通過從人胚胎幹細胞獲得的定形內胚層細胞的分化得到胰和肝內胚層細胞及組織的製作方法

2023-09-14 03:40:15

專利名稱：：通過從人胚胎幹細胞獲得的定形內胚層細胞的分化得到胰和肝內胚層細胞及組織的製作方法
技術領域：
：本發明涉及從多能幹細胞例如人胚胎幹細胞和定形內胚層(definitiveendoderm)細胞的有效分化，以形成胰內胚層細胞的方法。本發明直接應用於製備胰島|3細胞，所述胰島p細胞可作為治癒糖尿病的治療的一部分使用。此外，本發明可用於從人胚胎幹細胞和定形內胚層細胞製備肝內胚層細胞。本發明涉及用於使用無飼養細胞的確定成分培養基(definedmedia)從幹細胞(優選人胚胎幹細胞)製備定形內胚層和胰內胚層細胞的方法。相關申請本申請要求2006年6月2日提交的，標題為"通過從人胚胎幹細胞獲得的定形內胚層細胞的分化得到胰腺和肝內胚層細胞和組織"的臨時申請US60/810,424,和2007年3月15日提交的，標題為"從人胚胎幹細胞製備定形內胚層和胰腺內胚層的改進方法"的US60/918,100的利益，兩個申請均在此全部引入作為參考。
背景技術：
：胚胎幹(ES)細胞代表在早期胚胎內多能細胞生物學和分化的機制研究的有效模型系統，並且提供了哺乳動物基因操作的機會和由此得到的商業、醫學和農業應用。此外，ES細胞的適當增殖和分化可用於製備適於移植的無限制的細胞源，用於治療由細胞損傷或功能障礙引起的疾病。如國際專利申請WO99/53021中所描述的包括早期原始外胚層樣(EPL)細胞的其他多能細胞和細胞抹、體內或體外衍生的ICM/上胚層、體內或體外衍生的原始外胚層、原始生殖細胞(EG細胞)、畸胎癌細胞(EC細胞)、和由分化或核轉移衍生的多能細胞共有部分或全部的這些特性和應用。最近，已建立使ES細胞分化成為定形內胚層細胞的方法。本發明是從人胚胎幹細胞和定形內胚層細月包開始。多能細胞的成功分離、長期克隆維持、基因操作和種系傳遞(germ-linetransmission)通常很難，並且其原因未知。國際專利申請WO97/32033和美國專利No.5,453,357描述了包括來自除嚙齒類外物種的多能細胞。人ES細胞已在國際專利申請WO00/27995和美國專利No.6,200,806中描述，且人EG細胞已在國際專利申請WO98/43679中描述。已證明通過多能細胞的體外分化，緊密控制分化或形成特殊分化或終末分化細胞的均一細胞群的能力是有問題的。當前的方法包括從多能細胞以無控制的方式形成胚胎體，並且不能形成均一的細胞群。混合的細胞群，例如此種類型的胚胎體中的細胞，通常不可能適於治療或商業用途。調節ES細胞多能性和分化的生物化學機制十分不明確。然而，有限可用的經驗數據說明多能ES細胞在體外培養條件下的持續維持依賴於細胞外血清環境中存在的細胞因子和生長因子。已發現通過許多這類因子例如胰島素、IGF(s)和FGF(s)通過脂激酶磷脂醯肌醇3-激酶(PI3-激酶)激活細胞內信號事件(Carpenter&Cantley，(1996)Cwr.(9;/".Ce〃.5z'o/.,8:153-158)。響應這些可溶性因子對特異細胞表面受體的結合，PI3-激酶募集至細胞內膜表面，啟動第二信號事件通路，導致幾種下遊的細胞內靶分子的功能調節，所述靶分子影響多種生物學過程。稱為'納巴黴素的哺乳動物靶點'(mTOR)的蛋白激酶在PI3-激酶的下遊靶點中。mTOR的刺激既在核糖體p70S6激酶激活之前，也是核糖體p70S6激酶激活所必須的，核糖體p70S6激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是調節蛋白合成系統的主要激酶(Chung等人，(1994)Nature,370:71-75)。在胚胎發育期間，從三種主要的細胞群形成身體組織外胚層、中胚層和定形內胚層。這些細胞群，也稱為原代生殖細胞層，通過稱為原腸胚形成的過程形成。在原腸胚形成後，每個原代生殖細胞層產生特異的細胞群和組織。中胚層製備血細胞、內皮細胞、心臟和骨骼肌和脂肪細胞。定形內胚層產生肝、胰腺和肺。外胚層產生神經系統、皮膚和腎上腺組織。因此，需要用於製備細胞譜系豐富的細胞群，並進一步分化定形內胚層細胞成為胰內胚層細胞和/或肝內胚層細胞，從而促進這些細胞的增殖，和這些細胞進一步分化的產物的確定方法和組合物。人多能細胞，包括從人臍帶血獲得的細胞，提供了研究人發育早期和幾種疾病狀態例如糖尿病和帕金森氏病治療幹預的獨特機會。例如，使用從hESCs衍生的胰島素生成的(3-細胞可提供對現有細胞治療方法的巨大改進，現有細胞治療方法利用來自供體胰腺的細胞。現有的對糖尿病的細胞治療，利用來自供體胰腺的細胞，受到移植所需高質量胰島細胞缺乏的限制。對單一I型糖尿病患者的細胞治療需要約8x108個胰腺胰島細胞的移植(Shapiro等人，2000，NEnglJMed343:230-238;Shapiro等人，200la，BestPractResClinEndocrinolMetab15:241-264;Shapiro等人，200lb，Bmj322:861)。像這樣，當前對於成功的移植需要至少兩個健康的供體器官以獲得足夠的胰島細胞。自hESCs獲得的定形內胚層細胞，提供了原料源，從原料可發展出大量的高質量的分化的胰腺內胚層或肝內胚層細胞，用於在人細胞治療中使用的進一步分化和分化細胞的製備。人胚胎幹細胞(hESCs)可分化成為3個胚層(外胚層、中胚層和定形內胚層)或胚外內胚層，這依賴於所使用的培養條件(圖1)。在多種條件下，hESCs已被成功地分化成為定形內胚層(DE)。D'Amour等人(2005)描述了將手動傳代的hESCs置於小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養層上生長，在基因敲除代血清(knockoutserumreplacement)(KSR)存在的培養基中，作為分化起始點。分化成為DE，之後在包含低濃度的FCS或暫時無FCS的培養基存在下，加入激活蛋白A(ActivinA)(或相似因子例如Nodal)。另一種我們開發的方法(McLean等人，2007)利用生長在無飼養層條件下的hESCs，培養基由補充Fgf2的MEF條件培養基組成。之後通過加入PI3K信號抑制劑例如LY294002或雷帕黴素，促進分化為DE。兩種方法均製備包含~70-80%DE的細胞群，通過包括CXCR4、Soxl7、FoxA2等的DE標記分析筌定。DE可進一步分化成胰腺內胚層(PE),其為胰腺細胞i普系前體的細胞類型，並且表達如Pdxl的標記。在從DE至PE的轉變中，細胞經過腸管樣狀態(guttubelikestate)。從hESCs在手動傳代的MEF飼養層上的生長描述PE形成的方法。從DE至PE的分化包括細胞經過腸管樣狀態，此時細胞表達例如Tcf2/HNF1B和HNF4A的標記，並且包括為了至少部分分化在FCS中的培養(D'Amour等人，2006)。我們也描述了通過加入視黃酸直接從DE培養物形成PE的方法，也包括在FCS中在基質膠(Matrigel)上膠原酶傳代的細胞的培養(Dalton和KulikUGARF提交2006)。D'Amour等人，NatureBiotech,2005McLean等人，StemCells,Jan.2007D'Amour等人，NatureBiotech,2006如上文所述的方法，在專利提交中或同級別的出版物中已經報導了幾種用於從hESCs製備DE的方法。這些方法使用祠養成纖維細胞或無祠養層條件，但是胎牛血清和/或KSR總是存在的。這就存在問題，因為由於批次的差異，這些成分產生了實驗的不一致性。因為FCS和KSR包含不確定的活性，當使用hESCs用於治療開發時，這就存在問題。圖1表示在處理定形內胚層後，表達胚胎肝標記物(embryoniclivermarker)甲胎蛋白(AFP)的細胞的製備。在加入LY294002(50|aM)後4天，BG01hESCs分化成為定形內胚層。培養基更換為DMEM/F12,10%FCS，並且細胞生長至6天以上。未處理:未處理的hESCs。通過QRT-PCR分析AFP轉錄水平，一式三份，在標準化為GAPDH的參照轉錄後，轉錄水平表示為相對未處理樣本(hESCs)的倍數增加。注意儘管在加入FgflO後可見最佳的AFP誘導，但在FgflO存在或不存在時都可得到此結果。圖2表明在RA處理後，Pdxl轉錄誘導的時程。BG01hESCs使用LY294002(50juM)處理4天，之後換至包含DMEM/F12,10%FCS，50ng/mlFgflO和2MM視黃酸的培養基中至多4天。未處理-未處理的hESCs。通過QRT-PCR分析轉錄水平，一式三份，在標準化為GAPDH的參照轉錄後，轉錄水平表示為相對未處理樣本(hESCs)的倍數增加。表明Pdxl轉錄水平的倍數誘導。圖3表明在RA處理後，Pdxl和Isll轉錄誘導的時程。用LY294002(50UM)處理BGOIhESCs4天，之後換至由DMEM/F12,10%FCS,50ng/mlFgflO和2ixM視黃酸組成的培養基中至多4天。未處理:未處理的hESCs。通過QRT-PCR分析轉錄水平，一式三份，在標準化為GAPDH的參照轉錄後，轉錄水平表示為相對未處理樣本(hESCs)的倍數增加。圖4表明在不同培養條件下，Soxl7、AFP和Pdxl的改變。未處理:在MEF-CM、Fgf2、20。/。KSR存在下，培養在基質膠上的未處理的BG01hESCs。LYA:在MEF-CM和Fgf2中生長在基質膠上的hESCs用LY294002處理4天。F106d:用LY294002處理4天的hESCs，換至包含Fgf10(50ng/ml)、10%FCS的培養基中6天。RA4d/2d:用LY294002處理4天的hESCs，換至包含FgflO(50ng/ml)、2jxMRA、10%FCS的培養基(DMEM/F12)中4天。隨後在缺少RA和FgflO的相同培養基中再培養2天。通過QRT-PCR分析Soxl7、AFP和Pdxl轉錄，一式三份，在標準化為GAPDH的參照轉錄後，轉錄水平表示為相對未處理樣本(hESCs)的倍數增加。圖5表明用RA處理的Pdxl+細胞的免疫焚光染色。在加入LY294002(50pM)後4天BG01hESCs分化至定形內胚層。培養基換為DMEM/F12，10。/。FCS，並且如下細胞再生長至多5天。用LY294002處理4天的hESCs換至包含FgflO(50ng/ml)、2jnMRA、10%FCS的培養基(DMEM/F12)5天。處理和未處理(hESCs)生長在用4%多聚曱醛包被的LabTec細胞培養玻片上，與探針兔抗-人Pdxl抗體(Chemicon，1:1,000)—起孵育，隨後與AlexaFluor(594nm)標記的山羊抗-兔二抗(紅色)一起孵育。在包含DAPI的培養基中計數細胞，所述DAPI用於使核DAN(藍色)可視化。圖6表明當在合適的條件下培養時，表達例如Oct4、Nanog、Sox2和Rexl的hESCs可分化成三胚層(中胚層、外胚層和定形內胚層)或胚外細月包類型。為了製備定形內胚層，hESCs轉變首選經過中內胚層樣狀態(T+、MixLl+、Wnt3a+)。在經過中內胚層細胞的轉變後，可成為定形內胚層(CXCR4+、Soxl7+、GATA4,6+、Gsc+、FoxA2+)。定形內胚層是可形成其他內胚層譜系的前體細胞類型。圖7表明在hESC確定成分培養基配方(a)中使用accutase酶傳代的BG02hESCs。為了DE分化，在~18-24小時後，替換為分化培養基(a),存在或不存在Wnt3a(25ng/ml)。指定時間從培養基製備RNA，進行T、MixLl、GSC、Soxl7和CXCR4轉錄的QRT-PCR分析。Q-PCR反應標準化為GAPDH對照。'所需實驗(Assaysondemand)'QRT-PCR反應來自AppliedBiosystems公司，並且之前已有描述(McLean等人，2007)。圖8表明發生定形內胚層分化而排除其他的細胞譜系。BG02hESCs置於確定條件(a)中,在18小時後，培養基換為含有Wnt3a(25ng/ml)的分化培養基(a)，首先孵育24小時。時程進行96小時。在24、48、72和96小時，收集分化培養基(a)中的未處理hESCs(96小時)或細胞，用於QRT-PCR分析。'所需實驗'QRT-PCR反應來自AppliedBiosystems公司，並且之前已有描述(McLean等人，2007)。圖9表明BG02hESCs如圖8中接種並分化。指定時間(UT，未處理；在分化培養基中「al24、48、72、96小時)，固定細胞並通過與識別T(R&DSystems)和Soxl7的抗體孵育進行免疫細胞化學(ICC)實驗(D'Amour等人，2005)。使用DAPI進行DNA染色，並顯示合併的DAPI、T和Soxl7染色。放大20倍。圖10表明nanog陽性細胞在分化期間減少。BG02hESCs如圖8、9中接種並分化。指定時間(UT，未處理；在分化培養基中「a124、48、72、96小時)，固定細胞並通過與識別Nanog的抗體一起孵育進行免疫細胞化學(ICC)實驗。使用DAPI進行DNA染色，並顯示合併的DAPI和Nanog染色。放大20倍。圖11表示在分化培養基(a)中分化96小時，並用識別DE細胞表面標記物CXCR4的抗體染色的BG02hESCs。未處理的hESC培養物(BG02)僅有非常少量的CXCR4+細胞(93%的處理細胞(BG02d4-DE)為CXCR4陽性。圖12表示BG02hESCs的明場照片。在確定條件下製備的DE。DE經過4天的時間製備。放大10倍。圖13表明在確定成分培養基條件下，使用RA處理DE後，與PE形成相關的轉錄的QRT-PCR分析。BG02hESCs經4天分化成為DE,在指定時間在包含視黃酸和Fgf10的培養基中分裂並分化。QRT-PCR數據表示為標準化為GAPDH對照後的數據。時間點指DE形成後的時間(天)。圖14表明在確定條件下，從hESC-衍生的DE製備的PE培養物的ICC。如在圖13圖例中所描述的進行細胞分化。細胞用4%多聚曱醛固定，之後在用RA和Fgfl0處理後的2、6、12天用TritonX-100進行滲透化處理，之後用山羊抗-人Pdxl抗體或TCF2抗體(R&DSystems)和DAPI(DNA)染色。放大20倍。圖15表明hESC，s至胰內胚層細胞的分化。在確定條件下，這些細胞如上所述在步驟l(激活蛋白A、低P13激酶或P13激酶抑制劑)分化3-5天，隨後8-10天(步驟2)，時間在圖中指明，並且Ngn3和PdxlmRNAs的水平使用TaqMan探針進行Q-PCR評價。發明簡述本發明涉及胰內胚層細胞(PE)，通過在包含有效量的胎牛血清(FCS-優選約10%的基礎培養基加血清)中，將定形內胚層細胞暴露於有效濃度的視黃酸(至少約0.05-0.1嗎/ml，優選約0.1-25嗎/ml，更優選約0.1-2.0jxg/ml)至少約2天，優選至少約4天，並且更優選約4天，隨後將步驟l獲得的細胞暴露於無視黃酸的基礎培養基中的FCS(優選約10%)至少1天，優選至少約2天，從定形內胚層細胞獲得所述胰內胚層細胞。這種方法優選導致在處理樣品中至少約35-50%並且優選至少約70-80+%的細胞表達胰腺內胚層標記物，Pdxl和Isll。使用上述本發明的方法從定形內胚層細胞製備的細胞群PE標記物Pdxl和Isll的純度高達70-80%。使用本發明的方法，在人定形內胚層細胞(DE)處理後，通常觀察到PdxlmRNA增加從70倍至幾百倍。這種製備的有效性是出人意料的。在現有技術方法中，從DE製備PE(Pdxl+和Isll+)的有效性通常在約10-20%的範圍內。在其它實施方案中，可以使用與上述胰內胚層細胞相同的製備方法，定形內胚層(DE)細胞分化成為肝內胚層細胞，但在此方法中，用有效量10ng/ml-100ng/ml(優選，約50ng/ml)的FgflO代替視黃酸。儘管在本發明中可使用任何定形內胚層(DE)，但優選的內胚層是使用PI3K抑制劑LY294002從人胚胎幹細胞獲得的。在用於從hESC獲得DE的方法中，在基礎培養基中hESC，s暴露於LY294002約4-5天，以獲得優選用於製備表達生物標記物的胰腺內胚層的定形內胚層。DE是人細胞型，具有分化成包括肝、肺、胰腺、胸腺、腸、胃和曱狀腺的細胞的能力。在本發明中，用我們方法已能夠製備胰腺內胚層(PE)細胞，從而最終高效率地、持續地提供胰島(3細胞。本方法建立了定形內胚層分化成為胰腺內胚層(PE)的方便的方法。胰腺內胚層是具有分化成為包括P細胞的多種胰腺譜系能力，但不再具有分化成為非-胰腺譜系細胞的能力的細月包。一方面，本發明涉及具有高達70-80+%胰腺內胚層標記物Pdxl和/或Isll的細胞群。在本發明中，人胚胎幹細胞(hESCs)經過下列處理以形成定形內胚層(DE)細胞，在任選包含胎牛血清(FCS)的基礎培養基中，定形內胚層細胞暴露於有效濃度的視黃酸至少約2天，優選至少4天，並且更優選約4天，隨後使步驟l中的分化細胞接觸沒有視黃酸的基礎培養基(優選包含有效量的FCS)至少一天，優選至少約2天。此方法優選導致至少約50%和優選至少約70-80+o/。的被處理的樣品中的細胞表達胰腺內胚層標記物Pdxl和/或Isll。除了上述優選的用於製備起始的定形內胚層細胞的方法，在本發明中，定形內胚層細胞可通過任何本領域已知的方法製備，包括例如在美國申請出版物20060003446中G.Keller等人；20060003313中K.D，Amour等人、20050158853中K.D，Amour等人和20050260749中JonOdorico等人建立的方法，相關部分在此引用作為參考。在其它實施方案中，本發明涉及改善hESCs分化成為DE,和之後成為成為PE的方法和條件，其使用確定成分培養基，所述培養基不使用不確定成分，例如胎牛血清或血清補充物例如KSR培養基。DE製備的有效性和培養系統的穩固性與之前的報導相比顯著增大。在這些其它實施方案中，本發明涉及在無飼養細胞條件下，從哺乳動物胚胎幹細胞，優選人胚胎幹細胞，產生定形內胚層細胞的方法，包括使用生長基質或如本文所述的方法，將接種的胚胎幹細胞暴露於確定成分培養基或MEF條件培養基，並且之後將幹細胞暴露於為確定成分的培養基的分化培養基(沒有胎牛血清或KSR類型血清成分並且無IGF和胰島素)，所述培養基包含有效量的SMAD通路激動劑，例如TGF卩超家族成員(濃度為從1ng/ml至100ng/ml，優選約25-50ng/ml)，例如激活蛋白A、nodal、TGF(3或其他TGF成分，並且任選的包含PI3激酶信號抑制劑(如本文所述)。任選的，包括有效量的牛血清白蛋白(約0.5-3%，優選約2%)以提供蛋白質源。優選的，確定成分培養基包含P13K信號抑制劑。優選的，包括有效量的Wnt3a(1ng/ml至約100ng/ml，優選約25ng/ml)。優選的，生長基質如本文所述為基質膠。在此方面，本發明提供了通過將幹細胞暴露於包括促進分化成為定形內胚層細胞成分的，無血清或因子(IGF或胰島素)或促機PI3激酶活性的成分的確定成分培養基(使用有效量的激活蛋白A、nodal或TGFP或如本文所述的其他物質)，從人胚胎幹細胞(生長在任何培養基中，優選確定成分培養基中)提供高水平定形內胚層細胞的方法。在約3-6天之後，優選4-5天後獲得的定形內胚層細胞可暴露於在確定成分培養基(優選包含Wnt3a和BSA)中有效濃度的視黃酸(至少約0.1-0.2嗎/ml，優選至少約l嗎/ml，約2-25jxg/ml，更優選約10(ig/ml,並且任選的有效量的FgflO(濃度約1ng/ml至約100ng/ml，優選濃度約50ng/ml)約5-12天，優選約8-10天，以製備表達Pdxl和Isll標記物的胰腺內胚層(PE)細胞，所述細胞可再暴露於相同培養基幾天(約1-5天)以製備表達Ngn3和Nkx6.1標記物的內分泌胰腺細胞。本發明適用於在多種無飼養層條件下生長的hESCs的培養，條件包括但不限制於細胞生長在1.在基質上例如基質膠上MEF條件培養基，其包含分化試劑；2.確定成分培養基製劑，其不使用條件培養基、FCS或KSR型血清補充物。如本文所述的方法，代替基質膠使用BDCell-TakCell和TissueAdhesive、BDTMFIBROGENHumanRecombinantCollagenI、BDFIBROGENHumanRecombinantCollagenIII、BDMatrigelTMBasementMembraneMatrix、BDMatrigelTMBasementMembraneMatrixHighConcentration(HC)、BDPuraMatrixTMPeptideHydrogel、CollagenI、CollagenIHighConcentration(HC)、CollagenII(Bovine)、CollagenIII、CollagenIV、CollagenV和CollagenVI等，其包括有效量的層粘連蛋白、牛腱蛋白、血小板反應蛋白、膠元、纖連蛋白、vibronectin、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸及其混合物中的一種或多種。本發明還涉及從胚胎幹細胞優選人胚胎幹細胞製備定形內胚層細胞的方法，該方法包括無飼養細胞將胚胎幹細胞暴露於分化培養基，所述培養基包含較高水平的激活蛋白A、nodal或TNF(3,並且任選的包含PD激酶信號抑制劑，其中分化培養基是確定成分培養基，無胎牛血清或KSR類型血清成分。在本發明的一方面，從胚胎千細胞製備至少約90%的定形內胚層細胞。在本發明的每個實施方案中定形內胚層細胞或其他本領域可用的細胞可進一步分化為胰內胚層細胞。發明詳述下列術語用於描述本發明除非另有說明，根據相關領域普通技術人員的常規用法理解本文使用的術語。除了下面提供的術語的定義外，分子生物學中的常用術語的定義可見Rieger等人,1991Glossaryofgenetics:classicalandmolecular,第5片反，柏林Springer-Verlag;和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人，Eds.,CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.，(1998Supplement)聯合出版。應當理解如在說明書和權利要求書中所使用的"a"或"an"可表示一種或多種，這依賴於所使用之處的上下文。因此，例如"a細胞"可指至少一種細胞。參照下列本發明優選的實施方案和本文包含的實施例的詳細說明，可更容易地理解本發明。然而，在公開和描述本發明的組合物和方法前，應當理解本發明不限制於特定的條件，或特定的方法等，當然本發明的改變和多種修改和變更對於本領域技術人員是明顯的。對於生長細胞、分離細胞和相關克隆、DNA分離、擴增和純化，對於酶反應(包括DNA連結酶、DNA聚合酶、限制性核酸內切酶等)的標準技術，和各種分離技術對於本領域技術人員是已知的並且是常用的。許多標準技術描述於Sambrook等人，1989MolecularCloning第二版，冷泉港實驗室，Plainview，紐約；Maniatis等人，1982MolecularCloning,冷泉港實驗室，Plainview，紐約；Wu(Ed.)1993Meth.Enzymol.218,第I部分;Wu(Ed.)1979Meth.Enzymol.68;Wu等人，(Eds.)1983Meth.Enzymol.100和101;Grossman和Moldave(Eds.)1980Meth.Enzymol.65;Miller(ed.)1972ExperimentsinMoleculargenetics,冷泉港實'瞼室，冷7良港，紐約；Old和Primrose,1981PrinciplesofGeneManipulation,CaliforniaPress大學,Berkeley;Schleif和Wensink，1982PracticalMethodsinMolecularBiology;Glover(Ed.)1985DNACloning,巻I和II,IRLPress,牛津，英國；Hames和Higgins(Eds.)1985NucleicAcidHybridization,IRLPress,牛津，英國；以及Setlow和Hollaender1979基因ticEngineering:PrinciplesandMethods,巻1-4，PlenumPress,紐約。使用的縮寫和術語認為在本領域中是標準的並且在專業雜誌，例如本文引用的雜誌中是常用的。如本文所用，術語"分化試劑"指誘導細胞例如hESC，s或定形內胚層細胞部分或最終分化的任何化合物或分子，其中所述分化是至少部分由於PI3-激酶通路(用於定形內胚層細胞的形成)信號的抑制，包括有效量的視黃酸以形成胰內胚層細胞或包括有效量的成纖維細胞生長因子，例如成纖維細胞生長因子10(Fgfl0)以形成肝內胚層細胞。分化試劑為如下描述，但此術語並不限制於此。本文使用的術語"分化試劑"包括表現相似生物活性的天然或合成分子的範圍內。如本文所用，術語"PI3-激酶通路抑制劑"指在接觸抑制劑的細胞中，降低PI3-激酶活性或PI3-激酶下遊的至少一種分子的任何分子或化合物。這些抑制劑是用於製備定形內胚層細胞的優選的抑制劑，所述定形內胚層細胞是本發明中使用的原料細胞。術語包括，例如PI3-激酶拮抗劑，PI3-激酶信號轉導級聯的拮抗劑，降低內源性PI3-激酶的合成或表達的化合物，降低內源性PI3-激酶釋放的化合物，和抑制PI3-激酶活性激動劑的化合物。在上述的一些實施方案中，抑制劑選自雷帕黴素、LY294002、渥曼青黴素、氯化鋰、Akt抑制劑I、Akt抑制劑II(SH-5)、Akt抑制劑III(SH-6)、NL-71-101，和上述混合物。Akt抑制劑I、II、AktlII和NL-71-101在Calbiochem公司有售。在其他實施方案中，抑制劑選自雷帕黴素和LY294002。在其他優選的實施方案中，抑制劑包括LY294002。在另一個實施方案中，抑制劑包括Aktl-II。應當理解可使用抑制劑的組合，以產生所需的分化效果。最終的結果為製備大量的定形內胚層細胞，根據本發明作為起始細胞林用於製備胰內胚層細胞和/或肝內胚層細胞。在一個優選的實施方案中，多能hESC細胞與有效量的PI3-激酶通路抑制劑接觸(優選LY294002,也稱為[2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4//-1-苯並吡喃-4-酉同，Calbiochem有售，許多其他的生物化學製造廠家有售)，以製備定形內胚層細胞，並且由此製備的定形內胚層細胞與有效量的視黃酸(約0.005-25Hg/ml，更優選約0.1-2.0(ag/ml，更優選約0.2-2.0嗎/ml)，在包含胎牛血清(約1.0%至約20%,優選約10%的胎牛血清)的基礎培養基中接觸。定形內胚層細胞暴露於包含視黃酸的培養基至少約2天，優選至少約4天，更優選約4天，此後將細胞暴露於包含FCS(優選約10%)的無視黃酸的基礎培養基至少l天，優選至少約2天。優選將細胞在每步分離，但可不分離而簡單進行。這種方法優選導致在處理樣品中至少約30%、至少40%、至少50%、至少60%和優選至少約70-80+。/。的細胞表達胰腺內胚層標記物Pdxl和/或Isll。使用上述本發明的方法從定形內胚層細胞製備PE標記物Pdxl和Isll純度高達70-80%的細胞群。使用本發明的方法，處理人胚胎幹細胞(hESCs)後，通常觀察到PdxlmRNA表達增加70-倍至幾百倍。並且Isll也顯著增加。製備的有效性是出人意料的結果。在現有技術方法中，從hESC，s的PE(Pdxl十和Isll+)製備的有效性在約10-20%的範圍內。在其它實施方案中，通過下列相同的方法，定形內胚層(DE)細胞可分化為肝內胚層(LE)細胞，所述方法使用上述胰內胚層細胞的製備方法，但使用有效量的成纖維細胞生長因子，優選FgflO代替視黃酸，所述量優選約10ng/ml-100ng/ml，優選約25ng/ml-75ng/ml,更優選約50ng/ml。在此方法中，定形內胚層細胞在基礎培養基中，優選包含FCS(在基礎培養基中約1%至約20%，優選約10。/。的FCS),暴露於一種多種的成纖維細胞生長因子，優選FgflO,至少1天，優選至少約2天，甚至更優選至少約4天或更長，或者優選約4天，隨後來自步驟1的細胞暴露於基礎細胞培養基，該培養基任選地包含有效量的胎牛血清(約1%至約20%，優選約10%FCS)並且無成纖維細胞生長因子，至少l天，並且優選至少約2天，或者優選約2天。在其它實施方案中，本發明涉及用於改善使用確定成分培養基使hESCs分化成為DE和之後成為PE的方法和條件，所述確定成分培養基不使用不確定的成分，例如胎牛血清或血清補充物，例如KSR培養基。DE製備的有效性和培養系統的穩固性與之前的報導相比顯著增加。在這些其它實施方案中，本發明涉及在無飼養細胞條件下，從哺乳動物胚胎幹細胞，優選人胚胎幹細胞製備定形內胚層細胞的方法，包括使用生長基質或如本文所述的方法，將接種的胚胎幹細胞暴露於確定成分培養基或MEF條件培養基，並且之後將幹細胞暴露於為確定成分培養基的分化培養基(無胎牛血清或KSR-型血清成分，並且無IGF和胰島素)，該培養基包含有效量的SMAD通路激動劑，例如TGFP超家族成員(濃度1ng/ml至100ng/ml,優選約25-50ng/ml),例如激活蛋白A、nodal、TGF卩或其他TGF成分，和任選的PI3激酶信號抑制劑(如本文所述)。任選地，包含有效量的牛血清白蛋白(約0.5-3%，優選約2%),以提供蛋白質源。優選的，確定成分培養基包含P13K信號抑制劑。優選的，包含有效量的Wnt3a(1ng/ml至約100ng/ml，優選約25ng/ml)。優選的，生長基質如本文所述為基質膠。此方面，本發明的方法提供了通過將幹細胞暴露於包含促進分化為定形內胚層細胞的成分(使用有效量的激活蛋白A、nodal或TGFP或如本文所述)的，無血清或因子(IGF或胰島素)或促進PI3激酶活性的成分的確定成分的培養基，從人胚胎幹細胞(生長在任何培養基中，優選確定成分的培養基)得到高水平的定形內胚層。在約3-6天後優選4-5天後獲得定形內胚層細胞，黃酸(至少約0.1-0.2嗎/ml,優選至少約1pg/ml,約2-25昭/ml，更優選約10嗎/ml,並且任選的有效量的FgflO(濃度約1ng/ml至約100ng/ml，優選濃度約50ng/ml)8-10天，以製備表達Pdxl和Isll標記物的胰腺內胚層(PE)細胞，所述細胞再暴露於相同的培養基幾天(約1-5天)，以製備表達Ngn3和Nkx6.1標記物的內分泌胰腺細月包。在上述每種方法中，細胞可通過用胰蛋白酶或accutase或相似試劑傳代而分離，游離並進行本發明的方法，或任選的，並且優選的，來自每步的層製備的細胞不用進一步分離進行下個步驟。細胞也可在使用前離心並吹打，從而限制細胞樣品的大小，從而形成單細胞或包含較少細胞的細胞蔟。如本文所用，術語"有效量"指在本發明中任何用於製備目的結果的成分或材料的量和濃度。術語可應用於P13-激酶抑制劑例如LY294002，可有利地用於製備定形內胚層細胞，可應用於視黃酸，作為分化試劑使用以從定形內胚層細胞製備胰內胚層細胞，或應用於成纖維細胞生長因子，作為分化試劑使用以從定形內胚層細胞製備肝內胚層細胞等。術語"視黃酸"指全反式視黃酸。術語Fgf成纖維細胞生長因子指生長因子，用於在無視黃酸的本發明的方法中使用，以製備肝內胚層細胞。儘管一種或多種的各種成纖維細胞生長因子可在本發明的方法中使用，優選的成纖維細胞生長因子是成纖維細胞生長因子10(Fgf10)。術語"基礎細胞培養基，，、"基礎細胞培養基"或"基礎培養基"或"細胞分化培養基"或"穩定培養基"用於描述細胞生長培養基，在培養基中製備定形內胚層細胞，或任選的，定形內胚層細胞分化成為胰腺內胚層(PE)細胞或肝內胚層(PE)細胞，或分化後穩定。基礎細胞培養基在本領域是眾所周知的，並且包含至少最小量的培養基，和任選的成分例如生長因子，包括成纖維細胞生長因子、視黃酸、葡萄糖、非必需胺基酸、鹽(包括微量元素)、穀氨醯胺、胰島素(標明，並不排除)、轉鐵蛋白、P巰基乙醇和其他本領域已知的試劑和如本文所述的試劑。優選的培養基包括基礎細胞培養基，其包含2%至20%(優選，約10。/。)的胎牛血清，或無胎牛血清和KSR但包含牛血清白蛋白的確定成分培養基。包含10%FCS的DMEM/F12是特別優選的基礎細胞培養基。在本發明中使用的基礎細胞培養基是市售的，並可用市售成分補充，在許多商業來源中InvitrogenCorp.(GIBCO)、CellApplicationsInc.和BiologicalIndustries,BethHaEmek以色列有售。在優選的實施方案中，將至少一種分化試劑例如糹見黃酸、成纖維細胞生長因子或LY294002加入至細胞培養基，幹細胞或前體細胞生長在培養基中從而進行幹細胞至前體細胞前體領域普通技術人員將能夠容易地改變細胞培養基，以根據本發明製備前體或胰腺/肝細胞。細胞分化培養基基本上與基礎細胞培養基同義，但在本文中用於分化過程，並且包含細胞分化試劑，以分化細胞至其他細胞。穩定培養基是在分化步驟前或後使用的基礎細胞培養基，以穩定細胞株以備後用。一般而言，如本文所用，細胞分化培養基和穩定培養基可包含基本相似的基礎細胞培養基的成分，但在不同的地方使用，並且可包含不同的成分從而影響培養基使用的目的結果。在優選的在確定成分的培養基中("確定成分的培養基")形成胰內胚層細胞的案例中，培養基是確定的最低標準培養基(優選來自Gibco的DMEM/F1250:50),其排除了胎牛血清或KSR(基因敲除代血清)、胰島素和IGF，但包括SMAD通路激動劑，例如TGF(3超家族成員(濃度1ng/ml至100ng/ml,優選約25-50ng/ml)，例如激活蛋白A、nodal、TGF(3或其他TGF成分，和任選的有效量的PI3激酶信號抑制劑(如本文所述)。任選的包括有效量的牛血清白蛋白(約0.5-3%,優選約2%)以提供蛋白質源。優選確定成分培養基包含P13K信號抑制劑。優選包含有效量的Wnt3a(1ng/ml至約100ng/ml，優選約25ng/ml。優選生長基質如本文所述為基質膠。細胞優選生長在細胞支持物上。在本發明中，基質膠作為細胞支持物使用是優選的。細胞支持物優選包含至少一種分化蛋白。術語"分化蛋白"用於描述使細胞促進胚胎幹細胞或定形內胚層細胞分化的蛋白(也優選attachment)。本發明中使用的優選的分化蛋白包括，例如細胞外基質蛋白，其是在細胞外基質中發現的蛋白，例如層粘連蛋白、生腱蛋白、血小板反應蛋白和其混合物，促進生長並包含表皮生長因子(EGF)的同源性結構域，表現出生長促進和分化活性。可在本發明中使用的其他分化蛋白包括例如膠元、纖連蛋白、vibronectin、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸和其混合物。此外，也可可使用包含有效濃度的一種或多種胚胎幹細胞分化蛋白的凝膠和其他材料。包括這些分化蛋白的示例的胚胎幹細胞分化蛋白或材料包括，例如BDCell-TakTMCell和TissueAdhesive、BDTMFIBROGENHumanRecombinantI、BDTMFIBROGENHumanRecombinantCollagenIII、BDMatrigelBasementMembraneMatrix、BDMatrigelBasementMembraneMatrixHighConcentration(HC)、BDTMPumMatrixPeptideHydrogel、CollagenI、CollagenIHighConcentration(HC)、CollagenII(牛)、CollagenIII、CollagenIV、CollagenV和CollagenVI等。用於本發明的優選的分化蛋白材料包括Matrigel材料。包含一種或多種分化蛋白的優選的組合物/材料是BDMatrigelBasementMembraneMatrix。它是可溶的基底膜製備物，其乂人Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取，所述肉瘤是ECM蛋白豐富的肺瘤。其主要成分是層粘連蛋白，其次是膠元IV、硫酸乙醯肝素、蛋白聚糖類、觸覺蛋白(entactin)和巢蛋白(nidogen)。如本文所用，術語"激活，，指Pdxl或Isll表達的增加，或Pdxl,Isll或肝標記物活性的上調。如本文所用，當涉及細胞、細胞林、細胞培養物或細胞群，術語"游離的"指從細胞的自然來源大體上分離，從而使細胞、細胞抹、細胞培養物或細胞群可在體外培養。此外，術語"游離"指從兩個或多個細胞群物理選擇(physicalselection)出一種或多種細胞，其中的選擇根據細胞形態和/或各種標記物的表達。如本文所用，術語"表達"指在細胞中多聚核苷酸的轉錄或多肽的翻譯，從而使表達分子的細胞的分子水平顯著高於不表達分子的細胞。測量分子表達的方法對於本領域普通技術人員是眾所周知的，並且包括並不限制於Northern雜交、RT-PCT、原位雜交、蛋白免疫印跡和免疫染色。如本文所用，術語"接觸"(即定形內胚層細胞與化合物接觸)為了在體外共同孵育化合物和細胞(例如，在培養物中的細胞中加入化合物)。術語"接觸"並不包括細胞在體內暴露於視黃酸、成纖維細胞生長因子或其他分化試劑，例如受試者自然製備的PI3-激酶通路抑制劑(即，可能是自然的生理過程導致的暴露)。可用任何合適的方式使細胞接觸視黃酸或成纖維細胞生長因子，或PB-激酶通路抑制劑例如LY294002製備定形內胚層細胞。例如，細胞可貼壁培養或懸浮培養。應當理解的是接觸分化試劑的細胞可進一步用其他的細胞分化環境處理，以穩定細胞，或進一步分化細胞，例如製備胰島細胞。申請人已表證在基礎細胞培養基中用視黃酸的定形內胚層細胞的培養製備分化的細胞，如胰腺或肝內胚層細胞，其中細胞比自發分化的細胞具有更大的均一性。本發明涉及包含游離的分化的哺乳動物細胞群，優選人胰內胚層細胞的組合物，其中在體外細胞從多能或定形內胚層細胞分化，其中大於約30%的細胞表達Pdxl和/或Isll。在本發明的一個實施方案中，大於約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、67%、70%、72%、74%、75%、76%、77%、78%、79°/。或甚至80%的細胞表達Pdxl和/或Is11。優選的，在包括細胞群的組合物中，至少50%表達Pdxl和/或Isll的細胞，高達70-80%或更多。本發明還涉及包含游離的肝內胚層細胞的同源細胞群的組合物，其中細胞在體外分化培養，其中大於約350/。、40%、45%、50%、55%、60%、65%、67%、70%、72%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或甚至80%的細胞是肝內胚層細胞。本發明還包括分化多能哺乳動物細胞，優選人多能細胞，成為胰腺內胚層細胞的方法，包括(a)提供多能哺乳動物細胞，和(b)將多能哺乳動物細胞與有效量的PI3-激酶信號通路抑制劑接觸，以至少部分的分化多能細胞為定形內胚層譜系的細胞，並且之後使用視黃酸作為分化試劑在包含有效量的FCS(優選約10%)的基礎培養基中(優選DMEM/F12)，分化定形內胚層細胞為胰內胚層細胞。內胚層細胞可為游離的，但優選暴露於無視黃酸的DMEM/F12，任選的包含FCS(優選約10%)再1天或更長(優選2天)，其中胰內胚層細胞是游離的。胰內胚層細胞可進一步分化為胰腺(3細胞。在本發明任選的實施方案中，肝內胚層細胞的製備與上述步驟相同，但替代用視黃酸分化定形內胚層細胞，去除視黃酸，並且在成纖維細胞生長因子(Fgf10)存在下分化，由此製備肝內胚層細胞而不是胰內胚層細胞。如本文所述的方法，胰內胚層細胞可進一步分化為胰腺p-細胞，並在糖尿病治療中使用(類型1)。考慮到通過與視黃酸接觸分化定形內胚層細胞以製備胰內胚層細胞。在一個實施方案中，在基礎細胞培養基中，與視黃酸接觸之前，分離細胞成基本單個的細胞培養物。使用蛋白酶，例如但不限制於胰蛋白酶，分離細胞。在一個實施方案中，在接種後細胞與視黃酸接觸12小時至約6天，接種後接觸12小時至約48小時，或接種後接觸約24小時。在一個實施方案中，細胞與視黃酸接觸大於24小時、大於約48小時、或大於約72小時、大於約96小時、或約96小時。在暴露於基礎細胞培養基的視黃酸後，可直接分離獲得的胰內胚層細胞(胰蛋白酶作用)，並且之後任選的並且優選的暴露於無視黃酸的基礎細胞培養基(任選的，包含FCS)至少12小時、至少24小時、至少48小時或48小時，或任選的，從暴露於視黃酸獲得的未分離胰內胚層細胞，可再暴露於無視黃酸的基礎細胞培養基。優選的，在細胞用組合物培養大於約24小時，優選至少48小時後，視黃酸有效的引起定形內胚層細胞向胰腺內胚層譜系分化。考慮當細胞接種大於約12小時，在細胞與抑制劑接觸前，或當細胞已接種約24小時，在細胞接觸抑制劑前，視黃酸有效的引起多能哺乳動物細胞向內胚層譜系的分化。在一些實施方案中，定形內胚層細胞以低於約2.5x106細胞/35mm平皿的濃度接種，至少約2.5x104細胞/35mm平皿，在約2.5x105至約2x106細月包/35mm平皿之間，在約5x105至約2x106細胞/35mm平皿之間，寸氐於約2xl06細胞/35mm平皿,或密度大於4x105糹田胞/35mm平亞。在一些優選方面，定形細胞以約7.5x105細胞/35mm平皿的濃度接種。在從多能細胞特別是人胚胎幹細胞(hESC)製備定形內胚層細胞中，如在本發明可選的實施方案的第一步中，本發明還包括使用組合物培養細胞，包括細胞培養物培養基和分化試劑，所述分化試劑為PI3-激酶通路抑制劑，從而分化胚胎幹細胞為定形內胚層細胞。在本發明一些實施方案中，抑制劑選自LY294002、雷帕黴素、渥曼青黴素、氯化鋰、Akt抑制劑I、Akt抑制劑II、Akt抑制劑III、NL-71-101,和其混合物。在一個實施方案中，抑制劑是雷帕黴素。在一些實施方案中，雷帕黴素最初濃度為約0.1nM至約500nM、約0.5nM至約250nM、約1.0nM至約150nM、或約1.5nM至約30nM。在另一個實施方案中，抑制劑是LY294002。在一些實施方案中，LY294002最初濃度為約1至約500^M、約2.5至約400^M、約5|_iM至約250iliM、約10|iM至約200|aM或約20至約163(iM。在另一個實施方案中，抑制劑為Aktl-II。在一些實施方案中，Aktl-II最初濃度為約0.1|iM至約500|uM、約1|LiM至約250|aM、約5pM至約20)liM、約10|aM至約100pM，或約40|aM。基礎細胞培養基可還包含成纖維細胞生長因子。在一個用於製備定形內胚層細胞的實施方案中，FGF是bFGF。在實施方案中，bFGF最初濃度約0.1ng/ml至約100ng/ml、約0.5ng/ml至約50ng/ml、約1ng/ml至約25ng/ml、約1ng/ml至約12ng/ml,或最初濃度約8ng/ml。在從定形內胚層細胞製備肝內胚層細胞的實施方案中，FGF優選FGF10，有效濃度通常在從約lng/ml至約100ng/ml，優選約10ng/ml至約90ng/ml，優選約25至約75ng/ml,優選約50ng/ml的範圍內。FGF也包含在用於製備胰內胚層細胞的基礎培養基中，濃度約1至約100ng/ml,優選約10至約50ng/ml。在另一個實施方案中，細胞培養物培養基為條件培養基。條件培養基可從飼養層(feedlayer)獲得。考慮祠養層可包含成纖維細胞，並且在一個實施方案中，包含胚胎成纖維細胞。當有效地製備定形內胚層細胞時，這特別相關。在一些優選實施方案中，細胞培養物培養基是條件培養基。條件培養基可從飼養層獲得。考慮當製備定形內胚層細胞時，祠養層包含成纖維細胞，並且在一個實施方案中，包含胚胎成纖維細胞。在優選的實施方案中，用於製備定形內胚層細胞的條件培養基包含DMEM/F-12(50/50)、約20%KSR、約0.1mMNEAA、約2mML-穀氨醯胺、約50U/ml青黴素、約50pg/ml鏈黴素，和約8ng/mlbFGF。在另一個實施方案中，用於製備定形內胚層細胞的細胞培養物培養基包括TGF(3家族成員。在一些實施方案中，TGF(3家族成員選自Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B、TGF-P、BMP2和BMP4。在其他實施方案中，TGF-卩家族成員是激活蛋白A或Nodal。在特定實施方案中，激活蛋白A的最初濃度為約1ng/ml至約1mg/ml、約10ng/ml至約500ng/ml、約25ng/ml至約250ng/ml、約50ng/ml至約200ng/ml、或約100ng/ml。在其他實施方案中，Nodal的最初濃度約100ng/ml至約5mg/ml、約500ng/ml至約2.5mg/ml、約800ng/ml至約1.5mg/ml,或約1mg/ml。在優選的實施方案中，與胰內胚層細胞製備相關，條件培養基優選包含DMEM/F-12(50/50),含有約10。/。FCS,約0.2|im(微摩爾)視黃酸和10-50ng/mlFgflO。在此實施方案中，游離的定形內胚層細胞(從離心步驟吹打)重懸在上述基礎細胞培養基中，並以優選約7.5x105細胞/100mm的濃度接種在塗覆基質膠的組織培養皿上。培養皿在37。C/5。/oC02孵育，並且每日更換培養基。4天後，培養基換為DMEM/F12、10。/。FBS1-4天(無視黃酸或Fgf),之後可游離胰內胚層細胞，或可選的，再次進行分化，成為胰腺p細胞，所述胰腺(3細胞用於治療患有I或II型糖尿病的患者。通過參考下列本文包括的本發明的優選的實施方案的詳述和實施例，可容易的理解本發明。然而，在本組合物和方法公開和描述前，應當理解本發明不限制於特別的核酸、特別的多肽、特別的細胞類型、特別的宿主細胞、特別的條件或特別的方法等，當然其中的改變和許多修改和變化對於本領域技術人員是顯而易見的。如本文所用，術語"內胚層"包括，但不限制於定形內胚層；體壁內胚層、髒壁內胚層，和中內胚層細胞。如本文所用，術語"定形內胚層"指早期內胚層細胞，其具有分化成為任何或多種內胚層細胞類型的能力，所述內胚層細胞從胚胎中的內胚層譜系(即胰腺、肝、肺、胃、腸和曱狀腺)產生。定形內胚層細胞是多能的。因此，本發明文中使用的術語"定形內胚層"指至少向內胚層細胞類型分化多於從其衍生的多能細胞的分化。並且，如本文所用，製備內胚層細胞包括製備富含內胚層細胞的細胞培養物。如本文所用，"定形內胚層"細胞的特徵在於表達特異的標記物轉錄，例如S0X17,伴隨無標記物轉錄的胚胎外內胚層，例如AFP和血栓調節蛋白。此外這種細胞可表達CXCR4、GATA4、GATA4.6和GSC。此外，LY處理導致最初未分化的hES細胞表達的細胞表面CD標記物的丟失，包括但不限制於CD9、27、30、46、58和81。在一些本發明的實施方案中，定形內胚層細胞表達SOX17標記物基因水平高於SOX7的水平，SOX17為髒壁內胚層特徵的標記物基因。此外，在特定的實施方案中，SOX17標記物基因的表達高於OCT4標記物基因的表達，SOX17為hESCs的特徵基因。在其他本發明的實施方案中，定形內胚層細胞表達SOX17標記物基因，水平高於AFP、SPARC或血栓調節蛋白(TM)標記物基因水平。在本發明的實施方案中，通過本文描述的方法製備的定形內胚層細胞不表達Pdxl或Isll(Pdxl-陰性或Isll-陰性)。在另一個實施方案中，通過例如流式細胞術確定，定形內胚層細胞表現出血栓調節蛋白的低表達，相似的情況見於多能細胞群。在特定的本發明的實施方案中，使用的定形內胚層細胞培養物基本上無表達OCT4、SOX7、AFP、SPARC、TM、ZIC1或BRACH標記物基因的細胞。在其他實施方案中，使用的定形內胚層細胞培養物基本上無表達SOX7、AFP、SPARC、TM、ZIC1或BRACH標記物基因的細胞。對於在細胞培養物中的細胞，術語"基本上無，，指特別的細胞類型以低於細胞總數的5%的量出現在細胞培養物中。術語"胰腺內胚層"指衍生自定形內胚層細胞的內胚層細胞，所述定形內胚層細胞暴露於單獨的有效量的視黃酸，或和其他生長因子，例如成纖維細胞生長因子(例如FgfIO)組合，並且表達標記物Pdxl和Isll標記物，並可進一步分化為胰腺P細胞。術語"肝內胚層"指衍生自定形內胚層細胞的內胚層細胞，使定形內胚層細胞暴露於生長因子，例如成纖維細胞生長因子(例如FgflO),無視黃酸。如本文所用，術語"分化"指細胞類型的製備，分化的細胞類型多於從其衍生的細胞類型。因此術語包括部分和最終分化的細胞類型。在特定的本發明的實施方案中，術語"富含"指細胞培養物包含多於約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的所需的細胞譜系，這依賴於細胞類型和使用的方法。使用本發明製備的從胚胎幹細胞在接觸PI3-激酶通路抑制劑後分化的定形內胚層細胞類型可根據本發明用於製備胰內胚層細胞或肝內胚層細胞。根據本發明製備的細胞在多種研究領域和開發中有多種用途，包括但不限制於藥物發現、藥物開發以及檢測、毒理學、治療目的的細胞的製備和移植、以及基礎科學研究。這些細胞類型表達在大範圍研究領域中關注的分子。這包括各種細胞類型發揮功能所需的已知分子，如標準的參考文獻中所述。這些分子包括，但不限制於細胞因子、生長因子、細胞因子受體、細胞外基質、轉錄因子、分泌多肽(激素)和其他分子，以及生長因子受體。在優選的實施方案中，定形內胚層細胞是人細胞，且胰腺內胚層和/或肝內胚層細胞是人細胞。這些細胞是根據本發明的方法使用多能人細胞衍生的。如本文所用，術語"多能(pluripotent)人細胞"或"人胚胎幹細胞"包括獲得自人胚胎、胎兒或成人組織的多能細胞。在一個優選的實施方案中，多能人細胞為人多能胚胎幹細胞(hESC)。在另一個實施方案中，多能人細胞為人多能胎兒幹細胞，例如原始幹細胞。在另一個實施方案中，多能人細胞為人多能成人幹細胞。如本文所用，術語"多能，，指細胞能夠至少發育成為外胚層、內胚層和中胚層的細胞。如本文所用術語"多能"指全能和多能的細胞。如本文所用，術語"全能(totipotent)細胞"指能夠發育成為所有的細胞語系的細胞。術語"多能的(multipotent)"指最終分化的細胞。也如本文所用，術語"多能的(multipotent)"指沒有處理(即，核轉移或去分化誘導)的細胞，且不能從所有三個胚層形(中胚層，外胚層和內胚層)衍生，形成分化的細胞類型，或者換言之為部分分化的細胞。多能人細胞可選自人胚胎幹(ES)細胞;人內細胞團(ICM)/上胚層細胞;人原始外胚層細胞，例如早期原始外胚層細胞(EPL);人原始胚(EG)細胞;和人畸胎癌(EC)細胞。可使用任何本領域技術人員已知的方法，衍生本發明的人多能細胞。例如，可使用去分化和核轉移方法製備人多能細胞。此外，本發明使用的人ICM/上胚層細胞或原始外胚層細胞在體內或體外衍生。EPL細胞在貼壁培養中製備，或作為細胞聚集物在懸浮培養中製備，如WO99/53021中所描述。此外，可使用本領域技術人員已知的方法傳代人多能細胞，包括手動傳代方法和批量(bulk)傳代方法，例如抗體選擇和蛋白酶傳代。在特定的實施方案中，本發明的胚胎幹細胞具有正常核型，而在另一個實施方案中，胚胎幹細胞具有非正常核型。在一個實施方案中，大部分胚胎幹細胞具有非正常核型。考慮大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或大於95%的檢測的中期細胞表現出非正常核型。在一些實施方案中，當細胞培養大於5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，或20代後，非正常核型很明顯。在一個實施方案中，非正常核型包括至少一個常染色體的三倍體，其中常染色體選自染色體l、7、8、12、14、和17。在另一個實施方案中，非正常核型包括多於一種常染色體的三倍體，其中多於一種的常染色體中的至少一種選自染色體1、7、8、12、14和17。在一個實施方案中，常染色體是染色體12或17。在另一個實施方案中，非正常核型包括另外的性染色體。在一個實施方案中，核型包括兩個X染色體和一個Y染色體。考慮可能發生的染色體的易位，並且術語"非正常核型"包括這種易位。本發明還包括上述染色體異常的組合。如上文所述的方法，在特定的實施方案中，本發明包括如第一步，多能哺乳動物細胞的分化方法，包括(a)提供多能哺乳動物細胞，和(b)多能哺乳動物細胞與有效量的PI3-激酶信號通路抑制劑接觸，以使至少部分分化的多能細胞成為內胚層譜系細胞。在一個實施方案中，步驟(b)包括細胞分化環境的使用。在另一個實施方案中，在步驟(b)後，細胞可與細胞分化環境接觸。根據本發明其他的步驟包括將定形內胚層細胞在細胞分化環境中(例如基礎細胞培養基)暴露於視黃酸，以製備胰內胚層細胞。或者，定形內胚層細胞可在沒有視黃酸的細胞分化環境中(例如基礎細胞培養基)暴露於成纖維細胞生長因子(例如Fgf10)，以製備肝內胚層細胞。如本文所用，術語"細胞分化環境"指細胞培養條件(例如通常為基礎細胞培養基)，其中誘導多能細胞分化，或誘導成為在富含分化細胞的人細胞培養物。優選的，由生長因子誘導的分化細胞譜系本身是均一的。術語"均一的"指包含大於約50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的所需細胞譜系的細胞群。可直接從分化過程獲得均一譜系，無需進一步的細胞純化，或者，流式細胞術和其他技術可用於純化細胞，特別是胰內胚層細胞或肝內胚層細胞。在一個實施方案中，誘導多能細胞分化成為定形內胚層譜系的細胞，所述細胞可進一步分化以製備胰內胚層細胞或肝內胚層細胞。優選的，誘導多能細胞分化成為包含大於約50%的定形內胚層細胞的細胞。在另一個實施方案中，細胞群包括大於約55%、60%、65%、70°/。、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的定形內胚層譜系。可分離內胚層細胞或直接使用，無需分離或純化，以製備胰腺內胚層或肝內胚層細胞。分化培養基或環境(通常為基礎細胞培養基)可用於分化本發明的多能細胞，可在多能細胞接觸PI3-激酶抑制劑之前、期間或之後。在製備胰內胚層細胞時，分化試劑為有效量的視黃酸，可在定形內胚層細胞接觸分化培養基(基礎細胞培養基，如本文所述)之前、期間或之後使用。根據本發明，以形成定形胰腺或肝內胚層細胞的細胞分化培養基(基礎細胞培養基)可包括各種如上述成分，包括例如KODMEM培養基(敲除Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基)、DMEM、Ham，sF12培養基(特別是DMEM/F1250:50)、FBS或FCS(胚胎牛血清或胎牛血清)、成纖維細胞生長因子包括FGF2(成纖維細胞生長因子2)、FGF8、FGF10(特別用於胰腺或肝內胚層細胞)、KSR或hLIF(人白血病抑制因子)。細胞分化培養基還可包括補充物例如L-穀氨醯胺、NEAA(非必需胺基酸)、P/S(青黴素/鏈黴素)、N2和P-巰基乙醇(P-ME)。考慮細胞分化環境可加入其他的因子，包括但不限制於纖連蛋白、層粘連蛋白、肝素、硫酸肝素、視黃酸、表皮生長因子家族(EGFs)成員、成纖維細胞生長因子家族成員(FGFs)包括FGF2、FGF8和/或FGF10、血小板衍生的生長因子家族(PDGFs)成員、轉化生長因子(TGF)/骨形態生成蛋白(BMP)/生長和分化因子(GDF)家族拮抗劑包括但不限制於頭蛋白、促濾泡素抑制素、脊索發生素、gremlin、cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高劑量激活蛋白和amnionless。也可以TGF/BMP/GDF受體-Fc嵌合體形式加入TGF/BMP/GDF拮抗劑。可加入的其他因子包括可通過Notch受體家族激活或失活信號的分子，包括但不限制於S樣和Jagged家族蛋白和Notch加工或裂解抑制劑。其他生長因子可包括胰島素樣生長因子家族(IGF)成員、胰島素、wingless相關(WNT)因子家族，和hedgehog因子家族。可加入其他因子以促進定形內胚層幹/前體增殖和存活，以及這些前體衍生物的存活和分化。在其他的實施方案中，方法包括接種貼壁培養細胞。如本文所用，術語"接種(plated)，，和"接種(plating)"指任何使細胞在貼壁培養物中生長的過程。如本文所用，術語"貼壁培養"指細胞在固體表面上培養的細胞培養系統，固體表面可順序包被固體物質，固體物質可順序包被另一種包被材料，例如下列材料，或任何其他的使培養的細胞增殖活穩定的化學或生物材料。細胞可以或不能緊貼固體表面或底物。在一個實施方案種，優選細胞接種在基質膠包被的培養板上。用於貼壁培養的底物可包括一種下述物質或下述物質的組合多聚鳥氨酸、層粘連蛋白、多聚賴氨酸、純化的膠元、明膠、細胞外基質、纖連蛋白、生腱蛋白、玻連蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖類、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和飼養層，例如但不限制於原始成纖維細胞或成纖維細胞細胞抹。此外，貼壁培養底物可包括細胞外基質，覆蓋飼養層、覆蓋多能人細胞或細胞培養物或覆蓋定形內胚層細胞或細胞培養物。本發明的方法考慮細胞可用詞養細胞或飼養層培養。術語"伺養細胞"用於描述與靶細胞共同培養的細胞，在當前分化狀態穩定靶細胞。飼養層包括在培養物中有多於一種的飼養細胞。在上述方法的一個實施方案中，條件培養基從穩定靶細胞當前分化狀態的飼養細胞獲得。可使用本領域技術人員已知的常規方法游離並特徵化穩定靶細胞當前分化狀態的飼養細胞製備的任何和全部因子。這些因子可用於替代祠養層，或可用於補充祠養層。如本文所用，術語"穩定"指細胞的分化狀態。當細胞或細胞群被穩定時，其經過多次傳代在培養物中持續增殖，並且優選在培養物中無限增殖；此外，優選每種在培養物中的細胞為相同的分化狀態，並且當和細胞分開，通常產生相同類型的細胞或產生相同分化狀態的細胞。優選的，若細胞培養條件沒有改變，穩定的細胞或細胞群不再分化或去分化，並且細胞持續傳代並且無過度生長。優選的，穩定的細胞能夠在穩定狀態中無限增殖，或至少多於2次傳代。優選的，穩定多於5代、多於10代、多於15代、多於20代、多於25代，或最優選的，穩定多於30代。在特定的實施方案中，細胞穩定多於l年的持續培養。在一個實施方案中，將分化為定形內胚層細胞的幹細胞(多能細胞)通過常規方法以多能狀態在培養物中維持，直至細胞分化為所需定形內胚層。在一些實施方案中，TGFP家族成員聯合PI3-激酶通路抑制劑給予多能細胞。如本文所用，術語"TGF-P家族成員"指通常本領域技術人員認為特徵性的屬於TGF-P家族的生長因子，特徵在於與已知TGF-P家族成員相同，或由於與已知TGF-P家族成員功能相似。在一些實施方案中，TGF-P家族成員選自Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B、TGF-P、BMP2和BMP4。在一個實施方案中，TGF-P家族成員為激活蛋白A。此外，生長因子Wnt3a用於製備定形內胚層細胞。在特定的本發明的實施方案中，使用上述任何生長因子的組合。無需向細月包同時加入這些成分。在至少一個實施方案中，通過傳代在培養物中維持定形內胚層細胞直至理想地分化成為胰腺內胚層或肝內胚層。在一些實施方案中，FGF家族成員(例如，優選FGFIO)聯合分化試劑視黃酸給予定形內胚層細胞，以製備胰腺內胚層或肝內胚層細胞。本文描述的分化方法的一些實施方案中，向細胞提供上述生長因子，從胚層細胞分化成胰內胚層細胞或肝內胚層細胞的濃度存在。在本發明的一些實施方案中，上述生長因子在細胞培養物中以至少約0.5ng/ml、至少1ng/ml、至少10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml、或至少約1000ng/ml的濃度出現。在本發明一些實施方案中，上述生長因子在加入細胞培養物後再去除。例如，可在生長因子加入約1天，約2天，約3天，約4天，約5天，約6天，約7天，約8天，約9天或約10天後去除。在優選的實施方案中，生長因子在加入後約4天去除。定形內胚層細胞、胰內胚層細胞或肝內胚層細胞的培養物可在包含減少的血清或無血清的培養基中生長。在特定的本發明的實施方案中，血清濃度在約0.1%至約20。/。(v/v)的範圍內。在一些實施方案中，定形內胚層細胞用血清補充物培養。在其他實施方案中，定形內胚層細胞在B27存在的條件下生長。在這些實施方案中，B27補充物的濃度可在約0.2%至約20%(v/v)的範圍內或大於約20%(v/v)。任選的，加入的B27補充物的濃度可按市售的多種強度的B27儲備液測定。例如，B27的50X儲備液在Invitrogen(Carlsbad,CA)有售。向充足體積的生長培養基中加入充足量的這種儲備液可製備補充了所需量的B27的培養基。例如，向卯ml的生長培養基加入10ml的50XB27儲備液可製備補充5XB27的生長培養基。在培養基中B27補充物的濃度可為約O.IX、約0.2X、約0.3X、約0.4X、約0.5X、約0.6X、約0.7X、約0.8X、約0.9X、約IX、約I.IX、約1.2X、約1.3X、約1.4X、約1.5X、約1.6X、約1.7X、約1.8X、約1.9X、約2X、約2.5X、約3X、約3.5X、約4X、約4.5X、約5X、約6X、約7X、約8X、約9X、約IOX、約IIX、約12X、約13X、約14X、約15X、約16X、約17X、約18X、約19X、約20X和大於約20X。在優選的實施方案中，胰內胚層細胞和肝內胚層細胞都優選在包含約1%至約20%(體積)胎牛血清，更優選約10%的胎牛血清的基礎細胞培養基中生長。從hESC培養物至定形內胚層或從定形內胚層至胰腺內胚層或肝內胚層的過程可通過定量這些細胞特徵性的標記物基因的表達和hESCs、定形內胚層細胞(為胰腺或肝內胚層細胞)和其他細胞類型特徵性的標記物基因的表達缺失，進行4全測。這些標記物基因的基因表達的定量方法可通過使用定量PCR(Q-PCR)。進行Q-PCR的方法是本領域已知的。其他本領域已知的方法也可用於定量標記物基因表達。標記物基因表達可通過使用感興趣的標記物基因的特異抗體檢測。使用本文描述的方法，可製備組合物，其包含定形內胚層細胞、胰內胚層細胞或肝內胚層細胞，所述細胞基本沒有其他的細胞類型。或者，製備的組合物包含hESCs和定形內胚層，或定形內胚層細胞和胰內胚層細胞或肝內胚層細胞的混合物。例如，製備的組合物中包含每95個hESCs至少5個定形內胚層細胞，或每95個定形內胚層細胞至少5個胰內胚層細胞或肝內胚層細胞。在另一個實施方案中，組合物中包含每5個hESCs至少95個定形內胚層細胞，或每5個定形內胚層細胞高達80或更多的胰腺或肝內胚層細胞。此外，考慮了組合物，其包含定形內胚層細胞和hESCs或胰腺內胚層或肝內胚層細胞和定形內胚層細胞。在一些本發明的實施方案中，可通過這種細胞特異性的親合標記物游離定形內胚層細胞、胰內胚層細胞或肝內胚層細胞。對定形內胚層細胞、胰內胚層細胞或肝內胚層細胞特異的親和標記物的一個實例是特異於標記物多肽的抗體，所述多肽存在於需要純化的內胚層細胞表面上，但基本不出現在考慮到在包被PI3-激酶信號通路抑制劑或視黃酸(任選的，包括FGF例如FGFIO)之前，作為材料使用的多能細胞或定形內胚層細胞可解離為基本單個的細胞培養物，以製備肝內胚層細胞。如本文所用，"基本單個的細胞培養物"是在傳代期間的細胞培養物，所需生長的細胞彼此分離，從而使大部分細胞為單個細胞，或兩個細胞相連(雙聯體)。優選，所需成為培養物的細胞中大於40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的細胞為單體或雙聯體。該術語包括任何現在已知方法的使用，或之後開發的能夠製備基本的單個細胞培養物的方法的使用。這些方法的非限制性實例包括使用細胞分散緩沖液、和使用蛋白酶，例如胰蛋白酶、膠原酶、分散酶和accutase。這些蛋白酶和一些蛋白酶的組合是市售的。本發明考慮在傳代期間的任意點，細胞培養物可解離成基本單個的細胞培養物，並且無需在傳代期間接觸抑制劑前立即解離細胞。解離可在一或更多代中發生。或者，可離心樣品解離細胞培養物。使用本發明的方法製備的細胞具有多種用途。特別的，細胞可作為核轉移技術的核材料源使用，並可用於製備用於移植的器官的細胞、組織或成分。例如，若製備胰腺內胚層細胞或肝內胚層細胞，可在人細胞治療或人基因治療中使用，以治療疾病，例如l型糖尿病、肝病和任何其他影響胰腺或肝的疾病。在一個上述的實施方案中，胰腺內胚層細胞用於治療糖尿病或進一步分化製備胰腺(3細胞，在糖尿病治療中使用。此外，細胞可用於毒性或藥物篩選。在整個申請中，參考了多個出版物。所有這些出版物的公開內容和出版物中引用的參考文獻，在此申請中全部引用，從而更全面地描述本發明所屬
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的狀態。實施例實施例1人ES細胞的培養人ES細胞的常規培養在此項工作中可使用人胚胎幹細胞才朱BG01(BresaGen，Inc.,雅典，GA)。BG01細胞生長在hES培養基中，培養基由補充20%敲除血清替代物(knockoutserumreplacer)(KSR;Invitrogen)的DMEM/F-12(50/50)、0.1mMMEM非必需胺基酸(NEAA;Invitrogen)、2mM的L-穀氨醯胺(Invitrogen)、50U/ml青黴素、50|ig/ml鏈黴素(Invitrogen)、4ng/mlbFGF(Sigma)和0.1mM的P-巰基乙醇(Sigma)組成。細胞在小鼠原代胚胎成纖維飼養層上生長，飼養層用絲裂黴素c有絲分裂滅活。飼養細胞以每35mm平亞1.2xl06細胞接種。BG01細胞使用膠原酶/胰酶方法傳代。簡言之，培養基從平皿去除，加入iml的200U/ml的IV型膠原酶(GibcoBRL)，並且細胞在37°C孵育1-2分鐘。去除膠原酶，並使用1ml的0.05%胰酶/0.53mMEDTA(GIBCO)。細胞在37°C醉育30秒，之後從飼養層清洗，胰酶在含10%胎牛血清(FBS;Hyclone)的DMEM/F-12中失活。細胞以每35mm平皿100,000-300,000細胞的密度重新接種在飼養層上，並且每3天傳代。BG01細胞在無飼養層條件中的生長絲裂黴素處理的MEFs用hES培養基(25mls)過夜處理，所述MEFs以56,000細胞/cn^的密度接種在750112培養瓶中。MEFs使用達1周，每24小時使用條件培養基(CM)收集。CM在使用前再補充8ng/ml的hbFGF。通過稀釋生長因子減少的(GrowthFactorReduced)BD基質膠基質(BDBiosciences)至在冰冷DMEM/F-12中終濃度1:30而製備基質膠包被的平皿。在室溫，將lml/35mm平亞用於包被平亞1-2小時或至少4°C過夜。培養板在4°C儲存長至1周。在臨用前去除基質膠溶液。胚狀體形成使用上述膠原酶/胰酶方法解聚(disaggregate)BG01細胞。約10,000細胞懸浮在50pl的補充10%FBS(AtlantaBiolabs)、0.1mMNEAA、2mML-穀氨醯胺、50U/ml青黴素和50Mg/ml鏈黴素的EB培養基中(DMEM(Cellgro)),並用p200的槍頭滴於100mmPetri皿蓋(Petridishlid)中。約每個蓋滴約50滴。將蓋置於平亞上，並在平亞中;^文置10ml的PBS。在第3和第5天，從蓋上清洗EBs，在室溫用胰酶孵育5分鐘，並用拉長的玻璃吸管解聚。細胞在lxPBS中清洗一次，在室溫用2。/oPFA/2。/o蔗糖固定10分鐘。之後細胞在PBS中清洗兩次，並儲存在1%BSA/PBS中，以備抗體染色使用。實施例2用PI3-激酶抑制劑處理HES細胞導致HES細胞分化抑制劑/分化試劑處理幹細胞使用膠原酶/胰酶方法從銅養物中傳代BG01細胞，並在條件培養基(CM;MEF條件培養基加8ng/mlbFGF)中以lx105細胞/35mm平皿的密度接種於基質膠包被的平皿上。約24小時後，用新鮮CM、帶有抑制劑的CM(在EtOH中重懸)、帶有EtOH的CM、或用自然分化培養基(SpontaneousDifferentiationmedium)(hES培養基減去bFGF)替換培養基。在其他方法中，在接觸CM、帶有抑制劑的CM和帶有EtOH的CM之前，以不同濃度接種BG01細胞，細胞以下列濃度接種約5xl04細胞/35mm平皿、約lx105細胞/35mm平皿、約2xl05細胞/35mm平皿、約4x105細月包/35mm平皿和約6xl05細胞/35mm平皿。優選使用濃度在約20-163inM範圍的抑制劑LY294002(Biomol)，並且抑制劑雷帕黴素(Calbiochem)在約1.5-30nM的濃度範圍內使用。LY294002通過結合至ATP停靠位點(dockingsite)pl10，抑制PI3-激酶通路。雷帕黴素通過抑制mTOR(雷帕黴素的哺乳動物靶點)抑制一系列PI3-激酶通路。細胞在此條件生長約72小時，每24小時更換培養基。使用膠原酶/胰酶方法收集細胞用於流式細胞術和RT-PCR分析，並且刮掉細胞用於生物化學分析。使用標準的顯樣i鏡，通過觀察細胞，注意到當LY294002或雷帕黴素存在時，BG01細胞經歷的形態學的改變。這種形態學的改變與自然分化經歷的細胞改變顯著不同。在未分化的培養物中，單個細胞不容易辨認，細胞相對小、不規則並且沒有清晰的較高密度的細胞連接。然而，在用LY294002處理後，細胞經歷了顯著的擴散和明顯的上皮樣骰狀形態。在較高密度，由於在相鄰細胞之間的分離的細胞連接很清楚，單個細胞也更容易辨認。jt匕夕卜，糹田月包以j氐於糹々2x105糹田月包/35mm平亞的密度4妾種，當包^皮LY294002或雷帕黴素接觸時表現出形態學改變。細胞以約4xl05細胞/35mm平皿或更高的密度接種，當接觸LY294002或雷帕黴素時不表現出相同的形態學改變。實施例3用PI3-激酶抑制劑處理的細胞的特性抑制劑研究如實施例2所描述進行。流式細力包術對於流式細胞術，在室溫BGOl細胞用lxPBS清洗，並用2%多聚曱醛/lxPBS固定10分鐘。之後細胞用lxPBS清洗，約2xl05細胞與一抗聘育，一抗用P/。BSA/lxPBS稀釋。使用的一抗是抗CD9和抗血栓調節蛋白抗體(CymbusBiotechnology),連接FITC的小鼠單克隆抗體，1:10稀釋。細胞4。C聘育30分鐘，之後用lxPBS清洗兩次。合適時，將細胞重懸在二抗中，抗小鼠Alexa-488(MolecularProbes)，在1%BSA/PBS中以1:1000稀釋，在4°C孵育30分鐘，並且之後用lxPBS中清洗兩次。細胞重懸在1%BSA/lxPBS中，並使用BeckmanCoulterFC500分析表面表達。RNA分離和RT-PCR分析總RNA使用TRIzol試劑(GibcoBRL)分離。RNA在1%的包含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上電泳，並使用AlphalmagerTM2200記錄和分析系統觀察以保證RNA完整性。10昭的RNA用DNase(Ambion)處理，使用DNase失活試劑(Ambion)去除DNase。cDNA使用SuperscriptII逆轉錄酶試劑盒(Invitrogen)使用oligo(dT)引物用500ng總RNA製備。PCR反應在1的cDNA上進行。PCR產物在包含溴化乙錠的2%的瓊脂糖凝膠上電泳，並使用AlphalmagerTM2200記錄和分析系統觀察。使用的PCR引物組合為GATA4、Mixl、Msxl、AFP、HNF4alpha、eHAND、Nanog、AFP和GAPDH.生物化學分析PI3-激酶信號通路的激活可通過蛋白印跡分析評價。簡言之，去汙劑提取物由未處理和處理的細胞培養物製備，通過SDS-PAGE分離，在硝酸纖維素膜上形成印跡。之後PI3-激酶細胞內靶分子PKB/Akt、S6激酶和S6蛋白的活性形式表達通過結合每種蛋白磷酸化形式的合適抗體在硝酸纖維素膜上形成的印跡確定。通常，每個樣品^r測30ng的總蛋白，一抗1:1000稀釋孵育，通過標準的基於ECL的方法學檢測各個情況下的結合。O-PCR基因表達實驗通過Q-PCR在多個時間點對多個標記物基因的進行實時定量分析。評價理想的和非理想的細胞類型的標記物基因特徵以獲得對細胞群的全部動力學的更好的理解。Q-PCR分析優點(strength)包括其高度敏感性和開發必須標記物的相對容易性，因為基因組序列是容易獲得的。此外，Q-PCR的極高度的敏感性允許來自在相當大的群中的相對少量的細胞的基因表達的檢測。此外，檢測非常低的基因表達水平的能力可提供群中的"分化偏性(differentiationbias)"指徵。在細胞表型明顯的分化之前，使用免疫化學技術很可能不能識別向特殊的分化通路的偏性。因此，Q-PCR提供了補充用於篩選成功分化處理的免疫細胞化學技術的分析方法。此工具提供了評價我們的分化流程的方法，成功用於半高通量分析的定量形式。通常使用SYBRGreenchemistry在RotorGene3000儀器(CorbettResearch)和兩步RT-PCR形式進行此方法的相對定量。設計引物處於外顯子-外顯子邊界，或當可能時跨越至少800bp的內含子，這可減少汙染的(contaminating)基因組DNA的擴增。當使用不包含內含子的標記基因時，或標記基因含有假基因(pseudogenes)時，可用DNaseI處理的RNA樣品。與hESC分化早期相關的標記物(特別是外胚層、中胚層、定形內胚層和胚胎外內胚層)，和驗證的引物提供在表1中。也表明了這些引物的人特異性。這很重要因為hESCs經常在小鼠祠養層上生長。通常，在各條件下，採用三份樣品，重複獨立分析以評價每個定量測定相關的生物變異性。4吏用RNeasy(Qiagen)分離總RNA，並使用RiboGreen(MolecularProbes)定量。使用iScript逆轉錄酶試劑盒(BioRad)從350-500ng總RNA逆轉錄，試劑盒包括oligo-dT和隨機引物的混合物。隨後每個20nL的反應稀釋至100|iL總體積，並且在每個10|aL的Q-PCR反應物中使用3(iL，反應物包括400nM的正和反引物和5pL2XSYBRGreenmastermix(Qiagen)。兩步循環參數在85-94。C變性5秒(特別根據每個引物對的擴增子的熔解溫度選擇)，隨後在60。C退火/延伸45秒。每個延伸相的最後15秒收集螢光數據。三點、10-倍稀釋以製備每個循環的標準曲線，根據標準曲線，起始循環閾值(Ct，s)轉換為定量值。每個樣品的定量值對看家基因標準化，之後計算三份樣品的均值和標準差。PCR循環後，進行熔解曲線分析，以確定反應特異性。在適合PCR擴增子的Tm處的單峰說明單個的特異性產物。此外，進行的不含逆轉錄酶的反應可作為陰性對照，並且沒有擴增。使用環孢素G(CyclophilinG)和GUS對所有樣品計算標準化因子。多個HGs的使用同時減少標準化過程本身的變異性，並增加相對基因表達值的可靠性(Vandesompele，等人，2002，GenomeBiol"3:RESEARCH0034)。使用Q-PCR確定許多接受不同實驗處理的交叉樣品的標記基因的相對的基因表達水平。使用標記基因，因為標記基因在早期胚胎層代表性的特異群中富集，並且特別集中於基因集合(setsofgenes)中，所述基因集合在定形內胚層細胞中表達不同。這些基因和其相對富集的情況在表1中顯示。它們有助於分離和表徵定形內胚層、胰腺內胚層或肝內胚層細胞的形成。表1tableseeoriginaldocumentpage36NODAL上胚層和前髒壁內胚層外胚層ZIC1神經管、神經前體(progenitors)SOX1神經前體中胚層BRACH新生中胚層(nascentmesoderm)FOXF1免疫組織化學SOX17抗體SOX17在整個定形內胚層表達，在原腸胚形成期間形成，並且它在腸管內維持表達(儘管表達水平沿A-P軸改變)，直至大約開始器官形成。SOX17也在一組胚胎外內胚層細胞表達。在中胚層或外胚層中沒有觀察到這種蛋白的表達。因此，SOX17是定形內胚層譜系合適的標記物，當與標記物綴合使用時以排除胚胎外譜系。SOX17抗體可如2003年12月23日提交的標題為"定形內胚層"美國臨時申請No.60/532,004中所述生產，在此全部引入作為參考。簡言之，人SOX17部分cDNA對應SOX17蛋白羧基末端胺基酸172-414,所述人SOX17部分cDNA用於在抗體生產公司GENOVAC(Freiberg,Germany),根據開發的流程，通過基因免疫大鼠用於生產SOX17抗體。基因免疫的流程可見美國專利Nos.5，830，876、5,817,637、6,165,993、6，261，281和國際出版物No.W099/13915,其公開在此全部引用作為參考。通過蛋白免疫印跡和ICC在hSOX17cDNA轉染的細胞抹上確定抗體對SOX17的特異性。免疫染色的細胞可在細胞培養玻片上生長，並用1XPBS清洗一次，並在室溫在4%PFA/4%蔗糖的pH7.4的PBS中固定10分鐘。之後在1XPBS中清洗3次，之後在室溫用3%山羊血清和0.1%Triton-XlOO的PBS溶液封閉1小時。一抗在3%山羊血清的PBS溶液稀釋，並且在4°C過夜該溶液。使用的一抗是兔抗-人AFP(Zymed)，1:50稀釋，和大鼠抗-人SOX17(購自Cythera，Inc.),1:1000稀釋使用。細胞用更換3次的1XPBS清洗1小時。在室溫使用二抗2小時。使用的二抗為山羊抗-兔AlexaFluor488和山羊抗-大鼠AlexaFluor594(MolecularProbes),均以1:1000在3%山羊血清的1XPBS中稀釋。細胞用更換3次的1XPBS清洗1小時。去除小室，用帶有DAPI的(Vector)VectaShield包埋培養基包埋載玻片。結果使用流式細胞術，值得注意的是CD9的表達在LY294002或雷帕黴素處理的BG01細胞中的降低顯著快於貼壁培養的自然分化細胞或胚狀體。此外，之前通過其他觀察得知CD9的表達影響細胞增殖、運動和粘附。通過RT-PCR分析，值得注意的是在用LY294002和雷帕黴素處理的細胞中可檢測到早期分化指徵的大量標記物。值得注意的是，當PI3-激酶信號阻斷時，檢測到的標記物可能不同於自然分化的貼壁BG01細胞培養物中所檢測到標記物。例如，和與自然分化分化培養物相比，阻斷PI3-激酶可導致HNF4a、GATA4、Mixl、和Msxl表達的增加，AFP水平的下降。此外，PCR數據支持隨多能(pluripotent)細胞密度改變而顯現的細胞形態上的不同。在一些情況下用LY294002或雷帕黴素處理的作用可依賴於細胞密度。生物化學分析，值得注意的是LY294002在細胞中的保持出現抑制了Akt、S6激酶和S6的激活。相似的，雷帕黴素的出現消除S6激酶和S6的活性。所有的觀察表明當這些抑制藥物出現時，至mTOR的PI3-激酶信號在BG01細胞中下調。S6(在此信號通路中的遠端靶信號)的激活在經歷自然分化的貼壁培養的BG01細胞中減少，但在抑制劑處理的細胞中消除。實施例4從人胚胎幹細胞製備胰內胚層細胞方法基質膠培養物來自mef飼養培養板的人ES細胞，細胞60-90%匯合，用IXPBS清洗，並向每個100mm組織培養板加入5ml的在DMEM/F12中的200-400U/ml的膠原酶IV，在37。C/5。/。CC)2孵育30-120分鐘，直至克隆從培養板表面取出。通過輕柔研磨收集細胞，置於15ml的錐形管中，並以200Xg離心5分鐘。從細胞沉澱(pellet)中吸出培養基並在帶有8ng/mlbFGF的10ml20%KSR的條件培養基(CM20K)中重懸。將所述細胞種於之前準備好的基質膠培養板上(1:30稀釋的基質膠的DMEM/F12溶液)，該細胞用帶有8ng/mlbFGF的CM20K以1:1至1:6稀釋。定形內胚層分化在基質膠上的人ES細胞培養物用PBS清洗2X。加入2-3ml胰酶/EDTA溶液，研磨細胞並在15ml錐形管中收集細胞。加入帶有10%FBS的DMEM/F12以終止胰酶消化，並且細胞以200Xg離心5分鐘。細胞沉澱，現在大部分為單細胞，具有2-4個細胞簇的小細胞群，在帶有8ng/mlbFGF的CM20K中重懸，4.5x105細胞/100mm接種在基質膠包被的組織培養板上。培養板在37°C/5%C02孵育16-24小時。孵育後，培養基更換為帶有8ng/mlbFGF、50ng/ml激活蛋白A和25ug/mlLY294002的CM20K。培養基每日更換，共4-6天。胰腺內胚層分化定形內胚層細胞(來自上述處理)使用PBS清洗2X。加入2-3ml胰酶/EDTA溶液，研磨細胞，並在15ml錐形管中收集。加入帶有10%FBS的DMEM/F12以終止胰酶消化，並且細胞以200Xg離心5分鐘。細胞沉澱，現在大部分為單細胞，具有2-4個細胞蔟的小細胞群，在DMEM/F12、10%FBS、2uM全反式視黃酸和10-50ng/mlFGF10中重懸。將細胞以7.5x105細胞/100mm接種在基質膠包被的組織培養板上。培養板在37°C/5%C02孵育，每天更換培養基。在4天後，培養基替換為DMEM/F12、10。/。FBS,共1-4天。在肝內胚層分化時，如果使用上述胰腺內胚層分化條件，除了不包含視黃酸並且增加FGF10的量(替代不包含的視黃酸)外，以上述相同條件製備肝內胚層。其他實施例第一個實施例涉及處理定形內胚層後，表達胚胎肝標記物的曱胎蛋白(AFP)的細胞的製備。加入LY294002(50uM)後，BG01hESCs分化成為定形內胚層4天。培養基換為DMEM/F12、10%FCS,並且細胞生長至多再6天(uptosixmoredays)。未處理:未處理hESCs。AFP轉錄水平通過QRT-PCR分析，一式三份，在對GAPDH的參照轉錄標準化後，轉錄水平表示為相對未處理樣本(hESCs)的增加倍數。注意儘管在加入FgflO後可見AFP誘導，但此結果可在無Fgfl0(inthepresenceofabsenceofFgflO)時實現，圖1。第二個實施例觀察RA處理後，Pdxl轉錄誘導的時程。BGOlhESCs用LY294002(50uM)處理4天，之後更換為包含DMEM/F12、10%FCS、50ng/mlFgflO和2uM視黃酸的培養基至多4天。未處理-未處理hESCs。轉錄水平通過QRT-PCR分析，一式三份，在對GAPDH的參照轉錄標準化後，轉錄水平表示為相對未處理樣本(hESCs)的增加倍數。表示除Pdxl轉錄水平的倍數誘導。實驗結果見圖2。第三個實施例觀察RA處理後，Pdxl和Isll轉錄誘導的時程。BG01hESCs使用LY294002(50uM)處理4天，之後更換由DMEM/F12、10%FCS、50ng/mlFgflO和2uM視黃酸組成的培養基至多4天。未處理:未處理hESCs。轉錄水平通過QRT-PCR分析，一式三份，在對GAPDH的參照轉錄標準化後，轉錄水平表示為相對未處理樣本(hESCs)的增加倍數。此實驗結果見圖3。第四個實施例觀察對不同培養條件對應的Soxl7、AFP和Pdxl的表達。未處理:未處理BG01hESCs在MEF-CM、Fgf2、20%KSR存在的基質膠上培養。L^:hESCs生長在MEF-CM和Fgf2和基質膠上，用LY294002處理4天。F106d:用LY294002處理hESCs4天，換為包含FgflO(50ng/ml),10%FCS的培養基再6天。RA4d/2d:使用LY294002處理hESCs4天，更換為包含FgflO(50ng/ml)、2PMRA、10%FCS的培養基(DMEM/F12)再4天。之後在無RA和FgflO的相同培養基中再培養2天。Soxl7、AFP和Pdxl轉錄通過QRT-PCR分析，一式三份，在對GAPDH的參照轉錄標準化後，轉錄水平表示為相對未處理樣本(hESCs)的增加倍數。圖4表示Soxl7、AFP和Pdxl對不同培養條件的反應。第五個實施例表明處理RA後Pdxl十細胞的水平。在此實驗中，在加入LY294002(50yM)後，BG01hESCs分化成為定形內胚層4天。培養基更換為DMEM/F12,10%FCS，並且細胞生長至多再5天。用LY294002處理hESCs4天，更換含FgflO(50ng/ml)、2uMRA、10%FCS的培養基(DMEM/F12)再5天。處理和未處理(hESCs)在LabTec細胞培養玻片生長，使用4%多聚曱醛固定，孵育兔抗-人Pdxl抗體(Chemicon，1:1,000)，隨後孵育AlexaFluor(594nm)標記的山羊抗-兔二抗(紅色)。細胞包埋在包含DAPI的培養基中，所述DAPI用於觀察核DNA(藍色)。圖5表明用RA處理的Pdxl十細胞免疫螢光染色。hESCs的培養方法hESCs優選在MEF-CM(詳細內容見之前的文檔)或確定成分培養基使用基質膠(1:200稀釋)(例如)作為生長基質中生長細胞，手動或通過使用酶方法例如膠原酶或accutase傳代，並通常以1x106每60mm平皿在hESC培養基中接種12-24小時，之後培養基換為促進DE分化(見如下'分化培養基')培養基。在分化期間，每日更換'分化培養基'。兩個用於hESC培養的確定成分培養基的實施例如下所述(a)DMEM:F12(Gibco)、2%BSA(Seriologicals、#82-047-3)、lxPen/Strep(Gibco)、lx非必需胺基酸(Gibco)、lx微量元素A、B和C(Cellgro;#99-182-Cl、#99-176-Cl、#99-175-Cl)、50ug/ml抗壞血酸(Sigma、#A4034)、10ug/ml轉鐵蛋白(Gibco、##11107-018)、O.lnM卩-疏基乙醇、8ng/mlFgf2(Sigma、#F0291)、200ng/mlLR畫IGF(JRHBiosciences,#85580)、10ng/ml激活蛋白A(R&DSystems、#338-AC)、10ng/mlHeregulinP(Peprotech;#100-03)。(b)第二種確定成分培養基包括DMEM/F12、lxPen/Strep、lx非必需胺基酸(Gibco)、Fgf2(10ng/ml)、IGF1(或LR-IGF;10ng/ml)、激活蛋白A(10ng/ml)、牛血清白蛋白(片段V或相似)、轉鐵蛋白(10yg/ml、Gibco)、lx微量元素(Cellgro)、P-巰基乙醇。其他的確定成分培養基在Ludwig等人，2006;NatureBiotech,249(2),185-187,2006中描述。生長在無飼養層條件下的細胞通過更換成包含不支持高PI3K信號的升高含量的(至少約5ng/ml、至少約5-10ng/ml、至少約15ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、約50-100ng/ml)激活蛋白A、nodal、TNF卩或來自TNF家族的其他因子的確定成分培養基(無胎牛血清或KSR-型血清補充物)。在正常情況下，需要因子通過促進PI3K活性促進hESCs的自我更新。之前已表明(McLean等人，2007)通過減少KSR或FCS或通過加入抑制劑的PI3K的抑制使激活蛋白A、nodal、TNF卩或其他成分的條件可以促進DE分化。例如，分化培養基不應具有促進PI3K信號的高水平的胰島素、IGF或EGF家族成員(如heregulin)。這種DE分化培養基的實施例是:(a)DMEM:F12(Gibco)、2%BSA(Seriologicals、#82-047-3)、lxPen/Strep(Gibco)、lx非必需胺基酸(Gibco)、lx微量元素A、B和C(Cellgro;#99-182-Cl、#99-176-Cl、#99-175-Cl)、50ug/ml抗壞血酸(Sigma、#A4034)、10ug/ml轉鐵蛋白(Gibco、##11107-018)、O.lnMp-巰基乙醇、8ng/mlFgf2(Sigma、#F0291)、100ng/ml激活蛋白A(R&DSystems,#338-AC)、Wnt3a(25ng/ml、R&DSystems)。(b)第二種確定的分化培養基包含DMEM/F12、Fgf2(10ng/ml;Sigma、#F0291)、Wnt3a(25ng/ml、R&DSystems)、激活蛋白A(100ng/ml、R&DSystems)、牛血清白蛋白(2%、Seriologicals、#82-047-3)、轉鐵蛋白(10ug/ml、Gibco、##11107-018)、微量元素、P-巰基乙醇也作為基礎培養基使用，之後可加入特異信號。最佳的，在更換分化培養基後最初24-36小時包含Wnt3a。分化實驗如每個之前的文檔和McLean等人，2007(Stemcell)所述。結果描述為了表明真正的定形內胚層從hESCs的製備，表明沒有製備胚外譜系是十分重要的，因為細胞類型例如胚外譜系也表達用於鑑別DE的幾種標記物(例如Soxl7、GATA4，6、FoxA2)。分化的特徵為在經過成為中內胚層的中間期細胞轉變後形成分化。這種細胞類型通常表達T、MixLl和Wnt3a,重要的是通過T+狀態表明預定的DE形成，如McLean等人2007和D'Amour等人2005所述。化hESCs成為CXCR4+Soxl7+DE。圖7表明TmRNA水平在12小時增加，到24小時表現出最大水平(相對未處理hESCs70-倍誘導)。MixLl轉錄峰在48小時((>400-倍誘導)。DE相關轉錄例如Soxl7、Gsc和CXCR4增加直至處理的72小時，分別表現出高達800、230和200倍增加。在Wnt3a存在或無Wnt3a時進行平行實驗，表明+Wnt3a條件促進處理72小時後CXCR4mRNA的量，但並不重要(notessential)。圖8表明標記物轉錄的Q-PCR分析以評價是否製備胚外(AFP,THBD)或中胚層(FoxFl)。分析表明在處理96小時後無胚外內胚層標記物(AFP，THBD)的增加，表明Soxl7表達與DE形成相關。當DE轉錄增加，例如Soxl7(400-倍)、CXCR4(~275畫倍)、Gsc(260-倍)、GATA4(~90-倍)Nanog水平(ESC標記物)減少。中內胚層轉錄水平增加(T,MixLl)在24-48小時的DE轉錄增加之前，與向DE轉變的通過中內胚層的細胞群轉變一致。通過免疫細胞化學，分別使用Soxl7和T抗體評價分析分化成為DE和中內胚層的細胞％(圖9)。在24和48小時，更換為分化培養基之後，幾乎100%的細胞用T抗體染色為陽性，表明在這些時間點出現接近均一群的中內胚層。到處理的48小時，Soxl7陽性細胞的％開始增加，並且檢測到許多Soxl7-T雙陽性細胞(~20%)。到72小時，培養物由~>95%Soxl7十細胞組成，93%CXCR4陽性細胞的培養物。這優於至今任何其他報告的方法。表示出了在我們的條件下的hESCs的明場圖片和製備的DE(圖11)。我們開發了從hESCs製備DE的改進方法。此方法與之前的方法相比具有幾個優點，包括更穩固、可重複的培養系統，此系統更適於細胞治療的開發。圖8表明通常的用於分化hESCs成為DE和之後成為後腸/胰腺內胚層(Pdxl+細胞)的策略。腸管標記物Tcf2和胰腺內胚層/後側前腸(posteriorforegut)標記物Pdxl的增加在DE重接種於包含RA和Fgfl0的培養基後的12天表現出(圖1"。通過QRT-PCR檢測轉錄。Tcf2轉錄峰在~第6天，比hESCs中增加~60-倍，並且Pdxl轉錄峰~第10天，表現出與hESCs中相比幾乎2,000倍的增加。之後在接種的DE上進行ICC，RA和Fgfl0存在2、6和12天(圖14)。Tcf2陽性細胞在處理2天後檢測(25%陽性)但到6天增加到100%，到12天稍孩i降低到50%。在第2和第6天沒有4企測到Pdxl陽性細胞，但在第12天培養物〉80%。*這些通常的方法對所有檢測的細胞4朱有效，包括BG01、BG02、H7、H9。從定形內胚層製備胰腺內胚層的方法一旦通過上述一種方法製備0乂014+DE，細胞使用accutase或膠原酶(或相似的)傳代，並接種在基質膠上(U00;或相似基質)。DE通常以0.5xl06/60mm平皿在PE分化培養基中接種長達12天(見下)。胰腺內胚層分化培養基0)DMEM:F12(Gibco)、2%BSA(Seriologicals、#82-047-3)、lxPen/Strep(Gibco)、lx非必需胺基酸(Gibco)、lx微量元素A、B和C(Cellgro;#99-182-Cl、#99-176-Cl、#99-175-Cl)、50ug/ml抗壞血酸(Sigma、#A4034)、10ug/ml轉鐵蛋白(Gibco、##11107-018)、O.lnMe-巰基乙醇、10ng/ml激活蛋白A(R&DSystems,#338-AC)、10ng/mlHeregulinP(Peprotech;#100-03)、200ng/mlLR-IGF(JRHBiosciences、#85580)、全反式視黃酸(0.2-2.0jiM;Sigma-Aldrich)、50ng/ml重組人FgflO(R&DSystems)。當補充有效量的視黃酸和FgflO時，其他確定成分培養基製劑的用途(見上述人ESC確定成分培養基)可用於分化步驟。實施例為了促進(高效的/可控的/特異的結果)hESCs的分化，包括特異譜系的製備，包括內胚層譜系，包括但不限制於定形內胚層或胰腺內胚層。用於治療和非治療目的。與上述相同，但為應用其他(即成人)幹細胞或前體。當肺瘤細胞去分化時、當癌症細胞為幹-細胞樣時，和當癌症細胞不發生分化時，為在癌症申請。在各種疾病狀態下在前體或部分定型的細胞分化失敗的情況下。可直接向HESC培養基加入本發明使用，或存在低濃度的血清或聯合其他生長因子使用，例如細胞因子，其他因子包括TGF和超家族成員。當需要製備特殊細胞類型時，作為藥物篩選的一部分。權利要求1.從定形內胚層細胞製備人胰內胚層細胞的方法，其包括a.在細胞分化培養基中，將人定形內胚層細胞暴露於有效量的視黃酸至少一天的時間；並且b.通過將所述細胞暴露於不含視黃酸的穩定培養基而穩定由步驟a獲得的分化細胞。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述定形內胚層細胞從暴露於P13K抑制劑的人胚胎幹細胞獲得。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述細胞分化培養基包含濃度約0.05昭/ml至約25ng/ml的視黃酸。4.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述細胞分化培養基包含濃度約0.1嗎/ml至約2嗎/ml的視黃酸。5.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述細胞分化培養基還包含成纖維細胞生長因子。6.根據權利要求1或4所述的方法，其中所述細胞分化培養基還包含濃度約2嗎/ml至約100嗎/ml的成纖維細胞生長因子10。7.根據權利要求1或4所述的方法，其中所述細胞分化培養基還包含濃度約2(ig/ml至約100昭/ml的成纖維細胞生長因子10。8.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述細胞分化培養基為包含約2%至約20%胎牛血清的基礎細胞培養基。9.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述細胞分化培養基包含約10%胎牛血清。10.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述穩定培養基為包含約2%至約20%胎牛血清的基礎細胞培養基。11.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述穩定培養基為包含約10%胎牛血清的基礎細胞培養基。12.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述暴露步驟發生至少約2天的時間。13.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述暴露步驟發生至少約4天的時間。14.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述暴露步驟發生至少約4天的時間。15.根據權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述穩定步驟發生至少約1天的時間。16.根據權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述穩定步驟發生至少約2天的時間。17.根據權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述基礎細胞培養基是DMEM和F12的混合物。18.根據權利要求16所述的方法，其中所述基礎細胞培養基是DMEM和F12以50:50混合的混合物。19.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中，在定形內胚層細胞或所述分化細胞在包含分化蛋白的支持物上生長期間，發生所述暴露步驟或所述穩定步驟。20.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中，在定形內胚層細胞或所述分化細胞在包含基質膠的支持物上生長期間，發生所述暴露步驟或所述穩定步驟。21.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中，在所述定形內胚層細胞或所述分化細胞在包含分化蛋白的支持物上生長期間，發生所述暴露步驟和所述穩定步驟。22.從定形內胚層細胞製備肝內胚層細胞的方法，其包括a.在細胞分化培養基中將定形內胚層細胞暴露於有效量的成纖維細胞生長因子至少一天的時間；並且b.通過將所述細胞暴露於穩定培養基，穩定由步驟a獲得的分化細胞。23.根據權利要求21所述的方法，其中所述成纖維細胞生長因子是成纖維細胞生長因子IO。24.製備胰內胚層細胞的方法，其包括a.將通過將人胚胎幹細胞暴露於包含有效量的作為分化試劑的P13K抑制劑的基礎細胞培養基，從人胚胎幹細胞製備定形內胚層細胞；b.穩定所述的來自步驟a的定形內胚層細胞；c.在步驟b後，在細胞分化培養基中將定形內胚層細胞暴露於有效量的視黃酸至少一天；並且d.通過將所述細胞暴露於無視黃酸的穩定培養基，穩定從步驟a獲得的分4b細l包。25.在無飼養細胞條件下，從胚胎幹細胞製備定形內胚層細胞的方法,包括使用生長基質將接種的胚胎幹細胞暴露於確定成分培養基或MEF條件培養基，並且之後將幹細胞暴露於分化培養基，所述分化培養基為確定成分培養基，其包含有效量的激活蛋白A、nodal、TGF(3或其他TGF成分，並且任選的包含PI3激酶信號抑制劑。26.根據權利要求24所述的方法，其中確定成分培養基包括PI3K信號抑制劑。27.根據權利要求24或25所述的方法，其中所述生長基質為基質膠.。28.從胚胎幹細胞製備定形內胚層細胞的方法，包括將無飼養細胞的所述幹細胞暴露於包含升高濃度的激活蛋白A、nodal或TNF卩和任選的PI3激酶信號抑制劑的分化培養基，其中所述分化培養基是不含胎牛血清或KSR-型血清成分的確定成分培養基。29.根據權利要求24-27中任一項所述的方法，其中，所述定形內胚層細胞以至少約90%的水平從所述胚胎幹細胞製備。30.根據權利要求24-28中任一項所述的方法，其中所述定形內胚層細胞進一步分化為胰內胚層細胞。31.根據權利要求24-29所述的方法，其中所述細胞是人細胞。32.—種從人胚胎幹細胞製備胰內胚層細胞的方法，所述方法包括在無飼養細胞條件下，從胚胎幹細胞製備定形內胚層細胞，包括使用生長基質將胚胎幹細胞暴露於確定成分培養基或MEF條件培養基中，並且之後將所述幹細胞暴露於分化培養基至少約3-6天的時間，所述分化培養基為確定成分培養基，該培養基包含有效量的SMAD通路激動劑，和任選的PI3激酶信號抑制劑，以製備定形內胚層細胞，並且之後再將所述定形內胚層細胞暴露於包含有效量的視黃酸和任選的有效量的FGF10的確定成分培養基約5-12天，優選8-10天，以製備胰內胚層細胞。33.根據權利要求32所述的方法，其中所述SMAD通路激動劑選自激活蛋白A、nodal、TGF卩、TGF成分或其混合物。34.根據權利要求32或33所述的方法，其中所述培養基還包括有效量的wnt3a。35.根據權利要求34所述的方法，其中所述生長基質為基質膠。全文摘要本發明涉及允許從多能幹細胞例如人胚胎幹細胞和定形內胚層細胞的有效分化，以形成胰內胚層細胞的方法。本發明直接應用於製備終代胰島β細胞，所述胰島β細胞可作為治癒糖尿病的部分治療使用。此外，本發明可用於從人胚胎幹細胞和定形內胚層細胞製備肝內胚層細胞。本發明涉及使用沒有飼養細胞的確定成分培養基，從幹細胞，優選人胚胎幹細胞，製備定形內胚層和胰內胚層細胞的方法。從胚胎幹細胞提供胰內胚層細胞的簡單的兩個步驟代表了本發明的其他實施方案。文檔編號C12N5/08GK101541953SQ200780028903公開日2009年9月23日申請日期2007年6月4日優先權日2006年6月2日發明者戴維·雷諾茲,史蒂芬·達爾頓,麥可·庫利克申請人:喬治亞大學研究基金會