一種檢測鄰苯二甲酸二甲酯的方法及試劑盒的製作方法
2023-09-15 20:55:55 2
一種檢測鄰苯二甲酸二甲酯的方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測鄰苯二甲酸二甲酯的方法及試劑盒，屬於生物檢測領域。本發明通過化學方法合成了DMP人工抗原，再用DMP人工抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合篩選得到分泌DMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株；再以合成的DMP人工抗原作為包被抗原、DMP單克隆抗體作為一抗創建了檢測DMP的間接競爭ELISA方法和試劑盒，可用於樣品中的DMP測定，該方法具有操作簡單、費用低廉、快速靈敏等優點。
【專利說明】-種檢測鄰苯二甲酸二甲醒的方法及試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物檢測領域，涉及一種簡便、費用低廉、快速靈敏檢測鄰苯二甲酸二 甲醋（DMP)的免疫學方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 鄰苯二甲酸二甲醋（DMP)，又稱1,2-苯二甲酸二甲醋，駄酸二甲醋，英文名是 Dimeth}d地地313*6,分子式(：1化。〇4,分子量為194. 19,密度為1. 191g/mL。DMP是一種無 色透明，微黃色油狀的液體，稍微有點芳香味，其沸點為283. 7C，能與己醇、己離等一般有 機溶劑混溶，不溶於水和石油離。鄰苯二甲酸醋類與塑料分子的相容性很化它們之間由氨 鍵或範德華力連接，彼此保留各自相對獨立的化學性質，常常作為增塑劑廣泛應用於食品 包裝、醫療設備製造、建築裝修、農業用品等生活的各個領域，隨著使用時間由塑料轉移到 環境中，造成空氣、水和±壤的汙染。美國環保局巧PA)將6種鄰苯二甲酸醋類（PAEs)類 化合物列入129種重點控制的汙染物名單中，包括鄰苯二甲酸二甲醋（DMP)、鄰苯二甲酸二 己醋值EP)、鄰苯二甲酸二下醋值BP)、鄰苯二甲酸二辛醋值OP)、鄰苯二甲酸下予醋炬BP) 和鄰苯二甲酸二（2-己基）己醋值EHP)，我國環境優先汙染物黑名單中也包括3種PAEs化 合物；鄰苯二甲酸二甲醋（DMP)、鄰苯二甲酸二下醋值BP)、鄰苯二甲酸二辛醋值OP)。
[0003] 我國食品接觸材料中DMP的使用限量為3%，僅能用於非接觸、非脂肪性食品的 材料，不得用於接觸嬰幼兒食品用材料。我國對食品塑料包裝材料進行提取、淨化後經氣 相色譜-質譜聯用（GC-M巧測定，採用特徵選擇離子監測掃描模式檢測，DMP最低可檢出 0.05mg/kg。賈麗等運用高效液相色譜法OPLC)測定鄰苯二甲酸二甲醋，用己醇提取樣品 中的鄰苯二甲酸醋類，再用己膳-水作為淋洗液，測定DMP的檢出限為0. 14 y g/L。
[0004] 目前，國內外對DMP的監測方法主要是色譜法，包括氣相和液相色譜法，此外，還 有色譜-質譜的聯用技術。雖然該些方法都能精確地檢測DMP的含量，但此法對儀器條件 要求高，前處理的操作相對複雜、耗時也較長。現已有基於多克隆抗體的PAEs免疫檢測研 究，但多克隆抗體的製備受動物免疫時間、免疫批次限制而不能無限量生產。
【發明內容】
[000引本發明的目的在於提供一種分泌DMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發明的目的 還在於提供一種檢測DMP的間接競爭化ISA方法及試劑盒。
[0006] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0007] -種分泌DMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，通過包含如下步驟的方法製備得到：
[0008] (1)取用DMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾細胞與SP2/0細胞息液混合。
[0009] (2)離也棄上清，加入PEG使細胞融合，再加入1640培養基終止陽G的作用；重複 該步驟。
[0010] (3)離也棄上清，加入HAT培養基，鋪至細胞板中進行培養。
[0011] (4)融合後第7天觀察，標出有融合細胞的孔，記錄位置和克隆數，補加HAT培養 基；2周後，用HAT培養基全量換液，待細胞長至板底1/10時做檢測。
[0012] (5)選擇效價最高的並且對DMP具有特異性的陽性細胞進行克隆，克隆化結束後， 建株得到分泌DMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0013] 步驟（1)中所述的DMP人工抗原優選通過包含如下步驟的方法製備得到：
[0014] 1)半抗原的合成
[00巧]往10血甲醇中加入IOg 4-硝基鄰苯二甲酸，攬拌下加入1血濃硫酸（98% )作催 化劑，12CTC回流化。反應結束後，繼續升溫，蒸出剩餘的甲醇。抽濾除去催化劑，得到粗產 品。粗產品用氨氧化軸中和，減壓蒸觸收集180?185C /7. 3kPa的觸分，得到純淨的4-硝 基鄰苯二甲酸二甲醋。用甲醇作溶劑，溶解4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋，按照每3mmol 4-硝 基鄰苯二甲酸二甲醋加0. 〇5g把碳的比例加入把碳，加氨氣還原24小時。除去未參加反應 的把碳和甲醇，得到4-氨基鄰苯二甲酸二甲醋（DMAP)晶體。
[001引。人工抗原的合成
[0017] 將40mg(0. 2mmol)DMAP溶於2血二氧六環中，攬拌條件下緩慢加入2血Imol/L 肥1。待冷卻至4。滴加200iiL 7%的NaN〇2溶液，攬拌反應30min得到重氮鹽溶液。再 將10血含60mg載體蛋白的0. 2mol/L pH9. 0測酸鹽緩衝液加入到重氮鹽溶液中，繼續反應 池。IOOOOg離也5min，取上清，放於0. Imol/L抑7. 4PBS中透析，得到DMP人工抗原。所 述的載體蛋白優選為牛血清白蛋白炬SA)或卵清蛋白（OVA)，相應得到的DMP人工抗原為 DMAP-BSA 或 DMAP-OVA。
[0018] 一種檢測DMP的間接競爭化ISA方法，包括如下步驟：
[001引 （1)試劑1用試劑2稀釋至0.5 yg/血，100 UL/孔包被酶標板，空白對照孔加 IOOy L試劑2,4°C過夜。
[0020] 似每孔加入200 y L試劑3,輕晃90s，倒出孔內液體，拍幹，重複3次後，每孔加入 250 Ul試劑4,放於37 °C比。
[002。 做每孔加入200 y L試劑3,搖晃90s，倒出孔內液體，拍幹，重複3次後，按如下 處理加樣；DDMP標準品；用試劑5梯度稀釋的不同濃度的DMP標準品50 UL 2)檢測樣品： 用試劑5溶解的檢測樣品50 y L，扣陽性對照；50 y L試劑5 ;各處理分別再加入50 y L試劑 6 (濃度為250ng/mL)，放於37C比；
[002引 （4)每孔加入200 y L試劑3,輕晃90s，倒出孔內液體，拍幹，重複3次後，每孔加入 IOOy L 試齊U 7,放於 370C Ih。
[002引 妨每孔加入200 y L試劑3,輕晃90s，倒出孔內液體，拍幹，重複3次後，新鮮配製 試劑8,100 y L/孔加入酶標板，室溫避光25min。
[0024] (6)每孔加50 U L試劑9,終止反應，用酶標儀測定492皿處的吸光值。
[0025] (7) W DMP標準品的濃度對數log[C]為橫坐標狂)，對應的抑制率I (%)為縱坐 標（Y)，可得一條Y = bX+a直線，抑制率I (%)通過如下公式計算得到：
[0026] 1(%)=令^xlOO A-A.,,
[0027] 式中；A為陽性對照孔的吸光值，Ai為含有濃度i的DMP孔的吸光值，A。為空白對 照孔的吸光值。
[0028] 根據檢測樣品的吸光值計算抑制率Y，代入直線，可得X，取反對數，即可得出檢測 樣品中DMP的濃度。
[0029] 上述步驟中試劑1-9分別為：人工抗原DMAP-0VA，0. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩 衝液，含0.05% Tween-20的PBS ;1%卵清蛋白，含1%牛血清白蛋白的PBS，DMP單克隆 抗體，HRP標記的羊抗小鼠IgG, OPD顯色劑，2mol/L略〇4。所述的DMP單克隆抗體由W DMAP-BSA作為DMP人工抗原通過上述方法製備的雜交瘤細胞株分泌得到，具體方法為：將 約為1-2 X IO6個雜交瘤細胞用0. Olmol/L抑7. 4PBS漂洗2次，小也將細胞吹下，200g離也 5min棄上清，再用0. 4mL PBS息浮細胞沉澱，注射到已提前用石蠟處理過的BALB/c小鼠腹 腔內。10-12天後無菌操作收集小鼠腹水，200g離也5min，沉澱細胞可凍存，上清中含有大 量單克隆抗體。通過二氧化娃吸附法除去腹水中的小顆粒物質、殘渣和脂肪滴。辛酸/硫 酸饋沉澱法純化腹水，在PBS中透析4-5天，得到純化腹水，獲得DMP單克隆抗體。
[0030] 一種檢測DMP的間接競爭化ISA試劑盒，包含上述試劑1-9和DMP標準品。
[0031] 為了更好地檢測DMP的汙染水平W及評價暴露於DMP產生的潛在不利影響，本發 明製備出一株能穩定分泌DMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，通過間接競爭化ISA方法檢測 DMP在環境、生活用品、醫療器械、人體血液W及尿液中的含量，與色譜法相比，操作簡單、費 用低廉、快速靈敏等優點。
[0032] 採用本發明方法和試劑盒，根據所建立的標準曲線y = 19. 68X+20. 71，R2 = 0. 993(圖1)，當抑制率達到10%時，得到鄰苯二甲酸二甲醋的最低檢測限（LD)即ICi。為 0. 28 U g/Lo
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033] 圖1是通過本發明方法測定DMP的標準曲線。
【具體實施方式】
[0034] W下實施例用於進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。若未特別指 明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0035] 實施例IDMP人工抗原的合成
[003引 1、半抗原的合成
[0037] 在裝有溫度計、分水器、冷凝管的H頸燒瓶中，加入IOg 4-硝基鄰苯二甲酸和 IOmL甲醇，在磁力攬拌器的作用下，加入ImL濃硫酸（98% )催化劑，控制反應溫度在12CTC 左右，回流化。反應結束後，繼續升溫，蒸出剩餘的甲醇。抽濾除去催化劑，得到粗產品。粗 產品用氨氧化軸中和，減壓蒸觸收集180?185C /7. 3kPa的觸分，得到純淨的4-硝基鄰苯 二甲酸二甲醋，是一種淡黃色晶體。用甲醇作溶劑，完全溶解4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋，按 照每3mmol樣品加0. 05g把碳的比例加入把碳，加氨氣還原24小時。除去未參加反應的把 碳和甲醇，得到4-氨基鄰苯二甲酸二甲醋（DMAP)晶體。
[0038] 2、人工抗原的合成
[0039] 將40mg(0. 2mmol)DMAP溶於2血二氧六環中，攬拌條件下緩慢加入2血Imol/L 肥1。待冷卻至4。滴加200iiL 7%的NaN〇2溶液，攬拌反應30min得到重氮鹽溶液。再 將10血含60mg載體蛋白炬SA或OVA)的0. 2mol/L pH9. 0測酸鹽緩衝液加入到重氮鹽溶 液中，繼續反應化。IOOOOg離也5min，取上清，放於0. Imol/L抑7. 4PBS中透析，得到人工 抗原 DMAP-BSA 或 DMAP-OVA。
[0040] 實施例2分泌DMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株的製備
[0041] 1、小鼠的免疫及抗體效價的檢測
[0042] 將人工抗原DMAP-BSA用PBS均稀釋到Img/mU加入等體積的完全佐劑（FCA)或不 完全佐劑（FICA)，充分混勻，採用頸背部皮下注射和加強免疫的方式對小鼠進行免疫，免疫 方案表1。免疫結束後7-10天後，BALB/c小鼠尾部取血，30(K)巧m離也lOmin，上清即為抗 血清，採用間接化ISA測定抗血清效價，選擇效價為64000的小鼠取脾細胞。
[0043] 表1免疫方案
[0044]
【權利要求】
1. 一種分泌鄰苯二甲酸二甲酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特徵在於：通過包含如 下步驟的方法製備得到： (1) 取用DMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾細胞與SP2/0細胞懸液混合； (2) 離心棄上清，加入PEG使細胞融合，再加入1640培養基終止PEG的作用；重複該步 驟； (3) 離心棄上清，加入HAT培養基，鋪至細胞板中進行培養； (4) 融合後第7天觀察，標出有融合細胞的孔，記錄位置和克隆數，補加HAT培養基；2 周后，用HAT培養基全量換液，待細胞長至板底1/10時做檢測； (5) 選擇效價最高的並且對DMP具有特異性的陽性細胞進行克隆，克隆化結束後，建株 得到分泌DMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
2. 根據權利要求1所述的分泌鄰苯二甲酸二甲酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特徵 在於：步驟（1)中所述的DMP人工抗原通過包含如下步驟的方法製備得到： 1) 半抗原的合成 往IOmL甲醇中加入IOg 4-硝基鄰苯二甲酸，攪拌下加入ImL濃硫酸作催化劑，120°C 回流7h ;反應結束後，繼續升溫，蒸出剩餘的甲醇；抽濾除去催化劑，得到粗產品；粗產品用 氫氧化鈉中和，減壓蒸餾收集180?185°C /7. 3kPa的餾分，得到純淨的4-硝基鄰苯二甲 酸二甲酯；用甲醇作溶劑，溶解4-硝基鄰苯二甲酸二甲酯，按照每3_〇1 4-硝基鄰苯二甲 酸二甲酯加〇. 〇5g鈀碳的比例加入鈀碳，加氫氣還原24小時；除去未參加反應的鈀碳和甲 醇，得到DMP晶體； 2) 人工抗原的合成 將40mg DMAP溶於2mL二氧六環中，攪拌條件下加入2mL lmol/L HCl ;待冷卻至4°C， 滴加200 ii L 7%的NaNO2溶液，攪拌反應30min得到重氮鹽溶液；再將IOmL含60mg載體蛋 白的0. 2mol/L pH9. 0硼酸鹽緩衝液加入到重氮鹽溶液中，繼續反應3h ; IOOOOg離心5min， 取上清，放於0. lmol/L pH7. 4 PBS中透析，得到DMP人工抗原。
3. 根據權利要求2所述的分泌鄰苯二甲酸二甲酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特徵 在於：所述的載體蛋白為BSA或0VA，相應得到的DMP人工抗原為DMP-BSA或DMAP-0VA。
4. 一種檢測鄰苯二甲酸二甲酯的間接競爭ELISA方法，其特徵在於包括如下步驟： (1) 試劑1用試劑2稀釋至0. 5 ii g/mL，100 ii L/孔包被酶標板，空白對照孔加100 ii L 試劑2,4°C過夜； (2) 每孔加入200 ii L試劑3,搖晃90s，倒出孔內液體，拍幹，重複3次後，每孔加入 25〇1^試劑4，放於371：111; (3) 每孔加入200 ii L試劑3,搖晃90s，倒出孔內液體，拍幹，重複3次後，按如下處理加 樣：1) DMP標準品：用試劑5梯度稀釋的不同濃度的DMP標準品50 y L，2)檢測樣品：用試 齊U 5溶解的檢測樣品50 ii L，3)陽性對照：50 ii L試劑5 ;各處理分別再加入50 ii L試劑6， 放於 37°C Ih; (4) 每孔加入200 ii L試劑3,搖晃90s，倒出孔內液體，拍幹，重複3次後，每孔加入 100 UL 試劑 7,放於 37 °C Ih ; (5) 每孔加入200 ii L試劑3,搖晃90s，倒出孔內液體，拍幹，重複3次後，新鮮配製試劑 8,100 ii L/孔加入酶標板，室溫避光25min ; (6) 每孔加50 ii L試劑9,終止反應，用酶標儀測定492nm處的吸光值； (7) 以DMP標準品的濃度對數log[c]為橫坐標（X)，對應的抑制率I (%)為縱坐標（Y)， 可得一條Y=bX+a直線，抑制率I (%)通過如下公式計算得到：
式中：A為陽性對照孔的吸光值，Ai為含有濃度i的DMP孔的吸光值，Atl為空白對照孔 的吸光值； 根據檢測樣品的吸光值計算抑制率Y，代入直線，可得X，取反對數，即可得出檢測樣品 中DMP的濃度； 上述步驟中試劑1-9分別為：人工抗原DMAP-0VA，0. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩衝液，含 0. 05% Tween-20的PBS ; 1%卵清蛋白，含1%牛血清白蛋白的PBS，DMP單克隆抗體，HRP標 記的羊抗小鼠IgG，OPD顯色劑，2mol/L H2S04。
5. 根據權利要求4所述的檢測鄰苯二甲酸二甲酯的間接競爭ELISA方法，其特徵在於：所述的DMP單克隆抗體通過包含如下步驟的方法製備得到：將1-2 X IO6個以DMP-BSA作為 DMP人工抗原通過權利要求1所述的方法製備的雜交瘤細胞用0.01m〇l/L pH7.4 PBS漂洗2 次，將細胞吹下，200g離心5min棄上清，再用0. 4mL PBS懸浮細胞沉澱，注射到已提前用石 蠟處理過的BALB/c小鼠腹腔內；10-12天後無菌操作收集小鼠腹水，200g離心5min，上清 中含有單克隆抗體；通過二氧化矽吸附法除去腹水中的小顆粒物質、殘渣和脂肪滴；辛酸/ 硫酸銨沉澱法純化腹水，在PBS中透析4-5天，得到純化腹水，獲得DMP單克隆抗體。
6. -種檢測鄰苯二甲酸二甲酯的間接競爭ELISA試劑盒，其特徵在於：包含權利要求4 中所述的試劑1-9和DMP標準品。
【文檔編號】G01N33/577GK104357405SQ201410689857
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月25日 優先權日:2014年11月25日
【發明者】李慧, 李瀟瀟, 袁均林, 丁書茂, 楊旭, 張銘 申請人:華中師範大學