蛋白質化合物，編碼核苷酸序列，產生細胞系和其應用的製作方法
2023-09-15 11:40:35 2
專利名稱：蛋白質化合物，編碼核苷酸序列，產生細胞系和其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種本質上為蛋白質的組合物，該組合物能選擇性抑制對雌激素敏感的腫瘤細胞的分裂和/或能對所說腫瘤細胞施加細胞毒性作用。本發明也涉及一種從人脂肉瘤分離到的能在培養中分裂的細胞系(該培養過程中細胞系產生所說組合物)以及涉及於其中存在所述組合物的條件培養基中的該細胞系的培養方法。
本發明還涉及所說產物在診斷和臨床上的應用。
現有技術中已知大量能在體外生長的最初從人腫瘤分離到的細胞系。這些細胞系在研究其生理學性質方面以及特異因子的產生方面特別有用。
至今儘管有大量嘗試，但在現有技術中仍然沒有發現已知的具有與脂肪細胞(adiposecell或adipocytes)相關的分化表型的細胞系，也沒有發現已知的屬於脂肉瘤類的腫瘤分離到的細胞系。如果這些細胞源於基質組織(目前很少知道該組織的特性，考慮到鄰近組織所起的某些功能，該組織被認為起控制作用)則特別有用。事實上，體內在有激素睪酮存在的乳腺中，脂細胞誘導上皮組織退化[Kratochwill，K.Developmentandlossofandrogenresponsivenessintheemtryonicrudimentofthdmousemammarygland.Dev.Biol61∶358-365，1977]，因而施加旁作用(Paracrineaction)，這種作用可能被所說脂細胞釋放的一種或多種化合物介導[Kratochwill，K.1987，incellularandMolecularBiologyofMammaryCancer一書(D.Medina，W.K.dweel，G.Heppner，e.E.Anderson，eds.pp1-8Plenum，NewYork]。
上述研究具體給出以能完成體內觀察到的功能的細胞系的體外分離和生長所需的證據。
本發明的作者第一次分離到能夠在培養中分裂，具有脂細胞表型相關表型的細胞系，並表述其特性。令人驚奇的是，該細胞系在條件培養基為主的培養基中產生至少一種能夠選擇性抑制源於對雌激素敏感的上皮(epithelila)腫瘤的上皮腫瘤細胞分裂的化合物。
「與脂細胞表型相關表型」一詞是指至少一種象脂類合成一樣脂細胞特有的分化特徵的表現形式。「上皮腫瘤細胞」一詞是指源於上皮腫瘤的腫瘤細胞，所說細胞已被分離出或仍存在於腫瘤塊上。「雌激素敏感上皮腫瘤」一詞是指由帶有至少一種屬於雌性激素類激素受體的細胞所組成的腫瘤。「條件培養基」一詞是指在適合於細胞生長的溫度、溫度和PH條件下，在其中培養所述細胞至少6小時的培養基。「抑制細胞分裂能力」是指在所說細胞培養環境中培養至少3天後化合物在培養中抑制至少50%細胞生長的能力。
因此，明顯需要辨別和鑑定能夠選擇性抑制源於雌激素敏感性上皮瘤的瘤細胞分裂的這些化合物的特性。
近期出版的文獻[MendelsohnM.E.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，11212-11216，1991]中公開了「熱休克」(「heatshock」)P27人蛋白[HSD27，已由HickeyE.等識別和定序，Nucl.AcidsRes.，14，104127-4145(1986)]具有199aa胺基酸序列，與和雌激素-受體相關的蛋白質序列相同並稱作P29[CofferA.I.等，CancerRessearch45，3686-3693，1990]。
最近[Carper S.W.等，Nucl.Acids Res.18，6457，1990]一種從肺癌A549細胞系獲得的CDNA克隆已被定序，該克隆的核苷酸序列編碼205個胺基酸的蛋白質，其中首先的193個胺基酸與已知的人HSp27的那些胺基酸恰好一致。與編碼194位氨基磺酸酯殘基的密碼Z相對應處檢測出插入了兩個胞嘧啶殘基，它決定了讀碼(reading frame)移向位於核苷酸序列6161-618位處的下一個終止密碼Z處，這種插入引起HSp27蛋白質C-端序列的修飾，使最後5個胺基酸不同(從195位到199位)並表現出延長6個胺基酸(從200位到205位)。
在描述過的現有技術的蛋白質中，沒有證據表明其中任何一種具有對腫瘤細胞分裂的抑制活性。
在從LSA細胞系產生和分泌的化合物中，本發明的發明人識別出一種化合物，並鑑定了其特性，它的組合物本質上實際是蛋白質，能選擇性抑制雌激素敏感腫瘤上皮細胞分裂，並能對這些腫瘤細胞施加細胞毒性作用。發明人表述了所說化合物的生物化學特性，將其稱作P1LSA，並測定了其胺基酸序列，證明它由205個胺基酸組成。發明人驚奇地發現所說胺基酸序列除一單個胺基酸外與Carper S.W(文獻出處同上)測定的人HSp27蛋白質序列相同。所觀察到的不同是在194位胺基酸(精氨酸取代脯氨酸)，由編碼蛋白質HSp27的序列的581位處以鳥嘌呤取代了胞嘧啶而決定的。
因此，發明人識別出一種對雌激素敏感上皮腫瘤細胞具特異性的具抗腫瘤生物活性的新化合物。
發明人識別了編碼蛋白質P1LSA的核苷酸序列，並且測定了其胺基酸序列。
相應的，本發明的一個目的是一種化合物，其組合物在本質上實際上是蛋白質的，所說化合物能夠選擇性抑制雌激素敏感上皮腫瘤細胞的細胞分裂和/或能對所說腫瘤施加細胞毒性活性;所說的化合物的分子量範圍為27到30千道爾頓(KDa);所說化合物也含有基本上同源於相應的人蛋白質HSp27(熱休克p27)序列的從1位胺基酸到193位胺基酸的胺基酸序列，或者說關係到具生物活性的所述化合物的一個片斷。
「基本上同源的胺基酸序列」一詞是指在本發明的範圍內不引起蛋白質生物活性喪失的50%到100%同源的所指序列。「生物活性」一詞是指能選擇性抑制雌激素敏感性上皮腫瘤細胞分裂(抑制細胞生長活性)和/或對所說腫瘤細胞施加細胞毒性作用的能力。
按照本發明一個優選的實施方案，其組合物在本質上實際是蛋白質的所說化合物在其羧基末端含有一種基本上同源於以下序列的胺基酸序列GluAlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys-NH2優選的所說本質上為蛋白質的化合物包含下列胺基酸序列
MetThrGluArgArgValProPheSerLeuLeuArgGlyProSer15TrpAspProPheArgAspTrpTyrProHisSerArgLeuPheAsp30GlnAlaPheGlyLeuProArgLeuProGluGluTrpSerGlnTrp45LeuGlyGlySerSerTrpProGlyTyrValArgProLeuProPro60AlaAlaIleGluSerProAlaValAlaAlaProAlaTyrSerArg75AlaLeuSerArgGlnLeuSerSerGlyValSerGluIleArgHis90ThrAlaAspArgTrpArgValSerLeuAspValAsnHisPheAla105ProAspGluLeuThrValLysThrLysAspGlyValValGluIle120ThrGlyLysHisGluGluArgGlnAspGluHisGlyTyrIleSer135ArgCysPheThrArgLysTyrThrLeuProProGlyValAspPro150ThrGlnValSerSerSerLeuSerProGluGlyThrLeuThrVal165GluAlaProMetProLysLeuAlaThrGlnSerAsnGluIleThr180IleProValThrPheGluSerArgAlaGlnLeuGlyGlyArgGlu195AlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys205.
按照本發明的一個優選方案，所說本質上為蛋白質的化合物由LSA細胞(DSMACC.N.2029)產生，優選由所說細胞在培養基中分泌。
本發明的另一個目的是作為藥用的組合物，優選用於骯腫瘤，更優選用於治療雌激素敏感上皮腫瘤。該組合物含有本發明的本質上為蛋白質的化合物或其生理學上可接受的鹽。
本發明的另一個目的是根據本發明使用本發明的所說的本質上為蛋白質的化合物或其生理學上可接受的鹽製備用於抗腫瘤治療的藥用化合物，優選用於治療雌激素敏感性上皮腫瘤。
本發明的另一個目的是含有編碼本發明的化合物(其組合物根據本發明本質上是蛋白質的)的核苷酸序列的核酸。優選所說核酸包含以下核苷酸序列
ATGACCGAGCGCCGCGTCCCCTTCTCGCTCCTGCGGGGCCCCAGC45TGGGACCCCTTCCGCGACTGGTACCCGCATAGCCGCCTCTTCGAC90CAGGCCTTCGGGCTGCCCCGGCTGCCGGAGGAGTGGTCGCAGTGG135TTAGGCGGCAGCAGCTGGCCAGGCTACGTGCGCCCCCTGCCCCCC180GCCGCCATCGAGAGCCCCGCAGTGGCCGCGCCCGCCTACAGCCGC225GCGCTCAGCCGGCAACTCAGCAGCGGGGTCTCGGAGATCCGGCAC270ACTGCGGACCGCTGGCGCGTGTCCCTGGATGTCAACCACTTCGCC315CCGGACGAGCTGACGGTCAAGACCAAGGATGGCGTGGTGGAGATC360ACCGGTAAGCACGAGGAGCGGCAGGACGAGCATGGCTACATCTCC405CGGTGCTTCACGCGGAAATACACGCTGCCCCCCGGTGTGGACCCC450ACCCAAGTTTCCTCCTCCCTGTCCCCTGAGGGCACACTGACCGTG495GAGGCCCCCATGCCCAAGCTAGCCACGCAGTCCAACGAGATCACC540ATCCCAGTCACCTTCGAGTCGCGGGCCCAGCTTGGGGGCCGAGAA585GCTGCAAAATCCGATGAGACTGCCGCCAAGTAA618本發明的另一個目的在於含有本發明核苷酸序列的質粒或噬菌體型載體。
本發明的另一個目的是能在體外分裂並且具有與脂細胞相關表型的哺乳綱細胞系，它也在其條件培養基中產生至少一種能選擇性抑制腫瘤細胞分裂，優選上皮腫瘤細胞，更優選源於雌激素敏感性上皮腫瘤細胞分裂的化合物。
按照本發明的一個優選方案，所說細胞系從脂肉瘤(優選來源於人)分離出，這種細胞系更優選地是寄存於DSM登記號為2029的LSA細胞系。再一次強調根據本發明所說細胞系產生具有上述公開序列的實際上為蛋白質的化合物。
本發明另一個目的是以本文所公開的和要求保護的細胞系的生長為條件的培養基。
優選所說條件培養基包括至少一種能選擇性抑制腫瘤細胞(優選上皮腫瘤細胞，更優選源於雌激素敏感上皮腫瘤的細胞)分裂的化合物，更優選的所說化合物是本發明公開的蛋白質化合物。
按照本發明的一個優選方案，所說培養基以生長LSA細胞系(DSMACC.N.2029)為條件。
本發明的另一個目的是使用所說條件培養基產生治療腫瘤(優選上皮腫瘤，更優選雌激素敏感腫瘤)的藥物組合物。
本發明的另一個目的是使用所說條件培養基提純，鑑別和表徵至少一種能選擇性抑制腫瘤細胞，(優選上皮腫瘤細胞，更優選源於雌激素敏感上皮腫瘤的細胞)分裂的化合物。
本發明將用一些實施例來加以公開，這些實施例僅用來解釋和說明本發明，而不用來限制本發明。這裡供參考的附圖有附
圖1表示LSA系在有和無血清存在的兩種情況下的生長曲線;
附圖2a表示人正常胸腺細胞的細胞螢光分析結果;
附圖2b表示LSA細胞的細胞螢光分析結果;
附圖3表示在各種細胞系中摻入3[H]-胸苷的LSA-CM刺激條形圖。其中，1是對照樣品，2是在1/4稀度時的LSA-CM，3是在1/2稀度時的LSA-CM，4是未稀釋時的LSA-CM，5是對照樣品，6是未稀釋時的LSA-CM，7是對照樣品，8是未稀釋時的LSA-CM;
附圖4表示在有和無LSA-CM存在時的兩種情況下MCF-7細胞系的生長曲線;
附圖5表示在有和無LSA-CM存在時兩種情況下ZR-75-1細胞系的生長曲線;
附圖6表示在有和無LSA-CM存在時兩種情況下MDAMB-231細胞系的生長曲線;
附圖7表示在有無LSA-CM存在時兩種情況下NMNG細胞系的生長曲線;
附圖8表示在有和無LSA-CM存在時兩種情況下從卵巢(ovaric)癌得到的人細胞的生長曲線;
附圖9表示在有和無LSA-CM和/或純化的P1LSA存在時的兩種情況下從卵巢癌得到的人細胞生長的條形圖。
實施例1LSA細胞系的分離以無菌方式的外科手術從65歲成年婦女的腿部取出混合成脂細胞-纖維細胞型人脂肉瘤片斷。
片斷用鑿子(chisel)機械搗碎，以獲得1mm碎片，所得物質用相當於20μ/ml膠原酶(CLSP，Worthington，Regno Unito)，075mg/ml胰蛋白酶(1/300，Inc.Pharmaceuticals)，2%雞血清的CTC溶液處理，在37℃和不斷攪抖下在無Ca2+和Mg2+離子的Hank培養基(Soil)(GIBCO)和含有5%牛血清的Ham F12培養基(Soil)(GIBCO)中熱滅活和透折4小時，以獲得單細胞懸浮液。
細胞懸浮液以補充有5%牛血清(GIBCO)、青黴素(31μg/ml)、鏈黴素(50μg/ml)和二性黴素B(25μg/ml)的Ham F12(GIBCO)培養基稀釋。細胞以200，000細胞/皿鋪在直徑為100mm的平皿(Costar)上。
一種能在培養中分裂並具有特異於脂細胞特點的細胞克隆從培養基中獲得，所說克隆被稱作LSA，保藏在DSM，保藏號為ACC2029。
附圖1示出LSA系的生長曲線，其中在有和無血清存在下的生長曲線是明顯的。LSA系表現出90%的平皿鋪蓋率(platingefficiency)，在有血清存在時，其倍增時間為50-52小時，在無血清存在時，則為102小時，培養基每72小時換一次。
實施例2LSA系的特性表述LSA細胞的DNA內含物通過細胞螢光計(Partec Pas Ⅱ flow-cytometer)來分析。細胞經胰蛋白酶解並以70%乙醇固定，用含有5μg/ml溴化乙錠、12.5μg/ml光輝黴素和15mg MgCl2於0.1M Tris緩衝液(PH 7.5)的溶液染色。在Mitotic循環各步驟中的細胞百分數用Flintoff，W.E.，Davidson，S.V.和Siminowitch，L.在「Isolation and partial Charcterization of Methotrexate-Resistent phenotype from Chinese hamster ovary cell」(Somatic cell Genet.2∶245-261 1976)一文中和Ambesi-Impiom-bato，F.S.，Parks，L.A.M.和Coon H.G.在「Culture of hormone-dependent functional epithelial cells from rat thyroid」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77∶3455-3459，1980)一文中公開的方法獲得。
如附圖2b所示，這些值與用正常人胸腺細胞作為倍性標準的方法獲得的值相比。將胸腺細胞的G1-G0峰值定為1，在相同的條件下，LSA細胞的G1-G0峰值是1.79，這意味著DNA內含物幾乎是四倍。如附圖2a所示，DNA內含物/細胞也幾乎是用胸腺細胞獲得的兩倍。
在對數生長期的LSA細胞群的細胞循環的各種階段的細胞分布情況示於下列表1。
表1階段細胞百分比G1-G059S27G2/M 14S階段的細胞百分比說明細胞群處於活性生長階段。
染色體計數證明染色體數/細胞在80和90之間。
當在光學顯微鏡下觀察時，LSA細胞看上去象帶有豐富(abudant)細胞質的拉長體。而在電子顯微鏡下，則發現細胞核含有許多核仁和位於核周區的細胞器。細胞相互同源，線粒體相對豐富，細胞質泡在數量上和大小上恆定不變。最明顯的特點是在細胞質內存在液泡區域，此區域是電子反射的並且是高脂含量帶的典型，為在電子顯微鏡下觀察而將細胞處理配製的結果則將它們除去。此外，也存在一個發育良好的高爾基體(Golgi)。為了估算脂的含量，將LSA細胞鋪到Lab-Teck(NUNC)培養斜面上，在半匯合下(Semi-confluence)生長。將細胞衝洗後，用4%多聚甲醛和在PBS(磷酸鹽水緩衝液)中15%飽和苦味酸固定6分鐘，用蒸餾水衝洗細胞2次，然後用油紅O溶液染色5分鐘，再用PBS衝洗兩次，用1%甲基胺藍染色10秒鐘。
假如細胞在5%牛血清存在下生長，類脂被分散到細胞質中，成園形的泡。在無血清培養基中生長的細胞中則不形成類脂，但當用甲基黃嘌呤/desamethasone培養細胞48小時和用胰島素再培養48小時後則被刺激生成。
實施例3以LSA(SA-CM)為條件的培養基對不同細胞系體外生長的作用LSA細胞在盛有含5%牛血清的F12培養基的100mm平皿(Costar)中長到80%匯合後，以PBS洗滌細胞單層，用無血清F12培養基培養。24小時後，用新鮮培養基取代原培養基，該條件培養基每6-24小時收集一次，持續30天。細胞繼續生長，用錐蟲藍(Trypan Bluc)染色後，在相對照顯微鏡下觀察它們在結構上和功能上都顯示是有生命的。
以LSA細胞為條件的培養基能刺激正常上皮細胞的生長，像CHO(CCL-61)、FRTL-5(CRL-1468)和NIH-3T3(ECACC-87100803)在無血清下生長24小時的情況，正如由3H-胸苷摻入試驗所證明的(見附圖3)。與上述結果相反，以LSA細胞為條件的培養基，在用含有雌激素受體的腫瘤細胞體外分析時，表現出對細胞溶解活性生長的抑制作用。使用的細胞是從人乳房癌獲得的MCF-7細胞(Land，H.等，Science222∶778(1980)，ECACC-86012803)，該細胞具有雌激素受體(Soule，H.O.等，Natl.CancerInst.S1，1409-1413(1973))、雄激素受體(Horowity，K.B.等，Steroids26，785-795(1975))、胰島素和triodothyronine受體(MacGrath，C.M.CancerRes.，43∶1355-1360(1983));
從人乳房癌獲得的ZK-75-1(CRL-1504)細胞，所說細胞對雌激素受體呈陽性。
從人乳房癌獲得的MDAMB-231(ATCC-HTB26)細胞，而它對雌激素受體呈陰性。
從鼠乳房上皮獲得的NMMG(Burker，R.E.等，CancerRes.，38∶3769-3773(1978)，CRL-1636)細胞，所說細胞對雌激素受體呈輕微陽性。
從患有因卵巢癌轉移引起的腹膜滲漏的婦女獲得的卵巢癌人細胞等。所說細胞系對雌激素受體呈陽性。
這裡提到的細胞系的生長曲線通過按100，000細胞/皿鋪覆在直徑為100mm盛有帶有10%牛胎血清(FCS，GIBCO)的10mlDMEM(GIBCO)培養基中而獲得。有2mlLSA-CM被加到每個皿中。
附圖4表示MCF-7系的生長曲線，其中LSA-CM的抑制作用明顯。特別是，經4天處理後，由於胞溶作用，移去LSA-CM仍不能重新恢復MCF-7細胞的增殖能力。
附圖5表示在有或無LSA-CM存在的兩種情況下7R-75-1系的生長曲線，LSA-CM的存在引起強烈的生長抑制作用，並無任何胞溶作用。
附圖6和7表示MDAMB-231細胞和正常上皮NMMG細胞的生長曲線，其中明顯無由於LSA-CM引起的生長抑制作用，這樣的細胞不表現出雌激素受體。
附圖8表明，即使培養24小時後，LSA-CM條件培養基對人卵巢癌細胞具有細胞毒性作用。
在不同細胞系中LSA-CM對3H-胸苷摻入的作用列在下表2中。
表2在不同細胞系中LSA-CM對3H-胸腺苷摻入的作用細胞系無作用激活抑制MCF 7+ZR-75-1+NMMG+FRTL-S+CHO+NTH-3T3+實施例4LSA-CM對動物的作用挑選20隻受Bittner病毒感染有明顯腫瘤塊的Balb/cfc3H鼠(CharlesRiver)，系患雌激素依賴乳房癌，由病毒本身誘導而致。
每天腹膜注射200μlLSA-CM15天後，80%經治療過的鼠中觀察到腫瘤組織生長被抑制和壞死。
實施例5從LSA-CM分離P1LSA蛋白質LSA-CM培養基濃縮100倍，在PH7.4下對等溶磷酸鹽緩衝液滲析，然後在P6樹脂(Pharmacia)上凝膠過濾。將洗脫組分用來試驗選擇性抑制MCF-7細胞生長的能力。僅一個組分顯示所說生物活性。將所說組分的一個樣品在非變性條件下於聚丙烯醯胺膠上電泳而分離，鑑別為一種約29KDa的蛋白質，稱作P1LSA。將所說蛋白質電洗脫，用來生產以下所說的多克隆抗體和用於序列分析。
該蛋白質序列如下表3所示。
如附圖9所示，純化的P1LSA蛋白質對人卵巢腫癌細胞具有明顯的細胞毒性作用。
表3P1LSA蛋白質的氫基酸序列和相應的編碼序列ATGACCGAGCGCCGCGTCCCCTTCTCGCTCCTGCGGGGCCCCAGC45MetThrGluArgArgValProPheSerLeuLeuArgGlyProSer15TGGGACCCCTTCCGCGACTGGTACCCGCATAGCCGCCTCTTCGAC90TrpAspProPheArgAspTrpTyrProHisSerArgLeuPheAsp30CAGGCCTTCGGGCTGCCCCGGCTGCCGGAGGAGTGGTCGCAGTGG135GlnAlaPheGlyLeuProArgLeuProGluGluTrpSerGlnTrp45TTAGGCGGCAGCAGCTGGCCAGGCTACGTGCGCCCCCTGCCCCCC180LeuGlyGlySerSerTrpProGlyTyrValArgProLeuProPro60
GCCGCCATCGAGAGCCCCGCAGTGGCCGCGCCCGCCTACAGCCGC225AlaAlaIleGluSerProAlaValAlaAlaProAlaTyrSerArg75GCGCTCAGCCGGCAACTCAGCAGCGGGGTCTCGGAGATCCGGCAC270AlaLeuSerArgGlnLeuSerSerGlyValSerGluIleArgHis90ACTGCGGACCGCTGGCGCGTGTCCCTGGATGTCAACCACTTCGCC315ThrAlaAspArgTrpArgValSerLeuAspValAsnHisPheAla105CCGGACGAGCTGACGGTCAAGACCAAGGATGGCGTGGTGGAGATC360ProAspGluLeuThrValLysThrLysAspGlyValValGluIle120ACCGGTAAGCACGAGGAGCGGCAGGACGAGCATGGCTACATCTCC405ThrGlyLysHisGluGluArgGlnAspGluHisGlyTyrIleSer135CGGTGCTTCACGCGGAAATACACGCTGCCCCCCGGTGTGGACCCC450ArgCysPheThrArgLysTyrThrLeuProProGlyValAspPro150ACCCAAGTTTCCTCCTCCCTGTCCCCTGAGGGCACACTGACCGTG495ThrGlnValSerSerSerLeuSerProGluGlyThrLeuThrVal165GAGGCCCCCATGCCCAAGCTAGCCACGCAGTCCAACGAGATCACC540GluAlaProMetProLysLeuAlaThrGlnSerAsnGluIleThr180ATCCCAGTCACCTTCGAGTCGCGGGCCCAGCTTGGGGGCCGAGAA585IleProValThrPheGluSerArgAlaGlnLeuGlyGlyArgGlu195GCTGCAAAATCCGATGAGACTGCCGCCAAGTAA618AlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys205
通過與貯存在資料庫中的序列比較，證明該序列除僅一個胺基酸外，與上面提到的由CarperS.W.描述的對應的人HSp27蛋白質相同，不同之點在於194位胺基酸的取代，所說胺基酸是由精氨酸取代脯氨酸。
實施例6抗-P1LSA多克隆抗體的生產和P1LSA蛋白質活性的抑制將從10%聚丙烯醯胺膠上洗脫的100μgP1LSA蛋白質溶解在1mlPBS(磷酸鹽水緩衝液)，並與1ml費氏完全佐劑混合。每隔10天將混合物通過肌內注射兔子，共四次。20天內每隔一天從兔子取出30ml免疫血清。按廠商說明用MabTrapG(Pharmacia)純化免疫球蛋白(Ig)部分。
免疫沉澱和免疫印跡(immunoblotting)試驗表明，免疫球蛋白以一種特定方式與LSA-CM來源的P1LSA蛋白質反應。
37℃下預培養帶有10μl 1mg/ml Ig溶液的100μl LSA-CM30分鐘可終止抑制腫瘤上皮細胞(MCF-7)分裂的活性，恢復到類似於未處理的對照樣品的3H-胸腺摻入和生長曲線，證明以預免疫血清培養後LSA-CM活性未改變。
這些實驗數據表明，按以上實施例5公開的方法分離和純化的，具有表3公開的序列的P1LSA蛋白質實際上對抑制本文所說的上皮細胞分裂的活性起主要作用。
實施例7編碼P1LSA蛋白的核苷酸序列編碼P1LSA蛋白質的核苷酸序列由按標準方法從LSA細胞提純的RNA poly A+，使用下列引物進行PCR反應來測定Oligo5'GGGAATTCTGAGCAGACGTCCAGAGECORIOligo3'CGGAATTCCGGGCTAAGGCTTTACTTGECORI該兩序列分別從5'和3'位不轉譯編碼HSp27基因的序列推測出。
擴增產物在載體pGEM4Z(Promega)的EcorI位點被直接克隆，並用雙脫氧(dideoxy)法測序。編碼蛋白質的完全序列示於表3。
本發明以結合其優選方案而加以公開，但需理解，由本專業技術人員所作的修飾和改變並不背離本發明的精神和範圍。
權利要求
1.一種本質上為蛋白質的化合物，其特徵在於，它能選擇性抑制雌激素敏感上皮腫瘤細胞的細胞分裂和/或能在所說腫瘤細胞上施加細胞毒性作用；其分子量範圍為27到30KDa之間，含有一個從1位胺基酸到193位胺基酸基本與人HSp27(熱休克p27)蛋白質同源的胺基酸序列；或所說化合物一種生物活性片斷。
2.一種如權利要求1的本質上為蛋白質的化合物，所說化合物在其羧基末端含有一個與下列胺基酸序列同源的胺基酸序列GluAlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys-NH2
3.一種如權利要求2的本質上為蛋白質的化合物，這種化合物含有一個基本與下列胺基酸序列同源的胺基酸序列MetThrGluArgArgValProPheSerLeuLeuArgGlyProSer 15TrpAspProPheArgAspTrpTyrProHisSerArgLeuPheAsp 30GlnAlaPheGlyLeuProArgLeuProGluGluTrpSerGlnTrp 45LeuGlyGlySerSerTrpProGlyTyrValArgProLeuProPro 60AlaAlaIleGluSerProAlaValAlaAlaProAlaTyrSerArg 75AlaLeuSerArgGlnLeuSerSerGlyValSerGluIleArgHis 90ThrAlaAspArgTrpArgValSerLeuAspValAsnHisPheAla 105ProAspGluLeuThrValLysThrLysAspGlyValValGluIle 120ThrGlyLysHisGluGluArgGlnAspGluHisGlyTyrIleSer 135ArgCysPheThrArgLysTyrThrLeuProProGlyValAspPro 150ThrGlnValSerSerSerLeuSerProGluGlyThrLouThrVal 165GluAlaProMetProLysLeuAlaThrGlnSerAsnGluIleThr 180IleProValThrPheGluSerArgAlaGlnLeuGlyGlyArgGlu 195AlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys 205.
4.如權利要求1-3中任何一項的本質上為蛋白質的化合物，它是由LSA細胞(DSM ACC.N.2029)產生的，該化合物優選由所說細胞在培養基中分泌。
5.一種藥用組合物，優選抗腫瘤用，包含以上任何權利要求之一的本質上為蛋白質的化合物或其生理上可接受的鹽。
6.如權利要求5的組合物，用來治療雌激素敏感性上皮腫瘤。
7.以上權利要求之一的一種本質上為蛋白質的化合物或其生理上可接受鹽的用途，用於製備治療腫瘤的組合物，優選治療雌激素敏感性上皮腫瘤。
8.一種核酸，它含有編碼上述權利要求中任何一項所說本質上為蛋白質的化合物的核苷酸序列。
9.如權利要求8的核酸，含有下列核苷酸序列ATGACCGAGCGCCGCGTCCCCTTCTCGCTCCTGCGGGGCCCCAGC 45TGGGACCCCTTCCGCGACTGGTACCCGCATAGCCGCCTCTTCGAC 90CAGGCCTTCGGGCTGCCCCGGCTGCCGGAGGAGTGGTCGCAGTGG 135TTAGGCGGCAGCAGCTGGCCAGGCTACGTGCGCCCCCTGCCCCCC 180GCCGCCATCGAGAGCCCCGCAGTGGCCGCGCCCGCCTACAGCCGC 225GCGCTCAGCCGGCAACTCAGCAGCGGGGTCTCGGAGATCCGGCAC 270ACTGCGGACCGCTGGCGCGTGTCCCTGGATGTCAACCACTTCGCC 315CCGGACGAGCTGACGGTCAAGACCAAGGATGGCGTGGTGGAGATC 360ACCGGTAAGCACGAGGAGCGGCACGACGAGCATCCCTACATCTCC 405CGGTGCTTCACGCGGAAATACACGCTGCCCCCCGGTGTGGACCCC 450ACCCAAGTTTCCTCCTCCCTGTCCCCTGAGGGCACACTGACCGTG 495GAGGCCCCCATGCCCAAGCTAGCCACGCAGTCCAACGAGATCACC 540ATCCCAGTCACCTTCGAGTCGCGGGCCCAGCTTGGGGGCCGAGAA 585GCTGCAAAATCCGATGAGACTGCCGCCAAGTAA 618
10.含有權利要求8或9之一所述核苷酸序列的質粒或噬菌體型載體。
11.一種哺乳綱細胞系，能在體外分裂，並且具有與脂細胞相關表型，它在其培養基或條件培養基中產生至少一種權利要求1-4之一所述的，能選擇性抑制腫瘤細胞分裂的化合物。
12.如權利要求10的哺乳綱細胞系，其中所說的腫瘤細胞包括上皮腫瘤細胞。
13.如權利要求12的哺乳綱細胞系，其中所說上皮腫瘤細胞源於雌激素敏感性上皮腫瘤。
14.如權利要求1-13之一的哺乳綱細胞系，能在有和無血清培養基兩種情況下體外分裂。
15.如權利要求11-14中之一的哺乳綱細胞系，其中所說細胞系從人脂肉瘤分離出。
16.如權利要求15的哺乳綱細胞系，其中所說細胞系從人脂肉瘤分離出。
17.如權利要求16的哺乳綱細胞系，其中所說細胞系是LSA系(DSM ACC.N.2029)。
18.一種培養基，以根據權利要求11-17之一所說的細胞系生長為條件。
19.根據權利要求18施加條件的培養基，所說培養基含有至少一種能選擇性抑制腫瘤細胞分裂的化合物。
20.根據權利要求19施加條件的培養基，其中所說腫瘤細胞是上皮腫瘤細胞。
21.根據權利要求20施加條件的培養基，其中所說的上皮腫瘤細胞源於雌激素敏感性上皮腫瘤。
22.根據權利要求21施加條件的培養基，其中所說的細胞系是LSA細胞系(DSM ACC.N.2029)。
23.根據權利要求18-22中之一的條件培養基的用途，用來生產治療腫瘤的藥物組合物。
24.根據權利要求23的條件培養基的用途，其中所說的腫瘤是上皮腫瘤。
25.根據權利要求24的條件培養基的用途，其中所說的上皮腫瘤是雌激素敏感性的。
26.根據權利要求18-22中的條件培養基的用途，用於提純、鑑別和表徵至少一種能選擇性抑制腫瘤細胞分裂的化合物。
27.根據權利要求26的條件培養基的用途，其中所說的細胞源於雌激素敏感性上皮腫瘤。
28.根據權利要求27的條件培養基的用途，其中所說的細胞源於雌激素敏感性上皮腫瘤。
全文摘要
本發明涉及一種本質上為蛋白質的組合物，該組合物能選擇性抑制對雌激素敏感的腫瘤細胞的分裂和/或能在所說腫瘤細胞上施加細胞毒性作用。本發明也涉及一種從人脂內瘤分離到的能在培養中分裂的細胞系(這一細胞系產生所說組合物)以及涉及其加以條件控制的培養基(有所說組合物存在其中)本發明還涉及所說產物在診斷和臨床上的各種應用。
文檔編號A61K38/00GK1078494SQ9310406
公開日1993年11月17日 申請日期1993年3月9日 優先權日1992年3月9日
發明者阿爾多·曼奇尼 申請人:國家腫瘤研究治療學院-G.派斯卡勒創建