著差別。在LTR組中，抗E1抗體效價下降了6.9倍，而在NR組中僅下降了1.5倍。在隨訪觀察結束時，在具有持續反應的患者體內的抗E1效價下降到原來效價的1/22.5，在NR組中甚至還略有增加。因此，基於以上數據，在監測IFN-α治療期間抗E1抗體含量的降低與對治療的長期持續性反應相關。所述抗抗E1測定對於預測IFN治療的長期反應或者對於總體上治療C型肝炎疾病非常有用。
這一發現是出乎預料的，相反，本發明人曾經預計在具有長期反應的患者中，在IFN治療期間抗E1抗體含量會提高。對於B型肝炎來說，由於抗H BsAg抗體的血清轉變而清除了這種病毒。另外，在許多其他病毒感染中，在抗外被蛋白抗體產生以後，消除了有關病毒。不過，在本發明的實驗中，在對治療具有長期反應的患者體內抗E1抗體明顯降低，而在非反應患者體內該抗體的含量大體上保持在同一水平上。儘管以上實驗的結果是出乎預料的，不過這種非顯而易見的發現可能對於HCV感染的臨床診斷非常重要並且有用。如圖9、10、11和12所示，在所研究的相同的患者體內抗E2含量表現出很大差別，而對於抗E1抗體來說沒有發現其效價有明顯的下降。圖35提供了該實驗研究的完整的概況。
從表2可以看出，在治療開始時，長期反應者體內的抗E1效價比對治療的不完全反應者的抗E1效價平均高至少2倍。因此，測定治療開始時抗E1抗體的效價，或者將監測在感染過程中對患者進行監測並測定抗E1效價。可以作為臨床診斷C型肝炎的有用的標誌。
正如在例7.3中所述，可能需要使用E1或E2蛋白的更明確的部分。
7.2在較大的患者群中分析E1和E2抗體以上實驗研究使得本發明人得出了這樣的結論在感染被徹底消除以後，抗HCV外被蛋白的抗體的變化比抗更常見的研究過的HCV抗原的抗體的變化更快，以E1抗體的改變最明顯。因此，我們在研究中包括了更多的1b型和3a感染的LTR患者，並且在患者群中補充了匹配的一系列NR，這樣兩個組就各包括14位患者。還分析了某些部分反應者(PR)以及反應延遲的反應者(RR)。
圖36表示LTR和NR組中平均E1抗體(E1Ab)和E2抗體(E2Ab)含量，而表4和5表示統計學分析。在這一較大的群體中，在IFN-α治療之前較高的E1抗體與LTR相關(p＜0.03)。由於在3a型感染的患者中觀察到了比1b型感染的患者體內的更高的E1抗體含量(圖37)，也要將基因型考慮在內(表4)。在1b感染型組內，在開始治療時LTR的E1抗體含量同樣高於NR的E1抗體含量(p＜0.05)；有限數量的3a型感染的NR無法進行統計學分析。
在對LTR進行1.5年的抗體含量監測時，只有E1抗體與在治療開始時測定的含量相比被快速清除[治療結束時P＝0.0058；在治療之後6個月和12個月分別為P＝0.0047和P＝0.0051]。在1型或3型感染的LTR中這種消除依然保持明顯(平均P值＜0.05)。以上數據證實了最初的發現，即在發展的早期階段E1Ab含量迅速降低。這一特徵似乎與病毒基因型無關。在NR、PR或RR中，在整個隨訪觀察期間沒有發現測定的任何抗體有所改變。在對治療有積極反應的患者中，在治療期間表現出ALT水平的正常化和HCV-RNA陰性，而在持續的反應者(LTR)和反應延遲的反應者(RR)之間存在顯著差別。與LTR相反，RR沒有表現出E1抗體含量的任何降低，這表明隱藏的HCV感染的存在既不能通過PCR或用於檢測HCV-RNA的傳統方法證實，又不能通過提高了的ALT含量證實。在治療期間在RR組中仍然存在的少量病毒RNA似乎能進行抗E1 B細胞刺激。因此，抗E1監測不僅能夠區分LTR和NR，而且還能區分LTR和RR。
7.3監測E1蛋白的特定區域的抗體儘管鑑定HCV抗原的分子生物學方法導致了在病毒診斷髮展中的前所未有的突破，對λgt11文庫進行免疫篩選的方法主要得到了分布在核心和非結構區上的線性表位，而有關外被蛋白區的分析還有待於在哺乳動物細胞中進行E1/E2區的克隆和表達。這一方法與很多其他病毒感染明顯不同，其中所述外被蛋白區的表位在解釋基因組結構很久以前就已經進行了作圖。所述表位和相應的抗體通常具有中和活性，這種活性可用於疫苗開發和/或用於開發具有臨床或預測價值的診斷測定方法(例如，B型肝炎表面抗原的抗體)。由於目前還沒有可以對C型肝炎疾病進行臨床診斷和預測的HCV疫苗或檢測方法，用於免疫監督的病毒外被區的鑑定可能會明顯導致對HCV診斷和預防的新的指導作用。
按照以前披露的方法(EP-A-0489968)，根據HC-J1序列(Okamoto等，1990)合成了若干二十聚體肽(表3)，這些肽各自有8個胺基酸相互重疊。除了肽env35(又被稱為E1 35)之外，這些肽無一能夠檢測大約200個HCV患者血清中的抗體。只有兩種血清與env35肽有微弱的反應。不過，通過例6所披露的抗E1 ELISA，可以發現以下額外的表位對例6所述的抗E1 ELISA進行以下改進在樣品稀釋劑中將50微克/毫升E1肽與1/20稀釋過的人血清混合。圖13表示在有單個的或E1肽混合物的情況下，人血清對重組E1(由vvHCV-40表達)蛋白的反應性結果。儘管在線性免疫測定方案中，通過塗在小片上的E1肽只能檢測2％的血清，不過超過半數的抗E1抗體的血清可以在用重組E1蛋白測定時通過相同的肽競爭。在注射純化的E1蛋白之後從Balb/C小鼠中獲得的某些鼠單克隆抗體隨後與E1競爭對所述單個肽的反應性(圖14)。很明顯，含有所述優勢表位的env53的部分在添加env53時能夠明顯競爭如果種血清與E1的反應性，並且還檢測到了env31區抗體。這一發現是驚人的，因為在將env53和env31肽直接塗在固相上時沒有發現任何反應性。
因此，用申請人以前所披露的技術合成了有關肽(參見WO93/18054)。合成了以下肽肽env35A-生物素NH2-SNSSEAADMIMHTPGCV-GK生物素(SEQ ID NO51)跨越HCV多蛋白的E1區的208-227號胺基酸肽生物素-env53(「表位A」)生物素-GG-ITGHRMAWDMMMNWSPTTAL-COOH(SEQ ID NO52)跨越HCV多蛋白的E1區的313-332號胺基酸肽1bE1(「表位B」)H2N-YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCGK-生物素(SEQ IDNO53)跨越HCV多蛋白的E1區的192-228號胺基酸並且與肽E1a-BB(生物素-GG-TPTVATRDGKLPATQLRRHIDLL，SEQ IDNO54)和E1b-BB(生物素-GG-TPTLAARDASVPTTTIRRHVDLL，SEQ IDNO55)的反應性進行比較，後者分別來自1a和1b基因型序列的相同部分，並且於1993年在Glasgow召開的第9屆國際病毒學會議上公開(表位C)。並且將用表位A、B和C測試了一組HCV血清的反應性，並且將表位B與env35A進行比較(在47個HCV陽性血清中，有8個在表位B上是陽性的，而沒有一個能與env35A起反應)。按照例6所披露的方法直接測定了結合在用鏈黴親和素包衣的平板上的生物素化的肽(50微克/毫升)對表位A、B和C的反應性。很明顯，表位A和B反應性最強，而表位C和env35A-生物素反應性要低得多。檢測了監測過對完整E1蛋白的反應性的相同系列的患者(例7.1)對表位A、B和C的反應性。觀察到了對表位C的很弱的反應性，而如圖15、16、17和18所示，表位A和B能與大部分血清起反應。不過，針對反應性最強的表位(表位A)的抗體似乎不能預測疾病的緩解，而抗1bE1抗體(表位B)幾乎只是在IFN治療開始時存在於長期反應者體內。因此，抗1bE1(表位B)抗體和抗env35(表位A)抗體可以提供用於預測C型肝炎疾病的有用的標誌。Env53表位可用於檢測交叉反應抗體(能在主要基因型之間交叉反應的抗體)，而Env53區的抗體對於在血清或肝臟組織中檢測通用E1抗原來說是非常有用的。能識別Env53區的單克隆抗體能夠與隨機表位文庫起反應。在用單克隆抗體5E1A10進行免疫篩選時能起反應的4個克隆中存在序列-GWD-。由於它與存在於所有HCV變體的env53區中的通用HCV序列類似，因此認為序列AWD含有env53交叉反應鼠表位的必需序列。Env31明顯還含有一個可變區，該可變區可能含有一個存在於氨基末端序列-YQVRNSTGL-(SEQ ID NO93)上的表位，並且可用於診斷。在表3中所示的Env31和E1-31是肽1bE1的一部分。肽E1-33和E1-51還能在某種程度上與鼠抗體起反應，而肽E1-55(含有可變區6(V6)；跨越329-336號胺基酸)也能與某些患者血清起反應。
抗E2抗體明顯具有不同於抗E1抗體的模式，尤其是在對治療具有長期反應的患者中。因此，很明顯的是，抗外被抗體的減少不能向使用單個的抗E1或抗E2蛋白那樣使用重組E1/E2蛋白進行有效測定。在同時測定兩種類型抗體的測定中，抗E2反應能明顯幹擾抗E1反應。因此，證實了檢測抗外被蛋白抗體對單個的E1和E2蛋白的能力。
7.4在24個抗E2MAB中只有三個能夠競爭肽對重組E2的反應性。其中的兩個與HVRI區反應(肽E2-67和E2-69，被稱為表位A)，而一個能識別由肽E2-13B識別的表位(表位C)。大部分鼠抗體能識別構象抗E2表位(圖19)。通常還能觀察到人類對HVRI(表位A)的反應，以及較低程度的對HVRII(表位B)和第三種線性表位區(由肽E2-23、E2-25或E2-27競爭，並稱為表位E)和第四種線性表位區(由肽E2-17B競爭，表位D)的反應，不過大部分血清與構象表位起反應(圖20)。可以按照以下方法根據其相對位置對所述構象表位進行分類通過蛋白A親和層析純化能識別構象表位的雜交瘤的15C8C1、12D11F1、9G3E6、8G10D1H9、10D3C4、4H6B2、17F2C2、5H6A7、15B7A2的上清液中的IgG抗體，在硼酸緩衝液中在有生物素的條件下將所得到的1毫克/毫升IgG生物素化。通過凝膠過濾層析將生物素化的抗體與游離的生物素分離。將合併的生物素化抗體級份稀釋100-10000倍。在有100倍含量的非生物素化競爭抗體存在的條件下通過生物素化的IgG檢測與固相結合的E2蛋白，然後再通過鹼性磷酸酶標記的鏈黴親和素檢測。
在表6中給出了的競爭的百分比。根據以上結果，可以描繪出四種構象抗E2表位區(表位F、G、H和I)(圖38)。另外，上述Mabs可以識別在本研究中所沒有出現過的肽的突變型線性表位。Mabs4H6B2和10D3C4能競爭16A6E7的反應性，但是，與16A6E7不同，它們不能識別肽E2-13B。這種Mabs能夠識別相同的線性表位(表位C)的變體，或者識別受到了空間位阻或在將16A6E7結合到E2-13B區上之後的構象表位(表位H)。
實施例8E1糖基化變體8.1前言由哺乳動物細胞表達的，由vvHCV10A編碼的E1蛋白，和由vvHCV41-44編碼的E2蛋白分別含有6個和11個碳水化合物部分。這一結果可以通過將vvHCV10A感染過的或vvHCV44感染過的RK13細胞的裂解物與濃度出現降低的糖苷酶(PNGase F或內切糖苷酶H(Boehringer Mannheim Piochemica)，按照生產商的說明操作)一起培養，以便使裂解物中的蛋白(包括E1)被部分脫糖基化(分別如圖39和40所示)。
缺乏某些糖基化位點的變體可以選擇具有改善了的免疫學反應性的外被蛋白。以HIV為例，業已發現缺乏某些特定的糖添加基序的gp120蛋白特別適用於診斷或疫苗目的。通過在A/香港/3/68(H3N2)流感病毒的逃脫變體的血凝集素蛋白上添加新的寡聚糖側鏈，可以抑制與中和單克隆抗體的反應性(Skehel等，1984)。當通過位點特異性誘變將新的糖基化位點導入所述流感血凝集素蛋白中時，會出現明顯的抗原性改變，這表明所述糖類起著抗原性調節物的作用(Gallagher等，1988)。在另一個分析中，來自Friend鼠白血病病毒的表面蛋白gp70的8個碳水化合物添加基序缺失了。儘管7種這樣的突變都不影響病毒的感染性，但是針對氨基末端的糖基化信號的第四個突變導致出現了非感染性表型(Kayman等，1991)。另外，本領域眾所周知的是添加N-連接的糖鏈對於摺疊中間物的穩定來說是重要的，並因此對於有效摺疊、抑制錯摺疊和內質網降解、寡聚化、生物學活性、以及糖蛋白的轉運來說也是重要的(有關綜述參見Rose等，1988；Doms等，1993；Helenius，1994)。
在對HCV基因型的不同的外被蛋白基因序列進行的排比之後，可以了解到並不是HCV亞型1bE1蛋白上的所有6個糖基化位點都是正確摺疊和反應性所必需的，因為在某些類型或亞型中缺少了某些糖基化位點。在1b、6a、7、8和9型中所存在的第4個糖基序(在Asn251上)在目前已知的所有其他類型中都缺乏。可以對這種糖添加基序進行誘變，以便產生具有改善了的反應性的1bE1蛋白類型。另外，2b型序列在V5區出現了一個額外的糖基化位點(在Asn299上)上。屬於基因型2c的分離物I83甚至缺少V1區的第一個糖基序(在Asn上)，而該基序存在於所有其他的分離物上(Stuyver等，1994)。不過，即使是在完全保守的糖添加基序中，所述糖的存在可能並非是摺疊所必需的，不過，它可能是避免免疫監督方面發生作用。因此，對正確摺疊(以及反應性)來說並非必需的糖添加基序的確定不是明確的，並且必須分析每一種變體，並檢測其反應性。糖基化基序的誘變(NXS或NXT序列)可以通過以下方式實現誘變編碼N、S或T的密碼子，使這些密碼子編碼的胺基酸不同於它原來所編碼的N，和/或使它所編碼的胺基酸不同於它原來所編碼的S或T。另外，可以將X位點誘變成P，因為已知NPS或NPT通常不會受到糖類的修飾。在確定哪一個糖添加基序是摺疊和/或反應性所需要的，哪一個是不需要的之後，可以實施所述誘變的組合。
8.2E1蛋白的誘變所有突變都是用克隆HCCI10A的E1序列(SEQ ID NO5)進行的。第一輪PCR反應是用針對位於疫苗11K晚期啟動子上遊的GPT序列的有義引物『GPT』(參見表7)，和含有需要的鹼基變化的反義引物(被命名為GLY#，其中的#表示糖基化位點的編碼，參見圖41)進行的，以便獲得所述誘變。設計了6種GLY#引物(各自對特定的糖基化位點有特異性)，以便將編碼N-糖基化Asn的密碼子(AAC或AAT)修飾成Gln密碼子(CAA或CAG)。之所以選擇穀氨醯胺，是因為它非常類似於天冬醯胺(這兩種胺基酸都是中性的，並且含有非極性殘基，穀氨醯胺具有較長的側鏈(一個以上的-CH2-基團))。
在糖基化位點下遊的若干密碼子的一個上導入沉默突變，以便產生新的特殊的或罕見的(例如，E1Gly5的第二個SmaI位點)限制酶位點。在不改變胺基酸序列的前提下，這種突變可用於區分突變型序列和原始E1序列(pvHCV-10A)或與其他序列區分(圖41)。這種額外的限制位點還可用於構建新的雜合(2倍、3倍等)糖基化變體。
在第一個錯配的核苷酸的5』末端延長18個核苷酸，並向3』末端延長12-16個核苷酸。表7示出了與N-連接的糖基化位點的序列的重疊的六種GLY#引物的序列。
為了進行定向誘變，使用了『錯誤啟動』或『重疊延伸』(Horton，1993)。這一概念如圖42和43所示。首先，由靶基因擴增兩種獨立的片段，以便得到每一種突變位點。由5』末端獲得的PCR產物(產物GLY#)是用5』有義GPT引物(參見表7)和相應的3』反義GLY#引物擴增的。第二個片段(產物OVR#)是用3』反義TKR引物和相應的5』有義引物(OVR#引物，參見表7，圖43)擴增的。
所述OVR#引物針對部分GLY#引物序列。因此，這兩組PCR產物擁有一個具有相同序列的重疊區。當混合上述中間產物(GLY-1和OVR-1，GLY-2和OVR-2等)，以較高的溫度熔化並退火時，產物GLY#的上部有義鏈可以與產物OVR#的反義鏈退火(反之亦然)，使得這兩股彼此起著對方的引物的作用(參見圖42B)。在兩輪PCR中通過Taq聚合酶延伸退火的重疊部分，產生了完整長度的突變型分子E1Gly#，該分子具有能破壞#號糖基化位點的突變。通過常見的兩種內部嵌套引物在第三輪PCR中製備了用於克隆的足夠量的E1GLY#產物。這兩種新的引物分別與疫苗11K啟動子的3』末端(有義GPT-2引物)和疫苗胸苷激酶基因座的5』末端(反義TKR-2引物，參見表7)重疊。所有PCR條件是按照在Stuyver等(1993)所披露的條件下進行的。
通過EcoRI/BamHI裂解將上述每一種PCR產物克隆到EcoRI/BamHI裂解過的含有原始E1序列的疫苗載體上(pvHCV10-A)。通過EcoRI/BamHI裂解分析特所選擇克隆的插入片段的長度，以及每一種新的限制位點的存在。通過雙鏈測序證實重疊的突變位點的序列。
8.3分析E1糖基化變體以例8.2中所披露的含有突變型E1序列的6種質粒為起點，通過與例2.5中所披露的野生型痘苗病毒重組製備了重組型痘苗病毒。簡單地講，用6種具有突變型E1序列的重組痘苗病毒、vvHCV-10A(具有非突變型E1序列)和野生型痘苗病毒感染175平方釐米的亞鋪滿的RK13細胞的燒瓶。在感染之後24小時裂解細胞，並按照例4所述方法在Western印跡上進行分析(參見圖44A)。所有突變體在SDS-PAGE上都表現出比原始E1蛋白更快的遷移率(相當於大約為2-3kDa的較小的分子量)；證實增加了一個糖基部分。還通過PCR和限制酶分析分析了重組病毒，以便證實不同突變體的身份。圖44B表示所有突變體(如圖41所示)都含有預期的額外限制位點。將另一部分細胞裂解物通過ELISA檢測不同突變體的反應性。將所述裂解物稀釋20倍，並添加到按照例6所述方法用凝集素GNA包衣的微孔平板上。讓被捕獲(突變型)糖蛋白與稀釋20倍的在例6中所披露的24個HCV感染患者的血清起反應。在表8中示出了6個突變體和E1的信噪比(S/N)值(GLY#的OD/野生型的OD)。該表還示出了GLY#的S/N值與E1蛋白的比例。應當理解的是，將不同突變體的細胞裂解物用於比較同患者血清的反應性的方法，可能會導致出現的結果是由於不同的表達水平所致，而不是由於反應水平所致。所述困難可以通過按例5所述方法純化不同的突變體而得到克隆，並通過檢測所有不同E1蛋白的相同的量而克服。不過，表5所示的結果已經表明，去掉第一個(GLY1)、第三個(GLY3)和第六個(GLY6)糖基化基序，能減弱某些血清的反應性，而去掉第二個和第五個位點則不能。去掉GLY4似乎能提高某些血清的反應性。以上結果表明，不同的患者對本發明糖基化突變體的反應不同。因此，所述突變型E1蛋白可用於HCV疾病的診斷(篩選、證實、預測等)和預防。
實施例9在糖基化缺陷型酵母中表達HCV E2蛋白為相當於克隆HCCL41的E2序列提供α交配因子前/原信號序列，將其插入酵母表達載體上，並且用該構建體轉化釀酒酵母細胞，將E2蛋白分泌到生長培養基中。業已發現，在釀酒酵母菌株中表達所述構建體時，大多數糖基化位點被高甘露糖型糖基化所修飾(圖45)。這會導致過高的不均勻性，並且抑制其反應性，這是疫苗或診斷用途所不需要的。為了克服這一問題，通過篩選釩酸鹽抗性克隆的方法製備了具有修飾過的糖基化途徑的釀酒酵母突變體。通過分析糖蛋白轉化酶的分子量和不均勻性，分析了所述克隆的修飾過的糖基化途徑。這使得我們能夠鑑定不同的糖基化缺陷型釀酒酵母突變體。然後在某些特定的突變體中表達E2蛋白，並在例4所述的Western印跡上讓這種蛋白與例7所述的單克隆抗體起反應(圖46)。
實施例10一般用途本發明的結果表明，為了獲得HCV外被蛋白與人類患者血清的高的反應性，不僅需要好的表達系統，而且還需要好的純化方法。這一目的可以通過使用本發明的合適的HCV外被蛋白表達系統和/或純化方法而實現，所述表達系統能確保保持所述蛋白的天然摺疊，而本發明的純化方法能確保消除汙染性蛋白，並保留其構象，並因此保留了HCV外被蛋白的反應性。用於診斷性篩選測定的純化HCV外被蛋白的量為每年數克。對於疫苗用途來說，可能需要更大量的外被蛋白。因此，所述痘苗病毒系統可用於篩選最佳的表達構建體，並用於有限的擴大和大規模表達並純化含有高甘露糖糖類的單個的或特異性寡聚外被蛋白。在用若干酵母菌株表達時可以實現這一目的。例如，對於B型肝炎來說，用哺乳動物細胞生產H BsAg的成本比用酵母產生的B型肝炎疫苗生產成本高。
本發明所披露的純化方法總體上還可用於『病毒外被蛋白』。這些病毒的例子來自黃病毒、新發現的GB-A、GB-B和GB-C肝炎病毒、瘟病病毒(如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬霍亂病毒(HCV)、邊界病病毒(BDV))，不過，還在較低的程度上涉及到諸如B型肝炎病毒的病毒(主要是用於純化H BsAg)。
本發明的外被蛋白純化方法，可用於在詳細說明部分所列舉的低等或高等真核細胞或原核細胞中細胞內和細胞外表達的蛋白。
實施例11證實預防和治療作用通過接種E1可以減輕慢性感染HCV的黑猩猩的肝臟疾病。不過，為了獲得明顯的免疫反應，需要多次接種。普通技術人員可以理解的是，通過免疫調節可以產生病毒的抗性，這種抗性是由病毒本身產生或者是由宿主產生的。為了分析在HCV上是否存在這種免疫調節，比較了在初次感染的黑猩猩和慢性感染的黑猩猩中對E1和NS3的免疫反應。由於預計在慢性感染的動物體內會出現較弱的反應，選擇這一組動物進行更嚴格的免疫接種方案，包括以下步驟採用在小鼠上證實更有效的佐劑誘導細胞反應(表9)，與明礬進行比較。這種佐劑是用於初次感染的動物的佐劑；而用於慢性感染動物的免疫接種方案包括12次免疫接種，與之對應的是初次感染的動物有6次免疫接種(圖47)。
儘管由於免疫接種的動物數量無法進行統計學分析，不過在人體液反應中可以檢測到以下明顯的傾向(表10)在初次感染的動物的血清轉化的接種次數較少；而在初次感染的動物中的免疫反應的幅度明顯較大，有2/3的感染過的動物沒有達到10個內部單位的水平，即使是在免疫接種12次之後也是如此。
在3次免疫接種之後進行的細胞反應分析發現了更大的差別(圖48a-d)，包括以下差別在慢性感染的動物體內幾乎缺乏E1-特異性T細胞增殖，而在初次感染的動物組中可以觀察到明顯的刺激作用；IL-2測定證實了在慢性攜帶者的T細胞區室中的較低的刺激作用；並且在初次感染的動物中誘導了明顯的Th2(IL-4)反應，與含有明礬佐劑的疫苗預期的結果一樣。
這證實了，至少E1免疫接種能在初次感染的動物中提供預防性作用，並且表明E2和/或E1和E1和E2蛋白和肽的組合可以在初次感染的動物中提供有用的治療和/預防效果。
正如以下結果所證實的，通過多次免疫接種只能部分克服對誘導針對HCV E1抗原的細胞和體液應答的『損害』在每一次注射之後觀察到了抗體效價的提高，但是在2/3的動物中沒有達到初次感染的動物的水平；並且T細胞增殖反應依然非常(圖49)。不過ELISPOT結果證實了IL-2略有增加(未發表)，IFN-g沒有變化(未發表)，並且IL-4增加(圖49)，這表明，Th2型應答更容易誘導。與在初次感染的動物中經過3次免疫之後所達到的水平相比，發現IL-4仍然處於低水平上。
對NS3免疫接種進行了十分相似的觀察，其中，在慢性黑猩猩上使用了更強的佐劑(RIBI)。與明礬製劑相比，在初次感染的動物上發現了以下現象在兩組中誘導的抗體效價相當(未發表)；與在初次感染的動物中的應答相比，在慢性動物中細胞分泌和T細胞增殖幾乎缺乏(圖49a-b)。
目前已經有某些證據表明，在慢性攜帶者中對HCV的免疫應答較低，或者至少不足於消除感染。上述結果支持了這樣的假說，即HCV慢性攜帶者的免疫系統可能受到了損害，並且它對HCV抗原的應答不如在初次感染的動物中有效。
在Wiedmann等所做的研究中(Hepatology2000；31230-234)的研究中，在HCV慢性攜帶者上，對HBV的免疫效果較差，這表明這種免疫損傷不局限於HCV抗原。DeMaria等(Hepatology2000；32444-445)證實了以上結果，並且提供了適合HCV患者的改進的疫苗用藥方案。本文所提供的數據表明，增加免疫接種的次數，確實可以增強體液的應答，但是，細胞(特別是Th1細胞)應答是難以誘導的，即使在使用有效的佐劑時也是如此。在抗病毒治療的時候開始免疫接種是有利的，此時免疫系統更容易作出應答。
表1重組痘苗質粒和病毒
nt核苷酸aa胺基酸K1Klenow DNA Pol填充T4T4 DNA Pol填充位置HCV多蛋白序列上的胺基酸位置表1(續)重組痘苗質粒和病毒
nt核苷酸aa胺基酸K1Klenow DNA Pol填充T4T4 DNA Pol填充位置HCV多蛋白序列上的胺基酸位置表2抗E1測定總結S/N±SD(平均抗E1效價)
LTR1年以上的長期、持續的反應NR無反應、反應延遲或部分反應表3用於競爭研究的合成肽蛋白 肽胺基酸序列 位置 SEQ ID NOE1 E1-31 LLSGLTVPASAYQVRNSTGL181-20056E1-33 QVRNSTGLYHVTNDCPNSSI193-21257E1-35 NDCPNSSIVYEAHDAILHTP205-22458E1-35ASNSSIVYEAADMIMHTPGCV208-22759E1-37 HDAILHTPGCVPCVREGNVS217-23660E1-39 CVREGNVSRCWVAMTPTVAT229-24861E1-41 AMTPTVATRDGKLPATQLRR241-26062E1-43 LPATQLRRHIDLLVGSATLC253-27263E1-45 LVGSATLCSALYVGDLCGSV265-28464E1-49 QLFTFSPRRHWTTQGCNCSI289-30865E1-51 TQGCNCSIYPGHITGHRMAW301-32066E1-53 ITGHRMAWDMMMNWSPTAAL313-33267E1-55 NWSPTAALVMAQLLRIPQAI325-34468E1-57 LLRIPQAILDMIAGAHWGVL337-35669E1-59 AGAHWGVLAGIAYFSMVGNM349-36870E1-63 VVLLLFAGVDAETIVSGGQA373-39271E2 E2-67 SGLVSLFTPGAKQNIQLINT397-41672E2-69 QNIQLINTNGSWHINSTALN409-42873E2-$3BLNGNESLNTGWWLAGLIYQHK 427-44674E2-$1BAGLIYQHKFNSSGCPERLAS439-45875E2-1B GCPERLASCRPLTDFDQGWG451-47076E2-3B TDFDQGWGPISYANGSGPDQ463-48277E2-5B ANGSGPDQRPYCWHYPPKPC475-49478E2-7B WHYPPKPCGIVPAKSVCGPV487-50679E2-9B AKSVCGPVYCFTPSPVVVGT499-51880E2-11BPSPVVVGTTDRSGAPTYSWG511-53081E2-13BGAPTYSWGENDTDVFVLNNT523-54282E2-17BGNWFGCTWMNSTGFTKVCGA547-56683E2-19BGFTKVCGAPPVCIGGAGNNT559-57884E2-21 IGGAGNNTLHCPTDCFRKHP571-59085E2-23 TDCFRKHPDATYSRCGSGPW583-60286E2-25 SRCGSGPWITPRCLVDYPYR595-61487E2-27 CLVDYPYRLWHYPCTINYTI607-62688E2-29 PCTINYTIFKIRMYVGGVEH619-63889E2-31 MYVGGVEHRLEAACNWTPGE631-65090E2-33 ACNWTPGERGDLEDRDRSEL643-66291E2-35 EDRDRSELSPLLLTTTQWQV655-67492
表4外被抗體含量隨時間的變化(完整的研究，28位患者) 全部 Ib型 3a型全部Ib型 3a型 全部全部 ′數值是與治療開始時獲得的值相比較″P值＜0.05
表5.LTR和NR的差異(完整的研究)Mann-WilhnayE1Ab S/NE1Ab效價E1Ab S/NE1Ab S/NE2Ab S/NU檢驗(P值) 全部全部1b型 3a型 全部治療開始0.0257*0.05*0.680.1078治療結束0.1742 0.12956個月隨訪 1 0.8099 0.425 0.308112個月隨訪 0.670.230.4386 0.6629*P值＜0.05
表6.鼠E2單克隆抗體之間的競爭實驗生物素化的抗E2 mabs的抗E2反應性的降低(％)競爭劑 17H10F4D102F10H10 16A6E7 10D3C4 4H6B2 17C2F2 9G3E8 12D11F1 15C8C1 8G10D1H917H10F4D10 - 62 10 ND 11 ND 5 6 30 ND2F10H10 90- 1 ND 30 ND 0 4 12 ND16A6E7 NDND - ND ND ND ND ND ND ND10D3C4 1160 92 - 94 26 28 43 53 304H6B2 NDND 82 ND - ND ND ND ND ND17C2F2 2 ND 75 ND 56 - 11 10 0 09G3E6 NDND 68 ND 11 ND - 60 76 ND12D11F1 NDND 26 ND 13 ND ND - 88 ND15C8C1 NDND 18 ND 10 ND ND ND - ND8G10D1H92 2 11 ND 15 ND 67 082 81 -競爭劑對照15B7A2 0 0 9 15 10 9 0 0 0 55H6A7 0 2 0 12 8 0 0 4 0 023C12H9 NDND 2 12 ND 4 ND ND ND 2ND＝未測定表7.引物SEQ ID NO.96 GPT 5′-GTTTAACCACTGCATGATG-3′SEQ ID NO.97 TKR5′-GTCCCATCGAGTGCGGCTAC-3′SEQ ID NO.98 GLY1 5′-CGTGACATGGTACATTCCGGACACTTGGCGCACTTCATAAGCGGA-3′SEQ ID NO.99 GLY2 5′-TGCCTCATACACAATGGAGCTCTGGGACGAGTCGTTCGTGAC-3′SEQ ID NO.100 GLY3 5′-TACCCAGCAGCGGGAGCTCTGTTGCTCCCGAACGCAGGGCAC-3′SEQ ID NO.101 GLY4 5′-TGTCGTGGTGGGGACGGAGGCCTGCCTAGCTGCGAGCGTGGG-3′SEQ ID NO.102 GLY5 5′-CGTTATGTGGCCCGGGTAGATTGAGCACTGGCAGTCCTGCACCGTCTC-3′SEQ ID NO.103 GLY6 5′-CAGGGCCGTTGTAGGCCTCCACTGCATCATCATATCCCAAGC-3′SEQ ID NO.104 OVR1 5′-CCGGAATGTACCATGTCACGAACGAC-3′SEQ ID NO.105 OVR2 5′-GCTCCATTGTGTATGAGGCAGCGG-3′SEQ ID NO.106 OVR3 5′-GAGCTCCCGCTGCTGGGTAGCGC-3′SEQ ID NO.107 OVR4 5′-CCTCCGTCCCCACCACGACAATACG-3′SEQ ID NO.108 OVR5 5′-CTACCCGGGCCACATAACGGGTCACCG-3′SEQ ID NO.109 OVR6 5′-GGAGGCCTACAACGGCCCTGGTGG-3′SEQ ID NO.110 GPT-25′-TTCTATCGATTAAATAGAATTC-3′SEQ ID NO.111 TKn-25′-GCCATACGCTCACAGCCGATCCC-3′加下劃線的核苷酸表示額外的限制位點用粗體字表示的核苷酸表示相對於原始HCCI10A序列的突變表8.通過ELISA分析E1糖基化變體血清123 4 56 78 9101112SN GLY1 1.802482 2.120971 1.403871 1.205697 2.120191 2.866913 1.950345 1.866183 1.730193 2.466162 1.220654 1.629403SN GLY2 2.400795 1.76818 2.326495 2.639308 2.459019 6.043993 2.146302 1.595477 1.688973 2.482212 1.467582 2.070524SN GLY3 1.642718 1.715477 2.281848 2.364748 1.691818 4.833742 1.98892 1.482099 1.602222 2.191658 1.464210 1.721164SN GLY4 2.570154 3.824038 3.874605 1.499387 3.15 4.71302 4.198751 3.959542 3.710507 5.170841 4.250784 3.955153SN GLY5 2.462051 1.793761 2.409344 2.627368 1.716311 4.964785 2.13912 1.578330 1.708937 3.021807 1.562002 2.07278SN GLY6 2.031487 1.495737 2.131613 2.627925 2.494833 4.704027 2.02069 1.496480 1.704978 2.677757 1.529808 1.744221SN E12.828205 2.227036 2.512792 2.790861 3.131679 4.869128 2.287753 1.954198 1.805558 2.616822 1.55719 2.593886總計 平均131415161718 19 2021222324 S/N S/NSN GLY1 6.886581 3.233804 3.783496 1.985105 2.317721 6.675179 1.93470 2.47171 4.378633 1.188748 2.168800 1.706992 69.88534 2.495223SN GLY2 7.556882 2.587613 3.621928 3.055849 2.933792 7.65433 2.127712 2.921288 4.680101 1.150781 1.661914 1.632785 69.65243 2.902185SN GLY3 7.930538 2.783055 3.016099 2.045828 2.515305 5.778357 1.980185 2.657384 4.268833 0.97707 1.336776 1.20378 82.09872 2.507447SN GLY4 8.176818 8.581122 6.707668 5.684498 5.0048138.4125 3.813321 3.002535 4.293038 2.393011 3.68713 2.481585 102.6978 4.279076SN GLY5 8.883408 2.940334 3.125501 3.330912 2.654224 5.424107 2.442804 3.126761 4.64657 1.153658 1.817901 1.638211 69.26511 2.886046SN GLY6 8.005581 2.499952 2.621704 2.672385 2.363301 8.194107 1.600716 2.885433 2.781003 1.200743 1.475062 1.715423 61.32181 2.555076SN E18.825112 3.183771 3.067265 3.280335 2.980354 7.191964 2.771218 3.878066 6.35443 1.167286 2.083333 1.70252 76.64068 3.189195血清1 2 34 5 67 8 9 10 1112GLY1/E1 0.637316 0.952374 0.65869 0.431977 0.677036 0.688794 0.852516 0.954901 0.958261 0.94319 0.783882 0.628171GLY2/E1 0.848878 0.793901 0.925463 0.94569 0.785233 1.035913 0.93617 0.816436 0.935431 0.94656 0.942455 0.798232GLY3/E1 0.680834 0.770296 0.900053 0.84373 0.508312 0.992733 0.859761 0.758418 0.887385 0.837488 0.940294 0.683547GLY4/E1 0.941587 1.717097 1.641952 0.537245 1.005882 0.967939 1.835317 2.028172 2.06505 1.976 2.72978 1.524798GLY6/E1 0.877607 0.805447 0.958831 0.941408 0.647748 1.019642 0.935031 0.806641 0.948488 1.154762 1.003148 0.799102GLY6/E1 0.718296 0.671825 0.848305 0.90578 0.798669 0.982522 0.883284 0.785781 0.944294 1.023288 0.982288 0.672435總計 平均13 14151617 18 192021222324 E1/GLY# E1/GLY#GLY1/E1 0.644248 1.015852 1.226988 0.605153 0.777666 0.928144 0.898182 0.672013 0.817759 1.018386 1.036267 0.957628 19.36524 0.806885GLY2/E1 0.86827 0.808489 1.180833 0.931505 0.984377 1.064289 0.78779 0.794245 0.874061 0.98586 0.797719 0.916998 21.67384 0.903077GLY3/E1 0.898633 0.867856 0.903319 0.897968 0.843962 0.803029 0.714554 0.695308 0.797215 0.837558 0.841052 0.675314 19.19921 0.799967GLY4/E1 0.92654 2.080802 1.860833 1.732902 1.880587 0.09102 1.376045 0.810335 0.801773 2.050064 1.787422 1.392178 36.38692 1.51608GLY5/E1 1.006606 0.923538 1.019006 1.017857 0.690574 0.75419 0.861491 0.850109 0.067512 0.988323 0.872593 0.919042 21.70879 0.907783GLY6/E1 0.907134 0.786217 0.654737 0.784184 0.79296 0.72221 0.543702 0.724683 0.519396 1.097197 0.70803 0.962919 19.59691 0.616538
表9.Balb/c小鼠體內有佐劑的E1的特徵
1在經過3次皮下/肌肉免疫接種之後，分別對3隻隨機挑選的小鼠進行分析，結果以用E1刺激(1μg/ml)4天之後獲得的平均比cpm形式表示，括號中的數字表示具有上述特殊刺激背景的小鼠數量2在經過1次足底免疫接種之後(n＝2)，結果以用E1刺激(1μg/ml)5天之後獲得的平均比cpm形式表示。
表10.體液應答不同E1抗體水平需要的免疫接種次數
1如果在免疫接種之前不存在E1抗體，將ELISA信號確定為高於截止水平，在其它病例中，高於免疫接種之前效價的3個獨立的時間點的結果被視為血清轉變點。
2單位確定如下在幹擾素治療之前和用1b基因型感染後，在人慢性載體中的E1抗體含量對50％的患者來說為＜0.1U/ml，對25％的患者來說為0.1-1U/ml，其餘25％的患者＞1U/ml，n＝58。
實施例12對受到HCV1b亞型慢性感染的黑猩猩進行免疫接種用E1(192-326號胺基酸)接種在13年以前(在免疫接種之前5015天)就已經感染了HCV1b亞型菌株的黑猩猩(Phil)，所述E1來自不同的1b基因型菌株，在胺基酸水平上具有95.1％的相同性(還可參見WO99/67285的表2，該文獻被全文收作本文的參考)，並且是按照WO99/97285中的例1-3所披露的方法製備的)。按照生產商的方法(Ribi公司，Hamilton，MT)對黑猩猩一共進行了6次肌內免疫接種，每次50微克E1，所述E1溶解在PBS/0.05％CHAPS，與RIBI R-730(MPLA+TDM+CWS)混合。以上6次免疫接種是用兩個系列每個系列3次接種的方式進行的，每個系列中的每次接種之間間隔3周時間，而2個系列之間間隔6周時間。從免疫接種之前150天開始，在免疫接種期間一直到免疫接種後1年(參見下文和WO99/67285)對所述黑猩猩進行連續監測，監測表示HCV誘導的疾病的活性的各種參數。所述參數包括血液化學、ALT、AST、γGT、血液化學、血清中的病毒負荷，肝臟和肝組織中的病毒負荷。另外，在體液和細胞水平監測對所述接種的免疫應答。在此期間，還要監測所述接種的任何負面影響，如行為的變化、臨床症狀、體重、體溫和局部反應(發紅、腫脹、硬結)，不對這些效果進行檢測。
很明顯，一旦抗E1的抗體水平達到最大值ALT(特別是γGT，數據未發表)含量就會降低(參見WO99/67285的圖8)。一旦所述抗體含量開始下降，ALT就能相當快地反彈，但是，只要仍然可以檢測到抗E1，γGT就保持在較低的水平上。
在可檢測到抗E1的時間內，肝臟內的E2抗原降低到幾乎檢測不到的水平，而E2抗原在所述抗體消失之後很快就反彈。隨著肝臟中所述核心和E2抗原變得無法檢測，肝臟的炎症也明顯減弱(還可參見WO99/67285的表3)。這是疫苗誘導肝臟損傷減輕的一個主要證據，有可能是通過清除，至少是部分清除其主要靶器官肝臟中的病毒抗原所致。
在整個研究期間，通過Amplico HCV監測儀(Roche，Basel，瑞士)測定在血清中的病毒血症水平大體上保持不變。
對體液應答所作的更詳細的分析發現，最大終點效價達到了14.5×103(在第6次免疫接種之後)，並且該效價在免疫接種之後1年內降低到無法檢測的水平(WO99/67285的圖8)。WO99/67285的圖9表明，由B細胞識別的可以由肽模擬的主要表位位於E2 N-末端區(肽V1V2和V2V3，有關所使用的肽的細節參見WO99/67285的表4)。由於針對重組E1的反應性強而且持續時間長，由該附圖可以推測由該表位所識別的抗體僅僅代表抗E1的所有抗體群體的一部分。其餘部分是針對不能由肽模擬的表位的，即不連續的表位。所述表位僅僅出現在完整的E1分子上或者甚至只能出現在顆粒樣結構上。所述對E1的免疫應答是獨特的，至少與在人類慢性HCV攜帶者(授予Maertens的WO96/13590)和黑猩猩(van Doorn等，1996)上正常出現的情況相比是獨特的，它能在它的初次感染過程中產生抗E1抗體。在上述患者中，抗E1也是部分針對不連續表位的，不過，大部分是針對C4表位的(佔患者血清的±50％)，小部分是針對V1V2(根據基因型在2％-70％之間波動)，而針對V2V3的反應性只能偶然記錄到(Maertens等，1997)。
分析T細胞反應性發現，免疫系統的該區室還是由所述疫苗以特殊方式刺激的，由於所述T細胞的刺激指數從1提高到2.5，並且在隨後的時間內依然會有某些提高(WO99/67285的圖10)。這種T細胞反應性只能出現在對幹擾素治療的長期反應者體內(參見授予Leroux-Roels等的PCT/EP94/03555；Leroux-Roels等，1996)。
實施例13用不同的亞型免疫接種慢性HCV攜帶者用HCV1b基因型的E1接種來自1a基因型的HCV在10年以前就已經感染了來自1a基因型的HCV(在免疫接種之前3809天)亞型菌株的黑猩猩(Ton)，在胺基酸水平上具有79.3％的相同性(還可參見WO99/67285的表2，該文獻被全文收作本文的參考)，並且是按照前面實施例中的方法製備的)。按照生產商的方法(Ribi公司，Hamilton，MT)對黑猩猩一共進行了6次肌內免疫接種，每次50微克E1，所述E1溶解在PBS/0.05％CHAPS，與RIBI R-730(MPLA+TDM+CWS)混合。以上6次免疫接種是用兩個系列每個系列3次接種的方式進行的，每個系列中的每次接種之間間隔3周時間，而2個系列之間間隔4周時間。從免疫接種之前250天開始，在免疫接種期間一直到免疫接種後9個月(參見下文和WO99/67285)對所述黑猩猩進行連續監測，監測表示HCV誘導的疾病的活性的各種參數。所述參數包括血液化學、ALT、AST、γGT、血清中的病毒負荷，肝臟和肝組織中的病毒負荷。另外，在體液和細胞水平監測對所述接種的免疫應答。在此期間，還要監測所述免疫接種對動物產生的任何負面影響，如行為的變化、臨床症狀、體重、體溫和局部反應(發紅、腫脹、硬結)，不對這些效果進行檢測。
很明顯，一旦抗E1的抗體含量達到最大值ALT(特別是γGT含量，數據未發表)含量就會降低(參見WO99/67285的圖11)。一旦所述抗體含量開始下降，ALT和γGT就會反彈，不過在整個隨訪觀察期間ALT和γGT都保持在較低的水平上。與免疫之前的含量時間相比(85±11U/L)，在免疫接種之後ALT的含量甚至會顯著降低(62±6U/L)。由於在血清中回收到的組織損傷的標記物較少，以上發現是免疫誘導的肝臟疾病改善的第一證據。
在抗E1保持在高於1.0×103的效價期間，E2抗原水平變得無法檢測，不過，在較低的E1抗體水平又再次變得可以檢測。隨著HCV抗原的消失，肝臟的炎症也會從中度慢性活性肝炎向較弱形式的慢性持續性肝炎顯著降低(WO99/67285的表3)。這是所述疫苗能誘導肝臟損傷減輕的另一個主要證據，有可能是通過清除，至少是部分清除其主要靶器官肝臟中的病毒所致。
在整個研究期間，通過Amplico HCV監測儀(Roche，Basel，瑞士)測定在血清中的病毒血症水平大體上保持不變。對體液應答所作的更詳細的分析發現，所達到的最大終點效價為30×103(第六次免疫接種之後)。並且該效價在免疫接種之後9個月降低到0.5×103(WO99/67285的圖11)。WO99/67285的圖12表明由B細胞識別的可以由肽模擬的主要表位，該表位位於N-末端區(肽V1V2和V2V3，有關所使用的肽的細節參見WO99/67285的表4)。由於針對重組E1的反應性強而且持續時間長，根據該附圖可以推測由該表位所識別的抗體僅僅代表抗E1的所有抗體群體的一部分。其餘部分很有可能是針對不能由肽模擬的表位的，即不連續的表位。所述表位有可能僅僅出現在完整的E1分子上或者甚至只能出現在顆粒樣結構上。所述對E1的免疫應答是獨特的，至少與具有可檢測的E1的人類慢性HCV攜帶者上正常出現的免疫應答相比比是獨特的。在上述患者中，抗E1還是部分不連續的，大部分是針對C4表位的(佔患者血清的50％)，小部分是針對V1V2(根據基因型在2％-70％之間波動)，而只能偶然記錄到針對V2V3的反應性(Maertens等，1997)。由於該黑猩猩是用1a分離物感染的，還要評估所述抗體反應對E1-1a抗原的交叉反應性。從WO99/67285的圖13中可以看出，確實產生了所述交叉反應抗體，不過，這種抗體只佔整個抗體群體的一部分。引人注目的是，在肝臟中病毒抗原的重新出現和血清中可檢測的抗1aE1抗體的消失之間的相關性。
分析T細胞反應性還發現，免疫系統的該區室也是由所述疫苗以特殊方式刺激的，由於所述T細胞的刺激指數從1提高到2.5，並且在隨後的隨訪觀察時間內保持在較高的水平上(WO99/67285的圖14)。
實施例14用E1再加強HCV慢性攜帶者由於在例12和13中觀察到的E1抗體效價是不穩定的，並且隨著時間推移而降低，對於1b感染的黑猩猩來說甚至會降低到無法檢測的水平，對有關這種抗體應答是否能通過額外的加強免疫再次增強的問題進行了研究。以3周的間隔時間對這兩種黑猩猩再進行3次連續的免疫接種(與RIBI佐劑混合的50微克E1)。從WO99/67285的圖8和11中可以看出，一旦肝臟中的病毒抗原再次降低到低於檢測極限的水平，就可以群鼠加強抗E1應答。不過，在Ton的黑猩猩的血清中病毒負荷保持穩定(WO99/67285的圖11)。在隨訪觀察期間，第一次測出了低於每毫升105基因組當量的病毒血症水平。
值得注意的是以下發現，正如與第一個系列的免疫接種情形相同，與用1a亞型HCV菌株感染的黑猩猩(Phil)相比用1b亞型HCV菌株感染的黑猩猩(Phil)以較低的抗E1效價作出應答。第一輪最大效價為14.5×103對Ton黑猩猩的30×103，在額外加強免疫之後，Phil的效價僅為1.2×103，而Ton黑猩猩的效價為40×103)。儘管對這兩種動物的有利影響似乎是相似的，不過，根據該實驗可以得出這樣的結論為了獲得更高的效價，用來自另一種亞型或基因型的E1蛋白對慢性攜帶者進行免疫接種可能是特別有利的，並且通過用所述感染性亞型或基因型誘導可以避免在所述宿主中預先存在的和特異性的免疫抑制作用。另外，在同源組(1b疫苗+1b感染)中所觀察到的較低的效價可能表明了有大量抗體與病毒結合。因此，所誘導的抗體可能具有中和能力。
實施例15驗證E1免疫接種在黑猩猩中的預防作用HCV E1s蛋白(192-326號胺基酸)是用重組痘苗病毒HCV11B在Vero細胞中表達的。該痘苗病毒基本上與vvHCV11A相同(披露於US6150134中，該專利的所有內容被收作本文參考)。不過，已經從RK13傳入了Vero細胞。大體上按照PCT/E99/04342(WO99/67285)的例9中所披露的方法純化所述蛋白(通過lentil層析，還原烷基化和大小排阻層析)，利用碘代乙醯胺作為半胱氨酸的烷基化試劑。在純化之後，通過PCT/E99/04342中所披露的大小排阻層析方法將3％的Empigen-BB換成3％的甜菜鹼，這一方法可以回收到顆粒形式的E1。最後將該材料脫鹽成含有0.5％的甜菜鹼的PBS，E1的濃度為500微克/毫升。將這種E1與等體積的Alhydrogel 1.3％(Superfos，丹麥)混合，並最後用8倍體積的0.9％的氯化鈉進一步稀釋，以便獲得濃度為50微克E1/毫升和0.13％Alhydrogel的明礬輔佐的E1。
按照所披露的有關表達和純化E1的方法用重組痘苗病毒HCV101在Vero中表達並從中純化HCV E2ΔHVRI(412-715號胺基酸)，該重組痘苗病毒是按照PCT/E99/04342的例8中所披露的方法由pvHCV-101和野生型痘苗病毒重組而產生的。同樣，在將Empigen-BB換成甜菜鹼之後，E2ΔHVRI的表現就如同一種顆粒(通過動態光反射測定)。
選擇在HCV-RNA和HCV-抗體檢測中呈陰性的5隻黑猩猩。其中的1隻動物(Huub)不進行免疫接種，2隻動物接受以明礬為佐劑的50微克的E1的6次免疫接種(Marti和Yoran)，而其餘的2隻動物接受以明礬為佐劑的50微克E2ΔHVRI的免疫接種(Boost和Karlien)。所有免疫接種都是通過肌內方式進行的，間隔時間為3周。在每一隻動物中評估針對用來免疫接種的抗原的體液和細胞免疫應答，並且在每一隻動物中檢測兩種類型的應答，如表11所示。
表11在第6次免疫接種2周之後，通過ELISA測定抗體效價。將該樣品的一系列稀釋液與一種室內標準物進行比較(這種室內標準物被定義為具有1000mU/ml的E1或抗E2ΔHVRI抗體，它是來自根據高抗外被效價篩選的HCV慢性攜帶者的三種血清的混合物)。體現細胞免疫應答的刺激指數是通過在有或沒有外被抗原的條件下培養PBMC獲得的，所述PBMC來自第3次免疫之後2周的動物，並測定在培養5天之後為期18小時的時間內結合到所述細胞中的含氚胸苷的含量。刺激指數是摻入用外被抗原培養的細胞中的胸苷與摻入不用抗原培養的細胞中的胸苷的比例。大於3的刺激指數被認為是陽性信號。
在6次免疫接種的最後一次接種之後3周，用100VID(黑猩猩感染劑量)的1b基因型接種物(J4.91，由J.Bukh博士饋贈，NIH，Bethesda，馬裡蘭州)對包括對照在內的所有動物進行刺激。對於E1來說，疫苗蛋白和J4.91分離物(其序列信息可以從保藏號BAA01583獲得)為7％(135個胺基酸中的9個)。而對於E2ΔHVRI來說為11％(304個胺基酸中的32個)；因此，該刺激被認為是異源的，並且體現了真實的活的刺激。
在刺激之後第7天所有黑猩猩都變成HCV-RNA陽性(用HCV監測儀測定，Roche，Basel，瑞士)，並且在第35和63天之間檢測到了第一個ALT和γGT峰。這證明了所有黑猩猩都出現了急性肝炎。很明顯，2隻E1免疫接種的動物都解決了它們的感染，而於E2ΔHVRI和對照動物沒有。這一結論得到了以下事實的驗證E1免疫接種過的動物在第98天(Yoran)和133天(Marti)喪失了HCV-RNA(用HCV監測儀測定，Roche，Basel，瑞士)，並且在每個月進行的檢測中直到第273天都保持陰性。所有其他的動物在整個273天的隨訪觀察期間都保持RNA陽性，其ALT和γGT值與E1免疫接種的黑猩猩不同沒有恢復正常，而是逐漸提高。
總之，我們業已證實了E1免疫接種通過抑制慢性感染的發展改變了HCV感染的天然歷史，這種感染是與HCV相關的主要健康問題。
實施例16在人體內可以誘導的能夠清除黑猩猩體內感染的類似的E1應答為了在人體內獲得E1免疫接種的預防作用，需要在人體內誘導與黑猩猩相應的類似免疫應答。因此，我們對20位男性人類志願者進行了免疫接種，沒有檢測到抗E1應答(體液或細胞中)，使用三劑20微克E1免疫接種，該劑量是以0.5毫升的體積在0.13％的Alhydrogl上配製的。所有免疫接種都是以3周的間隔通過肌內注射進行的。正如在表12、17中所證實的，在20位志願者中確實產生了針對E1的顯著的體液和細胞免疫應答，這種應答不會沒有嚴重的負面影響。僅有1位志願者(對象021)被認為是非應答者，因為在3次E1免疫接種之後，體液或細胞應答都沒有超過截段水平。體液應答低於黑猩猩的結果與這一事實相關僅以20微克的用量進行了3次免疫接種，而不是使用50微克的用量進行6次免疫接種。
表12在第3次免疫接種2周之後，通過ELISA測定抗體效價。將該樣品的一系列稀釋液與一種室內標準物進行比較(這種室內標準物被定義為具有1000mU/ml的E1或抗E2ΔHVRI抗體，它是來自根據高抗外被效價篩選的HCV慢性攜帶者的三種血清的混合物)。體現細胞免疫應答的刺激指數是通過在有或沒有外被抗原的條件下培養PBMC獲得的，所述PBMC來自第3次免疫之後2周的動物，並測定在培養5天之後為期18小時的時間內結合到所述細胞中的含氚胸苷的含量。刺激指數是摻入用外被抗原培養的細胞中的胸苷與摻入不用抗原培養的細胞中的胸苷的比例。大於3的刺激指數被認為是陽性信號。
*該個體在免疫接種後被認為是抗E1陽性，因為在免疫之前的樣品和3次免疫接種之後的樣品之間出現了ELISA信號的顯著增強，不過，效價非常低，無法進行精確測定。
實施例17在免疫過的健康志願者體內加強E1應答在第26周(即在第3次免疫接種之後20周)，用在0.13％Alhydrogl上配製的體積為0.5毫升的20微克E1對例16中的20位人類志願者中的19位再進行1次加強接種。在該額外的免疫接種之後2周，再次測定抗體效價和細胞免疫應答。在20周的時間內，所有個體的抗體效價都降低了，不過，通過所述額外的免疫接種可以增強到等於或高於在第8周所出現的水平。與第8周的效價相比，在該加強免疫接種之後抗體的效價平均增加了1倍，而與第26周的效價相比增加了7倍(表13)。
表13在第3次免疫接種之後2周(＝8周)和20周(26周)以及在加強免疫接種之後2周(＝28周)通過ELISA測定抗體效價。將該樣品的一系列稀釋液與一種室內標準物進行比較(這種室內標準物被定義為具有1000mU/ml的E1或抗E2ΔHVRI抗體，它是來自根據高抗外被效價篩選的HCV慢性攜帶者的三種血清的混合物)。為了精確比較用第26周和28周的樣品重複進行在第8周進行的效價測定，它解釋了在例16的表12中的差別。
很明顯，對於大部分個體的T細胞應答在經過20周的時間之後仍然很高。考慮到對破傷風反應的正常化(它作為以前免疫的接種出現在大多數個體提內)，所述刺激指數的幾何平均值沒有變化。在經過所述額外的加強免疫之後，考慮到所述破傷風反應的正常化，沒有發現變化(圖51)。這證實了在3次E1免疫接種之後誘導了T輔助應答，並且表明這3次免疫接種已經誘導了非常好的T輔助記憶，它在至少6個月的時間內不需要進一步的加強免疫。
圖51的說明刺激指數(細胞免疫應答)是通過以下方法獲得的在有或沒有3微克重組E1或2微克破傷風類毒素的條件下培養來自免疫接種之前(0周)，第3次免疫接種之後2周(8周)，加強免疫接種之前(26周)以及加強免疫接種之後2周(28周)的個體的PBMC(105細胞)，並且在培養5天之後，測定在為期18小時的時間內結合到所述細胞中的含氚的胸苷的量。刺激指數是結合到用外被抗原培養的細胞中的胸苷與結合到不用抗原培養的細胞中的胸苷的比例。在第1個測定(A)中，測定0周和8周的樣品，而在第2個測定(B)中，測定26周和28周的樣品，其中，對0周的樣品進行再次分析。結果以所有20位(A，實驗)或19位(B，實驗)志願者的刺激指數的幾何平均值形式表示。
除了Th1細胞因子幹擾素γ之外，還在第26周和28周採集的並用E1再次刺激過的樣品的PBMC培養物的上清液中測定Th2細胞因子白介素-5。從圖52中可以看出，由E1刺激的PBMC分泌的主要細胞因子是幹擾素γ。另人吃驚的是，用明礬輔佐的E1觀察到了偏向Th1的強的應答，因為已知明礬是Th2誘導物。這一結果再次證實了誘導了良好的T細胞記憶應答，因為在最後的加強免疫之前(26周)就觀察到了非常強的應答。在另一個實驗中我們發現所述幹擾素γ分泌是特異性的，使用在第0周採集的樣品我們沒有發現在這些志願者的E1刺激的細胞培養物和未刺激過的細胞培養物之間在幹擾素γ的分泌方面有差別。
圖52的說明有3微克重組E1(E1)或2微克破傷風類毒素(TT)或無抗原(BI)的條件下培養來自加強免疫接種之前(26周)和加強免疫接種之後2周(28周)的個體的PBMC(105細胞)。通過ELISA測定取自24小時之後(白介素-5)或120小時之後(幹擾素γ)採集的上清液中的細胞因子。刺激指數是在用外被抗原培養的細胞上清液中測定的細胞因子與在不用抗原培養的細胞中測定的細胞因子的比例。結果以所有19位志願者分泌的pg細胞因子/毫升的幾何平均值形式表示。細胞因子量低於檢測極限的樣品被確定為檢測極限值。類似的，具有超出該測定的線性範圍的極高濃度的細胞因子的樣品被確定為該測定的線性範圍的上限。
實施例18免疫接種過的健康志願者對E1的細胞應答的精細作圖為了對E1特異性反應進行作圖，用標準Fmoc化合方法合成了一系列二十聚體肽，具有8個胺基酸的重疊，並且覆蓋整個E1序列。對所有的肽進行C-末端氨基化和N-末端乙醯化，除IGP1626以外，它具有游離的氨基末端。
IGP1626 YEVRNVSGIYHVTNDCSNSS(192-211號胺基酸)IGP1627 TNDCSNSSIVYEAADMIMHT(204-223號胺基酸)IGP1628 AADMIMHTPGCVPCVRENNS(216-235號胺基酸)IGP1629 PCVRENNSSRCWVALTPTLA(228-247號胺基酸)IGP1630 VALTPTLAARNASVPTTTIR(240-259號胺基酸)IGP1631 SVPTTTIRRHVDLLVGAAAF(252-271號胺基酸)IGP1632 LLVGAAAFCSAMYVGDLCGS(264-283號胺基酸)IGP1633 YVGDLCGSVFLVSQLFTISP(276-295號胺基酸)IGP1634 SQLFTISPRRHETVQDCNCS(288-307號胺基酸)IGP1635 TVQDCNCSIYPGHITGHRMA(300-319號胺基酸)IGP1636 HITGHRMAWDMMMNWSPTTA(312-331號胺基酸)在分別有25微克/毫升(未免疫接種的人體)或10微克/毫升(免疫接種過的人體)，在第3次或加強注射之後採集的樣品)肽的情況下培養來自14個沒有用E1免疫接種的不同的健康供體或10個用E1免疫接種的10個供體的PBMC。從圖53中可以看出，與未免疫接種過的人體相比，在免疫接種過的人體內肽IGP1627、1629、1630、1631、1633、1635和1635都能誘導明顯較強的反應。使用3的刺激指數作為肽IGP1627、1629、1631和1635的截斷值，1635是最經常被識別的(至少能被測試的半數免疫接種過的人體所識別)。該實驗證實，由來自哺乳動物細胞培養物的E1誘導的T細胞應答是對E1特異性的，因為這種應答不能被來自哺乳動物細胞培養物的相同的E1再次誘導，不過還可以通過合成肽誘導。另外，該實驗證實了E1中的大部分免疫原性T細胞結構域位於204-223、228-271、276-295、300-311號胺基酸之間，尤其是位於204-223、228-247、252-271和300-319號胺基酸之間。
圖53的說明刺激指數(細胞免疫應答)是通過以下方法獲得的在有或沒有肽的條件下培養PBMC(3×105細胞)，並測定在培養5-6天之後在一段時間內結合到所述細胞中的含氚的胸苷的量。刺激指數是結合到用肽培養的細胞中的胸苷與結合到不用肽培養的細胞中的含氚胸苷的比例。結果以接種過的人體(上圖)或未接種過的或對照(下圖)的單個值的形式表示。
因此，本發明還提供了以下E1肽、蛋白、含有它們的組合物和試劑盒、編碼所述肽和蛋白的核酸序列及其生產方法和用途。正如在本文中針對本發明的其他E1和相關肽所作的一般性說明。
跨越E1區的192-211號位置的IGP1626(SEQ ID NO112)，跨越E1區的204-223號位置的IGP1627(SEQ ID NO113)，跨越E1區的192-211號位置的IGP1626(SEQ ID NO112)，跨越E1區的204-223號位置的IGP1627(SEQ ID NO113)，跨越E1區的216-235號位置的IGP1628(SEQ ID NO114)，跨越E1區的228-247號位置的IGP1629(SEQ ID NO115)，跨越E1區的240-259號位置的IGP1630(SEQ ID NO116)，跨越E1區的252-271號位置的IGP1631(SEQ ID NO117)，跨越E1區的264-283號位置的IGP1632(SEQ ID NO118)，跨越E1區的276-295號位置的IGP1633(SEQ ID NO119)，跨越E1區的288-307號位置的IGP1634(SEQ ID NO120)，跨越E1區的300-319號位置的IGP1635(SEQ ID NO121)，跨越E1區的312-331號位置的IGP1636(SEQ ID NO122)。
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2109121120212PRT213C型肝炎病毒40091Ala Cys Asn Trp Thr Pro Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp1 5 10 15Arg Ser Glu Leu202109221120212PRT213C型肝炎病毒40092Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr1 5 10 15Gln Trp Gln Val20210932119212PRT213C型肝炎病毒40093Tyr Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu
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Thr Pro Thr Leu Ala2021011621120212PRT213C型肝炎病毒400116Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro1 5 10 15Thr Thr Thr Ile Arg2021011721120212PRT213C型肝炎病毒400117Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val1 5 10 15Gly Ala Ala Ala Phe2021011821120212PRT213C型肝炎病毒400118Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly1 5 10 15
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權利要求
1.一種治療用疫苗組合物，含有治療有效量的含有選自E1蛋白和E2蛋白的至少一種純化的重組HCV單個的或特異性寡聚的重組外被蛋白；並選擇性地含有可以藥用的佐劑的組合物。
2.如權利要求1的組合物，其中，所述重組HCV外被蛋白是由重組哺乳動物細胞產生的。
3.如權利要求1的組合物，其中，所述重組HCV外被蛋白是由重組酵母細胞生產的。
4.一種治療用疫苗組合物，含有治療有效量的含有至少一種下列E1和E2肽的組合物跨越核心/E1 V1區的181-200號胺基酸的E1-31(SEQ ID NO56)，跨越E1區的193-212號胺基酸的E1-33(SEQ ID NO57)，跨越E1 V2區的205-224號胺基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO58)，跨越E1 V2區的208-227號胺基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO59)，跨越E1區V1、C1、和V2區的192-228號胺基酸(含有表位B)的1bE1(SEQ ID NO53)，跨越E1區301-320號胺基酸的E1-51(SEQ ID NO66)，跨越E1 C4區的313-332號胺基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO67)，跨越E1區的325-344號胺基酸的E1-55(SEQ ID NO68)，跨越E2區的397-418號胺基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO72)，跨越E2區的409-428號胺基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO73)，跨越E2區的583-602號位置(表位A)的Env23或E2-23(SEQ IDNO86)，跨越E2區的595-614號位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO87)，跨越E2區的607-626號位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO88)，跨越E2區的547-586號位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO83)，跨越E2區的523-542號位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO82)，跨越E1區的192-211號位置的IGP1626(SEQ ID NO112)，跨越E1區的204-223號位置的IGP1627(SEQ ID NO113)，跨越E1區的192-211號位置的IGP1626(SEQ ID NO112)，跨越E1區的204-223號位置的IGP1627(SEQ ID NO113)，跨越E1區的216-235號位置的IGP1628(SEQ ID NO114)，跨越E1區的228-247號位置的IGP1629(SEQ ID NO115)，跨越E1區的240-259號位置的IGP1630(SEQ ID NO116)，跨越E1區的252-271號位置的IGP1631(SEQ ID NO117)，跨越E1區的264-283號位置的IGP1632(SEQ ID NO118)，跨越E1區的276-295號位置的IGP1633(SEQ ID NO119)，跨越E1區的288-307號位置的IGP1634(SEQ ID NO120)，跨越E1區的300-319號位置的IGP1635(SEQ ID NO121)，和跨越E1區的312-331號位置的IGP1636(SEQ ID NO122)。
5.一種治療感染了HCV的哺乳動物的方法，包括給予有效量的如權利要求1-4中任意一項的組合物，並選擇性地給予可以藥用的佐劑。
6.如權利要求5的方法，其中，所述哺乳動物是人。
7.一種含有選自E1蛋白和E2蛋白的至少一種純化的重組HCV重組外被蛋白，並選擇性地含有一種佐劑的組合物。
8.一種含有至少一種下列E1和E2肽的組合物跨越核心/E1 V1區的181-200號胺基酸的E1-31(SEQ ID NO56)，跨越E1區的193-212號胺基酸的E1-33(SEQ ID NO57)，跨越E1 V2區的205-224號胺基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO58)，跨越E1 V2區的208-227號胺基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO59)，跨越E1區V1、C1、和V2區的192-228號胺基酸(含有表位B)的1bE1(SEQ ID NO53)，跨越E1區301-320號胺基酸的E1-51(SEQ ID NO66)，跨越E1C4區的313-332號胺基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO67)，跨越E1區的325-344號胺基酸的E1-55(SEQ ID NO68)，跨越E2區的397-418號胺基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO72)，跨越E2區的409-428號胺基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO73)，跨越E2區的583-602號位置(表位A)的Env23或E2-23(SEQ IDNO86)，跨越E2區的595-614號位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO87)，跨越E2區的607-626號位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO88)，跨越E2區的547-586號位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO83)，跨越E2區的523-542號位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO82)，跨越E1區的192-211號位置的IGP1626(SEQ ID NO112)，跨越E1區的204-223號位置的IGP1627(SEQ ID NO113)，跨越E1區的192-211號位置的IGP1626(SEQ ID NO112)，跨越E1區的204-223號位置的IGP1627(SEQ ID NO113)，跨越E1區的216-235號位置的IGP1628(SEQ ID NO114)，跨越E1區的228-247號位置的IGP1629(SEQ ID NO115)，跨越E1區的240-259號位置的IGP1630(SEQ ID NO116)，跨越E1區的252-271號位置的IGP1631(SEQ ID NO117)，跨越E1區的264-283號位置的IGP1632(SEQ ID NO118)，跨越E1區的276-295號位置的IGP1633(SEQ ID NO119)，跨越E1區的288-307號位置的IGP1634(SEQ ID NO120)，跨越E1區的300-319號位置的IGP1635(SEQ ID NO121)，和跨越E1區的312-331號位置的IGP1636(SEQ ID NO122)。
9.一種用於誘導HCV特異性抗體的治療用組合物，含有治療有效量的含有由純化的重組HCV單個的或特異性寡聚的重組E1或E2蛋白形成的E1/E2複合物；並選擇性地含有可以藥用的佐劑的組合物。
10.如權利要求9的組合物，其中，所述重組HCV外被蛋白是由重組哺乳動物細胞生產的。
11.如權利要求9的組合物，其中，所述重組HCV外被蛋白是由重組酵母細胞生產的。
12.一種治療感染了HCV的哺乳動物的方法，包括給予有效量的如權利要求9-11中任意一項的組合物，並選擇性地給予可以藥用的佐劑。
13.如權利要求12的方法，其中，所述哺乳動物是人。
14.一種用於誘導HCV特異性抗體的藥用組合物，含有治療有效量的含有選自E1蛋白和E2蛋白的至少一種純化的重組HCV單個的或特異性寡聚的重組外被蛋白；並選擇性地含有可以藥用的佐劑的組合物。
全文摘要
本發明涉及一種用於純化選自E1和/或E2和/或E1/E2的HCV單個的或特異性寡聚外被蛋白的方法，其特徵在於，在為了分離所述重組表達的蛋白而裂解轉化過的宿主細胞時，用一種二硫鍵裂解劑進行二硫鍵裂解或還原的步驟。本發明還涉及一種通過該方法所分離的組合物。本發明還涉及所述組合物的診斷和治療用途。另外，本發明涉及將HCV E1蛋白和肽用於預測和監測HCV治療的臨床效果和/或臨床結果的用途。
文檔編號C07K14/18GK1547588SQ02800609
公開日2004年11月17日 申請日期2002年1月11日 優先權日2001年1月11日
發明者G·梅爾藤斯, F·波斯曼, E·德普, G 梅爾藤斯, 孤 申請人:基因創新有限公司