因子viii組合物及其製備和使用方法
2023-08-13 05:00:41
因子viii組合物及其製備和使用方法
【專利摘要】本發明涉及包含連接於延伸重組多肽(XTEN)的因子VIII凝血因子的組合物、編碼所述組合物的分離的核酸以及含有所述分離的核酸的載體和宿主細胞、以及製備所述組合物和使用所述組合物治療因子VIII相關疾病、病症和病狀的方法。
【專利說明】因子Vl I I組合物及其製備和使用方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年2月15日提交的美國臨時申請序列號61/599, 400的優先權， 所述申請以引用的方式併入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請含有已通過EFS-Web以ASCII格式提交且據此以引用的方式整體併入本 文的序列表。創建於2012年7月11日的所述ASCII拷貝命名為32887346. txt且大小為 13, 344, 768 字節。
[0005] 發明背景
[0006] 因子VIII是內源性凝血級聯路徑的一種重要組分。在循環中，因子VIII主要與 血管性血友病因子（von Willebrand factor)複合。在由凝血酶（因子IIa)活化後，它自 複合物解離以與因子IXa在內源性凝血級聯中相互作用，此又會活化因子X。一旦自血管 性血友病因子複合物移除，活化的因子VIII即由活化的蛋白質C (APC)、因子Xa及因子IXa 蛋白水解失活，且自血流快速清除。當與正常血管性血友病因子蛋白複合時，因子VIII的 半衰期是約12小時，而在不存在血管性血友病因子的情況下，因子VIII的半衰期降低至2 小時（Tuddenham EG 等，Br J Haematol. (1982) 52 (2): 259-267)。
[0007] 在血友病中，血液凝結受缺乏某些血漿凝血因子幹擾。甲型血友病是一種因子 VIII缺乏症，且是一種佔血友病病例的80%的隱性性連鎖X染色體病症。管理甲型血友病 的護理標準是用重組因子VIII濃縮物進行的補充療法。患有重度甲型血友病的受試者具 有低於正常值1-2%的循環促凝血因子VIII水平，且通常採用目的在於保持在各劑量之間 因子VIII高於1 %的防治性療法，此可通常通過一周給予因子VIII兩至三次來達成。患有 中等重度血友病（因子VIII水平是正常值的2-5%)的人佔25-30%的血友病事件且在輕 微創傷之後顯現流血。患有輕度甲型血友病（因子VIII水平是正常值的5-40%)的人佔 全部血友病事件的15-20%，且僅在重大創傷或手術之後發展流血。
[0008] 外源供應的因子VIII的體內活性受限於蛋白質半衰期較短與結合因子VIII且減 弱或破壞止血功能的抑制劑兩者。
[0009] 多達30%的接受外源供應的因子VIII的甲型血友病患者對因子VIII發動IgG 免疫反應（Towfighi，F.等 Comparative measurement of anti-factor VIII antibody by Bethesda assay and ELISA reveals restricted isotype profile and epitope specificity. Acta Haematol (2005) 114:84-90)，此可導致完全抑制它的促凝血活性 和 / 或促進因子 VIII 更快速清除（Bri5t E 等 High titer inhibitors in severe haemophilia A. A meta-analysis based on eight long-term follow-up studies concerning inhibitors associated with crude or intermediate purity factor VIII products. Throm.Haemost. (1994)72:162-164)。稱為 FVIII 抑制劑的 IgG 抗體主要針 對 A2、A3 及 C2 結構域（Scandella D 等 Localization of epitopes for human factor VIII inhibitor antibodies by immunoblotting and antibody neutralization. Blood(1989) 74:1618-1626)，但也可針對A1、B及Cl結構域來產生。因此，用於具有FVIII 抑制劑的患者的治療選項是有限的。
[0010] 通常靜脈內給予如因子VIII的大型蛋白質以使藥劑在血流中直接可用。先前已 證明肌肉內注射的未修飾因子VIII產生的最大循環水平僅為正常血漿水平的I. 4% (Pool 等，Ineffectiveness of Intramuscularly Injected Factor VIII Concentrate in Two Hemophilic Patients. New England J. Medicine (1966) 275 (10): 547-548)。可除通過靜脈 內途徑以外施用的製劑將大大簡化它們的使用，增加安全性，且導致大量成本節約。
[0011] 對治療性蛋白質的化學修飾可改進它的體內清除速率及隨後血清半衰期。常見修 飾的一個實例是添加聚乙二醇（PEG)部分，其通常通過PEG上的醛或N-羥基丁二醯亞胺 (NHS)基團與胺基團（例如賴氨酸側鏈或N末端）反應來偶聯於蛋白質。然而，綴合步驟 可導致形成需要提取、純化和/或其它進一步過程的異質產物混合物，所述所有過程都不 可避免地影響產物產率及質量控制。此外，如果在凝血因子的結合位點附近的胺基酸側鏈 通過聚乙二醇化過程而變得被修飾，那麼凝血因子的藥理學功能可受阻礙。其它方法包括 使Fc結構域基因融合於治療性蛋白質，此會增加治療性蛋白質的尺寸，因此降低通過腎進 行清除的速率。在一些情況下，Fc結構域賦予結合FcRn受體，且通過FcRn受體自溶酶體 再循環的能力，從而導致藥代動力學半衰期增加。不幸的是，Fc結構域在重組表達期間不 高效摺疊，且傾向於形成稱為包涵體的不溶性沉澱。這些包涵體必須被溶解且功能性蛋白 質必須自錯誤摺疊的聚集體復性，此為一種耗時、低效且昂貴的過程。
[0012] 發明概述
[0013] 本發明涉及新型凝血因子VIII融合蛋白組合物及其用途。具體來說，本文提供的 組合物特別用於治療或改善與甲型血友病、因子VIII缺乏症、流血性病症和凝血病變相關 的病狀。在一方面，本發明提供包含因子VIII (FVIII)和一個或多個延伸重組多肽（XTEN) 的分離的融合蛋白的組合物，其中所述融合蛋白展現促凝血活性。適用於構建所述融合蛋 白的主題XTEN通常是具有非重複序列和非結構化構象的多肽。在一個實施方案中，一個或 多個XTEN連接於選自天然人因子VIII、因子VIII B結構域缺失序列（"FVIII BDD"）及其 序列變體（全部前述各者總稱為"?￥111"或"0?"）的凝血因子？￥111("0?"），從而產生重 組因子VIII-XTEN融合蛋白（"CFXTEN"）。CFXTEN的因子VIII多肽組分包含Al結構域、 A2結構域、Cl結構域、C2結構域和任選B結構域或其部分。在一些實施方案中，通過描繪以 上提及的結構域以包含酸性al、a2和a3間隔子來進一步表徵FVIII。在另一實施方案中， 本公開涉及包含融合蛋白的藥物組合物及其在用於治療因子VIII相關病狀的方法和方案 中的用途。CFXTEN組合物相較於未連接於XTEN的FVIII具有增強的藥代動力學和藥理學 性質，此可允許更便利的給藥和改進功效。
[0014] 在第一方面，本發明涉及包含因子VIII多肽和一個或多個連接於所述因子VIII 的延伸重組多肽（XTEN)的重組因子VIII融合蛋白。在一些實施方案中，本發明提供包含 因子VIII多肽和至少一個延伸重組多肽（XTEN)的重組因子VIII融合蛋白，其中所述因子 VIII多肽包含含有al酸性間隔子區域的Al結構域、含有a2酸性間隔子區域的A2結構域、 含有a3酸性間隔子區域的A3結構域、Cl結構域、C2結構域和任選B結構域的全部或一部 分，且其中所述至少一個XTEN在以下各處連接於所述因子VIII多肽：（i)所述因子VIII 多肽的C末端；（ii)如果存在B結構域的全部或一部分，那麼在所述因子VIII多肽的B結 構域內；（iii)在所述因子VIII多肽的所述Al結構域內；（iv)在所述因子VIII多肽的所 述A2結構域內；(V)在所述因子VIII多肽的所述A3結構域內；(vi)在所述因子VIII多 肽的所述Cl結構域內；(vii)在所述因子VIII多肽的所述C2結構域內；(viii)在所述因 子VIII多肽的N末端處，或（ix)在所述因子VIII多肽的兩個結構域之間，其中相較於未 連接於XTEN的相應因子VIII，當通過體外凝血測定進行測量時，所述融合蛋白保留至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400% 或 500% 的 促凝血活性。在一個實施方案中，在前述重組因子VIII融合蛋白中，至少一個XTEN在於 選自表5、表6、表7、表8和表9的位點的1至6個胺基酸處或內的位點處連接於所述因子 VIII多肽。在其它實施方案中，本發明提供包含因子VIII多肽和至少第一延伸重組多肽 (XTEN)的重組因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽包含含有al酸性間隔子區域的 Al結構域、含有a2酸性間隔子區域的A2結構域、含有a3酸性間隔子區域的A3結構域、Cl 結構域、C2結構域和任選B結構域的全部或一部分，且其中所述第一 XTEN在以下各處連接 於所述因子VIII多肽：（i)所述因子VIII多肽的C末端；（ii)如果存在所述B結構域的全 部或一部分，那麼在所述因子VIII多肽的所述B結構域內；（iii)在所述因子VIII多肽的 所述Al結構域內；（iv)在所述因子VIII多肽的所述A2結構域內；(V)在所述因子VIII多 肽的所述A3結構域內；(vi)在所述因子VIII多肽的所述Cl結構域內；或（vii)在所述因 子VIII多肽的所述C2結構域內；且當相較於未連接於XTEN的相應因子VIII蛋白時，所述 融合蛋白（a)在本文所述的體外凝血測定或本領域中已知的其它此類測定中，保留至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400% 或 500% 促 凝血活性，和/或（b)在本文所述的體外結合測定或本領域中已知的其它此類測定中，展現 與抗因子VIII抗體的結合降低。在一個實施方案中，在前述重組因子VIII融合蛋白中，至 少一個XTEN在於選自表5、表6、表7、表8和表9的位點的1至6個胺基酸處或內的位點 處連接於所述因子VIII多肽。在其它實施方案中，本發明提供包含因子VIII多肽和至少 第一延伸重組多肽（XTEN)的重組因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽包含含有 al酸性間隔子區域的Al結構域、含有a2酸性間隔子區域的A2結構域、含有a3酸性間隔 子區域的A3結構域、Cl結構域、C2結構域和任選B結構域的全部或一部分，且其中所述第 一 XTEN在選自表6及表7的插入位點處連接於所述因子VIII多肽且其中相較於未連接於 XTEN的相應因子VIII蛋白，當通過本文所述的體外凝血測定或本領域中已知的其它此類 測定進行測量時，所述融合蛋白保留至少約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、 90%、100%、200%、300%、400%或500%的促凝血活性。未連接於XTEN的因子VIII蛋白 的非限制性實例包括天然FVIII、BDD FVIII、pBC100和來自表1的序列。在重組因子VIII 融合蛋白的另一實施方案中，當最優比對時，因子VIII多肽與選自由以下組成的組的序列 具有至少約80%序列同一性、或約90%、或約91 %、或約92%、或約93%、或約94%、或約 95%、或約96%、或約97%、或約98%或約99%至約100%序列同一性：表1的序列、圖3 中描繪的序列和圖4中描繪的序列。在另一實施方案中，融合蛋白包含至少另一在所述因 子VIII多肽的C末端處或在所述因子VIII多肽的B結構域內連接於所述因子VIII多肽 或任選置換所述因子VIII多肽的B結構域的XTEN。在一特定實施方案中，融合蛋白包含至 少一個位於所述因子VIII多肽的B結構域內或任選置換所述因子VIII多肽的B結構域的 XTEN序列。在另一特定實施方案中，融合蛋白包含至少一個在所述因子VIII多肽的C末端 處連接於所述因子VIII多肽的XTEN序列。在一個實施方案中，重組因子VIII融合蛋白包 含人因子VIII的B結構域缺失的變體，其中關於如圖3中闡述的全長人因子VIII序列，所 述B結構域缺失自在約胺基酸殘基編號741至約750處的第一位置開始且在於胺基酸殘基 編號1635至約1648處的第二位置處結束。在另一實施方案中，重組因子VIII融合蛋白包 含在所述因子VIII多肽的C末端處連接於所述因子VIII多肽的第一 XTEN序列，和在所述 因子VIII多肽的B結構域內或置換所述因子VIII多肽的B結構域的至少第二XTEN，其中 關於如圖3中闡述的全長人因子VIII序列，所述第二XTEN連接於約胺基酸殘基編號741 至約750的C末端和胺基酸殘基編號1635至約1648的N末端，其中所述XTEN的累積長 度是至少約100個胺基酸殘基。在一個實施方案中，在前述融合蛋白中，第二XTEN在N745 至P1640之間、或在S743至Q1638之間、或在P747至V1642之間、或在N745與Q1656之 間、或在N745與S1657之間、或在N745與T1667之間、或在N745與Q1686之間、或在R747 與V1642之間、或在T751與T1667之間連接因子VIII胺基酸。在一個實施方案中，重組 因子VIII融合蛋白包含當最優比對時，相較於選自表21的具有類似長度的序列具有至少 約80%序列同一性、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少 約94%、或至少約95 %、或至少約96 %、或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 %至約 100%序列同一性的序列。在另一實施方案中，重組因子VIII融合蛋白包含至少第二XTEN、 任選第三XTEN、任選第四XTEN、任選第五XTEN和任選第六XTEN，其中所述第二、第三、第四、 第五或第六XTEN各自在選自由以下組成的組的第二、第三、第四、第五或第六位點處連接 於所述因子VIII多肽：來自表5、表6、表7、表8和表9的插入位點；在成熟因子VIII的氨 基酸殘基 32、220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910的6個氨 基酸內的位置；在所述因子VIII多肽的任何兩個鄰近結構域之間的位置，其中所述兩個鄰 近結構域選自由Al和A2結構域、A2和B結構域、B和A3結構域、A3和Cl結構域、以及Cl 和C2結構域組成的組；在所述因子VIII多肽的B結構域內的位置，其中所述第二XTEN連接 於天然因子VIII序列的約胺基酸殘基編號741至約750的C末端和胺基酸殘基編號1635 至約1648的N末端；和所述因子VIII多肽的C末端。在一個實施方案中，第一 XTEN與第 二XTEN相隔至少10個胺基酸、至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、至少200個胺基酸、 至少300個胺基酸或至少400個胺基酸。在包含至少第二XTEN、任選第三XTEN、任選第四 XTEN、任選第五XTEN和任選第六XTEN的重組因子VIII融合蛋白的一個實施方案中，當最 優比對時，各XTEN相較於選自由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列組成的組的 具有類似長度的XTEN，具有至少約80%序列同一性、或至少約90%、或至少約91 %、或至少 約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或 至少約98%、或至少約99%、或約100%序列同一性。在重組因子VIII融合蛋白的另一實 施方案中，所述重組因子VIII融合蛋白包含至少第二XTEN、任選第三XTEN、任選第四XTEN、 任選第五XTEN和任選第六XTEN。在優選實施方案中，當向受試者施用時，重組因子VIII融 合蛋白展現終末半衰期至少約3小時、或4小時、或6小時、或12小時、或13小時、或14小 時、或16小時、或24小時、或48小時、或72小時、或96小時、或120小時、或144小時、或7 天、或14天、或21天，其中所述受試者選自人和因子VIII/血管性血友病因子雙重敲除小 鼠。另外，在這個段落的實施方案中，相較於未連接於XTEN的相應因子VIII，融合蛋白展 現與抗因子VIII抗體的結合降低或保留的促凝血活性更大或兩者。在一個實施方案中，當 各自通過體外凝血測定加以測定時，相較於未連接於XTEN的相應因子VIII，在抗FVIII抗 體存在下，重組因子VIII融合蛋白的促凝血活性大至少30 %、或40 %、50%、80%、100%、 200%、300%、400%或500%。在一個實施方案中，使用畢提斯達（Bethesda)測定，利用選 自由表10的抗體和來自具有因子VIII抑制劑的甲型血友病患者的多克隆抗體組成的組的 抗因子VIII抗體測定融合蛋白與抗因子VIII抗體的降低的結合，其中融合蛋白的結合降 低和促凝血活性保留是由相較於未連接於XTEN的因子VIII的畢提斯達效價，融合蛋白的 畢提斯達效價降低至少約2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、100或200個畢提斯 達單位所證明。
[0015] 在一個實施方案中，重組因子VIII融合蛋白可例如包含一個或多個XTEN，其中當 最優比對時，所述XTEN相較於一個或多個選自表4、表13、表14、表15、表16和表17的具有 類似長度的XTEN具有至少約80 %序列同一性、或約90 %、或約91 %、或約92 %、或約93 %、 或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%或約99%至約100%序列同一性。
[0016] 在另一方面，本發明涉及包含呈特定N末端至C末端構型的FVIII和一個或多個 XTEN的重組因子VIII融合蛋白。在CFXTEN組合物的一個實施方案中，本發明提供一種式 I的重組因子VIII融合蛋白：
[0017] (XTEN) X-CF- (XTEN) y I
[0018] 其中就各次出現獨立而言，CF是如本文定義的因子VIII，包括與來自表1的序列 具有至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約 98%、或至少約99%或100%序列同一性的序列；X是0或1且y是0或1，其中x+y彡1 ;且 XTEN是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限於與表4中闡述的序列具有至少約80%、 或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約 99%或100%序列同一性的序列。因此，CFXTEN融合組合物可具有XTEN-CF、XTEN-CF-XTEN 或CF-XTEN構型。
[0019] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式II的重組因子VIII融合 蛋白：
[0020] (XTEN) x- (S) x- (CF) - (XTEN) y II
[0021] 其中就各次出現獨立而言，CF是如本文定義的因子VIII，包括與表1中闡述的序 列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少 約98%、或至少約99%或100%序列同一性的序列；S是具有1個至約50個之間的胺基酸 殘基的可任選包括可與限制位點相容的裂解序列或胺基酸的間隔子序列；X是〇或1且y 是0或1，其中x+y彡1 ;且XTEN是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限於與表4中闡 述的序列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、 或至少約98%、或至少約99%或100%序列同一性的序列。
[0022] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種重組因子VIII融合蛋白，其 中所述融合蛋白具有式III :
[0023] (XTEN) x- (S) x- (CF) - (S) y- (XTEN) y III
[0024] 其中就各次出現獨立而言，CF是如本文定義的因子VIII，包括與表I中闡述的序 列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少 約98%、或至少約99%或100%序列同一性的序列；S是具有1個至約50個之間的胺基酸 殘基的可任選包括可與限制位點相容的裂解序列或胺基酸的間隔子序列；X是〇或1且y 是O或1，其中x+y彡I ;且XTEN是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限於與表4中闡 述的序列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、 或至少約98%、或至少約99%或100%序列同一性的序列。
[0025] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式IV的重組因子VIII融合 蛋白：
[0026] (Al) - (XTEN) u- (A2) - (XTEN) v- (B) - (XTEN) w- (A3) - (XTEN) x- (Cl) - (XTEN) y- (C2)-(XTEN) JV
[0027] 其中就各次出現獨立而言，Al是FVIII的Al結構域;A2是FVIII的A2結構域； A3是FVIII的A3結構域；B是FVIII的B結構域，其可為所述B結構域的片段或剪接變體； Cl是FVIII的Cl結構域；C2是FVIII的C2結構域；v是0或I 是0或I ;x是0或I ;y 是〇或I ;y是〇或1，前提是u+v+x+y+z彡1 ;且XTEN是如本文所述的延伸重組多肽，包括 但不限於與表4中闡述的序列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約 96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%或100%序列同一性的序列。
[0028] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式V的重組因子VIII融合 蛋白：
[0029] (XTEN) t- (S) a- (Al) - (S) b- (XTEN) a- (S) b- (A2) - (S) c- (XTEN) v- (S) c- (B) - (S) d- (XTEN) w- (S) d- (A3) - (S) e- (XTEN) x- (S) e- (CI) - (S) f- (XTEN) y- (S) f- (C2) - (S) g- (XTEN) z V
[0030] 其中就各次出現獨立而言，Al是FVIII的Al結構域;A2是FVIII的A2結構域;A3 是FVIII的A3結構域；B是FVIII的B結構域，其可為所述B結構域的片段或剪接變體；Cl 是FVIII的Cl結構域；C2是FVIII的C2結構域；S是具有1個至約50個之間的胺基酸殘 基的可任選包括可與限制位點相容的裂解序列或胺基酸的間隔子序列；a是0或I ;b是0或 1;(：是0或1;(1是0或1;6是0或1汀是0或1出是0或14是0或1 ;11是0或1;￥是 〇或I ;W是0或l，x是0或I ;y是0或I ;z是0或1，前提是t+u+v+w+x+y+z彡1 ;且XTEN 是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限於與表4中闡述的序列具有至少約80%、或至 少約90 %、或至少約95 %、或至少約96 %、或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 %或 100%序列同一性的序列。在式V的另一實施方案中，間隔子序列是甘氨酸或選自表11和 12的序列。
[0031] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式VI的重組因子VIII融合 蛋白：
[0032] (XTEN) u- (S) a- (Al) - (S) b- (XTEN) v- (S) b- (A2) - (S) c- (XTEN) w- (S) c- (A3) - (S) d- (XTEN) x- (S) d- (Cl) - (S) c- (XTEN) y- (S) c- (C2) - (S) f- (XTEN) z VI
[0033] 其中就各次出現獨立而言，Al是FVIII的Al結構域;A2是FVIII的A2結構域;A3 是FVIII的A3結構域；Cl是FVIII的Cl結構域；C2是FVIII的C2結構域；S是具有1個至 約50個之間的胺基酸殘基的可任選包括可與限制位點相容的裂解序列或胺基酸的間隔子 序列；a是0或l;b是0或l;c是0或l;d是0或l;e是0或l;f是0或l;u是0或l;v 是0或I ;w是0或l，x是0或I ;y是0或I ;z是0或1，前提是u+v+w+x+y+z彡1 ;且XTEN 是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限於與表4中闡述的序列具有至少約80%、或至 少約90 %、或至少約95 %、或至少約96 %、或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 %或 100%序列同一性的序列。在式V的另一實施方案中，間隔子序列是甘氨酸或選自表11和 12的序列。
[0034] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式VII的重組因子VIII融 合蛋白：
[0035] (SP)-(XTEN)x-(CS)x-(S) x-( FV III_l-745)-(S)y-(XTEN)y-(S) y- (FVII I_1640-2332) - (S) z- (CS) z- (XTEN) z VII
[0036] 其中就各次出現獨立而言，SP是信號肽，優選具有序列MQIELSTCFFLCLLRFCFS (SEQ ID NO :1611)，CS是表12中所列的裂解序列，S是具有1個至約50個之間的胺基酸殘基的 可任選包括可與限制位點相容的胺基酸的間隔子序列，"FVIII_l-745"是因子FVIII的殘 基 1-745 且"FVIII_1640-2332"是 FVIII 的殘基 1640-2332，x 是 0 或 l，y 是 0 或 1，且 z 是 0或1，其中x+y+z > 2 ;且XTEN是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限於與表4中闡 述的序列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、 或至少約98%、或至少約99%或100%序列同一性的序列。在式VII的一個實施方案中，間 隔子序列是GPEGPS (SEQ ID NO :1612)。在式V的另一實施方案中，間隔子序列是甘氨酸或 選自表11和12的序列。
[0037] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式VIII重組因子VIII融合 蛋白：
[0038] (Al) - (S) a- (XTEN) v-⑶ a- (A2) - (BI)-⑶ b- (XTEN) w-⑶ b- (B2) - (A3) - (S) c- (XTEN) x- (S) c- (Cl) - (S) d- (XTEN) y- (S) d- (C2) - (S) e- (XTEN) z VIII
[0039] 其中就各次出現獨立而言，Al是FVIII的Al結構域；A2是FVIII的A2結構域；BI 是B結構域的可具有FVIII的殘基741至743-750或者FVIII的約殘基741至約殘基745 的片段；B2是B結構域的可具有FVIII的殘基1635-1686至1689或者FVIII的約殘基1640 至約殘基1689的片段；A3是FVIII的A3結構域；Cl是FVIII的Cl結構域；C2是FVIII的 C2結構域；S是具有1個至約50個之間的胺基酸殘基的可任選包括可與限制位點相容的裂 解序列或胺基酸的間隔子序列；a是0或l;b是0或l;c是0或l;d是0或l;e是0或1; f是0或l;u是0或l;v是0或l;w是0或l，x是0或l;y是0或I ;z是0或1，前提是 u+v+w+x+y+z彡1 ;且XTEN是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限於與表4中闡述的序 列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少 約98%、或至少約99%或100%序列同一性的序列。在式VIII的一個實施方案中，間隔子 序列是GPEGPS (SEQ ID NO: 1612)。在式V的另一實施方案中，間隔子序列是甘氨酸或選自 表11和12的序列。
[0040] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式IX的重組因子VIII融合 蛋白：
[0041] (AIn) - (S) a- (XTEN) t- (S) b- (Alc) - (A2N) - (S) c- (XTEN) u- (S) d- (A2C) - (Bn) - (S) e- (XTEN) v- (S) f- (Bc) - (A3N) - (S) g- (XTEN) w- (S) b- (A3C) - (C1N) - (S)廠（XTEN) x- (S) 廠（Clc) - (C2N)-⑶ k- (XTEN) y-⑶ f (C2c)-⑶ m- (XTEN) JX
[0042] 其中就各次出現獨立而言，八^是八丨結構域的自至少殘基編號1(相對於天然成熟 FVIII加以編號）至至多殘基編號371的片段，A1。是Al結構域的自至少殘基編號2至至 多殘基編號372的片段，前提是所述AI n片段的序列在所述Al。片段中不重複;A2 1<是A2結 構域的自至少殘基編號373至至多殘基編號739的片段，A2。是A2結構域的自至少殘基編 號374至至多殘基編號740的片段，前提是所述A2N片段的序列在所述A2。片段中不重複； 81<是B結構域的自至少殘基編號741至至多殘基編號1647的片段，B。是B結構域的自至少 殘基編號742至至多殘基編號1648的片段，前提是所述B n片段的序列在所述B。片段中不 重複；八31^是A3結構域的自至少殘基編號1649至至多殘基編號2019的片段，A3。是A3結構 域的自至少殘基編號1650至至多殘基編號2019的片段，前提是所述A3 N片段的序列在所述 A3。片段中不重複；Cl 1<是Cl結構域的自至少殘基編號2020至至多殘基編號2171的片段， C1。是Cl結構域的自至少殘基編號2021至至多殘基編號2172的片段，前提是所述Cl N片段 的序列在所述C1。片段中不重複；C2 1<是C2結構域的自至少殘基編號2173至至多殘基編號 2331的片段，C2。是C2結構域的自至少殘基編號2174至至多殘基編號2332片段，前提是所 述C2 N片段的序列在所述C2。片段中不重複；S是具有1個至約50個之間的胺基酸殘基的 可任選包括可與限制位點相容的裂解序列或胺基酸的間隔子序列；a是0或I ;b是0或I ;c 是0或l;d是0或l;e是0或l;f是0或l;g是0或l;h是0或l;i是0或l;j是0或 1冰是0或1;1是0或1;111是0或14是0或1 ;11是0或1;￥是0或1#是0或1，1是0 或l;y是〇或l;z是0或1，前提是t+u+v+w+x+y+z彡1 ;且XTEN是如本文所述的延伸重組 多肽，包括但不限於相較於一個或多個選自表4的具有類似長度的XTEN，具有至少約80% 序列同一性、或約90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、 或約97%、或約98%或約99%至約100%序列同一性的序列。在式IX的一個實施方案中， 間隔子序列是GPEGPS (SEQ ID NO: 1612)。在式V的另一實施方案中，間隔子序列是甘氨酸 或選自表11和12的序列。在式IX的另一實施方案中，Z是1。在式IX的融合蛋白的另一 實施方案中，V是1且關於如圖3中闡述的全長人因子VIII序列，XTEN連接於約胺基酸殘 基編號741至約750的C末端和胺基酸殘基編號1635至約1648的N末端。在式IX的融 合蛋白的另一實施方案中，t、u、v、w、x、y和z的總和等於2、3、4、5或6。在式IX的另一實 施方案中，t、u、v、w、X、y和z的總和等於2,且V是1且z是1。在式IX的融合蛋白的另 一實施方案中，t、u、v、w、X、y和z的總和等於3, V和z各自等於1，且t、u、w、X或y的任 一者是1。在式IX的另一實施方案中，t、u、v、w、x、y和z的總和等於4, V和w和z各自等 於1，且t、u、X或y的兩者是1。在式的IX融合蛋白的另一實施方案中，XTEN的累積長度 在約84個至約3000個胺基酸殘基之間。在式IX的另一實施方案中，至少一個XTEN是緊 靠對應於成熟天然人因子VIII中選自由以下組成的組的胺基酸的胺基酸的下遊插入：氨 基酸殘基編號 32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910。在式1父 的融合蛋白的另一實施方案中，各XTEN在選自表5、表6、表7、表8和表9的位點處連接於 所述融合蛋白。在式IX的融合蛋白的另一實施方案中，當最優比對時，各XTEN相較於選自 由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列組成的組的具有類似長度的XTEN具有至 少約80%、或約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至 少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或約100%序列 同一I"生。
[0043] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式X的第一重組因子VIII 多肽：
[0044] (Al)-al-(A2)-a2-[B] X
[0045] 和一種包含式XI的第二多肽：
[0046] a3-(A3)-(Cl)-(C2) XI
[0047] 其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以異二聚體形式存在；其中Al是因子 VIII的Al結構域；A2是因子VIII的A2結構域；[B]是因子VIII的B結構域、其片段或被 缺失;A3是因子VIII的A3結構域；Cl是因子VIII的Cl結構域；C2是因子VIII的C2結 構域；al、a2和a3是酸性間隔子區域；其中所述Al結構域包含XTEN容許環-I (Al-I)區域 和XTEN容許環-2(Α1-2)區域；其中所述A2結構域包含XTEN容許環-1(A2-1)區域和XTEN 容許環-2 (A2-2)區域；其中所述A3結構域包含XTEN容許環-I (A3-1)區域和XTEN容許 環-2(A3-2)區域；其中XTEN序列插入區域Al-l、Al-2、A2-l、A2-2、A3-l或A3-2的至少一 者中；且其中所述重組因子VIII蛋白展現促凝血活性。在異二聚體的一個實施方案中，第 一多肽和第二多肽形成包含式（Al) - al - (A2) - a2 - [B] - [a3] - (A3) - (Cl) - (C2)的 單一多肽鏈。在一個前述實施方案中，"融合"是指肽鍵。
[0048] 在CFXTEN組合物的另一實施方案中，本發明提供一種式X的第一重組因子VIII 多肽：
[0049] (Al)-al-(A2)-a2-[B] X
[0050] 和一種包含式XI的第二多肽：
[0051] a3-(A3)-(Cl)-(C2) XI
[0052] 其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以異二聚體形式存在；其中Al是因子 VIII的Al結構域;A2是因子VIII的A2結構域；[B]是因子VIII的B結構域、其片段或 被缺失;A3是因子VIII的A3結構域；Cl是因子VIII的Cl結構域；C2是因子VIII的C2 結構域；al、a2和a3是酸性間隔子區域；其中XTEN序列插入a3中；且其中所述重組因子 VIII蛋白展現促凝血活性。在異二聚體的一個實施方案中，第一多肽和第二多肽形成包含 式（Al) - al - (A2) - a2 - [B] - [a3] - (A3) - (Cl) - (C2)的單一多肽鏈。在一個前述實施 方案中，"融合"是指肽鍵。
[0053] 在前述式X和XI多肽的實施方案中，XTEN容許環包含在表面暴露的可撓性環結構 內，且其中根據以DSSP資料庫的登錄號2R7E儲存的成熟因子VIII的二級結構，Al-I位於 β鏈1與β鏈2之間，A1-2位於β鏈11與β鏈12之間，A2-1位於β鏈22與β鏈23 之間，Α2-2位於β鏈32與β鏈33之間，Α3-1位於β鏈38與β鏈39之間且Α3-2位 於β鏈45與β鏈46之間。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，包含Al-I的表面 暴露的可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸15至約胺基酸45的區域。 在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，Al-I對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸 18至約胺基酸41的區域。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，包含Α1-2的表面暴 露的可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸201至約胺基酸232的區域。 在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，Α1-2對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸 218至約胺基酸229的區域。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，包含Α2-1的表面暴 露的可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸395至約胺基酸421的區域。 在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，Α2-1對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸 397至約胺基酸418的區域。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，包含Α2-2的表面 暴露的可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸577至約胺基酸635的區 域。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，Α2-2對應於天然成熟人因子VIII中自約氨 基酸595至約胺基酸607的區域。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，包含A3-1的 表面暴露的可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸1705至約胺基酸1732 的區域。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，A3-1對應於天然成熟人因子VIII中自 約胺基酸1711至約胺基酸1725的區域。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，包含 A3-2的表面暴露的可撓性環結構對應於天然人成熟人因子VIII中自約胺基酸1884至約 胺基酸1917的區域。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，A3-2對應於天然成熟人因 子VIII中自約胺基酸1899至約胺基酸1911的區域。在前述式X和XI多肽的其它實施方 案中，XTEN序列插入區域41-131-2^2-1、42-2^3-1或43-2的至少兩者中。在前述式父 和XI多肽的其它實施方案中，XTEN序列是緊靠對應於成熟天然人因子VIII中選自由以下 組成的組的胺基酸的胺基酸的下遊插入：胺基酸殘基編號32、220、224、336、339、399、416、 603、1656、1711、1725、1905 和1910。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，另一XTEN 序列插入a3酸性間隔子區域中。在前述式X和XI多肽的其它實施方案中，另一 XTEN序列 插入緊靠對應於胺基酸1656的胺基酸的下遊的a3酸性間隔子中。在前述式X和XI多肽 的其它實施方案中，Al結構域包含XTEN容許環-I(Al-I)區域和XTEN容許環-2 (A1-2)區 域，其中A2結構域包含XTEN容許環-1(A2-1)區域和XTEN容許環-2(A2-2)區域，且其中 A3結構域包含XTEN容許環-I (A3-1)區域和XTEN容許環-2 (A3-2)區域，且其中另一 XTEN 序列插入區域41-131-2、42-132-2、43-1或43-2的至少一者中。在前述式乂和乂1多肽 的其它實施方案中，另一 XTEN序列是緊靠對應於成熟天然人因子VIII中選自由以下組成 的組的胺基酸的胺基酸的下遊插入：胺基酸殘基編號32、220、224、336、339、390、399、416、 603、1656、1711、1725、1905和1910。在式乂和乂1多肽的前述實施方案中，融合蛋白展現未 連接於XTEN的相應因子VIII的促凝血活性的至少約30%、40%、50%、60%、70%或80% 或90%，其中所述促凝血活性是通過體外凝血測定加以測定。
[0054] 在所有實施方案中，當在細胞培養基中表達且通過體外凝血測定加以測定時，多 肽可例如展現體外促凝血活性超過0. 5IU/ml或I. 0或1. 5或2. 0IU/ml。促凝血活性可通 過顯色測定、單級凝結測定（例如aPTT)或兩者測量。
[0055] 在一些實施方案中，其中重組因子VIII融合蛋白包含因子VIII以及至少第一和 第二XTEN，所述至少第一 XTEN與所述至少第二XTEN相隔至少10個胺基酸、至少50個氨基 酸、至少100個胺基酸、至少200個胺基酸、至少300個胺基酸或至少400個胺基酸。
[0056] 在優選實施方案中，重組因子VIII融合蛋白包含因子VIII以及至少第一 XTEN 和任選至少第二、或任選至少第三、或任選至少第四XTEN，所述融合蛋白相較於未連接於 XTEN的相應因子VIII展現與抗因子VIII抗體的結合降低。可體內或通過體外測定評估降 低的結合。在一個實施方案中，體外測定是ELISA測定，其中相較於未連接於XTEN的FVIII， 抗FVIII抗體與融合蛋白的結合降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或至少 約40 %或更多。在另一實施方案中，體外測定是畢提斯達測定，其中融合蛋白的結合降低是 由相較於未連接於XTEN的因子VIII的畢提斯達效價，融合蛋白的畢提斯達效價降低至少 約2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、100或200個畢提斯達單位所證明。在體外 測定中，抗因子VIII抗體選自表10的抗體和來自具有因子VIII抑制劑的甲型血友病患者 的多克隆抗體。在展現與因子VIII抑制劑抗體的結合降低的包含因子VIII以及至少第一 和第二XTEN的重組因子VIII融合蛋白的特定實施方案中，所述第一XTEN在所述因子VIII 多肽的C2結構域內連接於所述因子VIII多肽，且所述第二XTEN在所述因子VIII多肽的 Al或A2結構域內連接於所述因子VIII多肽，其中相較於未連接於XTEN的相應因子VIII， 所述融合蛋白展現與因子VIII抑制劑抗體的結合降低，其中所述因子VIII抑制劑抗體能 夠結合位於所述A1、A2或C2結構域內的表位，且此外，其中所述融合蛋白展現促凝血活性。 在前述融合蛋白的一個實施方案中，第二XTEN在因子VIII多肽的A2結構域內連接於所述 因子VIII多肽且因子VIII抑制劑抗體結合因子VIII多肽的A2結構域。在前述融合蛋白 的另一實施方案中，第二XTEN在因子VIII多肽的C2結構域內連接於所述因子VIII多肽且 因子VIII抑制劑抗體結合因子VIII多肽的C2結構域。相較於未連接於XTEN的相應因子 VIII，當通過ELISA測定加以測定時，抗因子VIII抗體與融合蛋白的結合降低至少約5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%，其中所述抗因子VIII抗體選自由表10中的抗 體和來自具有因子VIII抑制劑的甲型血友病受試者的多克隆抗體組成的組。前述融合蛋 白可進一步包含至少三個XTEN，其中至少第三XTEN在選自以下的位點處連接於因子VIII : 在B結構域內或置換B結構域、在C末端處、以及在選自表7或表9的插入位點的1、2、3、 4、5或6個胺基酸處或內。在與抗因子VIII抗體的結合降低的實施方案中，相較於未連接 於XTEN的相應因子VIII，當通過體外凝血測定（例如顯色或單級凝結測定）加以測定時， 融合蛋白在抗FVIII抗體存在下的促凝血活性大至少10%、20%、30%、40%、50%、80%、 100%、200%、300%、400%或 500%或更多。
[0057] 在所有實施方案中，融合蛋白的XTEN的特徵可例如在於XTEN包含至少36、或至 少42、或至少72、或至少96、或至少144、或至少288、或至少400、或至少500、或至少576、 或至少600、或至少700、或至少800、或至少864、或至少900、或至少1000、或至少2000至 約3000個胺基酸殘基或甚至更多殘基；甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、谷 氨酸（E)和脯氨酸⑵殘基的總和佔 XTEN的總胺基酸殘基的至少約80%、或至少約90%、 或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99% ;XTEN大致 上是非重複的以致（i)XTEN不含有三個相同連續胺基酸，除非胺基酸是絲氨酸；（ii)至少 約80%的XTEN序列由非重疊序列基序組成，所述序列基序各自包含約9至約14、或約12 個由四至六個選自甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、穀氨酸（E)和脯氨酸 (P)的胺基酸組成的胺基酸殘基，其中在各非重疊序列基序中，任何兩個連續胺基酸殘基 都不出現超過兩次；或（iii)XTEN序列的子序列計分小於10 ;XTEN具有大於90%、或大於 95%、或大於99%無規捲曲形成率（如通過GOR算法所確定）；XTEN具有小於2% α螺旋 和2% β摺疊（如通過Chou-Fasman算法所確定）；當通過ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法分析時，XTEN缺 乏預測的T細胞表位，其中關於通過所述算法進行所述預測的ΤΕΡΙΤ0ΡΕ閾值計分的閾值 是-9,且其中所述融合蛋白展現終末半衰期長於至少約12小時、或至少約24小時、或至 少約48小時、或至少約72小時、或至少約96小時、或至少約120小時、或至少約144小時、 或至少約21天或更長。在一個實施方案中，重組因子VIII融合蛋白包含可與另一 XTEN相 同或不同的至少第二、或至少第三、或至少第四ΧΤΕΝ。根據一種不同方法，當最優比對時， CFXTEN融合蛋白的至少一個、至少第二、或至少第三、或至少第四XTEN相較於一個或多個 選自表4、表13、表14、表15、表16和表17的具有類似長度的XTEN各自具有至少約80% 序列同一性、或約90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、 或約97%、或約98%或約99%至約100%序列同一性。在另一不同方法中，CFXTEN融合蛋 白的至少一個、至少第二、或至少第三、或至少第四XTEN相較於選自以下的序列各自具有 至少90%、或約91 %、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、 或約 98 %、或約 99 %至約 100 %序列同一'註：AE42_1、AE42_2、AE42_3、AG42_1、AG42_2、 AG42_3、AG42_4、AE144_1 A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、 AE144_5A、AE144_6B、AG144_1、AG144_2、AG144_A、AG144_B、AG144_C、AG144_F、AG144_3、 AG144_4、AE288_1、AE288_2、AG288_1 和 AG288_2。
[0058] 在一個實施方案中，CFXTEN重組因子VIII融合蛋白的因子VIII組分包含一個、兩 個或三個選自相對於成熟人因子VIII編號的殘基R1648、Y1680和R1689的胺基酸取代，其 中所述取代選自丙氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸。所述取代的非限制性實例包括R1648A、Y1680F 和 R1689A。
[0059] 在另一實施方案中，當通過尺寸排阻色譜或類似方法測量時，CFXTEN融合蛋白展 現表觀分子量因子至少約1. 3、或至少約2、或至少約3、或至少約4、或至少約5、或至少約 6、或至少約7、或至少約8、或至少約9、或至少約10。
[0060] 在CFXTEN融合蛋白的一些實施方案中，一個或多個XTEN將通過一個或兩個各自 可由選自由因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶（kallikrein)、因子Vila、因子IXa、因子Xa、 因子 IIa(凝血酶）、彈性蛋白酶-2 (Elastase-2)、MMP-12、MMP13、MMP-17 和 MMP-20 組成的 組的哺乳動物蛋白酶裂解的裂解序列連接於FVIII，其中由所述哺乳動物蛋白酶在所述裂 解序列處進行的裂解使因子VIII序列自XTEN序列釋放，且其中釋放的因子VIII序列相較 於未裂解融合蛋白展現促凝血活性增加。在一個實施方案中，裂解序列可由因子XIa裂解。
[0061] 根據一種不同方法，CFXTEN融合蛋白包含至少三個位於因子VIII多肽的不同位 置處的XTEN，其中所述不同位置選自：在來自選自表5、表6、表7、表8和表9的位點的1至 6個胺基酸處或內的插入位置；在成熟因子VIII的胺基酸殘基32、220、224、336、339、390、 399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910的1至6個胺基酸處或內的位置；在因子￥111 序列中任何兩個鄰近結構域之間的位置，其中所述兩個鄰近結構域選自由Al和A2、A2和B、 B和A3、A3和Cl、以及Cl和C2組成的組；關於如圖3中闡述的全長人因子VIII序列，在 自在約胺基酸殘基編號741至約750處的第一位置開始且在於胺基酸殘基編號1635至約 1648處的第二位置處結束的內部B結構域缺失內的位置；和因子VIII序列的C末端，其中 多個XTEN的累積長度是至少約100至約3000個胺基酸殘基且其中融合蛋白相較於未連接 於XTEN的相應因子VIII保留至少約30%、或約40%、或約50%、或約60%、或約70%、或約 80%、或約90%的促凝血活性，其中促凝血活性是通過體外凝血測定加以測定。在一個前 述實施方案中，當向受試者施用時，融合蛋白相較於缺乏所述XTEN的相應因子VIII多肽展 現終末半衰期延長，其中當向受試者施用時，所述融合蛋白展現終末半衰期至少約3小時、 或4小時、或6小時、或12小時、或13小時、或14小時、或16小時、或24小時、或48小時、 或72小時、或96小時、或120小時、或144小時、或7天、或14天、或21天。在一個實施方 案中，受試者選自由人和因子VIII/血管性血友病因子雙重敲除小鼠組成的組。在一個前 述實施方案中，融合蛋白不包含選自GTPGSGTASSSP(SEQ ID N0:31)、GSSTPSGATGSP(SEQ ID N0:32)、GSSPSASTGTGP(SEQ ID N0:33)、GASPGTSSTGSP(SEQ ID N0:34)和
[0062] GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSEPATS GSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP (SEQ ID NO:59)的序列。在另一前述實施方案中，融合蛋白不含有由
[0063] GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSEPATS GSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP(SEQ ID N0:59)、
[0064] PGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGT SSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTAS SS(SEQ ID NO:71)或
[0065] PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPS GATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSST GSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGS STPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS(SEQ ID NO :80)組成的XTEN序列。
[0066] 在另一方面，本發明涉及相較於未連接於XTEN的FVIII具有增強的藥代動力學 性質，包括提高的參數的CFXTEN融合蛋白，其中所述增強的性質包括但不限於相較於未連 接於XTEN的FVIII，終末半衰期變長、曲線下面積變大、血液濃度保持在治療窗內的時間增 力口、導致血液濃度在治療窗內的連續劑量之間的時間增加、以及以IU計的可施用的劑量隨 時間降低，但仍然導致血液濃度高於為促凝血作用所需的閾值濃度。在一些實施方案中，當 向受試者施用時，CFXTEN融合蛋白相較於缺乏所述XTEN的相應因子VIII多肽展現終末半 衰期延長。受試者可為人或小鼠，如因子VIII/血管性血友病因子雙重敲除小鼠。在一個前 述實施方案中，當向受試者施用時，相較於未連接於XTEN的相應因子VIII，CFXTEN展現終 末半衰期長至少約2倍、或約3倍、或約4倍、或約5倍、或約10倍、或約20倍。在一個實 施方案中，當向受試者施用時，CFXTEN融合蛋白展現終末半衰期至少約3小時、或4小時、或 6小時、或12小時、或13小時、或14小時、或16小時、或24小時、或48小時、或72小時、或 96小時、或120小時、或144小時、或7天、或14天、或21天。在其它實施方案中，實施方案 的融合蛋白的增強的藥代動力學性質是相較於未連接於XTEN且以類似劑量向受試者施用 的相應FVIII，維持有需要的受試者中的促凝血融合蛋白的循環血液濃度高於0. 01IU/ml、 或(λ 05IU/ml、或(λ lIU/ml、或(λ 2IU/ml、或(λ 3IU/ml、或(λ 4IU/ml 或(λ 5IU/ml 的閾值濃 度持續的時期長至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、 或至少約8倍、或至少約10倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60倍的性質。半 衰期和高於閾值濃度花費的時間的增加允許相較於未連接於XTEN的相應FVIII，降低給藥 頻率以及降低向受試者施用的融合蛋白（以摩爾當量計）的量。在一個實施方案中，相較於 未連接於XTEN且使用類似劑量方案向受試者施用的相應FVIII，使用治療有效劑量方案向 受試者施用主題融合蛋白導致融合蛋白的血液水平的至少兩個連續Cmax峰值和/或Cmin 谷底值之間的時間增加至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至 少8倍、或至少10倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60倍或更高。
[0067] 在優選實施方案中，CFXTEN融合蛋白相較於未連接於XTEN的相應因子VIII保留 至少約30 %、或約40 %、或約50 %、或約60 %、或約70 %、或約80 %、或約90 %的促凝血活 性，其中促凝血活性是通過體外凝血測定，如但不限於顯色測定或單級或兩級凝結測定加 以測定。
[0068] 根據一種不同方法，本發明提供包含因子VIII多肽和至少一個延伸重組多肽 (XTEN)的重組因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽包含Al結構域、A2結構域、A3 結構域、Cl結構域、C2結構域和任選B結構域的全部或一部分，且其中所述至少一個XTEN 在選自殘基編號 18-32、或 40、或 211-224、或 336-403、或 599、或 745-1640、或 1656-1728、 或1796-1804、或1900-1912、或2171-2332的插入位點處連接於所述因子VIII多肽；且其 中所述融合蛋白相較於未連接於XTEN的相應因子VIII保留至少約30%、或約40%、或約 50%、或約60%、或約70%、或約80%、或約90%的促凝血活性。在一個前述實施方案中， 融合蛋白包含至少第二XTEN、或至少第三、或至少第四XTEN，其中所述XTEN在於選自表5、 表6、表7、表8和表9的位點的1至6個胺基酸處或內的位點處連接於因子VIII。在另一 實施方案中，本發明提供一種重組因子VIII融合蛋白，其進一步包含在選自表5、表6、表7、 表8、表9的插入位點處、在於來自圖8的一個或多個插入位置處的插入位置的N末端或C 末端側的6個胺基酸處或內、以及在一個或多個來自圖9的插入範圍內連接於所述FVIII 多肽的至少第二XTEN、或至少第三、或至少第四XTEN，其中至少兩個XTEN由具有至少100 至約400個胺基酸的胺基酸序列分隔。
[0069] 本發明提供CFXTEN，其中XTEN的XTEN半徑比率是至少2. 3或至少2. 5,且由具有 至少約20個胺基酸殘基、或至少約50、或至少約100、或至少約200、或至少約300、或至少 約400個胺基酸殘基的胺基酸序列分隔。在其它實施方案中，CFXTEN包含至少四個XTEN， 其中所述XTEN的XTEN半徑比率是至少2. 3、或至少2. 5、或至少2. 8，且其中四個XTEN中連 接於融合蛋白的至少三者由具有至少約20個胺基酸殘基、或至少約50、或至少約100、或至 少約200、或至少約300、或至少約400個胺基酸殘基的胺基酸序列分隔，且第四XTEN連接 在B結構域（或其片段）內或在C結構域（或其末端）內。
[0070] 在一些實施方案中，主題組合物被構造來相較於未連接於XTEN的相應FVIII， 對受試者中的清除受體具有降低的結合親和力。在一個實施方案中，CFXTEN融合蛋白展 現對FVIII的清除受體的結合親和力在未連接於XTEN的相應FVIII的結合親和力的約 0. 01% -30%、或約0. 1 %至約20%、或約1 %至約15%、或約2%至約10%的範圍內。在另 一實施方案中，相較於未連接於XTEN的相應FVIII，對清除受體的親和力降低的融合蛋白 的主動清除降低且半衰期相應增加長至少約2倍、或3倍、或至少4倍、或至少約5倍、或至 少約6倍、或至少約7倍、或至少約8倍、或至少約9倍、或至少約10倍、或至少約12倍、或 至少約15倍、或至少約17倍、或至少約20倍。
[0071] 在一實施方案中，本發明提供一種包含FVIII和一個或多個XTEN的重組因子VIII 融合蛋白，其中所述融合蛋白相較於未連接於XTEN的FVIII展現在生理條件下的溶解度增 加至少3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約7倍、或至少約8倍、或 至少約9倍、或至少約10倍、或至少約15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。
[0072] 在另一方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含本文所述的任何實施方案的融 合蛋白和藥學上可接受的載體。
[0073] 在另一實施方案中，本發明提供一種治療受試者的凝血病變的方法，其包括向所 述受試者施用包含凝結有效量的藥物組合物的組合物。在所述方法的一個實施方案中，在 所述施用之後，促凝血因子VIII的血液濃度維持在約0. 05、或1、或I. 5IU/ml或更高持續 至少所述施用之後48小時。在另一實施方案中，本發明提供一種使受試者的血液凝結的方 法，其包括使凝結有效量的藥物組合物與血液接觸。
[0074] 在另一實施方案中，本發明提供一種治療具有因子VIII的循環抑制劑的受試者 的凝血病變的方法，其包括向所述受試者施用包含治療有效量的CFXTEN的藥物組合物的 組合物，其中所述組合物相較於包含未連接於XTEN且使用類似量施用的相應因子VIII的 組合物展現在所述受試者中的促凝血活性更大。在所述方法的一個實施方案中，凝血病變 是甲型血友病。在另一實施方案中，凝血病變是創傷或手術或感染的結果。
[0075] 本發明提供一種治療受試者的流血事件的方法，其包括向所述受試者施用包含凝 結有效量的CFXTEN藥物組合物的組合物，其中所述凝結有效量的融合蛋白相較於未連接 於XTEN且使用類似量向所述受試者施用的相應因子VIII遏止流血事件持續的時期長至少 3倍、或至少4倍、或至少5倍。未連接於XTEN的相應因子VIII的非限制性實例包括天然 FVIII、表 1 的序列、BDD-FVIII 和 pCB0114FVIII。
[0076] 在另一實施方案中，本發明提供一種用於治療甲型血友病患者的醫藥方案的 CFXTEN重組因子VIII融合蛋白，所述方案包括包含CFXTEN融合蛋白的藥物組合物。在所 述醫藥方案的一個實施方案中，方案進一步包括確定為在甲型血友病患者中實現止血所需 的包含CFXTEN的藥物組合物的量的步驟。在另一實施方案中，用於治療甲型血友病受試者 的醫藥方案包括以有效量連續兩劑或更多劑向受試者施用藥物組合物，其中相較於未連接 於XTEN且使用類似劑量施用的因子VIII，所述施用導致至少一個、兩個或三個與甲型血友 病相關的參數較大改善至少10%、或20%、或30%、或40%、或50%、或60%、或70%、或 80%、或90%。改善的參數的非限制性實例包括促凝血FVIII的血液濃度、活化的部分凝 血酶原（aPTT)測定時間減少、單級或兩級凝結測定時間減少、流血事件的發作延遲、顯色 測定時間減少、流血測定時間減少、流血事件解決、或相對於天然FVIII的畢提斯達效價降 低。
[0077] 在另一方面，本發明提供編碼CFXTEN融合蛋白的任一實施方案的融合蛋白的分 離的核酸序列。在一個實施方案中，分離的核酸是編碼實施方案的CFXTEN融合蛋白的序列 的互補序列。在一個實施方案中，分離的核酸進一步包含編碼信號肽的序列，其中所述序列 是ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID N0:1613)或 其互補序列。在另一實施方案中，本發明提供一種包含編碼融合蛋白的核酸或其互補序列 的表達載體。在另一實施方案中，本發明提供一種包含前述表達載體的分離的宿主細胞。在 另一實施方案中，本發明提供一種產生任何實施方案的融合蛋白的方法，其包括提供包含 表達載體的宿主細胞；培養所述宿主細胞以實現所述融合蛋白的產生；以及回收所述融合 蛋白。
[0078] 在一個實施方案中，本發明提供一種分離的融合蛋白，其包含當最優比對時，相較 於選自表21的具有類似長度的序列具有至少約80 %序列同一性、或約90 %、或約91 %、或 約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%或約99%至約 100 %序列同一性的多肽。
[0079] 在另一實施方案中，本發明提供一種分離的核酸，其包含選自以下的多核苷酸序 列：(a)當最優比對時，相較於選自表21的具有類似長度的序列具有至少約80%序列同一 性、或約90%、或約91 %、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、 或約98%或約99%至約100%序列同一性的序列，或（b) (a)的多核苷酸的互補序列。在 另一實施方案中，分離的核酸包含連接於（a)的核酸的5'末端的序列ATGCAAATAGAGCTCTC CACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID N0:1613)或所述序列的連接於（b) 的3'末端的互補序列。
[0080] 明確涵蓋的是重組因子VIII融合蛋白可展現本文公開的性質的一者或多者或任 何組合。
[0081] 以引用的方式併入
[0082] 本說明書中提及的所有公布、專利和專利申請都以引用的方式併入本文，所述引 用的程度就如同已特定地和個別地指示將各個別公布、專利或專利申請以引用的方式併入 一般。
[0083] 附圖簡述
[0084] 本發明的特徵和優勢可通過參照以下詳細描述和闡述說明性實施方案的附圖加 以進一步說明。
[0085] 圖1顯示在加工和凝結期間的FVIII構造和結構域的空間排列的圖示，且意圖表 示天然FVIII與B結構域缺失的變體兩者。Al結構域在殘基1至372 (編號是相對於成熟 形式的FVIII序列NCBI蛋白質RefSeq NP_000123且涵蓋al殘基）的範圍內，A2結構域 在殘基373至740的範圍內，B結構域在殘基741至1648的範圍內，A3結構域在殘基1649 至2019 (涵蓋a3酸性區域）的範圍內，Cl結構域在2020至2172的範圍內，且C2結構域 在殘基2173至2332的範圍內。BDD變體包括在範圍741至1648之間的缺失，從而留下 一些剩餘殘基或不留下剩餘殘基，其中非限制性BDD剩餘序列是SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO: 1614)。圖IA顯示在加工之前單鏈FVIII的結構域構造。箭頭指示在殘基R372、R740、 R1648和R1689處的在加工和FVIII轉化成FVIIIa時被裂解的位點。圖IB顯示已通過在 R1648殘基處裂解加工成異二聚體的FVIII分子，其中A3結構域的a3酸性區域指示在A3 的N末端上。圖IC顯示通過在R372、R740和R1689殘基處裂解加工成FVIIIa異三聚體的 FVIII分子。
[0086] 圖2是凝血級聯的示意圖，其顯示通向共同路徑的內源性和外源性臂。
[0087] 圖3描繪成熟人因子VIII的胺基酸序列（SEQ ID NO: 1592)。
[0088] 圖4描繪缺失一部分B結構域的因子VIII序列（SEQ ID NO: 1593)。
[0089] 圖5說明FVIII連接於XTEN的CFXTEN構型的若干實例（XTEN顯示為粗波形線）。 在所有情況下，FVIII都可為FVIII的天然或BDD形式，或移除整個B結構域（包括天然裂 解位點）的單鏈形式。圖5A從左到右顯示單鏈因子VIII的三種變化形式，即XTEN連接於 N末端、C末端以及兩個XTEN連接於N末端和C末端。圖5B從左到右顯示成熟異二聚體 FVIII的六種變化形式，即XTEN連接於Al結構域的N末端；XTEN連接於C2結構域的C末 端；XTEN連接於Al結構域的N末端和C2結構域的C末端；XTEN連接於Al結構域的N末端 和A3結構域的N末端；XTEN連接於C2結構域的C末端和通過殘餘B結構域胺基酸連接於 A3結構域的N末端；以及XTEN連接於Al結構域的N末端、通過殘餘B結構域胺基酸連接 於A2結構域的C末端以及連接於C2結構域的C末端。圖5C從左到右顯示，單鏈因子VIII 的三種變化形式=XTEN連接於Al結構域的N末端，XTEN連接在Al結構域的表面環內以及 XTEN連接在A3結構域的表面環內；XTEN連接在A2結構域的表面環內，XTEN連接在C2結 構域的表面環內以及XTEN連接於C2結構域的C末端；XTEN連接於Al結構域的N末端和 在Cl結構域的表面環內以及連接於C結構域的C末端。圖ro從左到右顯示成熟異二聚體 FVIII的六種變化形式，即XTEN連接於Al結構域的N末端，XTEN連接在Al結構域的表面 環內以及XTEN連接在A3結構域的表面環內；XTEN連接在A2結構域的表面環內，和XTEN連 接在Cl結構域的表面環內以及XTEN連接於C2結構域的C末端；XTEN連接於Al結構域的 N末端，XTEN連接在Al結構域的表面環內，XTEN連接在A3結構域的表面環內以及XTEN連 接於C2結構域的C末端；XTEN連接於Al結構域的N末端，XTEN通過B結構域的殘餘氨基 酸連接於A3結構域的N末端以及XTEN連接在C2結構域的表面環內；XTEN連接在A2結構 域的表面環內，XTEN通過B結構域的殘餘胺基酸連接於A3結構域的N末端，XTEN連接在 Cl結構域的表面環內以及XTEN連接於C2結構域的C末端；以及XTEN連接在B結構域內或 BDD變體的殘餘B結構域殘基之間（且本發明也涵蓋以下變化形式：其中XTEN置換連接A2 和A3結構域的B結構域全部（包括所有天然裂解位點），從而產生單鏈形式的因子VIII)。 這個圖也包括其中一個或多個XTEN序列插入在B結構域內且所得融合物在細胞內加工期 間在一個或多個位點處（例如，在R1648位點處）被裂解的所有變化形式。
[0090] 圖6是XTEN插入在B結構域內以及連接於C2結構域的C末端的CFXTEN構建體 的圖形描繪，其說明XTEN的導致形成可覆蓋因子VIII鄰近於XTEN的部分的無規捲曲的非 結構化特徵。在下圖中，圖式描繪當XTEN呈無規捲曲時，它可採用產生會阻斷因子VIII抑 製劑抗體的結合的空間位阻的構象，所述抗體否則將對鄰近於XTEN插入位點的表位具有 親和力。
[0091] 圖7是對FVIII B結構域缺失序列進行的用以鑑定XTEN在FVIII序列內的插 入位點的各種分析的圖形描繪。A-H行的各者處於跨越FVIII BDD序列的Y軸值的任 意標度上以使低值表示對XTEN插入物的預測耐受性較高的區域，其中殘基編號在X軸 上。A行顯示結構域邊界；這行中的所有中斷都表示可能接受XTEN的邊界。B行顯示 外顯子邊界；即所述行中的各階躍都表示新外顯子。C行顯示由於在晶體中缺乏次序而 在X射線結構中不可見的區域。標記的D行表示使用相應程序FoldIndex以及RONN計 算的多個次序預測結果，所述FoldIndex見於全球資訊網站點bip. weizmann. ac. il/fldbin/ findex (2011 年2 月 23 日末次訪問）上（參見 Jaime Prilusky, Clifford E. Felder, Tzviya Zeev-Ben-Mordehai, Edwin Rydberg, Orna Man, Jacques S. Beckmann, Israel Silman 和 Joel L. Sussman, 2005, Bioinformatics based on the Kyte&Doolitlle algorithm),所 述RONN見於全球資訊網站點strubi. ox. ac. uk/R0NN(2011年2月23日末次訪問）上（參見 Yang，Z.R.，Thomson，R.，McMeil，P.和 Esnouf, R.M. (2005)R0NN: the bio-basis function neural network technique applied to the detection of natively disordered regions in proteins Bioinformatics 21:3369-3376)。E 和 F 行是基於可在 GenBank 中 獲得的來自11種哺乳動物的FVIII基因的多個序列比對加以計算。E行表示個別殘基的 保守性。F行表示FVIII的含3個胺基酸的區段的保守性。G和H行表示在11個哺乳動物 FVIII基因的多個序列比對中觀察到的間隙和插入。J行通過胺基酸編號列出基於組合以 上多個測量結果所獲得的XTEN插入點。
[0092] 圖8描繪使用圖8中描繪的信息且如實施例34的測定中所確認，在FVIII B結構 域缺失序列（SEQ ID NO: 1594)中鑑定為XTEN的活性插入點的位點。
[0093] 圖9描繪使用圖8和或實施例34中描繪的信息外加各插入點周圍的被視為適於 插入XTEN的一定跨度的胺基酸，在FVIII B結構域缺失序列（SEQ ID NO: 1595)中被鑑定 用於插入XTEN的位點的範圍。
[0094] 圖10是通過如對於圖7所述鑑定插入點，隨後使用分子生物學技術在各個插入點 處插入單一 XTEN(黑色棒條）來產生的CFXTEN文庫的裝配的示意圖。表達並回收構建體， 接著評估FVIII活性和藥代動力學性質以鑑定導致性質增強的那些CFXTEN構型。
[0095] 圖11是CFXTEN組分文庫的裝配的示意圖，其中單一或連接於各種長度的 XTEN(黑色棒條）的FVIII BDD結構域的區段以組合方式裝配成編碼CFXTEN的基因的 文庫，可接著評估所述文庫的FVIII活性和藥代動力學性質以鑑定導致性質增強的那些 CFXTEN 構型。
[0096] 圖12說明具有XTEN(顯示為粗波形線）的CFXTEN構型的若干實例，其中某些XTEN 可通過插入可由促凝血蛋白酶裂解的裂解序列（由黑色三角指示）加以釋放。圖12A說明 具有兩個末端可釋放XTEN的scFVIII。圖12B說明與圖12A相同的構型，但具有連接A3和 Cl結構域的額外非可釋放XTEN。圖12C說明具有兩個末端可釋放XTEN的成熟異二聚體 FVIII。圖12D說明與IOC相同的構型，但具有連接A3和Cl結構域的額外非可釋放XTEN。
[0097] 圖13是裝配、產生和評估XTEN中的代表性步驟的示意流程圖。
[0098] 圖14是裝配編碼融合蛋白的CFXTEN多核苷酸構建體中的代表性步驟的示意流程 圖。個別寡核苷酸501退火成序列基序502 (如含12個胺基酸的基序（" 12-mer")），其被 連接於來自文庫的其它序列基序以產生涵蓋所需長度的XTEN 504的集合，且連接於較小 濃度的含有BbsI和KpnI限制位點的寡聚物503。將連接產物的所得集合進行凝膠純化且 切割具有所需長度的XTEN的條帶，從而產生具有封堵序列（stopper sequence) 505的分離 的XTEN基因。將XTEN基因克隆至填充載體中。在這個情況下，載體編碼任選CBD序列506 和GFP基因508。接著用Bbsl/HindllI進行消化以移除507和508且放置終止密碼子。接 著將所得產物克隆至Bsal/HindllI消化的含有編碼FVIII的基因的載體中，從而產生編碼 FVIII-XTEN融合蛋白的基因500。
[0099] 圖15是裝配編碼包含CF和XTEN的融合蛋白的基因、所述基因以融合蛋白形式表 達和回收、以及所述融合蛋白作為候選CFXTEN產物加以評估中的代表性步驟的示意流程 圖。
[0100] 圖16說明使用供體XTEN序列來產生截短XTEN。圖16A提供AG864的序列（SEQ ID NO: 1596)，其中加下劃線序列用於產生序列長度576 (SEQ ID NO: 1597)。圖16B提供AG864 的序列（SEQ ID NO: 1598)，其中加下劃線序列用於產生序列長度288 (SEQ ID NO: 1599)。圖 16C提供AG864的序列（SEQ ID N0:1600)，其中加下劃線序列用於產生序列長度144(SEQ ID NO: 1601)。圖16D提供AE864的序列（SEQ ID NO: 1602)，其中加下劃線序列用於產生序 列長度 576(SEQIDN0:1603)。圖16E提供AE864 的序列（SEQIDN0:1604)，其中加下劃 線序列用於產生序列長度288 (SEQ ID NO: 1605)。圖16F提供用於產生四個144長度的序 列（按照出現順序分別是SEQ ID NO 1607-1610)的AE864的序列（SEQ ID NO: 1606)(雙 下劃線指示144序列中的首個胺基酸，其中單下劃線表示那個序列的其餘部分）。
[0101] 圖17是以將XTEN元件引入FVIII編碼序列中的不同策略設計因子VIII-XTEN表 達載體的圖示。圖17A顯示編碼融合於編碼FVIII的序列的3'末端的XTEN的表達載體。 圖17B描繪編碼插入編碼單一 FVIII的編碼序列的中部中的XTEN元件的表達載體。圖17C 描繪編碼兩個XTEN元件：一個插入FVIII編碼序列的內部，且另一融合於FVIII編碼序列 的3'末端的表達載體。
[0102] 圖18說明編碼XTEN的基因的組合基因裝配的過程。在這種情況下，基因自6個 鹼基片段裝配且各片段可以4種不同密碼子形式（A、B、C和D)獲得。這允許在裝配含12 個胺基酸的基序時實現理論多樣性4096。
[0103] 圖19顯示在皮下或靜脈內施用的單劑的連接於不同長度的非結構化多肽的GFP 不同組合物之後，在食蟹獼猴中的藥代動力學分布圖（血漿濃度），如實施例41中所述。組 合物是 GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-Y576 和 XTEN_AD836-GFP。在注射之後 各種時間分析血液樣本且使用用於捕獲的針對GFP的多克隆抗體和相同多克隆抗體的用 於檢測的生物素化製劑，通過ELISA測量血漿中的GFP的濃度。結果呈現為在給藥之後相 對於時間（小時）的血漿濃度，且特別顯示XTEN_AD836-GFP (即XTEN序列長度最長的組合 物）的半衰期可觀增加。序列長度最短的構建體GFP-L288具有最短半衰期。
[0104] 圖20顯示來自XTEN_AE864融合於GFP的N末端的融合蛋白的穩定性研究的樣本 的SDS-PAGE凝膠（參見實施例42)。在37°C下在食蟹獼猴血漿和大鼠腎溶解產物中孵育 GFP-XTEN多達7天。此外，也評估向食蟹獼猴施用的GFP-XTEN。在0、1和7天取樣且通過 SDS PAGE分析，然後用針對GFP的抗體使用蛋白質印跡分析進行檢測。
[0105] 圖21顯示對相對於分子量已知的蛋白質標準物測量的胰高血糖素-XTEN構建 體樣本的尺寸排阻色譜分析的結果，其中圖輸出為吸光度對滯留體積，如實施例40中所 述。胰高血糖素-XTEN構建體是1)胰高血糖素-Y288 ;2)胰高血糖素 Y-144 ;3)胰高血糖 素-Y72 ;和4)胰高血糖素-Y36。結果指示表觀分子量隨XTEN部分的長度增加而增加（對 於數據，參見實施例40)。
[0106] 圖22顯示由用如所指定的構建體轉化的細胞的細胞培養物表達的蛋白質的蛋 白質印跡的結果（實施例25)。泳道1-12中的樣本分別是：麗標準物、FVIII (42. 5ng)、 pBCOlOOB、pBC0114A、pBCOlOO、pBC0114、pBC0135、pBC0136、pBC0137、pBC0145、pBC0149 和 PBC0146。泳道8、9和12顯示與估計MW是95kDa的具有C末端XTEN288的FVIII -致的 條帶。泳道7和11顯示與估計麗是175kDa的具有C末端XTEN42的FVIII -致的條帶。 泳道2-6顯示與FVIII和重鏈一致的條帶。泳道10和23顯示與重鏈一致的條帶。泳道7 顯示與重鏈和連接的XTEN42 -致的條帶。
[0107] 圖23顯示對自流體動力學注射質粒DNA的FVIII和血管性血友病因子雙重敲除 小鼠獲得的樣本的FVIII測定的結果，如實施例36中所詳述。
[0108] 圖24是如實施例30中所述向HemA或FVIII/VWF雙重敲除小鼠施用的rBDD-FVIII 和純化CFXTEN融合蛋白pBCO 145和pBCO 146 (具有C末端XTEN)的藥代動力學性質的圖形 和表格描繪，其顯示CFXTEN在兩種小鼠品系中的半衰期均增強。
[0109] 圖25是使用在HemA小鼠中進行的細胞培養物PK測定，向HemA(圖25A)或FVIII/ VWF雙重敲除小鼠（圖25B)施用的rBDD-FVII I和CFXTEN融合蛋白pSD0050和pSD0062 (具 有內部插入的XTEN)的藥代動力學性質的圖形和表格描繪。如實施例32中所述，顯示劑 量、5分鐘回收率和半衰期（T1/2)，從而強調在兩種小鼠品系中，相較於陽性對照FVIII， CFXTEN的回收率和半衰期得以增強。
[0110] 圖26是使用PBC0114BDD-FVIII和含有三個在殘基18、745和2332處的144個氨 基酸的XTEN插入的CFXTEN構建體LSD0049. 002滴定GMA802IFVIII抑制劑的圖形描繪。數 據指示相較於FVIII陽性對照，為在50%程度上抑制CFXTEN所需的以μ g/ml計的抗體量 右移約0.7數量級。
[0111] 圖27是算法SegScore的邏輯流程圖的不意圖。在圖中，以下圖例適用：i，j-用 於穿過整個序列的控制迴路中的計數器；HitCount-這個變量是記錄子序列在嵌段中遇到 相同子序列多少次的計數器；SubSeqX-這個變量保存被檢查冗餘度的子序列；SubSeqY-這 個變量保存SubSeqX被檢查所針對的子序列；BlockLen-這個變量保存使用者確定的嵌段 長度；SegLen-這個變量保存區段長度。程序被硬編碼來產生長度是3, 4, 5, 6, 7, 8, 9和10 的子序列的計分；Block-這個變量保存一串長度BlockLen。所述串主要由來自輸入XTEN 序列的字母組成且由i計數器的位置所確定；SubSeqList-這是保存所有產生的子序列計 分的清單。
[0112] 圖28描繪對11個胺基酸的假設XTEN(SEQ ID NO: 1591)應用算法SegScore以確 定重複性。由N個胺基酸組成的XTEN序列被分成Ν-S+l個長度是S的子序列（在這個情 況下S = 3)。對所有子序列進行逐對比較且計算相同子序列的平均數目以產生子序列計分 1. 89。
[0113] 圖29是在暴露於針對FVIII的GMA8021抗體之後，測定的CFXTEN中的FVIII活 性與PBC114FVIII陽性對照的FVIII活性的個別構建體比率值的圖，分組是根據構建融合 蛋白中的XTEN的數目（參見實施例28)。結果顯示CFXTEN保留FVIII活性的能力與併入 的XTEN的數目增加基本上成線性關係。
[0114] 圖30描繪成熟B結構域缺失的（BDD)人FVIII構建體的一級序列和結構域結構 (實施例46)。顯不引入的NheI和ClaI限制位點的位置。應注意胺基酸編號對應於成熟 FVIII的一級序列中的胺基酸位置（圖30)。個別結構域是通過灰色線/框加以限定，其中 用灰色文本鑑定結構域。酸性區域（al、a2、a3)用虛線框指示。實心楔/三角指示FVIII 活化成FVIIIa時的凝血酶裂解位點。空心楔/三角指示細胞內蛋白水解加工成雙鏈形式 的FVIII的位點。六角形指示N連接的糖基化的位點。圓圈指示Tyr硫酸化的位點。引入 cDNA中以有助於XTEN插入/重組的獨特非天然限制位點（NheI，GCTAG ;ClaI，ATCGAT)用 灰色以雙下劃線加以突出。
[0115] 圖31提供圖30中所述的FVIII構建體的圖解表示，其指示結構域組構以及天然 和非天然限制位點的位置。
[0116] 圖32顯示結構數據集2R7E、3⑶Z和PM0076106的圖示ASAView輸出結果。顯 示結構域AU A2、A3、Cl和C2中的胺基酸的可及溶劑面積（ASA)。對存放在由結構生物 信息學研究合作協會（Res earch Collaboratory for Structural Bioinformatics) (RCSB; http://www.rcsb.org/pdb)維護的蛋白質資料庫（Protein Data Bank)中的 X 射線結晶坐標 3CDZ (Ngo 等，Structure 16:597-606 (2008))和 2R7E (Shen 等，Blood 111:1240-1247(2008))、以及對存放在由 Consorzio Interuniv ersitario per Ie Applicazioni di Supercalcolo per University e Riserc a(CASPUR)和羅馬大學生物 化學科學系（Department of Biochemical Sciences of the University of Rome)維 護的蛋白質模型資料庫（Protei n Model Database) (http://mi.caspur.it/PMDB/main. php)中的由分子動力學模擬研究獲得的預測細化FVIII結構的原子坐標PM0076106(Ven kateswarlu, BMC Struct. Biol. 10:7(2010))進行分析。
[0117] 圖33顯示XTEN插入位點的位置的結構示意圖。對應於FVIII的晶體結構（PDB : 2R7E)的中心圖式由結構域A1、A2、A3、C1和C2的詳細視圖圍繞。β鏈和α螺旋顯示為 條帶表示。環顯示為α碳管。在XTEN插入位點處的胺基酸顯示為CPK球形表示。各圖中 的編號指示根據圖30中的編號的XTEN插入位點的位置。
[0118] 圖34顯示圖33中所示的XTEN插入位點的位置的結構示意圖，其中所得重組 FVIII蛋白顯示FVIII活性。
[0119] 圖35顯示圖34中所示的XTEN插入位點的位置的結構示意圖，其中所得重組 FVIII蛋白顯示FVIII活性。
[0120] 圖36顯示圖35中所示的XTEN插入位點的位置的結構示意圖，其中所得重組 FVIII蛋白顯示FVIII活性。
[0121] 圖37顯示FVIII的結構域AU Α2、A3、Cl和C2的ClustalW多個序列比對，其顯 示導致重組FVIII蛋白顯示FVIII活性（黑色框、白色文本）或不顯示FVIII活性（灰色 框、粗體文本）的XTEN插入位置。
[0122] 圖38顯示對以標識符2R7E存放在蛋白質資料庫處的天然活性人FVIII晶體結構 中的兩條多肽鏈的二級結構的DSSP圖解表示（參見實施例47)。胺基酸序列編號與圖30 中的蛋白質序列相同。β折置區域顯不為實心箭頭且指定為β?至β66。XTEN容許環的 位置由交叉影線框表示。結構域AlXTEN容許環指定為環Al-I和環Α1-2。結構域Α2ΧΤΕΝ 容許環指定為環Α2-1和環Α2-2。結構域Α3ΧΤΕΝ容許環指定為環Α3-1和環Α3-2。
[0123] 圖39顯示對以標識符2R7E存放在蛋白質資料庫處的天然活性人FVIII晶體結構 中的兩條多肽鏈的二級結構的DSSP圖解表示（參見實施例47)。胺基酸序列編號與圖30 中的蛋白質序列相同。β折置區域顯不為實心箭頭且指定為β?至β66。XTEN容許環的 位置由交叉影線框表示。結構域AlXTEN容許環指定為環Al-I和環Α1-2。結構域Α2ΧΤΕΝ 容許環指定為環Α2-1和環Α2-2。結構域Α3ΧΤΕΝ容許環指定為環Α3-1和環Α3-2。
[0124] 圖40顯示FVIII的結構域AU Α2、A3、Cl和C2的ClustalW多個序列比對，其顯 示導致重組FVIII蛋白顯示FVIII活性（黑色框、白色文本）或不顯示FVIII活性（灰色 框、粗體文本）的XTEN插入位置。XTEN容許環的位置由虛線矩形指示（參見實施例47)。
[0125] 圖41.圖41A呈現人FVIII(roB:2R7E)的前視結構示意圖，其顯示結構域A1、A2、 A3、Cl和C2的位置（用虛線加圓圈）和以CPK球形表示加以突出的XTEN容許環A1-1、 A1-2、A2-1、A2-2、A3-1和A3-2的位置。圖41B呈現人FVIII(PDB:2R7E)的側視結構示意 圖，其顯示結構域AU A2、A3、Cl和C2的位置（用虛線加圓圈）和以CPK球形表示加以突 出的XTEN容許環Al-l、Al-2、A2-l、A2-2、A3-l和A3-2的位置。
[0126] 圖42顯示分離的人FVIII(roB:2R7E)A結構域的頂視結構示意圖，其顯示 以CPK球形表示加以突出的XTEN容許環的位置。圖42B、42D和42F顯示分離的人 FVIII (H)B: 2R7E) A結構域的側視結構示意圖，其顯示以CPK球形表示加以突出的XTEN容許 環的位置。
[0127] 圖43顯示各種因子VIII B結構域缺失和個別突變的序列。4-10行顯示各種B結 構域缺失，其中指示的XTEN連接側接B結構域殘餘殘基或A3結構域殘基。R1648A突變由 箭頭在5和8行中指示，而Y1680F突變由箭頭在8-10行中指示。
[0128] 圖44是具有單一 XTEN插入物的各種CFXTEN的顯色和aPTT測定活性的條形圖 (實施例49)。
[0129] 圖45是具有2個XTEN插入物的各種CFXTEN的顯色和aPTT測定活性的條形圖 (實施例49)。
[0130] 圖46是具有3個XTEN插入物的各種CFXTEN的顯色和aPTT測定活性的條形圖 (實施例49)。
[0131] 圖47是相較於BDD-FVIII對照，施用的各種具有單一 XTEN插入物的CFXTEN在 DKO小鼠中的血漿水平的圖，其顯示通過在各個位置處插入XTEN實現半衰期長10至20倍 (實施例50)。
[0132] 圖48是相較於BDD-FVIII對照，施用的各種具有一個、兩個和三個XTEN插入物 的CFXTEN在DKO小鼠中的血漿水平的圖，其顯示相較於單一或兩個插入物，通過包括額外 XTEN插入物實現半衰期增加（實施例51)。
[0133] 圖49是在畢提斯達測定中用實施例52中所述的三種血友病患者血清（圖49A-C) 或綿羊抗FVII (圖49D)測定的樣本中的剩餘因子VIII促凝血活性的繪製抑制曲線的圖， 其顯示相較於未連接於XTEN的FVIII，兩個CFXTEN分子的抑制曲線明顯左移。
[0134] 發明詳述
[0135] 在描述本發明的實施方案之前，應了解所述實施方案是僅通過舉例方式提供，且 本文所述的本發明的實施方案的各種替代方案可用於實施本發明。眾多變化、改變和替代 在不脫離本發明的情況下現將被本領域技術人員所想到。
[0136] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有與由本發明所屬領域 的普通技術人員通常所理解相同的含義。儘管在實施或測試本發明時可使用與本文所述的 那些方法和材料類似或等效的方法和材料，但以下描述適合的方法和材料。在起衝突的情 況下，以包括定義的專利說明書為準。此外，材料、方法和實例僅具有說明性而非意圖具有 限制性。眾多變化、改變和替代在不脫離本發明的情況下現將被本領域技術人員所想到。
[0137] 定義
[0138] 在本申請的情形下，除非另外指定，否則以下術語具有歸於它們的含義：
[0139] 除非上下文另外明確規定，否則如在說明書和權利要求中所用，單數形式"一個" 和"所述"包括複數個提及物。舉例來說，術語"一個細胞"包括複數個細胞，包括其混合物。
[0140] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換用於指代任何長度的胺基酸聚合 物。聚合物可為線性或分支的，它可包含修飾的胺基酸，且它可被非胺基酸打斷。所述術語 也涵蓋已例如通過形成二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其它操作（如與 標記性組分綴合）加以修飾的胺基酸聚合物。
[0141] 如本文所用，術語"胺基酸"是指天然和/或非天然或合成胺基酸，包括但不限於D 或L兩種光學異構體、以及胺基酸類似物和肽模擬物。標準單字母代碼或三字母代碼用於 指定胺基酸。
[0142] 術語"結構域"在關於因子VIII多肽使用時是指全長結構域或其功能性片段，例 如因子VIII的Al結構域、A2結構域、A3結構域、B結構域、Cl結構域和/或C2結構域的 全長或功能性片段。
[0143] 術語"天然L-胺基酸"是指甘氨酸（G)、脯氨酸（P)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)、亮氨 酸（L)、異亮氨酸（I)、甲硫氨酸（M)、半胱氨酸（C)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)、 組氨酸（H)、賴氨酸（K)、精氨酸（R)、穀氨醯胺（Q)、天冬醯胺（N)、穀氨酸（E)、天冬氨酸 (D)、絲氨酸（S)和蘇氨酸（T)的L光學異構體形式。
[0144] 如應用於序列以及如本文所用的術語"非天然存在"是指不具有哺乳動物中所見 的野生型或天然存在的序列的對應物、不互補於哺乳動物中所見的野生型或天然存在的序 列、或不與哺乳動物中所見的野生型或天然存在的序列具有高度同源性的多肽或多核苷酸 序列。舉例來說，當適合地比對時，非天然存在的多肽或片段相較於天然序列可共有至多 99%、98%、95%、90%、80%、70%、60%、50%或甚至更小胺基酸序列同一性。
[0145] 術語"親水性"和"疏水性"是指物質與水具有的親和程度。親水性物質對 水具有強烈親和力，傾向於溶解於水中，與水混合，或由水溼潤，而疏水性物質大致上 對水缺乏親和力，傾向於排斥而非吸收水且傾向於不溶解於水中或與水混合或由水溼 潤。胺基酸可基於它們的疏水性加以表徵。已開發許多尺度。一個實例是由Levitt，M 等，J Mol Biol(1976) 104:59 開發的尺度，其列於 Hopp, TP 等，Proc Natl Acad Sci USA(1981)78:3824中。"親水性胺基酸"的實例是精氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、天冬醯 胺和穀氨醯胺。特別感興趣的是親水性胺基酸天冬氨酸、穀氨酸以及絲氨酸和甘氨酸。"疏 水性胺基酸"的實例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。
[0146] "片段"在應用於蛋白質時是天然生物活性蛋白質的保留至少一部分治療和/或生 物活性的截短形式。"變體"在應用於蛋白質時是與天然生物活性蛋白質具有序列同源性 的保留生物活性蛋白質的至少一部分治療和/或生物活性的蛋白質。舉例來說，相較於參 照生物活性蛋白質，變體蛋白質可共有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%胺基酸序列同一性。如本文所用，術語"生物活性蛋白質部分"包括如例如通過 定點誘變、合成編碼基因、插入而故意地修飾的蛋白質或通過突變而偶然地修飾的蛋白質。
[0147] 術語"序列變體"是指相較於它們的天然或原始序列，已通過插入、缺失或取代一 個或多個胺基酸加以修飾的多肽。插入可位於蛋白質的任一末端或兩個末端處，和/或可 位於胺基酸序列的內部區域內。一個非限制性實例是在生物活性有效負載蛋白質的序列內 插入XTEN序列。在缺失變體中，移除如本文所述的多肽中的一個或多個胺基酸殘基。因此， 缺失變體包括有效負載多肽序列的全部片段。在取代變體中，移除且用替代殘基置換多肽 的一個或多個胺基酸殘基。在一方面，取代在性質上是保守性的且這個類型的保守性取代 在本領域中是熟知的。
[0148] 如本文所用，"內部XTEN"是指已插入凝血因子的序列中的XTEN序列。內部XTEN 可通過將XTEN序列插入如FVIII的凝血因子的序列中來構建，所述插入是通過在凝血因子 的結構域內的兩個鄰近胺基酸之間（"結構域內"）或在兩個結構域之間（"結構域間"）插 入來實現或其中XTEN置換凝血因子的部分內部序列。
[0149] 如本文所用，"末端XTEN"是指已融合於凝血因子的N末端或C末端或融合在凝血 因子的N末端或C末端中或融合於凝血因子的N末端或C末端的蛋白水解裂解序列或接頭 的XTEN序列。末端XTEN可融合於凝血因子的天然末端。或者，末端XTEN可置換凝血因子 的一部分末端序列。
[0150] 術語"XTEN釋放位點"是指CFXTEN融合蛋白中可由哺乳動物蛋白酶識別且裂解， 從而實現XTEN或XTEN的一部分自CFXTEN融合蛋白釋放的裂解序列。如本文所用，"哺乳 動物蛋白酶"是指通常存在於哺乳動物的體液、細胞或組織中的蛋白酶。XTEN釋放位點可被 工程化來由各種哺乳動物蛋白酶（也稱為"XTEN釋放蛋白酶"）裂解，所述哺乳動物蛋白酶 如FXIa、FXIIa、激肽釋放酶、？￥111 &、？￥111&4乂&411&(凝血酶）、彈性蛋白酶-2、麗?-12、 MMP13、MMP-17、MMP-20或在凝結事件期間存在的任何蛋白酶。可利用能夠識別確定裂解位 點的其它等效蛋白酶（內源性或外源性）。可針對所用蛋白酶調整和定製裂解位點。
[0151] 當提及第一多肽連接於第二多肽時，術語"在…內"涵蓋分別使所述第一或第二多 肽的N末端連接於所述第二或第一多肽的C末端的連接，以及將所述第一多肽插入所述第 二多肽的序列中。舉例來說，當XTEN "在因子VIII多肽的結構域內"連接時，所述XTEN可 連接於N末端、C末端，或可插入所述結構域中。
[0152] 如本文所用，術語"位點"在用於指代XTEN插入在如因子VIII的生物多肽內或向 如因子VIII的生物多肽插入的位點時表示連接所述XTEN所處的胺基酸位置。當描述編號 位點，如XTEN插入在因子VIII內或向因子VIII插入的第一、第二、第三、第四、第五或第六 位點時，各位點將理解為表示因子VIII中的不同位點；例如，所述第二位點是與所述第一 位點不同的因子VIII位置，所述第三位點不同於所述第二和所述第一位點等。
[0153] 如應用於本文提供的CFXTEN多肽的一種或多種形式的"活性"或"促凝血活性"是 指無論通過體外、離體或體內測定所測量，都能夠結合靶標凝血蛋白底物或輔因子且促進 凝結事件的能力。所述測定包括但不限於單級凝結測定、兩級凝結測定、顯色測定和ELISA 測定。"生物活性"是指體外或體內生物功能或作用，包括但不限於受體或配體結合、或 FVIII凝血因子對在本領域中通常已知的凝血的作用、或細胞、生理或臨床反應,包括遏止 流血事件。
[0154] 如本文所用，術語"ELISA"是指如本文所述或如本領域中另外已知的酶聯免疫吸 附測定。
[0155] "宿主細胞"包括可為或已為主題載體的接受者的個別細胞或細胞培養物。宿主細 胞包括單一宿主細胞的子代。由於天然、偶然或故意突變，子代可不必與原始親本細胞完全 相同（在形態方面或在總DNA互補序列的基因組方面）。宿主細胞包括用本發明的載體體 內轉染的細胞。
[0156] "分離的"在用於描述本文公開的各種多肽時是指已被鑑定且與它的天然環境的 組分分離和/或自所述天然環境的組分回收的多肽。它的天然環境的汙染物組分是將通常 幹擾多肽的診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素和其它蛋白質或非蛋白質溶質。如為 本領域技術人員顯而易知，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段不需要 "分離"以將它與它的天然存在的對應物區分。此外，"濃縮的"、"分離的"或"稀釋的"多核 苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段可與它的天然存在的對應物區分，因為每體積分子的 濃度或數目通常大於它的天然存在的對應物的濃度或數目。一般來說，通過重組手段製備 且在宿主細胞中表達的多肽被視為"分離的"。
[0157] "分離的"多核苷酸或多肽編碼核酸或其它多肽編碼核酸是被鑑定且與在多肽編 碼核酸的天然來源中它通常與之締合的至少一種汙染物核酸分子分離的核酸分子。分離的 多肽編碼核酸分子不同於它在自然界中所見的形式或配置。因此，分離的多肽編碼核酸分 子不同於當它存在於天然細胞中時的特定多肽編碼核酸分子。然而，分離的多肽編碼核酸 分子包括通常表達多肽的細胞中含有的多肽編碼核酸分子，在所述細胞中，例如核酸分子 在不同於天然細胞的位置的染色體或染色體外位置中。
[0158] "嵌合"蛋白含有至少一種在序列中不同於在自然界中存在的位置的位置中包含 至少一個區域的融合多肽。所述區域可通常以單獨蛋白質形式存在且在融合多肽中集合在 一起；或它們可通常以相同蛋白質形式存在，但以新型排列置放在融合多肽中。可例如通過 化學合成，或通過產生並翻譯其中以所需關係編碼肽區域的多核苷酸來產生嵌合蛋白。
[0159] "綴合的"、"連接的"、"融合的"和"融合"在本文中可互換使用。這些術語是指通 過無論什麼手段（包括化學綴合或重組手段）將兩種或更多種化學元素、序列或組分接合 在一起。舉例來說，如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，那麼使它可操作地連接於編碼序 列。通常，"可操作地連接"是指所連接的DNA序列是連續的，且在閱讀相中或框內。"框內 融合"是指以維持原始ORF的正確閱讀框的方式接合兩個或更多個開放閱讀框（ORF)以形 成連續較長0RF。因此，所得重組融合蛋白是含有兩個或更多個對應於由原始ORF編碼的多 肽的區段的單一蛋白質（所述區段在自然界中通常不這樣接合）。
[0160] 在多肽的情形下，"線性序列"或"序列"是多肽中呈氨基末端至羧基末端方向的 一定順序的胺基酸，其中在序列中彼此相鄰的殘基在多肽的一級結構中是連續的。"部分序 列"是多肽的一部分的已知在一個或兩個方向上包含其它殘基的線性序列。
[0161] "異源"是指源於某一實體，所述實體就基因型而言不同於它與之比較的實體的其 餘部分。舉例來說，自它的天然編碼序列移除且可操作地連接於除天然序列以外的編碼序 列的甘氨酸富集序列是異源甘氨酸富集序列。如應用於多核苷酸、多肽的術語"異源"是指 多核苷酸或多肽源於某一實體，所述實體就基因型而言不同於它與之比較的實體的其餘部 分的基因型。
[0162] 術語"多核苷酸"、"核酸"、"核苷酸"和"寡核苷酸"可互換使用。它們是指任何長度 的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸 可具有任何三維結構，且可執行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例： 基因或基因片段的編碼或非編碼區、由連鎖分析確定的基因座（loci)(基因座（locus))、 外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、核糖酶、cDNA、重組多核苷酸、分支 多核苷酸、質粒、載體、具有任何序列的分離的DNA、具有任何序列的分離的RNA、核酸探針 和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，那麼 可在聚合物裝配之前或之後賦予對核苷酸結構的修飾。核苷酸的序列可由非核苷酸組分打 斷。可在聚合之後，如通過與標記組分綴合來進一步修飾多核苷酸。
[0163] 術語"多核苷酸的互補序列"表示相較於參照序列，具有互補鹼基序列和逆向定 向，以致它可以完全保真度與參照序列雜交的多核苷酸分子。
[0164] 如應用於多核苷酸的"重組"是指多核苷酸是體外克隆、限制和/或連接步驟、以 及產生可潛在於宿主細胞中表達成重組蛋白的構建體的其它程序的各種組合的產物。
[0165] 術語"基因"和"基因片段"在本文中可互換使用。它們是指含有至少一個能夠在 轉錄和翻譯之後，編碼特定蛋白質的開放閱讀框的多核苷酸。基因或基因片段可為基因組 的或cDNA，只要多核苷酸含有至少一個可涵蓋整個編碼區或其區段的開放閱讀框即可。"融 合基因"是由至少兩種連接在一起的異源多核苷酸組成的基因。
[0166] "同源性"或"同源"或"序列同一性"是指兩個或更多個多核苷酸序列之間或兩 個或更多個多肽序列之間的序列相似性或可互換性。當使用如BestFit的程序來確定兩 個不同胺基酸序列之間的序列同一性、相似性或同源性時，可使用預設設置，或可選擇如 blosum45或blosum80的適當計分矩陣來使一致性、相似性或同源性計分最優化。優選地， 同源的多核苷酸是在如本文定義的嚴格條件下雜交且相較於那些序列具有至少70%、優選 至少80 %、更優選至少90 %、更優選95 %、更優選97 %、更優選98 %、以及甚至更優選99 % 序列同一性的那些多核苷酸。同源的多肽優選具有至少70%、優選至少80%、甚至更優選 至少90 %、甚至更優選至少95-99 %、以及最優選100 %相同的序列同一性。
[0167] "連接"是指在兩個核酸片段或基因之間形成將它們連接在一起的磷酸二酯鍵的 過程。為將DNA片段或基因連接在一起，DNA的末端必須可彼此相容。在一些情況下，在核 酸內切酶消化之後，末端將直接可相容。然而，可能必要的是首先使通常在核酸內切酶消化 之後產生的交錯末端轉化成鈍末端以使得它們對於連接可相容。
[0168] 術語"嚴格的條件"或"嚴格的雜交條件"包括涉及多核苷酸將在比與其它序列更 大的可檢測程度上（例如，超過背景至少2倍）與它的靶標序列雜交所處的條件。通常，部 分地關於進行洗滌步驟所處的溫度和鹽濃度來表述雜交的嚴格性。通常，嚴格條件將為以 下條件：其中在pH 7.0至8. 3下，鹽濃度小於約1.5M Na離子，通常約0.01至LOM Na離 子濃度（或其它鹽）且溫度是至少約30°C (對於短多核苷酸（例如10至50個核苷酸）而 言）和至少約60°C (對於長多核苷酸（例如大於50個核苷酸）而言）一舉例來說，"嚴格 條件"可包括在37°C下在50%甲醯胺、IM NaCl、l% SDS中雜交，以及在60°C至65°C下在 0· I X SSC/1 % SDS中洗滌3次，各次15分鐘。或者，可使用溫度約65°C、60°C、55°C或42°C。 SSC濃度可自約0. 1至2X SSC變化，其中SDS是以約0. I %存在。所述洗滌溫度通常選擇為 低於特定序列在確定離子強度和PH下的熱熔點約5°C至20°C。Tm是50%靶標序列雜交於 完全匹配探針所處的溫度（在確定離子強度和PH下）。用於計算Tm的等式和用於核酸雜交 的條件是熟知的且可見於 Sambrook, J.等，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual," 第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001中。通常，阻斷試劑用於阻斷非特 異性雜交。所述阻斷試劑包括例如約100-200 μ g/ml的剪切和變性的鮭魚精子DNA。有機 溶劑（如在約35-50% v/v濃度下的甲醯胺）也可在特定情況（如RNA = DNA雜交）下使用。 關於這些洗滌條件的適用變化將易於為本領域普通技術人員顯而易知。
[0169] 如應用於多核苷酸序列的術語"同一性百分比"、"序列同一性百分比"和"同一 性％"是指使用標準化算法比對的至少兩個多核苷酸序列之間匹配的殘基的百分比。所述 算法可以標準化和可復現方式在所比較的序列中插入間隙以使兩個序列之間的比對最優 化，且因此實現兩個序列的更有意義比較。同一性百分比可在整個確定多核苷酸序列的長 度上加以測量，或可在較短長度，例如在取自較大確定多核苷酸序列的片段（例如具有至 少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450個連續殘基的片段）的長 度上加以測量。所述長度僅是示例性的，且應了解，由本文在表、圖或序列表中所示的序列 支撐的任何片段長度都可用於描述在其上測量同一性百分比的長度。序列同一性百分比是 通過以下方式來計算：在比較窗上比較兩個最優對準的序列，確定匹配位置（相同殘基存 在於兩個多肽序列中所處的位置）的數目，用比較窗中的位置總數（即，窗口大小）除匹配 位置的數目，以及用100乘以結果以產生序列同一性百分比。當將比較不同長度的序列時， 最短序列限定比較窗的長度。當計算序列同一性時，不考慮保守性取代。
[0170] 關於本文鑑定的多肽序列的"序列同一性百分比（％)"定義為在比對序列且必 要時引入間隙以實現最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代考慮為序列同一性的 一部分之後，查詢序列中與第二參照多肽序列或其部分的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基 的百分比。出於確定胺基酸序列同一性百分比的目的的比對可以屬於本領域中的技能的 各種方式實現，所述方式例如使用可公開獲得的計算機軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可確定適於測量比對的參數,包括為在所比較序 列的全長上實現最大對準所需的任何算法。同一性百分比可在整個確定多肽序列的長度上 加以測量，或可在較短長度，例如在取自較大確定多肽序列的片段（例如具有至少15、至少 20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150個連續殘基的片段）的長度上加以測量。 所述長度僅是示例性的，且應了解，由本文在表、圖或序列表中所示的序列支撐的任何片段 長度都可用於描述在其上測量同一性百分比的長度。
[0171] 如本文在多肽的情形下所用的術語"非重複性"是指在肽或多肽序列中缺乏內部 同源性程度或內部同源性程度有限。術語"大致上非重複"可指例如存在少許或不存在以 下情況：在序列中四個連續胺基酸是相同胺基酸類型；或指多肽具有10或更小的子序列計 分（下文定義）或指以自N末端至C末端的順序不存在構成多肽序列的序列基序的樣式。 如本文在多肽的情形下所用的術語"重複性"是指在肽或多肽序列中的內部同源性的程度。 相反，"重複"序列可含有短胺基酸序列的多個相同拷貝。舉例來說，目標多肽序列可分成 n-mer序列且可對相同序列的數目進行計數。高度重複序列含有大部分相同序列，而非重複 序列含有少許相同序列。在多肽的情形下，序列可含有具有確定或可變長度的較短序列或 基序的多個拷貝，其中所述基序自身具有非重複序列，從而致使全長多肽大致上是非重複 的。測量非重複性所處的多肽的長度可自3個胺基酸至約200個胺基酸、約自6個胺基酸 至約50個胺基酸、或自約9個胺基酸至約14個胺基酸變化。在多核苷酸序列的情形下使 用的"重複性"是指序列中的內部同源性程度，例如像給定長度的相同核苷酸序列的頻率。 重複性可例如通過分析相同序列的頻率來測量。
[0172] "載體"是將插入的核酸分子轉移至宿主細胞中和/或在宿主細胞之間轉移插入的 核酸分子的核酸分子，優選在適當宿主中自我複製。所述術語包括主要起將DNA或RNA插入 細胞中的作用的載體、主要起複製DNA或RNA的作用的複製載體、和起轉錄和/或翻譯DNA 或RNA的作用的表達載體。也包括提供一種以上上述功能的載體。"表達載體"是在引入適 當宿主細胞中時可轉錄且翻譯成多肽的多核苷酸。"表達系統"通常暗示包含可起產生所需 表達產物的作用的表達載體的適合宿主細胞。
[0173] 如應用於多肽的"血清降解抗性"是指多肽能夠抵抗在血液或其組分中的降解的 能力，所述降解通常涉及血清或血漿中的蛋白酶。血清降解抗性可通過通常在約37°C下 組合蛋白質與人（或視情況小鼠、大鼠、猴）血清或血漿通常持續一定範圍的天數（例如 0.25、0.5、1、2、4、8、16天）來測量。這些時間點的樣本可進行蛋白質印跡測定且用抗體檢 測蛋白質。抗體可針對蛋白質中的標籤。如果蛋白質在蛋白質印跡上顯示單一條帶（其中 蛋白質的尺寸與注射的蛋白質的尺寸一致），那麼未發生降解。在這個示例性方法中，如通 過蛋白質印跡或等效技術判斷的50%蛋白質降解所處的時間點是蛋白質的血清降解半衰 期或"血清半衰期"。
[0174] 如本文所用的術語"t1/2 "是指計算為In (2) /Kel的終末半衰期。Kel是通過對數濃度 對時間曲線的終末線性部分的線性回歸計算的終末消除速率常數。半衰期通常是指為沉積 在活生物體中的一半數量的施用物質由正常生物過程代謝或消除所需的時間。術語"t1/2 "、 "終末半衰期"、"消除半衰期"和"循環半衰期"在本文中可互換使用。
[0175] "主動清除"是指蛋白質除通過過濾或凝聚以外自循環移除所憑藉的機制，且其包 括由細胞、受體、代謝或降解介導的自循環移除蛋白質。
[0176] "表觀分子量因子"和"表觀分子量"是關於由特定胺基酸序列展現的表觀分子量 相對增加或降低的量度的相關術語。表觀分子量是使用尺寸排阻色譜（SEC)或類似方法， 通過與球狀蛋白質標準物進行比較來測定，且用"表觀kD"單位計量。表觀分子量因子是表 觀分子量與實際分子量之間的比率；後者是通過基於胺基酸組成添加組成中各類型的氨基 酸的計算分子量或通過根據在SDS電泳凝膠中與分子量標準物的比較進行估計來預測。
[0177] 術語"流體動力學半徑"或"斯託克斯半徑（Stokes radius) "是溶液中分子的有 效半徑（Rh，以nm計），其是通過假定物體穿過溶液且由溶液的粘性所抵抗來測量。在本發 明的實施方案中，XTEN融合蛋白的流體動力學半徑測量結果與作為一種更直觀量度的'表 觀分子量因子'相關。蛋白質的"流體動力學半徑"影響它在水溶液中的擴散速率以及它在 大分子的凝膠中遷移的能力。蛋白質的流體動力學半徑是通過它的分子量以及通過它的結 構（包括形狀和緊密性）來測定。用於測定流體動力學半徑的方法在本領域中是熟知的，如 通過使用如美國專利號6, 406, 632和7, 294, 513中所述的尺寸排阻色譜（SEC)。大多數蛋 白質具有球狀結構，此是蛋白質具有最小流體動力學半徑所可具有的最緊密三維結構。一 些蛋白質採用隨機和開放的非結構化或'線性'構象且因此相較於具有類似分子量的典型 球狀蛋白質具有大得多的流體動力學半徑。
[0178] "生理條件"是指活宿主中的一組條件以及體外條件，包括模擬活受試者的那些條 件的溫度、鹽濃度、pH。已建立具有生理相關條件的用於體外測定的宿主。通常，生理緩衝 液含有生理濃度的鹽且調整至在約6. 5至約7. 8、且優選約7. 0至約7. 5的範圍內的中性 pH。多種生理緩衝液列於Sambrook等（2001)中。生理相關溫度在約25°C至約38°C、且優 選約35°C至約37°C的範圍內。
[0179] "反應性基團"是可偶聯於第二反應性基團的化學結構。反應性基團的實例是氨 基、羧基、硫氫基、羥基、醛基、疊氮基。一些反應性基團可被活化來促進與第二反應性基團 偶聯。活化的非限制性實例是羧基與碳二亞胺反應、羧基轉化成活化的酯、或羧基轉化成疊 氮化物官能團。
[0180] "控制釋放劑"、"緩慢釋放劑"、"長效製劑（cbpot formulation) "和"持續釋放劑" 可互換用於指代相對於在不存在試劑下施用多肽時的釋放持續時間，能夠延長本發明多肽 的釋放持續時間的試劑。本發明的不同實施方案可具有不同釋放速率，從而產生不同治療 量。
[0181] 術語"抗原"、"靶標抗原"和"免疫原"在本文中可互換用於指代抗體片段或抗體 片段基治療劑與其結合或針對其具有特異性的結構或結合決定簇。
[0182] 如本文所用的術語"有效負載"是指具有生物或治療活性的蛋白質或肽序列；SP小 分子的藥效團的對應物。有效負載的實例包括但不限於凝血因子、細胞因子、酶、激素、以及 血液和生長因子。
[0183] 如本文所用的術語"拮抗劑"包括部分或完全阻斷、抑制或中和本文公開的天然多 肽的生物活性的任何分子。用於鑑定多肽的拮抗劑的方法可包括使天然多肽與候選拮抗劑 分子接觸以及測量一種或多種通常與天然多肽相關的生物活性的可檢測變化。在本發明的 情形下，拮抗劑可包括蛋白質、核酸、碳水化合物、抗體或降低生物活性蛋白質的作用的任 何其它分子。
[0184] 術語"激動劑"是以廣義使用且包括模擬本文公開的天然多肽的生物活性的任何 分子。適合激動劑分子明確包括天然多肽、肽、小有機分子等的激動劑抗體或抗體片段、片 段或胺基酸序列變體。用於鑑定天然多肽的激動劑的方法可包括使天然多肽與候選激動劑 分子接觸以及測量一種或多種通常與天然多肽相關的生物活性的可檢測變化。
[0185] 如本文所用，"治療"或"緩和"或"改善"可互換使用且是指施用藥物或生物製劑 以實現治療益處，治癒現存病狀或減輕現存病狀的嚴重性，或實現防治性益處，預防或降低 病狀發作的可能性或病狀發生的嚴重性。就治療益處而言，其是指根除或改善所治療的潛 伏病狀或與潛伏病狀相關的一種或多種生理症狀以使在受試者中觀察到改善，縱使受試者 可能仍然受潛伏病狀折磨。
[0186] 如本文所用的"治療作用"或"治療益處"是指由施用本發明的融合蛋白產生的生 理作用，包括但不限於減輕、改善或預防人或其它動物的疾病，或另外增強人或動物的身體 或精神良好狀態，而非能夠誘導產生針對生物活性蛋白質具有的抗原性表位的抗體。對於 防治性益處，可向處於發展特定疾病、所述疾病的病狀或症狀（例如，診斷有甲型血友病的 受試者的流血）的風險下的受試者，或向儘管可能尚未對這個疾病作出診斷，但報告疾病 的一種或多種生理症狀的受試者施用組合物。
[0187] 如本文所用的術語"治療有效量"和"治療有效劑量"是指當以一次或重複劑量向 受試者施用時，單獨或作為融合蛋白組合物的一部分的藥物或生物活性蛋白質能夠對疾病 病況或病狀的任何症狀、方面、測量參數或特徵具有任何可檢測有益作用的量。所述作用無 需是絕對有益的。確定治療有效量完全在本領域技術人員的能力範圍內，尤其鑑於本文提 供的詳細公開內容。
[0188] 如本文所用的術語"治療有效劑量方案"是指用於單獨或作為融合蛋白組合物的 一部分連續施用多次劑量（即，至少兩次或兩次以上）的生物活性蛋白質的時程，其中所述 劑量是以治療有效量給予以對疾病病況或病狀的任何症狀、方面、測量參數或特徵產生持 續有益作用。
[0189] I). -般技術
[0190] 除非另外指示，否則本發明的實施採用免疫學、生物化學、化學、分子生物學、微 生物學、細胞生物學、基因組學和重組DNA的常規技術，所述技術屬於本領域的技能。參 見 Sambrook, J.等，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,，'第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 "'Current protocols in molecular biology，'，F. M. Ausubel 等編，1987;叢書"Methods in Enzymology，，'Academic Press，San Diego，CA.; "PCR 2: a practical approach，'，M. J. MacPherson，B. D. Hames 和 G. R. Taylor 編，Oxford University Press, 1995 "'Antibodies, a laboratory manual，'Harlow, E.和 Lane, D. 編，Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ;''Goodman&Gilman, s The Pharmacological Basis of Therapeutics, " 第 11 版，McGraw-Hill, 2005 ;以及 Freshney, R. I. , "Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique," 第 4 版,John Wiley&Sons, Somerset, NJ, 2000,其內容以引用的方式整體併入本文。
[0191] II).凝血因子 VIII
[0192] 本發明部分地涉及包含連接於一個或多個延伸重組蛋白（XTEN)的因子VIII凝 血因子（CF)的組合物，從而產生CFXTEN融合蛋白組合物。如本文所用，"CF"是指因子 Vin(FVIII)或FVIII的模擬物、序列變體和截短形式，如下所述。
[0193] "因子VIII"或"FVIII"或"FVIII蛋白"是指凝血因子蛋白質及其物種（包括人、 豬、犬、大鼠或鼠類FVIII蛋白）和序列變體，包括但不限於含有2351個胺基酸的單鏈前體 蛋白質（具有19個胺基酸的疏水性信號肽）；約270-330kDa的含有2332個胺基酸的成熟 因子VIII輔因子蛋白質，其具有結構域結構A1-A2-B-A3-C1-C2 ;以及FVIII的非酶"活性" 或輔因子形式（FVIIIa)，其為具有由於在R1648之後進行蛋白水解裂解而形成的兩條鏈 的循環異二聚體，其具有含有胺基酸1-1648(相對於成熟FVIII形式加以編號）的主要由 A1-A2-B組成的重鏈形式（在90-220kD的範圍內）和含有胺基酸1649-2232的80kDa輕鏈 A3-C1-C2,所述各形式示意性描繪於圖1中。此外且如本文所用，AU A2和A3結構域各自 涵蓋酸性間隔子區域；分別為al、a2和a3酸性區域。因此，應了解，描述為具有A1、A2、A3、 B、Cl和C2結構域的CFXTEN構建體包括al、a2和a3酸性區域。如本文所用，"因子VIII" 或"FVIII"或"FVIII多肽"也包括變體形式，包括具有取代、添加和/或缺失的蛋白質，只 要變體保留如促凝血活性的所需生物活性即可。數萬種功能性FVIII變體已被構建且可用 作如本文所述的重組FVIII蛋白。參見PCT公布號WO 2011/069164A2、W0 2012/006623A2、 TO 2012/006635A2或WO 2012/006633A2,其全部以引用的方式整體併入本文。已知許多功 能性FVIII變體。此外，已在血友病患者中鑑定FVIII中之數百種非功能性突變。參見例 如Cutler等，Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)，其以引用的方式整體併入本文。此外，來自人的 FVIII與來自其它物種的FVIII之間的比較已鑑定可能為功能所需的保守殘基。參見例如 Cameron 等，Thromb. Haemost. 79:317-22(1998)和 US 6, 251，632,其以引用的方式整體並 入本文。
[0194] 在一個實施方案中，人因子VIII結構域是由以下胺基酸殘基所界定：A1， 殘基 Alal-Arg372 ;A2，殘基 Ser373-Arg740 ;B，殘基 Ser741-Argl648 ;A3，殘基 Serl649-Asn2019 ;C1，殘基 Lys2020-Asn2172 ;C2,殘基 Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2 序列 包括殘基Serl649-Tyr2332。在另一實施方案中，殘基Arg336-Arg372通常稱為al區域，且 Arg372由凝血酶所裂解。在某些實施方案中，a2區域是Al結構域的一部分。在另一實施方 案中，殘基Glul649-Argl689稱為a3酸性區域。在某些實施方案中，a3酸性區域是A3結構 域的一部分。在另一實施方案中，天然FVIII蛋白具有下式：Al-al-A2-a2-B-a3-A3-Cl-C2， 其中Al、A2和A3是結構相關的"A結構域"，B是"B結構域"，Cl和C2是結構相關的"C結構 域"，且al、a2和a3是酸性間隔子區域。在前式中且參照圖30中的一級胺基酸序列位置，人 FVIII的Al結構域自Alal延伸至約Arg336，al間隔子區域自約Met337延伸至約Arg372， A2結構域自約Ser373延伸至約Tyr719，a2間隔子區域自約Glu720延伸至約Arg740，B結 構域自約Ser741延伸至約Argl648, a3間隔子區域自約Glul649延伸至約Argl689, A3結 構域自約Serl690延伸至約Asn2019, Cl結構域自約Lys2020延伸至約Asn2172,且C2結構 域自約 Ser2173 延伸至 Tyr2332 (Saenko 等，2005, J Thromb Hemostasis, 1，922-930)。除 特定蛋白水解裂解位點以外，對FVIII的結構域和區域之間的邊界的位置的指定在不同參 考文獻中可有所不同。因此，本文中指示的邊界是通過使用術語"約"來指定為大致邊界。
[0195] 所述因子VIII包括截短序列，如其中一部分或大部分B結構域序列缺失的B結 構域缺失的"BDD"序列（如美國專利號6, 818, 439和7, 632, 921中公開或引用的BDD序 列）。BDD FVIII 的一實例是 REFACTO? 或 ΧΥΝΤΗΑΦ>(重組 BDD FVIII)，其包含對 應於圖30的胺基酸1至743的第一多肽，融合於對應於圖30的胺基酸1638至2332的第 二多肽。可用於產生本發明的重組蛋白的示例性BDD FVIII構建體包括但不限於缺失對 應於成熟人FVIII的胺基酸747-1638 (圖30)的胺基酸的FVIII (Hoeben R. C.等丄81〇1· Chem. 265 (13) : 7318-7323 (1990)，其以引用的方式整體併入本文）、以及缺失對應於成熟人 FVIII的胺基酸771 - 1666或胺基酸868-1562(圖30)的胺基酸的FVIII (Meulien Ρ.等 Protein Eng. 2 (4) : 301-6 (1988)，其以引用的方式整體併入本文）。
[0196] 此外，涵蓋包括異源胺基酸插入或取代（如天冬氨酸取代位置75處的纈氨酸）的 序列、或重鏈和輕鏈是由接頭共價連接的單鏈FVIII (scFVIII)。如本文所用，"FVIII"將為 因子VIII分子的具有凝血因子VIII的典型特徵的任何功能性形式，所述形式在向例如患 有甲型血友病的受試者的所述受試者施用時能夠糾正人因子VIII缺乏。如美國專利或申 請號 4, 757, 006 ;4, 965, 199 ;5, 004, 804 ;5, 198, 349, 5, 250, 421 ;5, 919, 766 ;6, 228, 620 ; 6, 818, 439 ;7, 138, 505 ;7, 632, 921 ;和 20100081615 中所述，已分離、表徵和克隆 FVIII 或 序列變體。
[0197] 人因子VIII由存在於X染色體的長臂尖端（q28)的單拷貝基因編碼。它包含 接近 186, 000 個鹼基對（bp)且佔 X 染色體的約 0· 1 % (White, G. C.和511〇611^1^1'，(：· B.，Blood (1989) 73:1-12)。人FVIII胺基酸序列自如美國專利號4, 965, 199中所示的 cDNA加以推斷，所述專利以引用的方式整體併入本文。由cDNA序列獲得的天然成熟人 FVIII (即，無分泌信號肽但在其它翻譯後加工之前）呈現為圖3。
[0198] 編碼成熟因子VIII mRNA的DNA見於26個大小在69至3, 106bp的範圍內的單 獨外顯子中。分隔外顯子的25個插入內含子區域大小在207至32, 400bp的範圍內。完 整基因由約9kb外顯子和177kb內含子組成。三個重複A結構域具有約30%序列同源性。 B結構域含有約25個預測糖基化位點中的19個，且A3結構域據信含有對血管性血友病因 子的結合位點。串聯C結構域在A3結構域之後且彼此具有約37%同源性（White，G.C.和 Shoemaker, C. B.，Blood(1989)73:1-12)。
[0199] 在新合成的前體單鏈分子中，B結構域分隔天然因子FVIII的A2結構域和 A3結構域。B結構域的準確邊界已以不同方式報導為自前體序列的胺基酸712延伸至 1648 (Wood 等，Nature(1984)312:330-337)或報導為胺基酸 741 - 1648 (Pipe, SW, Haemop hilia(2009) 15:1187 - 1196 以及美國專利號 7, 560, 107)或胺基酸 740-1689(1'〇〇16，11· Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:5939-5942)。如本文所用，"B 結構域"是指成熟因子 VIII的胺基酸741-1648。如本文所用，"FVIII B結構域缺失"或"FVIII BDD"是指胺基酸 741至1648中的任何胺基酸、片段或全部缺失的FVIII序列。在一個實施方案中，FVIII BDD 變體保留來自N末端（如本文所用的"B1"）和C末端（如本文所用的"B2"）的B結構域 的剩餘胺基酸。在一種FVIII BDD變體中，B結構域剩餘胺基酸是SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID N0:1614)。在一種 FVIII BDD 變體中，BI 剩餘物是 SFS 且B2 剩餘物是 QNPPVLKRHQR(SEQ ID N0:1615)。在另一 FVIII BDD變體中，BI剩餘物是SFSQN(SEQ ID N0:1616)且B2剩餘物是 PPVLKRHQR(SEQ ID N0:1617)。"B 結構域缺失的因子 VIir'、"FVIII BDD" 或 "BDD FVIII" 可具有美國專利號 6, 316, 226、6, 346, 513、7, 041，635、5, 789, 203、6, 060, 447、5, 595, 886、 6, 228, 620、5, 972, 885、6, 048, 720、5, 543, 502、5, 610, 278、5, 171，844、5, 112, 950、 4, 868, 112和6, 458, 563中公開的完全或部分缺失，所述專利各自以引用的方式整體並 入本文。在一些實施方案中，本發明的B結構域缺失的因子VIII序列包含在美國專利號 6, 316, 226 (也在US6, 346, 513中）的第4欄第4行至第5欄第28行以及實施例1-5處公 開的任一缺失。在另一實施方案中，B結構域缺失的因子VIII是S743/Q1638 B結構域缺失 的因子VIII (SQ形式因子VIII)(例如，胺基酸744至胺基酸1637缺失的因子VIII，例如， 具有全長因子VIII的胺基酸1-743和胺基酸1638-2332的因子VIII)。在一些實施方案 中，本發明的B結構域缺失的因子VIII具有在美國專利號5, 789, 203 (以及US 6, 060, 447、 US 5, 595, 886和US 6, 228, 620)的第2欄第26-51行以及實施例5-8處公開的缺失。在一 些實施方案中，B結構域缺失的因子VIII具有以下中所述的缺失：美國專利號5, 972, 885 的第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利號6, 048, 720的第6欄第1-22行以及實施 例1 ;美國專利號5, 543, 502的第2欄第17-46行；美國專利號5, 171，844的第4欄第22 行至第5欄第36行；美國專利號5, 112, 950的第2欄第55-68行，圖2以及實施例1 ;美 國專利號4, 868, 112的第2欄第2行至第19欄第21行以及表2 ;美國專利號7, 041，635 的第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第 8欄第26行、以及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利號6, 458, 563的第4欄 第25-53行。在一些實施方案中，B結構域缺失的因子VIII缺失大部分B結構域，但仍然 含有B結構域的為在體內將初級翻譯產物蛋白水解加工成兩條多肽鏈所必需的氨基末端 序列，如WO 91/09122中所公開，所述專利以引用的方式整體併入本文。在一些實施方案 中，構建缺失胺基酸747-1638,即實際上完全缺失B結構域的B結構域缺失的因子VIII。 Hoeben R. C.等 J. Biol. Chem. 265 (13) : 7318-7323 (1990)，其以引用的方式整體併入本文。 B結構域缺失的因子VIII也可含有因子VIII的胺基酸771 - 1666或胺基酸868-1562的缺 失。Meulien P.等Protein Eng. 2⑷：301-6 (1988)，其以引用的方式整體併入本文。作為 本發明的一部分的其它B結構域缺失包括：缺失胺基酸982至1562或760至1639 (Toole 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. (1986) 83, 5939-5942) )、797 至 1562 (Eaton 等 Bioche mistry (1986) 25:8343-8347) )、741 至 1646 (Kaufman (PCT 公布申請號 TO 87/04187))、 747-1560 (Sarver 等，DNA (1987) 6:553-564)、741 至 1648 (Pasek (PCT 申請號 88/00831))、 或 816 至 1598 或 741 至 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988)第 82 期：16-25 ;EP 295597))，所述文獻和專利各自以引用的方式整體併入本文。可在本發明的實施方案中利 用的任何因子VIII序列中進行各前述缺失。
[0200] 凝結中涉及的蛋白質包括因子I、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因 子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、蛋白質C和組織因子（共 同或個別"凝結蛋白"）。內源性和外源性凝結路徑中的主要凝結蛋白的相互作用顯示於 圖2中。大多數凝結蛋白以酶原形式存在，但當活化時展現促凝血蛋白酶活性，其中它們 活化另一凝結蛋白，從而有助於內源性或外源性凝血路徑和凝塊形成。在內源性凝血級聯 路徑中，FVIII與活化的因子IX、因子X、鈣和磷脂的複合物締合。因子VIII異二聚體不具 有酶活性，但在由凝血酶或因子Xa蛋白水解活化之後，異二聚體變得具有作為酶因子IXa 的輔因子的活性，其中因子VIIIa的活性的特徵在於它能夠形成因子IXa和X的呈適於由 因子IXa活化因子X的構象的膜結合位點。在由凝血酶裂解後，活化的FVIII (FVIIIa)自 血管性血友病因子解離且結合帶負電荷的磷脂PL，且所得複合物作為因子IXa的輔因子參 與在因子X活化（因子X酶（tenase))複合物中。在C2結構域以及A3結構域中的氨基 酸殘基1649至1689內是血管性血友病因子（vWF)結合位點，其用於與血管性血友病因子 複合，所得循環複合物保護FVIII免遭在血液中快速降解（Weiss HJ等Stabilization of factor VIII in plasma by the von Willebrand factor. Studies on posttransfusion and dissociated factor VIII and in patients with von Willebrandi s disease. J Clin Invest (1977)60:390)〇
[0201] 活化的因子VIII是包含Al結構域和A2結構域以及包括結構域A3-C1-C2的輕 鏈的異三聚體。因子IX的活化是通過自分子兩步移除活化肽（Ala 146-Arg 180)來實現 (Bajaj 等，Human factor IX and factor IXa, METHODS IN ENZYM0L0GY· 1993)。第一裂解 是由因子XIa或因子Vila/組織因子在Arg 145-Ala 146位點處進行。第二且限速裂解是 在Arg 180-Val 181處進行。活化移除35個殘基。活化的人因子IX以通過一個使酶連接 於Gla結構域的二硫橋固持在一起的C末端重鏈（28kDa)和N末端輕鏈（18kDa)的異二聚 體形式存在。因子IXa又與活化的因子VIII協力活化因子X。或者，因子IX和X可均由通 過外源性路徑產生的與脂質化組織因子複合的因子Vila活化。因子Xa接著參與凝血酶原 轉化成凝血酶所憑藉的最終共同路徑，且凝血酶又使纖維蛋白原轉化成血纖維蛋白以形成 減塊。
[0202] 凝血過程中的缺陷可導致凝塊形成所花費的時間延長的流血病症（凝血病變）。 所述缺陷可為先天性的或獲得性的。舉例來說，甲型血友病和乙型血友病是特徵在於分別 缺乏FVIII和FIX的遺傳性疾病。換句話說，生物活性因子VIII糾正源於受甲型血友病折 磨的個體的血漿中的凝血缺陷。重組FVIII已顯示是有效的且已被核准用於治療成年患者 和兒科患者的甲型血友病，且也用於阻止流血事件或預防與創傷和/或手術相關的流血。 因子VIII的當前治療用途在治療展現因子VIII缺乏的個體以及患有血管性血友病（Von Willebrand's disease)的那些個體方面可存在問題。此外，以補充療法接受因子VIII的 個體常產生針對這些蛋白質的常降低或消除所結合的FVIII的促凝血活性的抗體。由於降 低或打消治療功效的這些抗體的存在，連續治療是極度困難的。
[0203] 在一方面，本發明涵蓋在CFXTEN融合蛋白組合物中包括與人FVIII -致的FVIII 序列、與FVIII序列具有同源性的序列、天然序列（如來自人、非人靈長類動物、哺乳動物 (包括家養動物））、或截短形式的FVIII ;其全部保留天然FVIII的至少一部分促凝血活性 且適用於預防、治療、介導或改善甲型血友病或與創傷、手術或缺乏凝血因子VIII相關的 流血事件。可通過標準同源性搜索技術（如NCBI BLAST)或在公開資料庫中得到與FVIII 具有同源性的序列，所述資料庫如化學文摘服務資料庫（Chemical Abstracts Services Database)(例如 CAS 登記）、GenBank、全球蛋白質資源（Universal Protein Resource) (UniProt)和訂閱提供的資料庫，如GenSeq(例如Derwent)。
[0204] 在一個實施方案中，併入主題CFXTEN組合物中的FVIII是序列對應於自然界中所 見的FVIII蛋白的重組多肽。在另一實施方案中，FVIII是天然序列的保留相應天然FVIII 的至少一部分促凝血活性的非天然FVIII序列變體、片段、同源物或模擬物。在另一實施方 案中，FVIII是全部或一部分B結構域缺失的截短變體（"FVIII BDD")，其可呈異二聚形式 或可保持為單鏈（"scFVIII")，後者描述於Meulien等，ProteinEng.(1988)2(4):301-306 中。FVIII BDD的非限制性實例是在以下處缺失胺基酸的因子VIII序列：在殘基編號741 與殘基編號1640之間（相對於天然成熟FVIII加以編號）、或在殘基編號745與殘基編號 1640之間、或在殘基編號745與殘基編號1640之間、或在殘基編號741與殘基編號1690之 間、或在殘基編號745與殘基編號1667之間、或在殘基編號745與殘基編號1657之間、或 在殘基編號747與殘基編號1642之間、或在殘基編號751與殘基編號1667之間。
[0205] 在另一實施方案中，將異源序列併入FVIII中，所述異源序列可包括如以下更充 分描述的XTEN。表1提供由本發明的CFXTEN融合蛋白涵蓋的FVIII的胺基酸序列的非限制 性清單。在一些實施方案中，併入CFXTEN融合蛋白中的FVIII包括相較於選自表1的具有 類似長度的胺基酸序列，具有至少約70%序列同一性、或者 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序列一性的蛋白質。
[0206] 表I :FVIII氨某酸序列
[0207]
【權利要求】
1. 一種包含因子VIII多肽和至少第一延伸重組多肽（XTEN)的重組因子VIII融合蛋 白，其中所述因子VIII多肽包含含有al酸性間隔子區域的A1結構域、含有a2酸性間隔子 區域的A2結構域、含有a3酸性間隔子區域的A3結構域、C1結構域、C2結構域和任選B結 構域的全部或一部分，且其中所述第一 XTEN在以下各處連接於所述因子VIII多肽：（i)所 述因子VIII多肽的C末端；（ii)如果存在所述B結構域的全部或一部分，那麼在所述因子 VIII多肽的所述B結構域內；（iii)在所述因子VIII多肽的所述A1結構域內；（iv)在所述 因子VIII多肽的所述A2結構域內；(v)在所述因子VIII多肽的所述A3結構域內；(vi)在 所述因子VIII多肽的所述C1結構域內；(vii)在所述因子VIII多肽的所述C2結構域內； (viii)在所述因子VIII多肽的N末端處，（ix)在所述因子VIII多肽的兩個結構域之間； 且其中當相較於未連接於XTEN的相應因子VIII蛋白時，所述融合蛋白（a)在體外凝血測 定中保留至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、 400 %或500 %的促凝血活性，或（b)在體外結合測定中展現與抗因子VIII抗體的結合降 低。
2. 如權利要求1所述的重組因子VIII融合蛋白，其包含因子VIII多肽和至少第一延 伸重組多肽（XTEN)，其中所述因子VIII多肽包含含有al酸性間隔子區域的A1結構域、含 有a2酸性間隔子區域的A2結構域、含有a3酸性間隔子區域的A3結構域、C1結構域、C2 結構域和任選B結構域的全部或一部分，且其中所述第一 XTEN在以下各處連接於所述因子 VIII多肽：（i)所述因子VIII多肽的C末端；（ii)如果存在所述B結構域的全部或一部分， 那麼在所述因子VIII多肽的所述B結構域內；（iii)在所述因子VIII多肽的所述A1結構 域內；（iv)在所述因子VIII多肽的所述A2結構域內；(v)在所述因子VIII多肽的所述A3 結構域內；(vi)在所述因子VIII多肽的所述C1結構域內；(vii)在所述因子VIII多肽的 所述C2結構域內；或（viii)在所述因子VIII多肽的兩個結構域之間；且當相較於未連接 於XTEN的相應因子VIII蛋白時，所述融合蛋白（a)在體外凝血測定中保留至少約10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%或 500%的促凝 血活性，以及（b)在體外結合測定中展現與抗因子VIII抗體的結合降低。
3. 如權利要求1或2所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述第一 XTEN在選自表5、 表6、表7、表8或表9的插入位點處連接於所述因子VIII多肽。
4. 一種包含因子VIII多肽和至少第一延伸重組多肽（XTEN)的重組因子VIII融合蛋 白，其中所述因子VIII多肽包含含有al酸性間隔子區域的A1結構域、含有a2酸性間隔子 區域的A2結構域、含有a3酸性間隔子區域的A3結構域、C1結構域、C2結構域和任選B結 構域的全部或一部分，且其中所述第一 XTEN在選自表6和表7的插入位點處連接於所述因 子VIII多肽且其中相較於未連接於XTEN的相應因子VIII蛋白，當通過體外凝血測定進 行測量時，所述融合蛋白保留至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100 %、200 %、300 %、400 % 或 500 % 的促凝血活性。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當最優比對時，所 述因子VIII多肽與選自由表1中的序列、圖3中描繪的序列和圖4中描繪的序列組成的 組的序列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、 或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約 99 %、或約100 %序列同一性。
6. 如權利要求1至5中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其包含在所述因子VIII 多肽的C末端處或在所述因子VIII多肽的所述B結構域內連接於所述因子VIII多肽或任 選置換所述因子VIII多肽的所述B結構域的至少第二XTEN。
7. 如權利要求1至5中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其包含在所述因子VIII 多肽的所述B結構域內連接於所述因子VIII多肽或任選置換所述因子VIII多肽的所述B 結構域的至少第二XTEN。
8. 如權利要求1至7中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多 肽包含人因子VIII的B結構域缺失的變體，其中關於如圖3中闡述的全長人因子VIII序 列，所述B結構域缺失自在約胺基酸殘基編號741至約750處的第一位置開始且在於約氨 基酸殘基編號1635至約1648處的第二位置處結束。
9. 如權利要求6至8中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述第一 XTEN序 列在所述因子VIII多肽的C末端處連接於所述因子VIII多肽，且所述第二XTEN在所述因 子VIII多肽的所述B結構域內連接於所述因子VIII多肽，其中關於如圖3中闡述的全長 人因子VIII序列，所述第二XTEN連接於約胺基酸殘基編號741至約750的C末端和氨基 酸殘基編號1635至約1648的N末端，其中所有XTEN的累積長度是至少約84個胺基酸殘 基。
10. 如權利要求1至9中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當最優比對時，相 較於選自由表21的序列組成的組的具有類似長度的序列，所述融合蛋白具有至少約80%、 或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約 95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、或至少約100%序列同 一性。
11. 如權利要求1至10中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其包含至少第二 XTEN、任選第三XTEN、任選第四XTEN、任選第五XTEN和任選第六XTEN，其中所述第二、第三、 第四、第五或第六XTEN各自在選自由以下組成的組的第二、第三、第四、第五或第六位點處 連接於所述因子VIII多肽： (a) 來自表5、表6、表7、表8或表9的插入位點； (b) 關於如圖3中闡述的全長人因子VIII序列，在胺基酸殘基編號32、220、224、336、 339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905 或 1910 的 6 個胺基酸內的插入位點； (c) 在所述因子VIII多肽的任何兩個鄰近結構域之間的插入位點，其中所述兩個鄰近 結構域選自由A1和A2結構域、A2和B結構域、B和A3結構域、A3和C1結構域、以及C1和 C2結構域組成的組； (d) 在所述因子VIII多肽的所述B結構域內，其中關於如圖3中闡述的全長人因子 VIII序列，所述第二XTEN連接於約胺基酸殘基編號741至約750的C末端和胺基酸殘基編 號1635至約1648的N末端； (e) 所述因子VIII多肽的C末端；以及 (f) 所述因子VIII多肽的N末端。
12. 如權利要求11所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述第一 XTEN與所述第二 XTEN相隔至少10個胺基酸、至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、至少200個胺基酸、至少 300個胺基酸或至少400個胺基酸。
13. 如權利要求1至12中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當向受試者施用 時，所述融合蛋白展現終末半衰期至少約3小時、或至少約4小時、或至少約6小時、或至少 約12小時、或至少約13小時、或至少約14小時、或至少約16小時、或至少約24小時、或至 少約48小時、或至少約72小時、或至少約96小時、或至少約120小時、或至少約144小時、 或至少約7天、或至少約14天、或至少約21天，其中所述受試者選自人和因子VIII/血管 性血友病因子雙重敲除小鼠。
14. 如權利要求1至13中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當最優比對時， 相較於選自由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列組成的組的具有類似長度的 XTEN，各XTEN具有至少約80%、或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約 93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少 約99%、或約100%序列同一性。
15. 如權利要求1至14中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中相較於未連接於 XTEN的相應因子VIII多肽，所述融合蛋白展現所述融合蛋白與抗因子VIII抗體的結合降 低和更大促凝血活性。
16. 如權利要求15所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當促凝血活性是通過體外凝 血測定加以測定時，相較於未連接於XTEN的相應因子VIII多肽，在所述抗FVIII抗體存在 下，所述融合蛋白的促凝血活性大至少30 %、40 %、50 %、80 %、100 %、200 %、300 %、400 % 或 500%。
17. 如權利要求15所述的重組因子VIII融合蛋白，其中相較於未連接於XTEN的相應 因子VIII多肽，所述融合蛋白與所述抗因子VIII抗體的結合降低是利用選自由表10中的 抗體和來自具有因子VIII抑制劑的甲型血友病患者的多克隆抗體組成的組的抗因子VIII 抗體，使用畢提斯達測定加以確定。
18. 如權利要求17所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白與抗因子VIII 抗體的結合降低和促凝血活性保留是由相較於未連接於XTEN的所述因子VIII多肽的畢提 斯達效價，所述融合蛋白的畢提斯達效價降低至少約2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、 70、80、100或200個畢提斯達單位所證明。
19. 一種包含至少一個延伸重組多肽（XTEN)的重組因子VIII融合蛋白，所述融合蛋白 具有式IX的結構： (A1N) - (S) a- (XTEN) t-⑶ b- (Alc) - (A2N) - (S) c- (XTEN) u-⑶ d- (A2C) - (BN) - (S) e- (XTEN)v-⑶ f- (Bc) - (A3N) - (S) g- (XTEN) w-⑶ h- (A3C) - (C1N) - (S)廠（XTEN) x-⑶廠（Clc) - (C2N) - (S)k- (XTEN) y-⑶ f (C2c)-⑶ m- (XTEN) z IX,其中就各次出現獨立而言， a) AlN是因子VIII的所述A1結構域的片段，其具有關於如圖3中闡述的全長人因子 VIII序列，在至少胺基酸殘基編號1至至多胺基酸殘基編號371的範圍內的序列； b) Al。是因子VIII的所述A1結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號2至至多氨 基酸殘基編號372的範圍內的序列，前提是所述A1N片段的序列在所述A1。片段中不重複； c) A2N是因子VIII的所述A2結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號373至至多 氣基酸殘基編號739的範圍內的序列； d) A2。是因子VIII的所述A2結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號374至至多 胺基酸殘基編號740的範圍內的序列，前提是所述A2N片段的序列在所述A2。片段中不重 復； e) BN是因子VIII的所述B結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號741至至多氨 基酸殘基編號1647的範圍內的序列； f) B。是因子VIII的所述B結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號742至至多氨 基酸殘基編號1648的範圍內的序列，前提是所述BN片段的序列在所述B。片段中不重複； g) A3N是因子VIII的所述A3結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號1649至至 多氣基酸殘基編號2018的範圍內的序列； h) A3。是因子VIII的所述A3結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號1650至至 多胺基酸殘基編號2019的範圍內的序列，前提是所述A3N片段的序列在所述A3。片段中不 重複； i) ClN是因子VIII的所述C1結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號2020至至 多胺基酸殘基編號2171的範圍內的序列； j) Cl。是因子VIII的所述C1結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號2021至至 多胺基酸殘基編號2172的範圍內的序列，前提是所述C1N片段的序列在所述C1。片段中不 重複； k) C2N是因子VIII的所述C2結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號2173至至 多胺基酸殘基編號2331的範圍內的序列； l) C2。是因子VIII的所述C2結構域的片段，其具有在至少胺基酸殘基編號2174至至 多胺基酸殘基編號2332的範圍內的序列，前提是所述C2N片段的序列在所述C2。片段中不 重複； m) S是具有1個至約50個之間的胺基酸殘基的可任選包括可與限制位點相容的裂解序 列或胺基酸的間隔子序列； n) a是0或1 ; 〇)b是0或1 ; p) c是0或1 ; q) d是0或1 ; r) e是0或1 ; s) f是0或1 ; t) g是0或1 ; u) h是0或1 ; v) i是0或1 ; w) j是0或1 ; x) k是0或1 ; y) 1是〇或1 ; z) m是0或1 ; aa) t 是 0 或 1 ; bb)u 是 0 或 1 ; cc) v 是 0 或 1 ; dd) w 是 0 或 1 ; ee) x 是 0 或 1 ; ff)y 是 〇 或 1 ; gg) z 是 0 或 1,前提是 t+u+v+w+x+y+z 彡 1 ; hh)各XTEN獨立地是延伸重組蛋白； 且其中所述融合蛋白具有至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或100%的未連接於XTEN的相應因子VIII多肽的促凝血活性，或其中當通過是ELISA或畢 提斯達測定的體外測定進行測量時，相較於未連接於XTEN的相應因子VIII，所述融合蛋白 展現與抗因子VIII抗體的結合降低。
20. 如權利要求19所述的重組因子VIII融合蛋白，其中z是1。
21. 如權利要求19所述的重組因子VIII融合蛋白，其中v是1且其中關於如圖3中闡 述的全長人因子VIII序列，（XTEN)v連接於約胺基酸殘基編號741至約750的C末端和氨 基酸殘基編號1635至約1648的N末端。
22. 如權利要求19所述的重組因子VIII融合蛋白，其中t、u、v、w、x、y和z的總和等 於 2、3、4、5 或 6。
23. 如權利要求22所述的重組因子VIII融合蛋白，其中t、u、v、w、x、y和z的總和等 於2,且v是1且z是1。
24. 如權利要求22所述的重組因子VIII融合蛋白，其中t、u、v、w、x、y和z的總和等 於3, v和z各自等於1，且t、u、w、x或y的一者是1。
25. 如權利要求22所述的重組因子VIII融合蛋白，其中t、u、v、w、x、y和z的總和等 於4, v和w和z各自等於1，且t、u、x或y的一者是1。
26. 如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所有XTEN的累積長 度在約84至約3000、或在約144至約2000、或約288至約1000個胺基酸殘基之間。
27. 如權利要求19至26中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當最優比對時， 相較於選自由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列組成的組的具有類似長度的 XTEN，各XTEN具有至少約80%、或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約 93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少 約99%、或約100%序列同一性。
28. 如權利要求19至27中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中各XTEN獨立地 在選自表5、表6、表7、表8和表9的插入位點處連接於所述融合蛋白。
29. 如權利要求19至28中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中XTEN是緊靠對 應於成熟天然人因子VIII中選自由以下組成的組的胺基酸的胺基酸的下遊插入：胺基酸 殘基編號 32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905 和 1910。
30. -種重組因子VIII融合蛋白，其包含：包含式X :(A1) -al - (A2) -a2 - [B]的第 一多肽；和包含式XI :a3 - (A3) - (Cl)_ (C2)的第二多肽； 其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以異二聚體形式存在； 其中，a)Al是因子VIII的A1結構域；b)A2是因子VIII的A2結構域；c) [B]是因子 VIII的B結構域、其片段或被缺失；d) A3是因子VIII的A3結構域；e)Cl是因子VIII的C1 結構域；f)C2是因子VIII的C2結構域；g)al、a2和a3是酸性間隔子區域； 其中所述A1結構域包含XTEN容許環-1 (A1-1)區域和XTEN容許環-2 (A1-2)區域； 其中所述A2結構域包含XTEN容許環-1 (A2-1)區域和XTEN容許環-2 (A2-2)區域； 其中所述A3結構域包含XTEN容許環-1 (A3-1)區域和XTEN容許環-2 (A3-2)區域； 其中XTEN序列插入所述區域Al-l、Al-2、A2-l、A2-2、A3-l或A3-2的至少一者中；且 其中所述重組因子VIII蛋白展現促凝血活性。
31. -種重組因子VIII融合蛋白，其包含：包含式X:(A1) -al - (A2) -a2- [B]的第 一多肽；和包含式XI :a3 - (A3) - (Cl)_ (C2)的第二多肽； 其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以異二聚體形式存在； 其中，a)Al是因子VIII的A1結構域；b)A2是因子VIII的A2結構域；c) [B]是因子 VIII的B結構域、其片段或被缺失或任選不存在；d) A3是因子VIII的A3結構域；e) C1是因 子VIII的C1結構域；f)C2是因子VIII的C2結構域；g)al、a2和a3是酸性間隔子區域； 其中XTEN插入a3中；且 其中所述融合蛋白展現促凝血活性。
32. 如權利要求30或權利要求31所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述第一多肽 和所述第二多肽形成包含式（Al) -al- (A2) -a2- [B] - [a3] - (A3) - (Cl) - (C2)的單一多肽鏈。
33. 如權利要求30所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述XTEN容許環包含在表面 暴露的可撓性環結構內，且其中根據以DSSP資料庫的登錄號2R7E儲存的成熟因子VIII的 二級結構，A1-1位於0鏈1與0鏈2之間，A1-2位於0鏈11與0鏈12之間，A2-1位 於3鏈22與@鏈23之間，A2-2位於@鏈32與@鏈33之間，A3-1位於@鏈38與3 鏈39之間且A3-2位於0鏈45與0鏈46之間。
34. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中包含A1-1的所述表面暴露的 可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸15至約胺基酸45的區域。
35. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中A1-1對應於天然成熟人因子 VIII中自約胺基酸18至約胺基酸41的區域。
36. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中包含A1-2的所述表面暴露的 可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸201至約胺基酸232的區域。
37. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中A1-2對應於天然成熟人因子 VIII中自約胺基酸218至約胺基酸229的區域。
38. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中包含A2-1的所述表面暴露的 可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸395至約胺基酸421的區域。
39. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中A2-1對應於天然成熟人因子 VIII中自約胺基酸397至約胺基酸418的區域。
40. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中包含A2-2的所述表面暴露的 可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸577至約胺基酸635的區域。
41. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中A2-2對應於天然成熟人因子 VIII中自約胺基酸595至約胺基酸607的區域。
42. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中包含A3-1的所述表面暴露的 可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸1705至約胺基酸1732的區域。
43. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中A3-1對應於天然成熟人因子 VIII中自約胺基酸1711至約胺基酸1725的區域。
44. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中包含A3-2的所述表面暴露的 可撓性環結構對應於天然成熟人因子VIII中自約胺基酸1884至約胺基酸1917的區域。
45. 如權利要求33所述的重組因子VIII融合蛋白，其中A3-2對應於天然成熟人因子 VIII中自約胺基酸1899至約胺基酸1911的區域。
46. 如權利要求30和32至45中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中XTEN插 入所述區域六1-1、六1-2、六2-1、六2-2、六3-1或六3-2的至少兩者中。
47. 如權利要求30和32至46中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中XTEN是 緊靠對應於成熟天然人因子VIII中選自由以下組成的組的胺基酸的胺基酸的下遊插入： 胺基酸殘基編號 32、220、224、399、416、603、1711、1725、1905 和 1910。
48. 如權利要求30和32至47中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中另一 XTEN 序列插入a3酸性間隔子區域中。
49. 如權利要求48所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述另一 XTEN序列緊靠對應 於成熟天然人因子VIII中的胺基酸1656的胺基酸的下遊插入a3酸性間隔子中。
50. 如權利要求31所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述A1結構域包含XTEN容許 環-1 (A1-1)區域和XTEN容許環-2 (A1-2)區域； 其中所述A2結構域包含XTEN容許環-1 (A2-1)區域和XTEN容許環-2 (A2-2)區域； 其中所述A3結構域包含XTEN容許環-1 (A3-1)區域和XTEN容許環-2 (A3-2)區域；且 其中另一 XTEN插入所述區域Al-1、Al-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2的至少一者中。
51. 如權利要求31所述的重組因子VIII融合蛋白，其中另一 XTEN緊靠對應於成熟天 然人因子VIII中選自由以下組成的組的胺基酸的胺基酸的下遊插入：胺基酸殘基編號32、 220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905 和 1910。
52. 如權利要求15至51中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白 展現至少約30%、40%、50%、60%、70%或80%或90%的未連接於XTEN的相應因子VIII 的促凝血活性，其中所述促凝血活性是通過體外凝血測定加以測定。
53. 如權利要求52所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述促凝血活性是通過顯色測 定、單級凝結測定或兩者進行測量。
54. 如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當在細胞培養基 中表達且通過體外凝血測定加以測定時，所述融合蛋白展現體外促凝血活性超過約0. 5IU/ ml、或約 1. 0、或約 1. 5、或約 2. 0IU/ml。
55. 如權利要求30至54中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當向受試者施 用時，所述融合蛋白展現終末半衰期至少約3小時、或4小時、或6小時、或12小時、或13 小時、或14小時、或16小時、或24小時、或48小時、或72小時、或96小時、或120小時、或 144小時、或7天、或14天、或21天。
56. 如權利要求55所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述受試者是人。
57. 如權利要求55所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述受試者是因子VIII/血管 性血友病因子雙重敲除小鼠。
58. 如權利要求30至57中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中相較於未連接 於XTEN的所述相應因子VIII，所述融合蛋白展現與抗因子VIII抗體的結合降低。
59. 如權利要求58所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當使用選自由表10中的抗體 和來自具有因子VIII抑制劑的甲型血友病患者的多克隆抗體組成的組的抗因子VIII抗體 在畢提斯達測定中進行測定時，相較於未連接於XTEN的所述因子VIII，所述因子VIII融合 蛋白具有的畢提斯達效價低至少約2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、100或200 個畢提斯達單位。
60. -種包含因子VIII多肽和至少第一和第二延伸重組多肽（XTEN)的重組因子VIII 融合蛋白，其中所述第一 XTEN在所述因子VIII多肽的C2結構域內連接於所述因子VIII 多肽，且所述第二XTEN在所述因子VIII多肽的A1或A2結構域內連接於所述因子VIII多 肽；其中（a)相較於未連接於XTEN的相應因子VIII，所述融合蛋白展現與抗因子VIII抗 體的結合降低，所述因子VIII抑制劑抗體能夠結合位於所述A1、A2或C2結構域內的表位； 和/或（b)其中所述融合蛋白展現促凝血活性。
61. 如權利要求60所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述第二XTEN在所述因子 VIII多肽的所述A2結構域內連接於所述因子VIII多肽。
62. 如權利要求60所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述抗因子VIII抗體結合所 述因子VIII多肽的所述A2結構域。
63. 如權利要求60所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述抗因子VIII抗體結合所 述因子VIII多肽的所述C2結構域。
64. 如權利要求60所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述重組因子VIII融合蛋白 進一步包含第三XTEN，其中所述第三XTEN在所述B結構域內或置換所述B結構域的插入位 點處連接於所述因子VIII在C末端處連接於所述因子VIII。
65. 如權利要求60所述的重組因子VIII融合蛋白，其包含在選自由表7中的位點組 成的組的插入位點的1、2、3、4、5或6個胺基酸處或內連接在所述因子VIII多肽內的第三 XTEN。
66. 如權利要求60所述的重組因子VIII融合蛋白，其包含在選自由表9中的位點組 成的組的插入位點的1、2、3、4、5或6個胺基酸處或內連接在所述因子VIII多肽內的第三 XTEN。
67. 如權利要求60至66中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當通過ELISA 測定加以測定時，相較於未連接於XTEN的所述相應因子VIII多肽，抗因子VIII抗體與所 述融合蛋白的結合降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%。
68. 如權利要求60至67中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述抗因子 VIII抗體選自由表10中的抗體和來自具有因子VIII抑制劑的甲型血友病受試者的多克隆 抗體組成的組。
69. 如權利要求60至68中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當通過體外凝 血測定加以測定時，相較於未連接於XTEN的所述相應因子VIII，在抗因子VIII抗體存在 下，所述融合蛋白保留至少 10%、20%、30%、40%、50%、80%、100%、200%、300%、400% 或500 %或更多的促凝血活性。
70. 如權利要求69所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述測定是顯色測定。
71. 如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，各XTEN具有特徵在於以 下的序列： (a) 所述XTEN包含至少36個胺基酸殘基； (b) 甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、穀氨酸（E)和脯氨酸（P)殘基的 總和佔所述XTEN的總胺基酸殘基的約80%以上； (c) 所述XTEN序列大致上是非重複的以致（i)所述XTEN不含有三個相同連續胺基酸， 除非所述胺基酸是絲氨酸；（ii)至少約80%的所述XTEN序列由非重疊序列基序組成，所述 序列基序各自包含約9至約14個由四至六個選自甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨 酸（T)、穀氨酸（E)和脯氨酸（P)的胺基酸組成的胺基酸殘基，其中在各所述序列基序中，任 何兩個連續胺基酸殘基都不出現超過兩次；或（iii)所述XTEN序列的子序列計分小於10 ; (d) 所述XTEN具有大於90 %無規捲曲形成率，如通過GOR算法所確定； (e) 所述XTEN具有小於2% a螺旋和2% 0摺疊，如通過Chou-Fasman算法所確定； 且 (f) 當通過TEPIT0PE算法分析時，所述XTEN缺乏預測的T細胞表位，其中關於通過所 述算法進行所述預測的TEPIT0PE閾值計分的閾值是-9。
72. 如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當最優比對時，相 較於一個或多個選自由表4、表13、表14、表15、表16和表17組成的組的具有類似長度的 XTEN序列，各XTEN獨立地具有至少約80 %、或至少約90 %、或至少約91 %、或至少約92 %、 或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約 98%、或至少約99%、或約100%序列同一性。
73. 如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中相較於選自 AE42_1、AE42_2、AE42_3、AG42_1、AG42_2、AG42_3、AG42_4、AE144_1 A、AE144_2A、AE144_2B、 AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AG 144_ 1、AG 144_2、AG 144_ A、AG144_B、AG144_C、AG144_F、AG144_3、AG144_4、AE288_1、AE288_2、AG288_1 和 AG288_2 的序列，至少一個XTEN具有至少90 %、或至少約91 %、或至少約92 %、或至少約93 %、或至 少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%、 或約100 %序列同一性。
74. 如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其在所述因子VIII序列 中包含一個、兩個或三個選自由相對於成熟人因子VIII編號的殘基R1645、R1648、Y1680、 R1689及其任何組合組成的組的胺基酸取代，其中各取代是獨立地成為是丙氨酸、甘氨酸或 苯丙氨酸的胺基酸。
75. 如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白展現 表觀分子量因子至少約1. 3、或至少約2、或至少約3、或至少約4、或至少約5、或至少約6、 或至少約7、或至少約8、或至少約9、或至少約10。
76. 如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽 通過一個或兩個各自可由選自由因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、因子IXa、因 子Xa、因子Ila(凝血酶）、彈性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20組成的組的哺 乳動物蛋白酶裂解的裂解序列連接於至少一個XTEN，其中由所述哺乳動物蛋白酶在所述裂 解序列處裂解會自所述XTEN釋放所述因子VIII序列，且其中所述釋放的因子VIII序列相 較於所述未裂的解融合蛋白展現促凝血活性增加。
77. 如權利要求76所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述裂解序列可由因子XIa裂 解。
78. -種包含至少三個獨立XTEN的重組因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽 包含含有al酸性間隔子區域的A1結構域、含有a2酸性間隔子區域的A2結構域、含有a3 酸性間隔子區域的A3結構域、Cl結構域、C2結構域和任選B結構域的全部或一部分，且其 中所述至少三個XTEN各自位於所述因子VIII多肽的不同插入位點處，其中所述不同插入 位點各自獨立地選自由以下組成的組： (a) 來自表5、表6、表7、表8或表9的插入位點； (b) 關於如圖3中闡述的全長人因子VIII序列，在胺基酸殘基32、220、224、336、339、 390、399、416、603、1656、1711、1725、1905 或 1910 的 6 個胺基酸內的插入位點； (c) 在所述因子VIII序列中的任何兩個鄰近結構域之間的插入位點，其中所述兩個鄰 近結構域選自由A1和A2、A2和B、B和A3、A3和C1、以及C1和C2組成的組； (d) 關於如圖3中闡述的全長人因子VIII序列，在自在約胺基酸殘基編號741至約750 處的第一位置開始且在於約胺基酸殘基編號1635至約1648處的第二位置處結束的內部B 結構域缺失內的插入位點； (e) 所述因子VIII序列的C末端； (f) 所述因子VIII序列的N末端；以及 (g) 在所述因子VIII多肽的兩個鄰近結構域之間； 其中所有XTEN的累積長度是至少約84至約3000個胺基酸殘基。
79. 如權利要求78所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白不包含選自 GTPGSGTASSSP (SEQ ID NO: 31), GSSTPSGATGSP (SEQ ID NO: 32), GSSPSASTGTGP (SEQ ID N0:33)、GASPGTSSTGSP(SEQ ID N0:34)和 GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSET PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP(S EQ ID NO :59)的序列。
80. 如權利要求78或權利要求79所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白 不含有由 GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSET PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP(S EQ ID NO :59), PGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTG SPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSS(S EQ ID NO:71)或 PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS PGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPG- SGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGAT GSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGS(SEQ ID NO:80) 組成的XTEN序列。
81. 如權利要求78至80中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中相較於未連接 於XTEN的所述相應因子VIII，所述融合蛋白保留至少約30%、或約40%、或約50%、或約 60%、或約70%、或約80%、或約90%的促凝血活性，其中所述促凝血活性是通過體外凝血 測定加以測定。
82. 如權利要求78至80中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白，其中相較於缺乏所 述XTEN的相應因子VIII多肽，當向受試者施用時，所述融合蛋白展現終末半衰期延長。
83. 如權利要求82所述的重組因子VIII融合蛋白，其中當向受試者施用時，所述融合 蛋白展現終末半衰期至少約3小時、或4小時、或6小時、或12小時、或13小時、或14小 時、或16小時、或24小時、或48小時、或72小時、或96小時、或120小時、或144小時、或 7天、或14天、或21天。
84. 如權利要求83所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述受試者是人。
85. 如權利要求83所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述受試者是因子VIII/血管 性血友病因子雙重敲除小鼠。
86. -種包含因子VIII多肽和至少一個XTEN的重組因子VIII融合蛋白，其中所述 因子VIII多肽包含A1結構域、A2結構域、A3結構域、C1結構域、C2結構域和任選B結構 域的全部或一部分，且其中所述至少一個XTEN的各者在選自由殘基編號18-32、或40、或 211-224、或 336-403、或 599、或 745-1640、或 1656-1728、或 1796-1804、或 1900-1912、或 2171-2332組成的組的插入位點處連接於所述因子VIII多肽；且其中所述融合蛋白具有 至少約30%、或約40%、或約50%、或約60%、或約70%、或約80%、或約90%的未連接於 XTEN的相應因子VIII的促凝血活性。
87. -種藥物組合物，其包含如前述權利要求中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白 和藥學上可接受的載體。
88. -種治療受試者的凝血病變的方法，其包括向所述受試者施用包含凝結有效量的 如權利要求87所述的藥物組合物的組合物。
89. 如權利要求88所述的方法，其中在所述施用之後，相較於包含未連接於XTEN的因 子VIII且以類似劑量向所述受試者施用的相應組合物，促凝血因子VIII的血液濃度維持 在較大水平下。
90. 如權利要求89所述的方法，其中在所述施用之後，所述血液濃度維持在約0. 05IU/ ml、或約0. lIU/ml、或約1. 5IU/ml或更高持續至少48小時。
91. 一種使受試者的血液凝結的方法，其包括使凝結有效量的如權利要求87所述的藥 物組合物與所述血液接觸。
92. -種治療具有因子VIII的循環抑制劑的受試者的凝血病變的方法，其包括向所 述受試者施用凝結有效量的如權利要求87所述的藥物組合物，其中相較於包含未連接於 XTEN的所述相應因子VIII且使用類似量向所述受試者施用的組合物，所述組合物展現在 所述受試者中的促凝血活性較大。
93. -種處理受試者的流血事件的方法，其包括向所述受試者施用凝結有效量的如權 利要求87所述的藥物組合物，其中相較於未連接於XTEN且使用類似量向所述受試者施用 的所述相應因子VIII，所述融合蛋白的所述凝結有效量遏止流血事件持續的時期長至少2 倍、或至少3倍。
94. 如權利要求88至93所述的方法，其中所述凝血病變是甲型血友病。
95. -種用於治療甲型血友病受試者的醫藥方案中的重組因子VIII融合蛋白，所述方 案包括包含如權利要求1至86中任一項所述的重組因子VIII融合蛋白的藥物組合物。
96. 如權利要求95所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述醫藥方案進一步包括確定 為在所述甲型血友病受試者中實現止血所需的藥物組合物的量的步驟。
97. 如權利要求95所述的重組因子VIII融合蛋白，其中用於治療甲型血友病受試者的 所述醫藥方案包括以有效量連續兩劑或更多劑向所述受試者施用所述藥物組合物，其中相 較於未連接於XTEN且使用類似劑量施用的因子VIII，所述施用導致至少一個、兩個或三個 與甲型血友病相關的參數較大改善至少10%、或20 %、或30%、或40 %、或50%、或60 %、 或 70%、或 80%、或 90%。
98. 如權利要求97所述的重組因子VIII融合蛋白，其中所述改善的參數選自促凝血因 子VIII的血液濃度、活化的部分凝血酶原（aPTT)測定時間減少、單級或兩級凝結測定時間 減少、流血事件的發作延遲、顯色測定時間減少、流血測定時間減少、流血事件解決、或相對 於天然FVIII的畢提斯達效價降低。
99. 一種用於治療甲型血友病的重組因子VIII融合蛋白，其包含如權利要求1至86中 任一項所述的重組因子VIII融合蛋白。
100. -種核酸或其互補序列，所述核酸編碼如權利要求1至86中任一項所述的重組因 子VIII融合蛋白。
101. 如權利要求100所述的核酸，其進一步包含編碼信號肽的序列，其中所述序列是 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID NO:1613) 或其互補序列。
102. 一種表達載體，其包含如權利要求100或權利要求101所述的核酸。
103. -種分離的宿主細胞，其包含如權利要求102所述的表達載體。
104. -種產生如權利要求1至86中任一項所述的融合蛋白的方法，其包括： (a) 提供包含如權利要求102所述的表達載體的宿主細胞； (b) 在用以實現所述融合蛋白的產生的條件下培養所述宿主細胞；以及 (c) 回收所述融合蛋白。
105. -種包含多肽的重組因子VIII融合蛋白，當最優比對時，相較於選自表21的具 有類似長度的序列，所述多肽具有至少約80%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約 92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少 約98%、或至少約99%、或至少約100%序列同一性。
106. -種分離的核酸，其包含選自以下的多核苷酸序列：（a)當最優比對時，相較於選 自表21的具有類似長度的序列，具有至少約80%、或至少約90%、或至少約91%、或至少 約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或 至少約98%、或至少約99%、或至少約100%序列同一性的序列，或（b) (a)的多核苷酸的互 補序列。
107. 如權利要求106所述的分離的核酸，其進一步包含連接於（a)的核酸的5'末端的 序列 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCnTTGCGAITCTGCTTTAGT 或所述序列的連 接於（b)的3'末端的互補序列。
【文檔編號】A61K38/37GK104487452SQ201280072346
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2012年7月11日 優先權日:2012年2月15日
【發明者】沃爾克·斯徹勒伯格, 佩-雲·常, 伐巴德哈·瓦法傑, 丁勝, 約勝·斯沃曼, 查-威·王, 班傑明·斯平克, 威廉·P·斯蒂姆, 內森·吉森, 約翰·庫曼, 劉童瑤, 伽拉貝特·G·託比, 江海燕, 羅伯特·彼得斯, 王德平, 梅柏松 申請人:阿穆尼克斯運營公司, 比奧根艾迪克Ma公司