分離的哺乳動物膜蛋白基因和相關試劑的製作方法

2023-09-12 14:01:05 2

專利名稱：分離的哺乳動物膜蛋白基因和相關試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及與在淋巴細胞，例如，在免疫系統中起作用的細胞中發現的基因有關的組合物。這些基因在控制哺乳動物免疫系統的發育、分化和/或生理中起作用。具體地，本申請提供了核酸、蛋白質、抗體，和使用它們的方法。
背景技術：
哺乳動物循環系統的循環組分包括各種細胞類型，包括紅細胞和骨髓細胞譜系的紅細胞和白細胞。見，例如，Rapaport(1987)Introduction to Hematology(第二版)Lippincott，Philadelphia，PA；Jandl(1987)BloodTextbook of Hematology，Little，Brown和同事，Boston，MA.；和Paul(編者，1998)Fundamental Immunology(第四版)Raven Press，N.Y。
樹突細胞(DC)是抗原加工或呈遞細胞，並且被發現於身體的所有組織。可將它們分成各種類別，包括心臟、腎、內臟和肺的間質樹突細胞；腎和黏膜中的朗格漢斯細胞；胸腺髓質和次級淋巴組織中的交錯樹突細胞；和血液和淋巴樹突細胞。儘管這些隔室的每一種中的樹突細胞都是表面上來自骨髓的CD45+白細胞，但是它們顯示出與成熟狀態和微環境有關的差異。
這些樹突細胞將抗原有效加工並呈遞到例如，T細胞。它們刺激次級淋巴器官的副皮質區中幼稚和記憶T細胞的應答。有證據證明樹突細胞在誘導耐受性中的角色。
初級和次級B細胞濾泡含有濾泡樹突細胞，其捕獲並長時間保留完整抗原作為免疫複合體。這些樹突細胞將天然抗原呈遞給B細胞並且可能參與抗原的親和性成熟、免疫記憶的產生和體液免疫應答的維持。
單核細胞是巨噬細胞性細胞，它們屬於單核巨噬細胞體系並停留在循環中。見Roitt(編者)Encyclopedia of ImmunologyAcademicPress，San Diego這些細胞起源於骨髓並且一旦它們分化僅在髓隔室中短時間保留。然後它們進入循環並可以保持相對長的時間，例如，幾天。單核細胞通過所稱作的血細胞滲出過程可以進入組織和體腔，在那裡它們分化成巨噬細胞並可能分化成樹突細胞。在炎症反應中，循環中單核細胞數可以倍增，並且許多數量增加的單核細胞滲出到炎症部位。
抗原呈遞指一種細胞事件，其中蛋白質抗原被攝入，被抗原呈遞細胞(APC)加工，然後被識別而引起免疫應答。最具活性的抗原呈遞細胞已經被鑑定為巨噬細胞(它們是單核細胞的直接發育產物)、樹突細胞，和某些B細胞。
在多數組織中發現巨噬細胞並且它們在各種蛋白質抗原和微生物的內化中具有高度活性。它們具有高度發育的內吞活性，並且分泌對免疫應答的啟動重要的許多產物。因為該原因，認為被單核細胞表達或者被單核細胞活化誘導的許多基因對於抗原攝入、加工、呈遞或所導致的免疫應答的調節是重要的。
然而，樹突細胞和單核細胞在它們所表達的蛋白質和許多它們的功能和作用機理，包括它們的活化狀態方面都沒有被良好表徵。具體地，與免疫應答的啟動(包括抗原加工和呈遞)相關的過程和機理仍然不清楚。缺乏關於這些細胞的結構、生物學和生理學性質的知識限制了對它們的理解。從而，當醫學病症中的抗原呈遞細胞的調節、發育或生理不尋常時，仍然難以處理這些醫學病症。
序列標識符描述SEQ ID NO1是靈長類SDCMP3 C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO2是靈長類SDCMP3 C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO3是嚙齒類SDCMP3 C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO4是嚙齒類SDCMP3 C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO5是靈長類SDCMP4長C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO6是靈長類SDCMP4長C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO7是靈長類SDCMP4短C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO8是靈長類SDCMP4短C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO9是全長人SDCMP3核苷酸序列。
SEQ ID NO10是全長人SDCMP3多肽序列。
發明概述本發明部分基於發現了各種哺乳動物Schering樹突細胞膜蛋白(SDCMP)基因。分布數據表明了更廣的細胞分布，結構數據提出了某些功能，並且通過特定SDCMP3和SDCMP4實施方案例證。SDCMP3和4顯示了與凝集素和脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)類的相似性。本發明包括基因產物的激動劑和拮抗劑，例如，天然序列的突變(突變蛋白)、融合蛋白、化學模擬物、抗體，和其他結構或功能類似物。還涉及編碼本發明蛋白質的分離的基因。還提供了這些不同蛋白質或核酸組合物的各種用途。
本發明提供了分離的結合組合物，其特異結合含有SEQ ID NO2、4、6、8、或10的多肽。在一些實施方案中，結合組合物是抗體或其抗體結合片段。通常，抗體結合片段是a)Fv片段；b)Fab片段；或c)Fab2片段，抗體是a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；或c)人源化抗體。
本發明還提供了使用結合組合物的方法，該方法包括將結合組合物與含有抗原的樣品接觸形成結合組合物抗原複合體。在額外的實施方案中，樣品是生物樣品，包括體液；樣品是人；抗原在細胞上；抗原被進一步純化；或者方法提供抗原的空間定位或分布。
還提供了檢測試劑盒，其含有結合組合物和a)關於試劑盒中試劑的使用或處理的使用說明材料；或b)隔室，其使得結合組合物或試劑盒的其他試劑分開。
本發明包括基本上純的或分離的多肽，該多肽特異結合結合組合物。該多肽含有SEQ ID NO2、4、6、8或10。還提供了使用該多肽的方法，該方法包括將該多肽與抗體在適宜條件下接觸以形成抗體多肽複合體。另一實施方案是檢測試劑盒，該試劑盒含有多肽和a)關於試劑盒中試劑的使用或處理的使用說明材料；或b)隔室，其使得該多肽或試劑盒的其他試劑分開。
本發明提供了分離或純化的編碼結合該結合組合物的多肽的核酸。在另一實施方案中，該核酸含有SEQ ID NO1、3、5、7或9。
還包括分離或純化的核酸，其在嚴格條件下與編碼結合該結合組合物的多肽的核酸雜交。在另一實施方案中，本發明提供了含有該核酸的表達載體和宿主細胞。通常，該宿主細胞是a)哺乳動物細胞；b)細菌細胞；c)昆蟲細胞；或d)酵母細胞。本發明還包括製備多肽的方法，該方法包括將宿主細胞在適宜條件下培養以表達該多肽和純化該多肽。
本發明提供了調節樹突細胞生理或功能的方法，該方法包括將細胞與SEQ ID NO2、4、6、8、或10的激動劑或拮抗劑接觸。在另一實施方案中，拮抗劑是抗體。在另一實施方案中，接觸是與抗原(包括細胞表面抗原、MHC I類或MHC II類抗原)相聯合。
詳述此處所引用的所有參考文獻都被相同程度地併入作為參考，就像為了所有目的每個單獨出版物或專利申請被特別和單獨地指出被完整併入作為參考一樣。
I.概要本發明提供了編碼在樹突細胞(DC)上表達的哺乳動物蛋白的DNA序列。關於樹突細胞綜述，見Steinman(1991)Annual Review ofImmunology9271-296；和Banchereau和Schmitt(編者，1994)Dendritic Cells in Fundamental and Clinical ImmunologyPlenumPress，NY。這些蛋白質被稱為樹突細胞蛋白質是因為它們在這些細胞上被發現並且它們的表達似乎表現出一定的特異性。
下面提供了這些蛋白質的特定人實施方案。下面的描述涉及(為了示例的目的)人DC基因，但是同樣可應用於來自其他來源或哺乳動物種類的結構(例如序列)相關的實施方案，包括多態性變體或個體變體。這些蛋白包括，例如，在序列上顯示出相對少的改變，例如，少於約5％，和數目上相對少的改變，例如，少於20個殘基置換，通常少於15，優選少於10，更優選少於5個置換，包括4、3、2、或1個置換的蛋白質。這些蛋白質還包括如所描述的從全長截斷的形式，和含有這些序列的實質片段的融合蛋白。
II.定義術語「結合組合物」指特異結合這些DC蛋白的分子(例如，在抗體-抗原相互作用中)。其他化合物，例如，蛋白質，也可以特異結合各自蛋白。通常，特異結合將是天然的生理上相關的蛋白質-蛋白質相互作用(共價或非共價)，並且可以包括多蛋白質複合體的成員，包括載體化合物或二聚體配偶體。該分子可以是聚合物，或化學試劑。功能類似物可以是具有結構修飾的蛋白質，或者可以是完全不相關的分子，例如，該分子的分子形狀與適宜的相互作用決定簇相互作用。變體可以作為蛋白質的激動劑或拮抗劑。見例如，Goodman，等人(編者)(1990)Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第八版)Pergamon Press，Tarrytown，N.Y。
如此處所用的，術語「結合劑DC蛋白複合體」指結合劑和DC蛋白的複合體。結合劑的特異結合指結合劑具有特異結合部位，該結合部位識別各自DC蛋白上的位點。例如，針對DC蛋白產生並識別該DC蛋白上的表位的抗體能夠通過特異結合形成抗體DC蛋白複合體。通常，結合劑DC蛋白複合體的形成使得可以測量其他蛋白質和生物產品的混合物中的DC蛋白。術語「抗體DC蛋白複合體」指結合劑DC蛋白複合體，其中結合劑是抗體。抗體可以是單克隆的、多克隆的或者甚至是抗體的抗原結合片段，例如，包括Fv、Fab或Fab2片段。
「同源」核酸序列當被比較時顯示出顯著的相似性。核酸中同源性的標準是或者通過序列比較和/或種系發生關係，或者基於雜交條件測量的本領域一般使用的同源性。下面更詳細的描述了雜交條件。
「分離的」核酸是一種核酸，例如，RNA、DNA或混合的聚合物，其與其他組分基本上分開，該其他組分天然地伴隨著天然序列，例如，來自最初物種的蛋白質和側翼基因組序列。該術語包括已經從其天然發生的環境除去的核酸序列，還包括重組或克隆的DNA分離物和化學合成的類似物或通過異源系統生物合成的類似物。基本上純的分子包括分子的分離形式。分離的核酸將通常是分子的同源組合物，但是將在一些實施方案中含有微小的異質性。該異質性通常發現於聚合物末端或者對於所希望的生物學功能或活性不關鍵的部分。
如此處所用的，術語「SDCMP3蛋白」當用於蛋白質語境中時將包括具有如SEQ ID NO2、4或10中所示的胺基酸序列的蛋白質或者這種蛋白質的重要片段。該術語指與各自SDCMP3蛋白質特異結合組分相互作用的多肽。這些結合組分，例如，抗體，通常以高親和性(例如，至少約100nM，通常高於約30nM，優選高於約10nM，更優選高於約3nM)結合SDCMP3蛋白。類似地，術語SDCMP4將關於SEQ ID NO6或8應用。
如此處所用的術語「多肽」或「蛋白質」包括蛋白質的重要片段或節段，並且包括一段胺基酸殘基，其至少約8個胺基酸，通常至少10個胺基酸，更通常至少12個胺基酸，通常至少14個胺基酸，更通常至少16個胺基酸，典型地至少18個胺基酸，更典型地至少20個胺基酸，通常至少22個胺基酸，更通常至少24個胺基酸，優選至少26個胺基酸，更優選至少28個胺基酸，並且在尤其優選的實施方案中，至少約30個或更多胺基酸，例如，35、40、45、50、60、70個胺基酸等。
「重組」核酸通常由其結構定義。其可以是通過將非天然相鄰的兩個片段融合產生序列而得到的核酸，但是排除天然產物，例如，天然發生的突變形式。
某些形式由產生的方法定義。關於此，例如，通過一種方法產生的產物，該方法使用重組核酸技術，例如，包括人為幹預核苷酸序列(通常為選擇或製備)。
這樣，本發明包括，例如，含有使用合成寡核苷酸方法得到的序列的核酸，和通過用編碼這些蛋白質的非天然發生的載體轉化細胞製備的產物。這通常將一個密碼子用編碼相同或保守胺基酸的冗餘密碼子代替，而通常導入或者除去序列識別位點，例如，限制酶的序列識別位點。備選地，將具有所希望的功能的核酸片段連接在一起以產生單一遺傳實體，該遺傳實體含有所希望的功能的組合，在通常可以得到的天然形式中沒有發現該功能組合。限制酶識別位點通常是這些人工操作的靶標，但是其他位點特異靶標，例如，啟動子、DNA複製位點、調節序列、控制序列，或其他有用的特徵，例如，引物片段，可以通過設計而被摻入。對於重組體，例如，融合多肽，具有類似的概念。特別包括合成的核酸，其通過遺傳密碼冗餘性編碼了類似於這些抗原的片段的多肽，和來自各種不同物種變體的序列的融合。
「溶解度」由以Svedberg單位測量的沉降來反映，Svedberg單位是特定條件下分子的沉降速度的量度。沉降速度的確定通常在分析性超速離心機上進行，但是現在通常在標準超速離心機上進行。見，Freifelder(1982)Physical Biochemistry(第二版)Freeman和同事，San Francisco，CA；和Cantor和Schimmel(1980)Biophysical Chemistry，1-3部分，Freeman和同事，San Francisco，CA。作為粗略測定，將含有假定的可溶多肽的樣品在標準完全大小的超速離心機中以約50K rpm旋轉約10分鐘，可溶分子將保留在上清液中。可溶微粒或多肽典型地將小於約30S，更典型地小於約15S，通常小於約10S，更通常小於約6S，並且，在具體實施方案中，優選小於約4S，更優選小於約3S。多肽或片段的溶解度取決於環境和該多肽。許多參數影響多肽溶解度，包括溫度、電解質環境、該多肽的大小和分子特徵，和溶劑的性質。通常，多肽所用的溫度為約4℃到約65℃。通常所用的溫度大於約18℃，更通常大於約22℃。對於診斷目的，溫度將通常為約室溫或更高溫度，但是低於測定中組分的變性溫度。對於治療目的，溫度將通常為體溫，對於人通常約37℃，儘管在某些條件下可以在原位或體外升溫或降溫。
該多肽的大小和結構將通常處於基本上穩定的生理活性狀態，並且通常不處於變性狀態。該多肽可以與處於四級結構的其他多肽結合，例如，以賦予可溶性，或者以某種方式與脂質或去汙劑結合而接近天然脂質雙層相互作用。
溶劑將通常是用於生物學活性的保持的一種類型的生物學相容的緩衝液，並且將通常接近生理溶劑。通常，該溶劑將具有中性pH，通常約5到10，優選約7.5。在一些場合下，將加入去汙劑，通常為溫和的非變性去汙劑，例如，CHS(膽醇烯基半琥珀酸鹽)或CHAPS(3-([3-膽醯胺基丙基]二甲基氨)-1-丙磺酸鹽)，或者處於足夠低的去汙劑濃度以便避免對蛋白質結構或生理性質的重大破壞。
「基本純的」通常指，例如，在蛋白質語境中，該蛋白質與其他汙染性蛋白質、核酸、或來自最初來源生物的其他生物製劑分離。純淨，或者「分離」可以由標準方法來分析，通常按重量計，並且將通常至少約50％純，更通常至少約60％純，通常至少約70％純，更通常至少約80％純，經常至少約85％純，更經常至少約90％純，優選至少約95％純，更優選至少約98％純，在最優選的實施方案中，至少約99％純。通常加入載體或賦形劑，或者製劑可以是無菌的或者含有緩衝組分。
在核酸序列比較語境中的「基本相似性」指比較時，片段或它們的互補鏈當最適對比(具有適宜的核苷酸插入或缺失)時至少約50％的核苷酸相同，通常至少56％，更通常至少59％，通常至少62％，更通常至少65％，通常至少68％，更通常至少71％，典型地至少74％，更典型地至少77％，通常至少80％，更通常至少約85％，優選至少約90％，更優選至少約95到98％或更高，在特定實施方案中，高達約99％或更多的核苷酸相同。備選地，當片段在選擇性雜交條件下與鏈或者其互補序列雜交時，存在基本相似性，雜交所用序列通常來自SEQID NO1、3或9。典型地，當在至少約30個核苷酸的一段序列上有至少約55％相似性，優選至少約25個核苷酸的一段序列上有至少約65％相似性，更優選至少約20個核苷酸的一段序列上有至少約75％和最優選約90％相似性時將發生選擇性雜交。見，Kanehisa(1984)Nucl.Acids Res.12203-213。如描述的相似性比較的長度可以在更長序列上，在某些實施方案中將在至少約17個核苷酸，通常至少約20個核苷酸，更通常至少約24個核苷酸，典型地至少約28個核苷酸，更典型地至少約40個核苷酸，優選至少約50個核苷酸，更優選至少約75到100個或更多核苷酸的一段序列上。對SDCMP3比較的測量不反映對SDCMP4的比較測量。
對於序列比較，通常一個序列作為參比序列，受試序列與該參比序列比較。當使用序列比較算法時，將受試和參比序列輸入計算機，如果需要，指定序列坐標，並指定序列算法程序參數。然後序列比較算法基於所指定的程序參數計算相對於參比序列，受試序列的百分數序列同一性。
可以對用於比較的序列實施光學比對，這可以使用例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法，或者Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性對比算法、或者Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat』l Acad.Sci.USA852444的方法搜尋相似性，這些算法的計算機化實現(Wisconsin遺傳學軟體包中的GAP、BESTFIT、FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者視覺檢查(一般見Ausubel，等人，如前)。
有用的算法的一個實例是PILEUP。PILEUP從一組相關序列產生多序列比對，使用漸進性的成對對比來顯示相互關係和百分數序列同一性。該算法還繪出樹或系統樹，其顯示用於產生比對的聚類關係。PILEUP使用Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360的漸進性比對方法的簡化方法。所用方法類似於Higgins和Sharp(1989)CABIOS5151-153描述的方法。該程序可以比對高達300個序列，每個序列的最大長度為5,000個核苷酸或胺基酸。該多重比對方法以兩個最相似的序列的成對比對開始，產生兩個比對序列的聚類。然後該聚類與下一個最相關的序列或者比對序列的聚類相比對。通過兩個單獨序列的成對比對的簡單延伸來對比兩個序列聚類。通過一系列漸進性、成對比對實現最後的比對。指定特定序列和它們的序列比較區域的胺基酸或核苷酸坐標並指定程序參數後運行該程序。例如，可以將參比序列與其他受試序列比較以確定百分數序列同一性關係，其中使用下面的參數默認缺口權重(3.00)、默認缺口長度權重(0.10)，和加權的末端缺口。
適於確定百分數序列同一性和序列相似性的算法的另一實例是BLAST算法，該算法在Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410中描述。用於實施BLAST分析的軟體可公開通過國家生物技術信息中心(httpwww.ncbi.nhn.nih.gov/)得到。該算法包括通過鑑定查詢序列中的長W的短字首先鑑定高得分序列對(HSPs)，該高得分序列對當與資料庫序列中的相同長度的字對比時匹配或滿足某一正值閾值得分T。T被稱為相鄰字得分閾值(Altschul，等人，如前)。這些最初鄰域字採樣作為種子啟動搜索以發現含有這些字採樣的更長HSPs。只要累積對比得分可以增加，那麼將該字採樣在兩個方向沿著每個序列延伸。當累積對比得分從所實現的最大值下降的量為X；由於一個或多個負得分殘基對比的積累，累積得分到達0或以下；或者到達一個序列的末端時，停止字採樣在每個方向的延伸。BLAST算法參數W、T和X確定對比的靈敏性和速度。BLAST程序使用的默認值為字長(W)為11、BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA8910915)比對(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，和兩個鏈的比較。
除了計算百分數序列同一性，BLAST算法還對兩個序列之間的相似性進行統計分析(見，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA905873-5787)。BLAST算法提供了相似性的一個測量是最小和概率(P(N))，其提供了概率的指示，兩個核苷酸或胺基酸序列之間的匹配將通過該概率偶然地發生。例如，如果在受試核酸和參比核酸的比較中最小和概率小於約0.1，更優選小於約0.01，最優選小於約0.001，那麼認為該核酸與參比序列相似。
多肽的兩個核酸序列基本上相同的另一指示是第一個核酸編碼的多肽與第二個核酸編碼的多肽免疫學交叉反應，如下述。從而，例如，當兩個肽僅通過保守置換而不同時，一種多肽與另一多肽通常基本上相同。兩個核酸序列基本上相同的另一指示是兩個分子在嚴格條件下相互雜交，如下述。
「嚴格條件」當在雜交語境中指同源性或基本相似性時，是鹽、溫度、有機溶劑和其他參數(通常在雜交反應中受控的參數)的嚴格的聯合條件。參數的聯合比任何單一參數的檢測更重要。見，例如，Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370。在嚴格條件下結合靶核酸的核酸探針對所述靶核酸是特異的。這種探針通常長11個核苷酸以上，並且在該探針的序列所限定的區域上與靶核酸足夠相同或互補而在嚴格雜交條件下結合靶標。通常，陽性信號將顯示出比背景高至少2倍信號，優選比背景高至少5倍，更優選至少15、25或甚至50倍。
通過密切相關的物種的種間雜交可以從其他哺乳動物，例如，靈長類或嚙齒類物種克隆和分離對應的SDCMP蛋白。見，例如，下文。關係遠的物種之間相似性可能相對較低，從而關係相對較近的物種的雜交是可取的。備選地，顯示出較小的物種特異性的抗體製劑可用於表達克隆方法。
術語「特異結合抗體」或者「特異免疫反應性」當指蛋白質或肽時，指一種結合反應，其確定在異源蛋白質群體和其他生物學組分的存在下該蛋白質的存在。從而，在所指定的免疫測定條件下，所指定的抗體結合特定蛋白並且不顯著結合樣品中存在的其他蛋白。在這些條件下對抗體的特異結合可能需要一種抗體，該抗體由於對特定蛋白的特異性而被選中。例如，可以選擇針對具有SEQ ID NO2或10中描繪的胺基酸序列的人SDCMP3蛋白免疫原產生的抗體以得到與SDCMP蛋白並且不與其他蛋白質特異免疫反應的抗體。這些抗體識別與同源人SDCMP3蛋白高度相似的蛋白。
III.核酸這些SDCMP基因在樹突細胞上選擇性表達。如所公開的優選實施方案將用於標準方法中以從其他物種，例如，溫血動物，如鳥和哺乳動物分離基因。交叉雜交將允許從個體、株系或種分離相關蛋白。可以利用許多不同方法基於本文提供的信息成功分離適宜的核酸克隆。DNA印跡雜交研究將在適宜的雜交條件下鑑定其他物種中的同源基因。
通過下述標準方法，可以用純化的蛋白或確定的肽產生抗體。合成肽或純化蛋白可以被呈遞到免疫系統以產生多克隆和單克隆抗體。見，例如，Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；和Harlow和Lane(1989)AntibodiesALaboratory ManualCold Spring Harbor Press，NY，它們在此處被併入作為參考。備選地，SDCMP抗原結合組合物可用作特異結合試劑，並且可以利用其結合特異性用於，例如，純化SDCMP蛋白。
特異結合組合物可用於篩選表達文庫，該表達文庫由表達各自SDCMP蛋白的細胞系製備。可以利用許多篩選方法，例如，表面表達的配體的標準染色，或者通過淘選。通過各種染色或免疫螢光方法也可以實施細胞內表達的篩選。結合組合物可用於親和純化或篩選表達該抗原的細胞。
序列分析表明這些SDCMPs是受體的凝集素/脫唾液酸糖蛋白超家族的成員。也見USSN 60/053,080，其在此處被併入作為參考。
對人SDCMP3的分析表明該蛋白是II型膜蛋白，跨膜片段為SEQ IDNO2或10的約殘基22到約t42。胞質尾部將在N末端，SEQ ID NO2或10的殘基1到21。C-型凝集素(CRD)結構域相應於SEQ ID NO10的約殘基79到219。CRD的特點是在SEQ ID NO10的107、176、194和202位的4個保守半胱氨酸殘基。此外，CRD具有相應於SEQ ID NO10的168-170殘基的穀氨酸-脯氨酸-天冬醯胺序列，該序列預示著甘露糖、N-乙醯基葡糖胺和其他相關糖的依賴Ca++的結合部位。
人蛋白的預測分子量為約18,500道爾頓，等電點為約6，在pH7下的電荷為約-2.6。親水性分析表明親水性序列的重要節段為約1-22、42-63、94-106和142-162。這些節段可能更具抗原性。對小鼠SDCMP3的類似分析表明該蛋白也是II型跨膜蛋白，跨膜節段為約ser20到thr40。細胞質尾將從約met1到trp19；C-型凝集素結構域將相應於約cys79到至少arg162。兩個假定的N-糖基化部位相應於asn131-ser133和asn183-ser185。通過計算機鑑定的人蛋白的尤其具有抗原性的一段序列為約met1-ser18；tyr43-arg53；lys72-ser85；ser94-asn106；和ser135-arg162。見，例如，Beattie，等人(1992)Eur.J.Biochem.21059-66。
對人SDCMP4的分析表明該蛋白是II型膜蛋白。其有兩種形式長形式(SEQ ID NO5和6)和短形式(SEQ ID NO7和8)，其相應於長形式的缺失，並且可以從備選的剪接事件得到。序列中分類的變異可以反映測序錯誤或等位基因變體。
長形式的預測的跨膜節段為約leu45到met67。該蛋白的近氨基部分將在細胞質內。通過計算機鑑定的人蛋白的尤其具有抗原性的一段序列為約met1到arg44；trp70-thr113；和asn139到cys220。一個值得注意的特徵是基序(YTQL，殘基14-17)向胞質內結構域的內化。CRD將從長形式的約cys120到met247延伸，從短形式的約cys74到met201延伸。將預測長形式的分子量為約27.6kD，短形式為約22.5kD，其理論等電點為約4.6，在pH 7下電荷為-7.8。
SDCMP5蛋白質的細胞外結構域含有一個C-型(Ca++獨立的)凝集素碳水化合物識別結構域(CRD)，這通過與其他凝集素的顯著序列同源性所指出。II型跨膜C-型凝集素的原型是肝脫唾液酸糖蛋白-受體(ASGPR)。
肝ASGPR的CRD表現出對半乳糖的結合特異性。此外，ASGPR的細胞內結構域具有基於酪氨酸的基序，其使得配體內化。不像ASGPR或者巨噬細胞甘露糖受體，SDCMP4的CRD序列並不強烈暗示其糖特異性。這種暗示的缺乏也是其他C-型凝集素的特徵，如通過NK細胞上的NGK2受體所例證的。
兩種具體SDCMP4的胞內結構域都顯示出YXXΦ型的內化序列(YTQL)，其中Φ代表疏水胺基酸。作為參照，肝臟ASGPRH1鏈的內化基序是YQDL。
值得注意的是，一些II型跨膜C-型凝集素(例如，人NKG2和DC-IR，小鼠Ly49和NKRP1)是免疫受體超家族(IRS)系統的成員。這些受體的一些形式能夠通過胞內ITIM基序遞送抑制信號。相反，其他形式缺少ITIM基序，並且同樣不傳輸負信號。這種非抑制性IRS成員的一個標誌是在跨膜區內存在帶電胺基酸。備選地，截斷形式可以與跨膜附屬分子相互作用。見，例如，Lanier，等人，(1998)Nature391703-7；和USSN 60/069,639，它們都在此處被併入作為參考。
SDCMP4既不在其胞內結構域中顯示出ITIM基序，也沒有帶電的跨膜殘基。基於此，似乎SDCMP4不可能定義C型凝集素IRS基因的新家族。相反，可以認為SDCMP4與參與配體內化的分子的ASGPR系統有關。
已經鑑定了兩種形式的SDCMP4，它們的區別是在胞外結構域中存在46個胺基酸近膜插入片段。在該區域的插入也在巨噬細胞和樹突細胞(ETA10)ASGPR中發生。
最後，通過RT-PCR在骨髓細胞(樹突細胞、單核細胞，和粒細胞)中已經觀察到SDCMP4的表達。與SDCMP3相比，被PMA和離子黴素活化後DC中SDCMP4的表達不被下調。
與這些序列相近的序列是ETA10序列。見，例如，Suzuki，等人(1996)J.Immunol.156128-135；和Sato，等人(1992)J.Biochem.111331-336。細胞外結構域表現出許多特徵，這些特徵表明該結構域是C型(Ca++依賴的)碳水化合物識別結構域(CRD)。儘管人形式的CRD似乎在其羧基末端被截斷，但是小鼠同系物(1469D4)的CRD未被截斷並且明確地將該凝集素分類為C-型超家族的一個新成員。
C型跨膜II型凝集素的原型是肝脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)。然而，ASGPR含有胞質內基於酪氨酸的配體內化序列，該序列在人或小鼠SDCMP3中均未發現。編碼人SDCMP3的基因定位於染色體12 p12-13，例如，人NK受體複合體中。值得注意地，該區域包括NKG2基因和CD94基因，這些基因編碼C型跨膜II型凝集素並且代表免疫受體超家族(IRS)系統的實例。從而，殺傷細胞抑制受體(KIR)CD94-NKG2A/B異二聚體通過NKG2序列中細胞內基於酪氨酸的ITIM基序轉導負信號。然而，NKG2的另一種形式缺少ITIM基序，並且用CD94產生的異二聚體無抑制性。
人SDCMP3的細胞內結構域不含有ITIM基序。然而，基於其染色體定位，以及其與IRS基因DC-IR的顯著(36.2％)同源性，預測人SDCMP3是IRS基因的新型C型凝集素家族。由於與其他IRS基因類似，所以SDCMP3可能代表一個基因家族，該家族將含有一些成員，這些成員有抑制(ITIM)或者無抑制功能。
通過RT-PCR，將靈長類SDCMP3表達限制在骨髓細胞中，該表達在樹突細胞(DC)、單核細胞和巨噬細胞中觀察到。選擇性地在CD14-衍生的DC而沒有在CD1a-衍生的朗格漢斯型DC中看到表達。最後，用PMA與離子黴素激活可以下調SDCMP3的表達。
該肽節段也可用於設計和產生適宜的寡核苷酸用以篩選文庫而確定類似基因，例如，相同或多態性變體的存在，或者鑑定DC。遺傳密碼可用於選擇適宜的寡核苷酸以用作篩選的探針。與聚合酶鏈式反應(PCR)技術聯合，合成的寡核苷酸將用於從文庫選擇所希望的克隆。
互補序列將也可以用作探針或引物。基於可能的氨基末端的鑑定，其他肽將尤其有用，例如，與錨定載體或者多聚A互補PCR技術或者與其他肽的互補DNA偶聯。
關於編碼這些DC蛋白的基因的核酸操作的技術，例如，將編碼多肽的核酸序列亞克隆到表達載體、標記探針、DNA雜交等一般在Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，NY中描述，其在此處被併入作為參考並且在下文中被稱為「Sambrook，等人」。還見，Coligan，等人(1987和定期增刊)Current Protocols in Molecular BiologyGreene/Wiley，New York，NY，將其稱為「Coligan，等人」。
有各種方法可用於分離編碼這些DC蛋白的DNA序列。例如，使用標記的寡核苷酸探針從基因組或cDNA文庫分離DNA，該探針具有與此處公開的序列相同或互補的序列。可以使用全長探針，或者通過將所公開的序列與其他蛋白相比較並選擇特異引物產生寡核苷酸探針。這些探針可直接用於雜交測定中以分離編碼DC蛋白的DNA，或者可以設計探針以用於擴增技術如PCR，用以分離編碼DC蛋白的DNA。
為了製備cDNA文庫，從表達DC蛋白的細胞分離mRNA。從mRNA製備cDNA並將其連接到重組載體。將該載體轉染到重組宿主中以增殖、篩選和克隆。製備和篩選DNA文庫的方法是熟知的。見Gubler和Hoffman(1983)Gene 25263-269；Sambrook，等人；或Coligan，等人。
對於基因組文庫，可以從組織提取DNA並將其機械剪切或用酶消化以產生約12-20kb的片段。然後將片段通過梯度離心並克隆到λ噬菌體載體中。這些載體和噬菌體在體外包裝，如，例如，Sambrook，等人，或Coligan等人中描述的。通過Benton和Davis(1977)Science196180-182中描述的噬菌斑雜交分析重組噬菌體。通常如在例如，Grunstein，等人(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 723961-3965中描述的實施菌落雜交。
可以在cDNA或基因組文庫中鑑定編碼DC蛋白的DNA，這可通過該DNA能夠在例如，菌落或噬菌斑雜交實驗中與此處描述的核酸探針雜交進行鑑定。通過本領域中技術人員熟知的標準方法分離相應DNA區域。見Sambrook等人。
擴增靶序列的各種方法，如聚合酶鏈式反應，也可用於製備編碼DC蛋白的DNA。聚合酶鏈式反應(PCR)技術被用於從mRNA、cDNA和從基因組文庫或cDNA文庫直接擴增這些核酸序列。分離的編碼DC蛋白的序列也可用作PCR擴增的模板。
在PCR技術中，合成與所要擴增的DNA區域中的兩個5』區互補的寡核苷酸引物。然後使用這兩種引物實施聚合酶鏈式反應。見Innis，等人(編者1990)PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplicationsAcademic Press，San Diego，CA。如所希望的，可以選擇引物擴增編碼所選全長DC蛋白的完整區域或者擴增更小的DNA片段。具體地，所提供的序列提供了例如，15-30個核苷酸的引物，這些引物可用於擴增所希望的編碼序列，或者其片段。一旦這些區域被PCR擴增，可以對它們測序並用標準技術從所得序列製備寡核苷酸探針。然後用這些探針分離編碼DC蛋白的其他形式的DNA。
根據首先由Beaucage和Carruthers(1983)Tetrahedron Lett.221859-1862描述的固相亞磷醯胺三酯方法或者使用如Needham-VanDevanter，等人(1984)Nucleic Acids Res.126159-6168中描述的自動化合成儀化學合成用作探針的寡核苷酸。通過例如，非變性丙烯醯胺凝膠電泳或通過如Pearson和Regnier(1983)J.Chrom.255137-149中描述的離子交換HPLC實施寡核苷酸純化。使用Maxam和Gilbert在Grossman和Moldave(編者1980)Methods inEnzymology65499-560 Academic Press，New York中的描述的化學降解方法可以驗證合成的寡核苷酸的序列。
本發明提供了編碼DC蛋白的分離的DNA或片段，如所述。此外，本發明提供了分離的或重組DNA，其編碼生物活性蛋白或者多肽，該DNA在適宜條件例如，高嚴格條件下能夠與此處描述的DNA序列雜交。所述生物活性蛋白或者多肽可以是天然發生的形式，或者重組蛋白或片段，並且具有如SEQ ID NO2、4、6、8或10中公開的胺基酸序列。優選實施方案將是全長天然分離物(例如，來自靈長類的分離物)。在糖基化形式中，該蛋白將顯示出更大的大小。此外，本發明包括使用分離的或重組DNA，或者其片段，該DNA或者該片段編碼與每種各自DC蛋白同源的蛋白。這些SDCMP3和4的片段與抗-CD3抗體聯合可以共刺激細胞，例如，樹突細胞或T細胞。該活化可以與抗原聯合。所分離的DNA可以在5』和3』側翼中具有各自調節序列，例如，啟動子、增強子、多聚A加入信號，等等。
本發明包括DC多核苷酸序列，該序列與在正常細胞中的表達相比可以以改變的方式表達，因此，可能設計針對這些序列的適宜的治療或診斷技術。從而，當一種失調與DC核酸的表達相關時，可以使用在翻譯水平上幹擾DC表達的序列。該方法利用了，例如，反義核酸，包括導入雙鏈RNA(dsRNA)以遺傳幹擾基因功能，如例如，在Misquitta，等人(1999)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA961451-1456中描述，和核酶以阻斷特定DC mRNA的翻譯。這些失調包括與表達錯誤調節相關的失調。
反義核酸是DNA或RNA分子，例如，至少與特定mRNA分子的一部分互補的寡脫氧核糖核苷酸，見Weintraub(1990)ScientificAmerican26240-46。寡脫氧核糖核苷酸能夠以可飽和的、序列獨立的，和溫度與能量獨立的方式進入細胞。見，例如，Jaroszewski和Cohen.(1991)Advanced Drug Delivery Reviews6235-250；Akhtar，等人(1992)「反義寡核苷酸的生物穩定性和膜轉運性質的藥學方面」，133-145頁，Erickson和Izant(編者)Gene RegulationBiology of Antisense RNA and DNARaven Press，New York；和Zhao，等人(1994)Blood 843660-3666。
已經表明一些免疫細胞，例如，淋巴細胞中寡脫氧核糖核苷酸的攝入受到細胞活化的調節。用B細胞有絲分裂原LPS刺激的脾細胞顯著增強了B細胞群體中寡脫氧核糖核苷酸攝入，而用T細胞有絲分裂原ConA處理的脾細胞表現出T但不是B細胞增加的寡脫氧核糖核苷酸攝入。見，例如，Krieg，等人，(1991)Antisense Research andDevelopment1161-171。
使用反義方法抑制基因的體外翻譯是本領域中熟知的。見，例如，Marcus-Sakura(1988)Anal.Biochem172289-295；和Akhtar(編者1995)Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotideTherapeuticsCRC Press，Inc。
核酶是能夠以類似於DNA限制性內切酶的方式特異切割其他單鏈RNA的RNA分子。通過編碼這些RNA的核苷酸序列的修飾，可以工程化分子，這些分子特異識別RNA分子中的特定核苷酸序列並將其切割。見，例如，Cech(1988)J.Amer.Med.Assn.2603030-3034。該方法的一個主要優點是因為它們是序列特異的，所以僅具有特定序列的mRNA被失活。
有兩種基本類型的核酶，即，四膜蟲型和「錘頭」型。見，例如，Haseloff(1988)Nature334585-591。四膜蟲型核酶識別長為4個鹼基的序列，而「錘頭」型核酶識別長為11-18個鹼基的鹼基序列。識別序列越長，該序列僅在靶mRNA種類中發生的可能性越大。因此，錘頭型核酶比四膜蟲型核酶優選用於失活特定mRNA種類，並且18鹼基識別比更短的識別序列優選。
IV.製備DC基因產物通過化學合成、篩選cDNA文庫，或者通過篩選從各種細胞系或組織樣品製備的基因組文庫可以得到編碼這些DC蛋白或其片段的DNA。
這些DNA可以在各種宿主細胞中表達以合成全長蛋白或片段，該全長蛋白或片段可以，例如，用於產生多克隆或單克隆抗體；用於結合研究；用於構建和表達修飾分子；和用於結構/功能研究。這些DC蛋白或它們的片段的每一種都可以在用適宜的表達載體轉化或轉染的宿主細胞中表達。這些分子可被基本上純化而沒有蛋白質或細胞汙染物，不同於從重組宿主得到的那些分子，並且因此當與藥學上可接受的載體和/或稀釋劑組合時可用於藥物組合物。該抗原，或者其部分可以作為與其他蛋白的融合蛋白表達。
表達載體通常是自身複製的DNA或RNA構建體，其含有所希望的DC基因或其片段，該DC基因或其片段通常與適宜的遺傳控制元件可操作地連接，這些遺傳控制元件在適宜的宿主細胞中被識別。這些控制元件能夠在適宜宿主中實現表達。實現表達所需的控制元件的特定類型將取決於所用的最終宿主細胞。通常，遺傳控制元件可以包括原核啟動子系統或真核啟動子表達控制系統，並且通常包括轉錄啟動子，和任選操縱子用以控制轉錄的開始，轉錄增強子用以升高mRNA表達水平，編碼適宜的核糖體結合部位的序列，和終止轉錄和翻譯的序列。表達載體通常還含有複製原點，其允許載體獨立於宿主細胞複製。
本發明的載體含有編碼各種DC蛋白的DNA，或其片段，通常編碼例如，生物活性多肽，或蛋白。該DNA可處於病毒啟動子的控制下並且可以編碼選擇標記。本發明還涉及這些表達載體的用途，該載體能夠在原核或真核宿主中表達編碼DC蛋白的真核cDNA，其中該載體與宿主相容並且其中編碼該蛋白的真核cDNA被插入到載體中，從而含有該載體的宿主的生長表達所述cDNA。通常，設計表達載體以在它們的宿主細胞中穩定複製或者擴增而極大地增加每個細胞所希望的基因的拷貝總數。不必總是要求表達載體在宿主細胞中複製，例如，使用不含有被宿主細胞識別的複製原點的載體可以實現在各種宿主細胞中該蛋白質或其片段的瞬時表達。可能使用載體，該載體通過重組導致DC基因或其片段整合到宿主DNA中，或者整合啟動子，該啟動子控制內源基因的表達。見，例如，Treco，等人，WO96/29411。
如此處所用的，載體包括質粒、病毒、噬菌體、可整合的DNA片段，和能夠將DNA片段整合到宿主基因組的其他載體。表達載體是專門的載體，它們含有遺傳控制元件，這些元件可以實現可操作地連接的基因的表達。質粒是最通常使用的載體形式，但是起等價功能的載體的所有其他形式也適於用於此處。見，例如，Pouwels，等人(1985和增刊)Cloning VectorsA Laboratory ManualElsevier，N.Y.；和Rodriguez，等人(編者1988)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their UsesButtersworth，Boston，MA。
適宜的宿主細胞包括原核生物、低級真核生物，和高級真核生物。原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性生物，例如，大腸桿菌(E.coli)和枯草桿菌(B.subtilis)。低級真核生物包括酵母，例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)和畢赤酵母(S.Pichia)，和Dictyostelium屬的種。高級真核生物包括從動物細胞建立的組織培養細胞系，這些動物細胞來自非哺乳動物來源，例如，昆蟲細胞，和鳥類，還來自哺乳動物來源，例如，人、靈長類、和嚙齒類。
原核宿主載體系統包括許多不同物種的各種載體。如此處所用的，將一般地使用大腸桿菌和其載體以包括用於其他原核生物的等價載體。用於擴增DNA的一種代表性載體是pBR322或其衍生載體。可用於表達DC蛋白或片段的載體包括，但不限於，含有lac啟動子的載體(pUC-系列)；含有trp啟動子的載體(pBR322-trp)；含有Ipp的啟動子(pIN-系列)、含有λ-pP或pR啟動子的載體(pOTS)；或者含有雜交啟動子如ptac的載體(pDR540)。見，Brosius，等人(1998)「使用λ-、trp-、lac-、和Ipp-衍生的啟動子的表達載體」，Rodriguez和Denhardt(編者)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses10205-236，Buttersworth，Boston，MA。
可以用含有DC基因序列的載體轉化低級真核生物，例如，酵母和Dictyostelium。為了本發明的目的，最常用的低級真核生物宿主是麵包酵母釀酒酵母。其將通常代表低級真核生物，儘管也可以利用許多其他株系和物種。酵母載體通常由複製原點(除非整合型)、選擇基因、啟動子、編碼所希望的蛋白的DNA或者其片段、翻譯終止序列、多腺苷酸化序列、和轉錄終止序列組成。酵母的適宜表達載體包括組成性啟動子，如3-磷酸甘油酸激酶和各種其他糖酵解酶基因啟動子或者可誘導的啟動子，如乙醇脫氫酶2啟動子或者金屬硫蛋白啟動子。適宜的載體包括下列類型的衍生物自複製低拷貝數(如YRp-系列)、自複製高拷貝數(如YEp-系列)、整合型(如YIp-系列)，或者微-染色體(如YCp-系列)。
高級真核生物組織培養細胞是用於DC蛋白表達的優選宿主細胞。原則上，可以使用多數任一高級真核生物組織培養細胞系，例如，杆狀病毒表達系統，該細胞系可來自無脊椎動物或脊椎動物來源。然而，優選用哺乳動物細胞以實現共翻譯時或翻譯後的正確加工。這些細胞的轉化或轉染和增殖是常規的。可用的細胞系包括HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、幼大鼠腎(BRK)細胞系、昆蟲細胞系、鳥細胞系、和猴(COS)細胞系。這些細胞系的表達載體通常包括複製原點、啟動子、翻譯起始位點、RNA剪接位點(例如，如果使用基因組DNA)、多腺苷酸化位點、和轉錄終止位點。這些載體可以還含有選擇基因或擴增基因。適宜的表達載體可以是質粒、病毒，或逆轉錄病毒，這些質粒、病毒，或逆轉錄病毒攜帶來自如例如，腺病毒、SV40、細小病毒、牛痘病毒或巨細胞病毒來源的啟動子。適宜的表達載體的代表性實例包括pCDNA1、pCD，見Okayama，等人(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMC1 neo Poly-A，見Thomas，等人(1987)Cell51503-512；和杆狀病毒載體，如pAC373或pAC 610。此外，通過基因打靶可以調節DC基因的上遊非編碼區或者DC基因內的編碼或非編碼序列，在基因靶定中產生新的DC轉錄單位，其表達DC蛋白。例如，通過增加細胞中所表達的基因的表達、改變調節模式或誘導或減少或消除基因的表達導入和靶定調節DC蛋白的外源序列在例如，標題為「蛋白質產生和遞送」的Treco等人(1998)WO96/29411中描述。
在一些實施方案中，DC蛋白不必糖基化以在一些測定中引起生物學應答。然而，通常希望在一些系統中表達DC多肽，該系統提供特定或明確的糖基化模式。在該情況中，通常的模式將是該表達系統天然提供的模式。然而，通過將例如，未糖基化形式的多肽暴露於導入異源表達系統的適宜的糖基化蛋白可以修改該模式。例如，可以用編碼哺乳動物或其他的糖基化酶的一種或多種基因共轉化DC基因。還理解過度糖基化對於DC蛋白的生物學活性是有害的，並且技術人員可以進行常規試驗以優化糖基化程度，該優化的糖基化程度賦予最佳生物學活性。
可以將DC蛋白，或者其片段工程化以通過磷脂醯肌醇(PI)連接到細胞膜，但是通過用磷脂醯肌醇切割酶，例如，磷脂醯肌醇磷脂酶C處理可以從細胞膜除去DC蛋白，或者其片段。這釋放了生物學活性形式的抗原，並允許通過蛋白質化學的標準方法進行純化。見，例如，Low(1989)Biochem.Biophys.Acta988427-454；Tse，等人(1985)Science2301003-1008；Brunner，等人(1991)J.Cell Biol.1141275-1283；和Coligan，等人(編者)(1996和定期增刊)CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley and Sons，New York，NY。
既然已經表徵了這些SDCMP蛋白，那麼通過合成肽的常規方法可以製備其片段或衍生物。這些方法包括如在Stewart和Young(1984)Solid Phase Peptide SynthesisPierce Chemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky(1984)The Practice of PeptideSynthesisSpringer-Verlag，New York，NY；和Bodanszky(1984)The Principles of Peptide SynthesisSpringer-Verlag，New York，NY中描述的方法。還見Merrifield(1986)Science232341-347；和Dawson，等人(1994)Science266776-779。例如，可以使用疊氮化物方法、醯基氯方法、酸酐方法、混合酸酐方法、活性酯方法(例如，對-硝基苯酯、N-羥基琥珀醯亞胺酯，或氰基甲酯)、碳二咪唑方法、氧化-還原方法、或二環己基碳二亞胺(DCCD)/加成法。固相和液相合成都可用於前面的方法。
通過肽分離，例如，通過提取、沉澱、電泳和各種形式的層析等可以從反應混合物分離和純化所製備的蛋白質和其片段。根據所希望的用途，可以得到不同純度的本發明的DC蛋白。使用公知的蛋白質純化技術或者通過使用此處描述的抗體或結合配偶體，例如，在免疫吸附親和層析中完成純化。該免疫吸附親和層析的實施過程為首先將抗體連接到固體支持體並將所連接的抗體與適宜的來源細胞的可溶裂解物、表達該蛋白的其他細胞的裂解物，或者由於DNA技術而產生這些蛋白的細胞的裂解物或上清液接觸，見下文。
可以對多種細胞系篩選一種與其他細胞相比高水平表達所述蛋白的細胞系。對各種細胞系，例如，小鼠胸腺基質細胞系TA4進行篩選並由於其有利的操作性質而被選中。可以從天然來源分離天然DC細胞蛋白，或者通過用適宜的表達載體轉化的細胞的表達得到天然DC細胞蛋白。所表達蛋白的純化可以通過標準方法實現，或者可以與工程化方法聯合以從細胞裂解物或上清液以高效率有效純化。FLAG或His片段可用於這些純化特徵。
V.抗體可以針對各種DC蛋白產生抗體，這些DC蛋白包括個體的、多態性、等位基因的、株系或物種變體，和它們的片段，這些蛋白和它們的片段可以是天然發生的(全長)形式或者重組形式。此外，可以針對活性形式或者失活形式產生抗體。也可使用抗獨特型抗體。
a.抗體製備許多免疫原可用於製備與這些DC蛋白具有特異反應性的抗體。重組蛋白是產生單克隆或多克隆抗體的優選免疫原。也可以使用純的或不純形式的天然發生的蛋白。使用此處描述的人DC蛋白序列製備的合成肽也可用作免疫原以產生DC蛋白的抗體。可以在如此處描述的真核或原核細胞中表達並如所描述的純化重組蛋白。然後將產物注射到能夠產生抗體的動物中。可以產生單克隆或多克隆抗體以隨後用於免疫測定中以測量該蛋白。
產生多克隆抗體的方法是本領域中技術人員公知的。簡言之，將免疫原，優選純化蛋白與佐劑混合併用該混合物免疫動物。通過採集待測血並確定對目標DC蛋白的反應性的效價監視動物對免疫製劑的免疫應答。當得到對該免疫原的適當高的效價抗體時，從該動物收集血液並製備抗血清。如果希望，可以將抗血清分級分離以富集對該蛋白具有反應性的抗體。見，例如，Harlow和Lane。
通過本領域中技術人員熟悉的各種技術可以得到單克隆抗體。簡言之，用所希望的抗原免疫動物，從該動物得到脾細胞，並通常通過與骨髓瘤細胞融合使脾細胞永生化。見，例如，Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6511-519，其在此處被併入作為參考。永生化的備選方法包括用EB病毒、癌基因或逆轉錄病毒或本領域中公知的其他方法轉化。對從單一永生化細胞產生的菌落進行篩選能夠產生對該抗原具有所希望的特異性和親和性的菌落，並且這些細胞產生的單克隆抗體的產率可以通過各種技術提高，這些技術包括注射到脊椎動物宿主的腹膜腔。備選地，通過根據Huse，等人(1989)Science2461275-1281所概述的一般方案從人B細胞篩選DNA文庫可以分離編碼單克隆抗體或者其結合片段的DNA序列。
通過將這些DC蛋白的預定片段與如上述的載體蛋白的綴合物免疫動物可以產生針對這些DC蛋白的預定片段的抗體，包括結合片段和單鏈形式的抗體。從分泌所希望的抗體的細胞製備單克隆抗體。可以對這些抗體篩選與正常或有缺陷的DC蛋白的結合，或者篩選激動劑或拮抗劑活性。這些單克隆抗體結合的KD為通常至少約1mM，更通常至少約300μM，典型地至少約10μM，更典型地至少約30μM，優選至少約10μM，更優選至少約3μM或以上。
在一些情況中，希望從各種哺乳動物宿主，如小鼠、嚙齒類、靈長類、人等製備單克隆抗體。製備這些單克隆抗體的技術的描述可以見Stites，等人(編者)Basic and Clinical Immunology(第四版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，和其中引用的參考文獻；Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory ManualCSHPress；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice(第二版)Academic Press，New York，NY；尤其Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497，其討論了產生單克隆抗體的一種方法。簡單總結，該方法包括用免疫原注射動物以引起體液免疫應答。然後處死動物並從其脾臟取出細胞，然後將該細胞與骨髓瘤細胞融合。得到雜交細胞，或者「雜交瘤」，其能夠體外增殖。然後篩選雜交瘤群體以分離單個克隆，每個克隆分泌針對該免疫原的單一抗體種類。這樣，所得單個抗體種類是來自免疫動物的永生化和克隆的單一B細胞應答免疫原物質上所識別的特定部位的產物。
其他適宜的技術包括選擇噬菌體或類似載體中抗體的文庫。見，Huse，等人(1989)「在λ噬菌體中產生免疫球蛋白所有組成成分的大組合文庫」Science 2461275-1281；和Ward，等人(1989)Nature 341544-546。所用的本發明的多肽和抗體可以被修飾或不被修飾，包括嵌合或人源化抗體。通常，該多肽和抗體將通過共價或非共價連接提供可檢測的信號的一種物質而被標記。各種標記和綴合技術是公知的並且在科學和專利文獻中被廣泛報導。適宜的標記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、螢光部分、化學發光部分、磁性微粒，等等。教導這些標記的使用的專利包括美國專利號3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149、和4,366,241。還可以產生重組免疫球蛋白。見，Cabilly，美國專利號4,816,567；和Queen，等人(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA8610029-10033。
本發明的抗體也可用於親和層析以分離每種DC蛋白。當抗體連接到固體支持體，例如，微粒，如瓊脂糖、SEPHADEX，等時，可以製備柱子，其中細胞裂解物可以穿過該柱子，洗滌柱子，然後增加溫和變性劑的濃度，從而，將釋放純化的DC蛋白。
該抗體還可用於篩選表達文庫的特定表達產物。通常，用於這種方法的抗體將被某一部分標記，該部分允許通過抗體結合容易地檢測抗原的存在。
SDCMP蛋白的抗體可用於分析，或者鑑定表達各自蛋白的特定細胞群體組分。通過測定表達DC蛋白的細胞的表達產物，可能診斷疾病，例如，免疫-受損的病症、DC衰竭病症，或DC的過量產生。
針對每種DC產生的抗體也可用於產生抗-獨特型抗體。抗-獨特型抗體將可用於檢測或診斷與各自抗原的表達有關的各種免疫學病症。
b.人源化非人來源的使用可以限制單克隆抗體的治療效率。來自鼠或其他非人來源的抗體可以引起免疫應答，效應物功能的低效募集，和從血流的快速清除(Baca，等人(1997)J.Biol.Chem.27210678-10684)。由於這些原因，希望通過人源化(Carpenter，等人(2000)J.Immunol.1656205；He，等人(1998)J.Immunol.1601029；Tang，等人(1999)J.Biol.Chem.27427371-27378)製備治療抗體。人源化抗體含有來自親本小鼠抗體的6個互補確定區(CDRs)的胺基酸序列，這些序列被嫁接到人抗體框架上。為了實現最優結合，可能需要通過改變通常與維持CDRs的構象有關的某些框架胺基酸，將人源化抗體微調回到在親本小鼠抗體中發現的相應胺基酸。
人源化的一個備選方案是使用噬菌體上展示的人抗體文庫(Vaughan，等人(1996)Nat.Biotechnol.14309-314；Barbas(1995)Nature Med.1837-839；de Haard，等人(1999)J.Biol.Chem.27418218-18230；McCafferty等人(1990)Nature348552-554；Clackson等人(1991)Nature352624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597)，或轉基因小鼠中所含的人抗體文庫(Mendez，等人(1997)Nature Genet.15146-156)。噬菌體展示技術可用於篩選和選擇具有高結合親和性的抗體(Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21371-377；Barbas，等人(2001)Phage DisplayA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Kay，等人(1996)Phage Display of Peptides and ProteinsALaboratory Manual，Academic Press，San Diego，CA)。使用噬菌體展示方法可以提供一種DNA序列，其提供緊密結合的單價抗體，如在絲狀噬菌體的表面上展示的。使用該DNA序列，研究人員可以構造緊密結合的人源化二價抗體。噬菌體展示文庫可以含有單鏈抗體，其中重鏈和輕鏈可變區通過連接體融合於單一基因中，或者該單鏈抗體可以含有共表達的重鏈和輕鏈(de Bruin，等人(1999)Nat.Biotechnol.17397-399)。
c.免疫測定通過各種免疫測定法可以測量具體蛋白。關於一般的免疫學和免疫測定方法的綜述，見Stites和Terr(編者)1991 Basic andClinical Immunology(第7版)。此外，本發明的免疫測定可以以幾種方法的任一種實施，這些方法在Maggio(編者1980)EnzymeImmunoassayCRC Press，Boca Raton，Florida；Tijssen(1985)″Practice and Theory of EnzymeAntibodies，A LaboratoryManual，如前廣泛綜述，這些文獻的每一個都被併入本文作為參考。還見Chan(等人)(1987)ImmunoassayA Practical GuideAcademic Press，Orlando，FL；Price和Newman(編者)(1991)Principles and Practice of linmunoassaysStockton Press，NY；和Ngo(編者1988)Non-isotopic ImmunoassaysPlenum Press，NY。
通過本領域中技術人員公知的各種方法可以實施免疫測定以測量這些DC蛋白。簡言之，測量該蛋白的免疫測定可以是競爭性或非競爭性結合測定。在競爭性結合測定中，所要分析的樣品與被標記的分析物競爭結合到固體表面的捕獲劑的特異結合位點。優選地，捕獲劑是與如上述產生的DC蛋白特異反應的抗體。結合到捕獲劑的標記分析物的濃度與樣品中存在的游離分析物的量成反比例。
在競爭性結合免疫測定中，樣品中存在的DC蛋白與標記蛋白競爭結合特異結合劑，例如，與DC蛋白特異反應的抗體。該結合劑可以結合到固體表面以實現結合的標記蛋白與未結合的標記蛋白的分離。備選地，競爭結合測定測定可以在液相中實施，並且可以用本領域中公知的各種技術將結合的標記蛋白與未結合的標記蛋白分離。分離後，確定結合的標記蛋白的量。樣品中存在的蛋白質的量與標記的蛋白質結合的量成反比例。
備選地，可以實施同質免疫測定，其中不需要分離步驟。在這些免疫測定中，通過蛋白質與其特異結合劑的結合而改變該蛋白質上的標記。標記蛋白中的該改變導致標記所發出的信號的減少或增加，從而測量免疫測定末的標記就可以檢測或者定量該蛋白質。
通過各種非競爭性免疫測定方法也可以定量確定這些DC蛋白。例如，可以使用兩位點、固相夾心免疫測定。在這種類型的測定中，蛋白質的結合劑，例如，抗體，被附著到固體支持體。標記第二種蛋白質結合劑，其也可以是抗體，並且在不同位點結合該蛋白。發生蛋白質上兩個位點的結合後，除去未結合的被標記的結合劑並測量結合到固相的標記結合劑的量。結合的標記結合劑的量與樣品中該蛋白質的量直接成比例。
可以用蛋白質印跡分析確定樣品中DC蛋白的存在。對例如，懷疑含有該蛋白質的組織樣品實施電泳。電泳分離樣品，並將蛋白質轉移到適宜的固體支持體，如硝酸纖維素濾器後，將固體支持體與可以與變性蛋白反應的抗體孵育。該抗體可被標記，或者備選地可通過將該抗體隨後與結合最初抗體的另一標記的抗體孵育來檢測該抗體。
上面描述的免疫測定形式使用標記的測定組分。該標記可以為各種形式。根據本領域中熟知的方法，該標記可以直接或間接偶聯到測定的所希望的組分。可以使用各種標記。通過幾種方法的任一種可以標記該組分。通常使用摻入3H、125I、35S、14C或32P的放射性標記。非放射性標記包括結合標記抗體的配體、螢光團、化學發光劑、酶和可以作為標記蛋白的特異結合對成員的抗體。標記的選擇取決於所需要的靈敏性、與化合物綴合的容易性、所需要的穩定性，和可以利用的儀器。關於可以使用的各種標記或信號產生系統的綜述，見，美國專利號4,391,904，其被併入本文作為參考。
通過各種免疫測定方法也可以測量與特定蛋白反應的抗體。關於可用於通過免疫測定技術測量抗體的免疫學和免疫測定方法的綜述，見，例如，Stites和Terr(編者)Basic and Clinical Immunology(第七版)如前；Maggio(編者)Enzyme Immunoassay，如前；和Harlow和LaneAntibodies，A Laboratory Manual，如前。
類似於上面關於特定蛋白的測量所描述的，也可以使用各種不同的免疫測定形式、分離技術和標記。
VI.純化的SDCMP蛋白在SEQ ID NO1、2；9和10中提供了靈長類(例如人)SDCMP3核苷酸和胺基酸序列。在SEQ ID NO3和4中提供了嚙齒類，例如小鼠SDCMP3序列。在SEQ ID NO5、6、7和8中提供了靈長類(例如人)SDCMP4核苷酸和胺基酸序列。肽序列允許製備肽以產生識別這些片段的抗體，並允許製備編碼這些序列的寡核苷酸。
可以利用標準純化方法，並且可以使用特定抗體實施純化。
VII.物理變體本發明還包括與SEQ ID NO2、4、6、8或10的胺基酸序列具有基本上胺基酸序列相似性的蛋白質或肽。還包括顯示出置換(例如，20個或更少，優選10個或更少，更優選5個或更少置換)的變體。當置換是保守置換時，變體將與相應的天然序列蛋白共有免疫原或抗原相似性或者交叉反應性。天然變體包括個體的、等位基因的、多態性、株系的和物種的變體。
通過優化殘基匹配，如果需要，通過導入所需的缺口確定胺基酸序列相似性，或者序列同一性。當將保守置換考慮為匹配時，該胺基酸序列相似性，或者序列同一性發生改變。保守置換通常包括下面組內的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、穀氨酸；天冬醯胺、穀氨醯胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。同源胺基酸序列包括每種各自蛋白質序列中的天然等位基因和種間變異。典型的同源蛋白或肽將與相關DC蛋白的胺基酸序列具有50-100％相似性(如果可以導入缺口)到75-100％相似性(如果包括保守置換)。同一性測量將至少約50％、通常至少60％，更通常至少65％，通常至少70％，更通常至少75％，優選至少80％，更優選至少80％，在尤其優選的實施方案中，至少85％或以上。也見Needleham，等人(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff，等人(1983)Time Warps.String Edits，和MacromoleculesTheTheory and Practice of Sequence Comparison第一章，Addison-Wesley，Reading，MA；和來自NCBI(NIH)；和Universityof Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI的軟體包。
編碼相應哺乳動物DC蛋白的核酸在嚴格條件下將通常與SEQ IDNO1、3、5、7或9的編碼部分雜交。例如，編碼各自DC蛋白的核酸在嚴格條件(例如，提供至少2×背景，優選5×、15×或25×背景的信號，而基本上不提供假陽性雜交信號)下將通常與SEQ ID NO1、3、5、7或9的核酸雜交。通常，所選的嚴格條件是在限定的離子強度和pH下所要雜交的序列的熱熔解點(Tm)低約10℃。Tm是在限定的離子強度和pH下50％的靶序列與完美匹配的探針雜交的溫度。通常，嚴格條件將是其中pH7時洗液中的鹽濃度為約0.02M並且溫度為至少約50℃的條件。其他因素可以顯著影響雜交的嚴格性，這些因素包括鹼基組成和互補鏈的大小、有機溶劑如甲醯胺的存在，和鹼基錯配的程度。優選的實施方案將包括在50％甲醯胺和20-50mM NaCl 42℃下結合所公開的序列的核酸。
通過核苷酸置換、核苷酸缺失、核苷酸插入，和核苷酸序列的倒置可以容易地修飾所分離的DC基因DNA。這些修飾導致新的DNA序列，這些DNA序列編碼這些DC抗原、它們的衍生物，或者具有高度相似的生理學、免疫原或抗原活性的蛋白質。
可以用修飾序列產生突變抗原或增強表達。增強的表達可涉及基因擴增、增強的轉錄、增強的翻譯，和其他機理。這些突變DC蛋白衍生物包括各自蛋白或其片段的預定的或位點特異的突變。「突變的DC蛋白」包括否則屬於上面提出的DC蛋白的同源性定義的多肽，但是其胺基酸序列與自然中發現的DC蛋白的序列不同(通過缺失、置換或插入導致)。具體地，「位點特異的突變DC蛋白」通常包括與具有例如，SEQ ID NO2或10的序列的蛋白質具有顯著相似性的蛋白質。通常，該變體將與那些序列共有許多理化和生物學活性，例如，抗原性或免疫原性，並且在優選實施方案中，該變體含有所公開序列的多數或全部。類似概念應用於這些各種DC蛋白，尤其在各種溫血動物，例如，靈長類和哺乳動物中發現的DC蛋白。
儘管位點特異突變位點是預定的，但是突變體不必是位點特異的。通過產生胺基酸插入或缺失可以實施DC蛋白質誘變。可以產生置換、缺失、插入或任意組合以得到最終構建體。插入包括氨基-或羧基-末端融合。可以在靶密碼子實施隨機誘變並對所表達的突變體篩選所希望的活性。在DNA的預定位點產生置換突變的方法是本領域中熟知的，例如，通過M13引物誘變或聚合酶鏈式反應(PCR)技術。也見Sambrook，等人(1989)和Ausubel，等人(1987和增刊)。DNA中的突變通常不應將編碼序列置於讀框的外面並且優選不產生將雜交而產生二級mRNA結構，如環或髮夾的互補區域。
本發明還提供了重組蛋白，例如，使用這些蛋白的片段產生的異源融合蛋白。異源融合蛋白是蛋白質或片段的融合，自然中，這些蛋白質或片段通常不會以相同方式融合。從而，免疫球蛋白與各自DC多肽的融合產物是連續蛋白質分子，其具有以典型的肽鍵融合的序列，通常作為單一翻譯產物並且表現出每種來源肽的性質。類似概念可用於異源核酸序列。
此外，通過將來自其他蛋白質的相似功能結構域組合可以產生新的構建體。例如，不同的新融合多肽或片段之間的結構域或其他片段可以被「交換」，該交換通常使用相關蛋白，例如，使用凝集素或脫唾液酸糖蛋白家族。優選地，將使用完整的結構域，例如，完整的Ig部分。見，例如，Cunningham，等人(1989)Science 2431330-1336；和O′Dowd，等人(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。從而，蛋白質結合特異性與其他功能結構域的功能連接將產生新的嵌合多肽，其表現出特異性的新的組合。而且，丙氨酸掃描誘變可優選應用於結構上位於二級結構之外的殘基，這將避免多數關鍵殘基，這些關鍵殘基的誘變通常破壞三級結構。
這些DC抗原的「衍生物」包括胺基酸序列突變體、糖基化變體，和與其他化學部分的共價或聚集綴合物。通過本領域中熟知的方法，將功能性與在這些DC蛋白胺基酸側鏈或N-或C-末端發現的基團連接可以製備共價衍生物。這些衍生物可以包括，但不限於，羧基末端或者含有羧基側鏈的殘基的脂肪族酯或醯胺、含有羥基的殘基的O-醯基衍生物，和氨基末端胺基酸或者含有氨基的殘基(例如，賴氨酸或精氨酸)的N-醯基衍生物。醯基選自包括C3到C18正常烷基的烷基-部分，從而形成烷醯基芳醯基種類。當免疫原性部分是半抗原時，對載體蛋白的共價附著是重要的。
具體地，可以包括糖基化改變，該糖基化改變為例如，在多肽的合成和加工期間，或者在進一步加工步驟中通過修飾該多肽的糖基化模式產生的。實現糖基化的尤其優選的方法是將該多肽暴露於來自通常提供這些加工的細胞的糖基化酶，例如，哺乳動物糖基化酶。也考慮去糖基化酶。還包括具有其他微小修飾的相同一級胺基酸序列的形式，這些修飾包括磷酸化胺基酸殘基，例如，磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸，或其他部分，包括核糖基或交聯試劑。還包括含有置換的蛋白，該置換將保留充分的免疫原性以產生識別例如，SEQ IDNO2或10的蛋白質的抗體。通常，這些蛋白質將含有對所公開序列的少於20個殘基置換，更典型的少於10個置換，優選少於5個，更優選少於3個。備選地，在結構結構域開始和結束的蛋白質將通常保留抗原性和交叉免疫原性。
衍生物的一個主要組是DC蛋白或其片段與其他蛋白質或多肽的共價綴合物。這些衍生物可以在重組培養中合成，如N-或C-末端融合，或者通過使用本領域中公知的試劑合成，這些試劑可以通過反應性側基用於蛋白質交聯。與交聯劑交聯的優選的蛋白質衍生位點在游離氨基、碳水化合物部分，和半胱氨酸殘基。
還提供了這些DC蛋白和其他同源或異源蛋白之間的融合多肽。異源多肽可以是不同表面標記之間的融合，導致例如，雜種蛋白。同樣，可以構建異源融合體，其將顯示出衍生蛋白質的性質和活性的聯合。典型的實例是報導多肽，例如，螢光素酶與蛋白質的片段或結構域，例如，受體結合片段的融合，從而，可以容易地確定所融合的蛋白的存在或位置。見，例如，Dull，等人，美國專利號4,859,609。其他基因融合配偶體包括細菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白質A、β-內醯胺酶、α澱粉酶、乙醇脫氫酶，和酵母α交配因子。見，例如，Godowski，等人(1988)Science 241812-816。
這些多肽也可以具有已經被化學修飾的胺基酸殘基，這些化學修飾包括磷酸化、磺化、生物素化或者加入或除去其他部分，尤其分子形狀與磷酸基團相似的那些部分。在一些實施方案中，該修飾將是有用的標記試劑，或者作為純化靶標，例如，親和配體。
本發明還考慮使用這些DC蛋白的衍生物，這些衍生物不同於胺基酸序列變異或糖基化得到的衍生物。這些衍生物可以包括與化學部分的共價結合或聚集結合。這些衍生物通常分成三類(1)鹽，(2)側鏈和末端殘基共價修飾，和(3)吸附複合體，例如，與細胞膜的吸附複合體。這些共價或聚集衍生物可用作免疫原、免疫測定中的試劑、或者用於純化方法中，如用於親和純化配體或其他結合配體。例如，通過本領域中熟知的方法可以將DC蛋白質抗原通過共價結合固定到固體支持體，如溴化氰活化的Sepharose，或者使用或不用戊二醛交聯將DC蛋白質抗原吸附到聚烯烴表面上，以用於抗-DC蛋白質抗體的測定法或純化。本發明的DC蛋白還可以被可檢測基團標記，例如，通過氯胺T方法放射性碘標記，共價結合稀土螯合物，或者綴合到另一螢光部分以用於診斷測定中。通過固定化抗體可以實現這些SDCMP蛋白的純化。
分離的DC蛋白質基因將允許轉化缺少相應DC蛋白表達的細胞，這些細胞，例如，物種型細胞，或者缺少相應蛋白質並且表現出陰性背景活性的細胞。所轉化基因的表達將允許分離抗原性純的細胞系，具有明確的或者單一物種變體。該方法允許更靈敏地檢測和區分這些DC蛋白的生理學效應。可以分離和使用亞細胞片段，例如，胞質體或膜片段。
VIII.結合劑DC蛋白複合體在免疫測定中確定一種DC蛋白，其特異結合針對明確的免疫原，例如，由SEQ ID NO2或10的胺基酸序列組成的免疫原產生的抗體或者與該抗體具有特異免疫反應性。該免疫測定使用針對SEQ ID NO2或10的蛋白產生的多克隆抗血清。所選擇的該血清具有針對相關家族的其他成員的低交叉反應性，並且在免疫測定中使用前通過免疫吸附除去任何這種免疫反應性。
為了產生用於免疫測定中的抗血清，例如，如此處描述的分離SEQID NO2或10的蛋白。例如，可以在哺乳動物細胞系中產生重組蛋白。使用標準佐劑，如弗氏佐劑，和標準小鼠免疫方案(見Harlow和Lane，如前)，用適宜的蛋白免疫小鼠的自交品系，如BALB/c。備選地，從此處公開的序列得到並綴合到載體蛋白的合成肽可以用作免疫原。收集多克隆血清並測定針對免疫測定(例如，免疫原固定在固體支持體上的固相免疫測定)中免疫原蛋白的效價。選擇效價為104或更大的多克隆抗血清並試驗它們針對其他相關蛋白的交叉反應性，該試驗使用競爭性結合免疫測定，如Harlow和Lane，如前，570-573頁中所描述的競爭性結合免疫測定。優選地，兩種不同相關蛋白聯合給定DC蛋白被用於該測定中。例如，對於凝集素蛋白，使用至少兩種其他家族成員以吸附完共有的表位。SDCMP3家族成員與該家族的兩種其他成員聯合使用。這些其他家族成員可以作為重組蛋白產生並且可以用此處描述的標準分子生物學和蛋白質化學技術分離。
競爭結合形式中的免疫測定可用於交叉反應性測定。例如，可以將SEQ ID NO2或10的蛋白質固定到固體支持體。加入該測定中的蛋白質與抗血清競爭結合固定化抗原。將上面的蛋白質與抗血清競爭結合固定化蛋白質的能力與SEQ ID NO2的蛋白質相比。使用標準計算方法計算上面蛋白的百分數交叉反應性。選擇並合併與上面所列的蛋白質的每一種的具有小於10％交叉反應性的那些抗血清。然後通過與上面所列蛋白質的免疫吸附從合併的血清除去交叉反應抗體。
然後將免疫吸收並合併的血清用於如上述的競爭性結合免疫測定中以將另一蛋白與免疫原蛋白(例如，SEQ ID NO2或10的SDCMP3蛋白)比較。為了進行該比較，測定寬範圍濃度下這兩種蛋白的每一種並確定將抗血清與固定化蛋白的結合抑制50％所需的每種蛋白的量。如果所需的第二種蛋白質的量少於所需的SEQ ID NO2或10的蛋白質的量的2倍，那麼認為第二種蛋白特異結合針對該免疫原產生的抗體。
可以理解DC蛋白可能是含有兩種或多種基因的同源蛋白家族。對於具體基因產物，如人Ig家族成員蛋白，本發明不僅包括此處公開的胺基酸序列，還包括其他蛋白，該其他蛋白是等位基因的、多態性的、非等位基因的，或物種的變體。還可以理解術語「人DC蛋白」包括非天然突變，這些非天然突變通過使用常規重組技術如單一位點突變的有意突變或者通過切除編碼這些蛋白質的DNA的短片段或者該基因的剪接變體，或者通過置換或加入少數新胺基酸導入。這些較小的改變必須基本上保持最初分子的免疫同一性和/或其生物學活性。這些改變包括與所指定的天然發生的各自SDCMP蛋白(例如，SEQ ID NO6或8的人SDCMP4蛋白)特異免疫反應的蛋白。認為較小的具體蛋白質修飾將包括具有相似化學性質的胺基酸的保守置換，如上面對作為一個整體的每個蛋白質家族所描述的。通過將蛋白質與SEQ ID NO2或10的蛋白質最優比對，並通過使用此處描述的常規免疫測定以確定免疫同一性，可以確定本發明的蛋白質組合物。
IX.用途本發明提供了試劑，這些試劑將用於本文別處(例如，關於發育異常的一般描述中，或者下面關於診斷試劑盒的描述中)描述的診斷應用中。
DC基因，例如，DNA或RNA可用作法醫測定中的組分。例如，可以用，例如，32P或者生物素標記所提供的核苷酸序列並將其用於檢測標準限制性片段長度多態性印跡，提供可測量的特徵以幫助區分個體。這些探針可用於熟知的法醫技術，如基因指紋法中。此外，從DC序列製備的核苷酸探針可用於原位測定中以檢測染色體異常。
針對DC蛋白或核酸的抗體和其他結合試劑可用於純化相應的DC蛋白分子。如在下面實施例中描述的，DC蛋白的抗體純化是可能的和可行的。使用此處描述的熟知的技術，抗體和其他結合試劑也可用於診斷方式以確定DC組分是否存在於組織樣品或細胞群體。能夠將結合試劑附著到DC蛋白提供了診斷與表達錯誤調節相關的失調的方法。抗體和其他DC蛋白結合試劑還可用作組織學標記，或者純化試劑。如下面實施例中所描述，這些蛋白的每一種的表達都限於特定組織類型。通過將探針，如抗體或核酸針對各自DC蛋白，可能使用該探針原位或體外區分組織和細胞類型。
此外，純化的抗原可用於耗盡選擇性結合該抗原的抗體的抗血清製劑。從而，例如，小鼠SDCMP3可用於耗盡針對可以與小鼠SDCMP3交叉反應的組分的人SDCMP4產生的抗血清。備選地，SDCMP3可用於純化抗血清的那些組分，這些組分親和地結合各自抗原。
SDCMP4與肝ASGPR具有許多共同特徵，ASGPR是II型跨膜C-型凝集素的最熟知的實例。肝ASGPR顯示出對半乳糖殘基的結合特異性，並且其細胞內結構域具有用於配體內化的酪氨酸基序。這些特徵使得肝ASGPR結合表達半乳糖殘基的脫唾液酸化的血漿糖蛋白，並隨後提供了這些蛋白從血漿的清除。
不能從SDCMP4的CRD序列完全推論出SDCMP4的配體特異性。然而，SDCMP4在DC上的表達表明潛在抗原組分(諸如在微生物上發現的)可以代表SDCMP4的天然配體。在該背景中，在DC和巨噬細胞上發現的另一C-型凝集素-甘露糖受體在識別例如酵母細胞壁的甘露糖部分後結合和內化酵母顆粒。
SDCMP4中基於酪氨酸的內化基序的存在預示著該分子在DC的受體介導的內吞中起作用。可以認為SDCMP4作為DC中的「抗原受體」內化配體，該配體將隨後被送到細胞內加工途徑，導致抗原呈遞和啟動或促進免疫應答。
這種SDCMP4介導的內化功能使得該受體是指導抗原進入DC的潛在靶標，例如，用以增強向T細胞的呈遞，和隨後活化特異免疫。從而，SDCMP4可以代表一種受體，其將抗原遞送到接種方案，從而，將抗原靶定到適宜細胞以啟動疫苗應答。這種策略的治療重要性與癌症的免疫治療尤其相關，其中腫瘤相關抗原(TAA)可以與特異識別SDCMP4的試劑偶聯以選擇性遞送到DC。
本發明還提供了可以表現出重要的治療價值的試劑。DC蛋白(天然發生的或重組的)、其片段和其抗體，以及被鑑定具有對DC蛋白結合親和性的化合物可用於治療與異常生理或發育相關的病症，包括異常增殖，例如，癌性病症，或退化性病症。通過適宜的治療性治療，使用此處提供的組合物可以調節異常增殖、再生、退化和萎縮。例如，與DC(例如，作為抗原呈遞細胞)的異常表達或異常信號化相關的疾病或失調是該蛋白的激動劑或拮抗劑的靶標。這些蛋白可能在造血細胞，例如，淋巴細胞的調節或發育中起作用，這些造血細胞影響免疫應答，例如，抗原呈遞和所導致的效應功能。
認為阻斷這些SDCMPs的相互作用就可以阻斷信號。從而，例如，使用針對這些蛋白的多克隆或篩選的單克隆抗體可以影響免疫應答，例如，MLR。備選地，可溶的細胞外片段可以阻斷與反受體的相互作用，從而也阻斷這種反應。因為MLR是免疫應答的啟動或維持的診斷，所以這些試劑可用於調節免疫系統的啟動和維持。
通過RNA印跡分析知道細胞類型中的其他異常發育病症具有DC蛋白mRNA。見Berkow(編者)The Merck Manual of Diagnosis andTherapy，Merck and Co.，Rahway，NJ；和Thorn，等人Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill，NY。例如，免疫系統的發育或功能異常可導致嚴重的醫學異常和病症，用此處提供的組合物可以預防或治療這些異常和病症。
可以純化重組DC蛋白或抗體並將它們施用於患者。這些試劑可以與其他活性或惰性成分組合用於治療，這些成分為例如，常規藥學上可接受的載體或稀釋劑，例如，免疫原性佐劑，以及生理上無害的穩定劑和賦形劑。具體地，這些成分可以用於疫苗背景中，其中抗原與激動劑或拮抗劑的這些治療形式之一組合。可以將這些組合無菌過濾或者通過在劑量小瓶中凍幹得到劑型，或者保存在穩定的水性製劑中。本發明還預期抗體或者其結合片段的用途，該結合片段包括不互補結合的形式。
使用抗體或者其受體或片段的藥物篩選可以鑑定對這些DC蛋白具有結合親和性的化合物，包括分離結合的組分。然後可以用生物學測定以確定該化合物是否具有內在刺激活性並由於其阻斷該蛋白的活性而因此是阻斷劑或拮抗劑。同樣，具有內在刺激活性的化合物可以通過該蛋白激活細胞從而由於其刺激該細胞而是激動劑。本發明還考慮針對這些蛋白的抗體作為拮抗劑的治療用途。
有效治療所需的試劑的量將取決於許多不同因素，包括施用方法、靶標部位、患者的生理狀態，和所施用的其他藥物。從而，將滴定治療劑量以優化安全性和效能。通常，體外使用的劑量可以對用於這些試劑的原位施用的量提供有用的指導。具體失調的治療的有效劑量的動物試驗將進一步提供對人劑量的預測性指示。在例如，Gilman，等人(編者)(1990)Goodman and Gilman′sThe PharmacologicalBases of Therapeutics(第八版)Pergamon Press；和(1990)Remington′s Pharmaceutical Sciences(第17版)Mack PublishingCo.，Easton，PA中描述了各種考慮。此處和下文討論了施用，例如，經口、靜脈內、腹膜內或肌內施用、透皮擴散，和其他施用的方法。藥學上可接受的載體將包括水、鹽水、緩衝液和例如在Merck Index，Merck和Co.，Rahway，NJ中描述的其他化合物。通常預期劑量範圍的量低於1mM濃度，通常小於約10μM濃度，通常小於約100nM，優選小於約10pM(皮摩爾)，最優選小於約1fM(毫微微摩爾)，與適宜的載體。緩釋製劑，或者緩釋裝置將通常用於持續施用。
DC蛋白、其片段、針對DC蛋白或其片段的抗體、拮抗劑和激動劑可被直接施用於所要治療的宿主，或者，根據化合物的大小，可以希望將該化合物綴合到載體蛋白如卵清蛋白或者血清白蛋白後施用。可以以許多常規劑量製劑施用治療製劑。儘管活性成分可以單獨施用，但是優選將其作為藥物製劑施用。製劑通常含有如上面定義的至少一種活性成分，以及其一種或多種可接受的載體。每種載體應該是藥學上和生理學上可接受的，也就是與其他成分相容並且對患者無害。製劑包括適於經口、直腸、鼻、或腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內和皮內)施用的製劑。製劑可以方便地以單位劑型給出並且可以通過藥劑學領域中熟知的任何方法製備。見，例如，Goodman，等人(編者)(1990)Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第八版)Pergamon Press，和(1990)Remington′sPharmaceutical Sciences(第17版)Mack Publishing Co.，Easton，PA；Avis等人(編者)(1993)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral MedicationsDekker，NY；Lieberman等人(編者)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsTablets Dekker，NY；和Lieberman等人(編者)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse SystemsDekker，NY。本發明的治療可以與其他化學治療或者化學預防劑組合或聯合使用。
本發明的DC蛋白的天然發生的和重組形式都可尤其用於試劑盒和測定方法，該試劑盒和測定方法能夠篩選對這些蛋白具有結合活性的化合物。最近已經開發了幾種自動測定方法以允許在短期內篩選上萬種化合物。見，例如，Fodor，等人(1991)Science 251767-773，和化學多樣性文庫的其他描述，其描述了通過多種化合物試驗結合親和性的方法。通過利用如本發明提供的DC蛋白的大量純化的，例如，可溶形式，可以極大地方便適宜測定法的開發。
例如，一旦蛋白質的結構已經被確定，那麼通常可以發現拮抗劑。使用純化的表面蛋白開發高度自動化測定方法後，現在可以試驗潛在的蛋白質類似物。具體地，使用此處描述的篩選技術將發現新的拮抗劑和激動劑。尤其重要的是發現對多種相關的細胞表面抗原具有聯合的結合親和性的化合物，例如，可以作為DC蛋白的種變體的拮抗劑的化合物。
本發明尤其用於通過使用重組DC蛋白在各種藥物篩選技術中篩選化合物。使用重組蛋白篩選特異配體的優點包括(a)來自特定來源的蛋白質的改良的可更新的來源；(b)每個細胞潛在的在測定中給出更好的信號噪聲比值的更多的抗原；和(c)物種變體特異性(理論上給出更大的生物學和疾病特異性)。
藥物篩選的一種方法利用了真核或原核宿主細胞，該宿主細胞被表達DC蛋白的重組DNA分子穩定轉化。可以從表達分離的該蛋白的任何其他宿主分離細胞。這些存活或被固定形式的細胞可以用於標準表面蛋白結合測定中。還見，Parce，等人(1989)Science246243-247；和Owicki，等人(1990)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA874007-4011，它們描述了檢測細胞應答的靈敏方法。競爭性測定尤其有用，其中將細胞(DC蛋白源)與已知對該抗原具有結合親和性的抗體，如125I-抗體，和待測樣品接觸並孵育，測量該試樣對結合組合物的結合親和性。然後分離結合的和游離的被標記的結合組合物以評估蛋白質結合的程度。所結合的受試化合物的量與結合已知來源的標記抗體的量成相反比例。可以用許多技術將結合的試劑與游離的試劑分開以評估結合程度。該分離步驟可通常包括諸如粘附到濾器然後洗滌，粘附到塑料然後洗滌，或者離心細胞膜。也可以用存活的細胞篩選藥物對這些DC蛋白介導的功能，例如，抗原呈遞或輔助功能的影響。
另一方法利用來自被轉化的真核或原核宿主細胞的膜作為DC蛋白的來源。這些細胞被DNA載體穩定轉化，該DNA載體指導適宜的蛋白，例如，工程化的膜結合形式的蛋白的表達。基本上，將從細胞製備膜並將其用於結合測定中，如上面提出的競爭測定。
另一方法是使用來自被轉化的真核或原核宿主細胞的溶解的、未純化的或溶解的、純化的DC蛋白。這允許「分子」結合測定，其優點是特異性增加，能夠自動化，和高藥物試驗通量。
藥物篩選的另一技術包括化合物的高通量篩選，這些化合物對各自DC蛋白具有適宜的結合親和性，該技術在Geysen，歐洲專利申請84/03564(1984年9月13日公開)中詳細描述。首先，在固體基質，如塑料針或者某些其他適宜的表面上合成大量不同的小肽受試化合物，見，Foder，等人，如前。然後將所有針與可溶的、未純化的或可溶的、純化的DC蛋白反應，並洗滌。下一步驟包括檢測所結合的試劑，例如，抗體。
確定那些位點與特定其他蛋白相互作用的一種方法是物理結構測定，例如，x-射線晶體學或者二維NMR技術。這些將提供關於哪些胺基酸殘基形成分子接觸區域的指導。關於蛋白質結合確定的詳細描述，見，例如，Blundell和Johnson(1976)Protein CrystallographyAcademic Press，NY。
X.試劑盒本發明還考慮這些DC蛋白、其片段、肽、和它們的融合產物在用於檢測DC蛋白或信息的存在的各種診斷試劑盒和方法中的用途。通常，試劑盒將具有隔室，隔室含有所定義的DC肽或基因片段或者試劑，其識別一種或另一種，例如，抗體。
測定受試化合物與各自DC蛋白的結合親和性的試劑盒將通常含有受試化合物；被標記的化合物，例如，已知對該蛋白具有結合親和性的抗體；DC蛋白質(天然發生的或重組的)來源；和將結合的標記化合物與游離的標記化合物分開的工具，如用於固定DC蛋白的固相。一旦篩選了化合物，可以在如本領域中熟知的適宜生物學測定中評價對該蛋白具有適宜的結合親和性的那些化合物，以確定這些化合物是否作為激動劑或拮抗劑以調節DC功能。重組DC多肽的存在也提供了用於校準這些測定的明確標準。
用於確定例如樣品中DC蛋白的濃度的優選試劑盒將通常包含標記的具有對DC蛋白的已知的結合親和性的化合物，例如，抗體；DC蛋白(天然發生的或重組的)來源和將結合的標記化合物與游離的標記化合物分開的工具，如用於固定DC蛋白的固相。通常將提供含有試劑的隔室，和使用說明書。
對各自DC或其片段特異的抗體，包括抗原結合片段，可用於診斷性應用以檢測該蛋白質和/或其片段的水平是否升高。這些診斷測定可以使用裂解物、活細胞、固定細胞、免疫螢光、細胞培養物、體液，並且還可以包括檢測血清中的抗原，等。診斷測定可以是同質的(沒有游離試劑和抗原-DC蛋白複合體之間的分離步驟)或者異質的(有分離步驟)。存在各種商業化測定，如放射免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定(EIA)、酶-倍增的免疫測定技術(EMIT)、底物標記的螢光免疫測定(SLFIA)、等等。例如，通過使用第二抗體，可以使用未標記的抗體，該第二抗體被標記並且識別針對DC蛋白或者其特定片段的抗體。在文獻中已經廣泛討論類似測定。見，例如，Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press，NY；Chan(編者1987)ImmunoassayA Practical GuideAcademic Press，Orlando，FL；Price和Newman(編者1991)Principles and Practice of ImmunoassayStockton Press，NY；和Ngo(編者1988)Nonisotopic ImmunoassayPlenum Press，NY。具體地，該試劑可用於診斷生物樣品中DC群體，以檢測樣品中DC的過量或不足。該測定可以用於活檢的組織學分析，或者評價血液或組織樣品中DC的數目。
抗獨特型抗體可以具有類似用途以診斷針對DC蛋白的抗體的存在，同樣可以診斷各種異常狀態。例如，DC蛋白的過量產生可導致各種免疫學反應，其可以診斷異常生理狀態，尤其增殖性細胞病症，如癌症或異常分化。
通常在試劑盒中提供用於診斷測定的試劑，以便優化測定的靈敏性。對於主題發明，根據測定的性質，提供了方案、和標記、標記或未標記的抗體或受體，或者標記的DC蛋白。這通常與其他添加劑，如緩衝劑、穩定劑、信號產生所需的物質，如酶的底物，等等一起提供。優選地，該試劑盒將還含有關於正確使用和使用後內含物的處理的使用說明。通常，試劑盒具有每種有用試劑的隔室。希望試劑作為乾燥的凍乾粉末提供，其中這些試劑可以在水性介質中重構，從而提供實施該測定的試劑的適當濃度。
藥物篩選和診斷測定的許多前述組分可以不加修飾地使用或者可以以各種方法修飾。例如，通過共價或非共價連接一個部分可以實現標記，該部分直接或間接提供可檢測的信號。在許多這些測定中，可以直接或間接標記該蛋白、受試化合物、DC蛋白或者其抗體。直接標記的可能性包括標記基團放射標記如125I、酶(美國專利號3,645,090)，如過氧化物酶和鹼性磷酸酶，和螢光標記(美國專利號3,940,475)，其能夠監視螢光強度、波長偏移，或者螢光偏振的改變。間接標記的可能性包括將一種組分生物素化，然後結合偶聯到上面標記基團之一的抗生物素蛋白。
有多種方法可以將結合的蛋白與游離蛋白分離，或者備選地，將結合的受試化合物與游離的受試化合物分離。可以將DC蛋白固定在各種基質上，然後洗滌。適宜的基質包括塑料，如ELISA板、濾器，和珠子。將DC蛋白固定到基質的方法包括，但不限於，使用捕獲抗體直接粘附到塑料、化學偶聯，和生物素-抗生物素蛋白。該方法中的最後一步包括通過幾種方法之一沉澱蛋白/抗體複合體，這些方法包括例如，例如有機溶劑如聚乙二醇或鹽，如硫酸銨的方法。其他適宜的分離技術包括，但不限於，Rattle，等人(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的螢光素抗體可磁化顆粒方法，和如在美國專利號4,659,678中描述的雙抗體磁性顆粒分離。
將蛋白質或它們的片段連接到各種標記的方法已經在文獻中廣泛報導並且不需要在此處詳細討論。許多技術包括通過利用碳二亞胺或活性酯使用活化的羧基基團以形成肽鍵，通過將巰基與活化的滷素，如氯乙醯基反應形成硫醚，或者活化的烯烴，如馬來醯亞胺用於連接，等等。融合蛋白也可用於這些應用中。
本發明的另一個診斷方法包括使用從各自DC蛋白的序列得到的寡核苷酸或多核苷酸序列。這些序列可用作探針以檢測來自懷疑患有異常病症，例如，癌症或免疫問題的患者的樣品中信息的水平。RNA和DNA核苷酸序列的製備、這些序列的標記，和這些序列的優選大小已經在文獻中大量描述和討論。通常，寡核苷酸探針將有至少約14個核苷酸，通常至少約18個核苷酸，並且多核苷酸探針可以高達數千鹼基。可以使用各種標記，最常用放射性核素，尤其32P。然而，也可以使用其他技術，如使用生物素修飾的核苷酸以導入多核苷酸。然後生物素作為結合抗生物素蛋白或抗體的部位，該抗體可以被各種標記物標記，這些標記物為諸如放射性核素、螢光團、酶，等等。備選地，可以使用能夠識別特異雙鏈體的抗體，這些雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、DNA-RNA雜種雙鏈體，或者DNA-蛋白雙鏈體。該抗體叉可以被標記並實施測定，其中雙鏈體結合到表面，從而在表面上形成雙鏈體時，可以檢測結合雙鏈體的抗體的存在。可以以任一常規技術使用針對新反義RNA的探針，該技術為諸如核酸雜交、加減篩選、重組檢測、雜種釋放翻譯(HRT)、和雜種停滯翻譯(HART)。還包括擴增技術，如聚合酶鏈式反應(PCR)。
還預期診斷試劑盒，其也定性或定量檢驗其他標記的存在。診斷或預後可以取決於用作標記的多種指徵的組合。從而，試劑盒可以檢驗標記的組合。見，例如，Viallet，等人(1989)Progress in GrowthFactor Res.189-97。
XI.結合配偶體分離已經分離了特異相互作用的結合配偶體的一個成員，存在分離反-配偶體的方法。見，Gearing，等人(1989)EMBO J.83667-3676。可以確定標記DC表面蛋白而不幹擾與其受體的結合的方法。例如，可以將親和標記融合到配體的氨基末端或羧基末端。可以篩選表達文庫對DC蛋白的特異結合，這可以通過例如細胞分類，或者其他篩選以檢測表達這種結合組分的亞群。見，例如，Ho，等人(1993)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA9011267-11271。備選地，可以使用淘選方法。見，例如，Seed和Aruffo(1987)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA843365-3369。製備與可得到的DC蛋白質序列適宜的構建體也可以應用雙雜交選擇系統。見，例如，Fields和Song(1989)Nature 340245-246。
可以使用蛋白質與標記的交聯技術分離DC蛋白的結合配偶體。這將允許鑑定與適宜的DC蛋白特異相互作用的蛋白。
參考下面的實施例可以最好地理解本發明的寬範圍，這些實施例不打算將本發明限制於特定實施方案。
實施例I.一般方法在例如Maniatis，等人(1982)Molecular Cloning，ALaboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，NY；Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)卷1-3，CSH Press，NY；Ausubel，等人BiologyGreene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel，等人(1987和增刊)Current Protocols in MolecularBiologyWiley/Greene，NY；huis，等人(編者)(1990)PCRProtocolsA Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press，NY中描述或參考了許多下面的標準方法。
蛋白質純化方法包括諸如硫酸銨沉澱、柱層析、電泳、離心、結晶、和其他方法。見，例如，Ausubel，等人(1987和定期增刊)；Deutscher(1990)″蛋白質純化指南″Methods in Enzymology卷182，和該系列中的其他卷；Coligan，等人(1996和定期增刊)CurrentProtocols in Protein ScienceWiley/Greene，NY；和生產商(例如Pharmacia，Piscataway，NJ，或Bio-Rad，Richmond，CA)的關於蛋白質純化產物的文獻。重組技術的組合允許融合到適宜的片段，例如，融合到FLAG序列，或者等價序列，其可以通過蛋白酶-可除去的序列融合。見，例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie1269-70；Hochuli(1990)″用金屬螯合吸收劑純化重組蛋白″Setlow(編者)Genetic Engineering，Principle and Methods1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe，等人(1992)QIAexpressThe HighLevel Expression and Protein Purification SystemQUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
在Hertzenberg，等人(編者，1996)Weirs’s Handbook ofExperimental Immunology，卷1-4，Blackwell Science；Coligan等人(1992和定期增刊)Current Protocols in Protein ScienceWiley/Greene，NY和Methods in Enzymology卷70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163。還見，例如，Paul(等人)(1993)Fundamental Immunology(第三版)Raven Press，N.Y。在，例如Steinman(1991)Annual Review of Immunology 9271-296；和Banchereau和Schmitt(編者，1994)Dendritic Cells inFundamenal and Clinical Immunology Plenum Press，NY中描述了確定免疫功能的方法。
在Melamed等人(1990)Flow Cytometry and SortingWiley-Liss，Inc，New York，NY；Shapiro(1988)Practical FlowCytometryLiss，New York，NY；和Robinson，等人(1993)Handbookof Flow Cytometry MethodsWiley-Liss，New York，NY中描述了FACS分析。
II.樹突細胞的產生如下得到人CD34+細胞。見，例如，Caux，等人(1995)1-5頁，Banchereau和SchmittDendritic Cells in Fundamental andClinical ImmunologyPlenum Press，NY。在幹細胞因子(SCF)、GM-CSF、和TNF-α存在下，在補加熱失活的胎牛血清(FBS；FlowLaboratories，Irvine，CA)、10mM HEPES、2mM L-穀氨醯胺，5×10-5M 2-巰基乙醇、青黴素(100μg/ml)的無內毒素RPMI 1640培養基(GIBCO，Grand Island，NY)中培養外周血或臍血細胞，有時選擇CD34+。該培養基被稱為完全培養基。
將CD34+細胞以2×104個細胞/ml接種於25到75cm2培養瓶(Corning，NY)中擴大。通過在第5和10天將這些培養物分到含有新鮮GM-CSF和TNF-α(細胞濃度1-3×105個細胞/ml)的培養基中以保持最優條件。在一些情況中，在約第6天，用FACS根據CD1a表達對細胞分選。
在一些情況中，培養12天後常規地收集細胞，最後使用5mM EDTA溶液回收貼壁細胞。在其他情況中，將CD1a+細胞以5×106個細胞/ml重懸在完全培養基中活化，並用1μg/ml 12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(PMA，Sigma)和100ng/ml離子黴素(Calbiochem，La Jolla，CA)活化適當的時間(例如，1或6h)。將這些細胞再擴大6天，並分離用於cDNA文庫製備的RNA。
III.RNA分離和文庫構建使用如Chirgwin，等人(1978)Biochem.185294-5299描述的硫氰酸胍/CsCl梯度方法分離總RNA。
備選地，使用OLIGOTEX mRNA分離試劑盒(QIAGEN)分離多聚(A)+RNA。用例如，用於cDNA合成和質粒克隆的SUPERSCRIPT質粒系統(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)產生雙鏈cDNA。將所得雙鏈cDNA單向克隆到，例如，pSport1並通過電穿孔轉染到ELECTROMAX DH10BTM細胞(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。
IV.測序將從隨機挑選的克隆或者從用未活化的細胞扣除雜交後的克隆分離的DNA用標準技術實施核苷酸序列分析。可以使用Taq雙脫氧終止子循環測序試劑盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)。用適宜的自動化測序儀的DNA測序凝膠分離標記的DNA片段。備選地，如例如在Maniatis，等人(1982)Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborPress；Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual，(第二版)，卷1-3，CSH Press，NY；Ausubel，等人，Biology，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel，等人(1987和增刊)Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York中描述的對所分離的克隆測序。也可以利用化學測序方法，例如，使用Maxam和Gilbert測序技術。
V.重組DC基因構建體例如，使用FastTrack mRNA試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA)從適宜的細胞群分離poly(A)+RNA。將樣品在例如含有甲醛的1％瓊脂糖凝膠中電泳並轉移到GeneScreen膜(NEN Research Products，Boston，MA)。在例如，65℃下，0.5M NaHPO4pH 7.2，7％SDS，1mMEDTA，和1％BSA(級分V)與107cpm/ml32P-dCTP標記的DC基因cDNA的混合物中實施雜交。雜交後，將濾器在50℃下，0.2×SSC，.1％SDS中洗滌3次，例如30分鐘，然後暴露於膠片24h。陽性信號通常為背景的2倍，優選5-25倍。
重組基因構建體可用於產生檢測信息的探針。可以切除插入片段並將其用於上述檢測方法中。種間雜交和洗滌的各種標準方法是本領域中熟知的。見，例如，Sambrook，等人，和Ausubel。
VI.DC基因蛋白在大腸桿菌中的表達用PCR製備含有可讀框的構建體，該可讀框優選可操作地與正確的啟動子、選擇、和調節序列結合。將所得表達質粒轉化到適宜的，例如，Topp5大腸桿菌菌株(Stratagene，La Jolla，CA)。將氨苄西林抗性(50μg/ml)轉化株37℃下生長在Luria培養基(Gibco)中直到550nm處光密度為0.7。用0.4mM異丙基-βD-硫代乳-吡喃糖苷(Sigma，St.Louis，MO)誘導重組蛋白並將細胞在20℃繼續孵育18小時。通過離心從1升培養物收穫細胞並將細胞重懸在例如冰冷30％蔗糖、50mM TrisHCl pH8.0，1mM乙二胺四乙酸的200ml混合液中。置於冰上10分鐘後，加入冰冷卻的水至總體積2升。冰上20分鐘後，離心除去細胞並通過5μM Millipak 60(Millipore Corp.，Bedford，MA)過濾使上清液澄清。
通過標準純化方法，例如，各種離子交換層析方法純化重組蛋白。也可以使用下面描述的利用抗體的免疫親和方法。可以使用親和方法，其中表位標記被工程化到表達構建體中。
類似方法被用於製備真核細胞中的表達構建體和細胞。可以如上面描述的產生真核啟動子和表達載體。
VII.人DC基因作圖根據標準技術實施DNA分離、限制酶消化、瓊脂糖凝膠電泳、DNA印跡轉移和雜交。見Jenkins，等人(1982)J.Virol.4326-36。可以用Hybond-N尼龍膜(Amersham)製備印跡。用32P-dCTP標記探針，在例如0.1×SSC，0.1％SDS，65℃的最終嚴謹性條件下進行洗滌。
備選地，可以將BIOS Laboratories(New Haven，CT)小鼠體細胞雜種細胞分布板與PCR方法結合。見，Fan，等人(1996)Immunogenetics4497-103。
如通過用PCR引物實施放射雜種作圖所確定的，人SDCMP3基因位於染色體12 p12-13(人NK受體複合體)上。
VIII.個體變異分析根據分布數據，選擇大量的容易接近的細胞類型用於從個體採樣。使用PCR技術，為該基因分析了大群體個體。用cDNA或其他PCR方法對不同個體，例如遠交小鼠品系中的相應基因測序，並比較它們的序列。這指出了種族或其他群體中分散的程度，以及確定哪些殘基可能被修飾而對功能無顯著影響。
IX.抗體的製備通過在如上面所示的大腸桿菌中表達產生重組DC蛋白，並測定其生物學活性。備選地，可以通過純化方法得到天然蛋白質來源。抗體試劑可用於免疫純化中，或者用於追蹤分離方法。可以用活性或變性的蛋白免疫適宜的哺乳動物以產生多克隆血清，或者單克隆抗體。
X.對應DC基因的分離將編碼這些基因的人cDNA克隆用作探針，或者用於設計PCR引物，用以發現各種靈長類物種，例如，黑猩猩中的對應物。可以從其他動物，例如，馴養的農場或寵物動物物種鑑定其他對應DC基因。
XI.使用試劑分析細胞群體檢測樣品中存在的樹突細胞的水平對於異常疾病狀況的診斷是重要的。例如，組織或淋巴系統中樹突細胞數目的增加可能指徵存在DC增生，或者組織或移植物排斥。低DC群體可以指徵對例如，細菌或病毒感染的異常反應，其可能需要適宜的治療而使DC應答正常化。
使用對細胞表面DC蛋白特異的標記的結合試劑的FACS分析(見，例如，Melamed，等人(1990)Flow Cytometrv and SortingWiley-Liss，Inc，New York，NY；Shapiro(1988)Practical FlowCytometryLiss，New York，NY；和Robinson，等人(1993)Handbookof Flow Cytometry MethodsWiley-Liss，New York，NY)被用於確定細胞混合物，例如，PBMCs、粘附細胞，等中存在的DC的數目。結合試劑還用於新鮮或固定的組織樣品的組織學分析以分析DC浸潤。還可以在破壞性測定，或者在細胞保持存活的某些測定中評價各種細胞群體。備選地，可以使用組織或細胞固定方法。
用，例如Murphy，等人(1993)J.Immunol.Methods162211-223中描述的半定量PCR可以定量DC轉錄物的水平。設計引物和其他方法使得基因組DNA不被檢測。
XII.製備免疫選擇性結合製劑例如，如上面描述的製備多克隆抗血清。其他脫唾液酸糖蛋白受體被用於耗盡特異結合這些受體的組分，留下將結合所希望的SDCMP3或SDCMP4的組分。這些耗盡的血清可以連接到例如，固體基質，並用於從不純的來源免疫選擇抗原。可以將免疫選擇的抗原進一步純化，該純化可使用標準蛋白質純化方法，例如，硫酸銨沉澱、離子交換，或其他層析方法、HPLC等。可以用特異血清跟蹤純化，例如，確定哪些級分是所希望的蛋白質部分。
XIII.表達分布檢測DC(從GM-CSF和TNFα中培養12天的CD34+祖細胞製備，用PMA和離子黴素活化1-6h)、TF1(早期骨髓樣細胞系)和U937(骨髓單核細胞系，用PMA和離子黴素活化)中靈長類SDCMP3的分布。還檢測了單核細胞和單核細胞衍生的樹突細胞和來自扁桃體的CD11 c+樹突細胞中的表達。在未活化的Jurkat、CHA、MRD5、JY細胞系、來自扁桃體的漿細胞CD11 c-樹突細胞(活化的或未活化的)、B淋巴細胞、T淋巴細胞或粒細胞(活化的或未活化的)中沒有檢測到信號。這些數據清楚地將人SDCMP3鑑定為幹預骨髓樹突細胞的靶標，或者作為感染性疾病和癌症的潛在診斷。
DC亞組的評價將CD34+祖細胞與GM-CSF和TNFα培養6天，FACS-分類成CD1a+和CD14+群體。將分類的亞組在GM-CSF和TNFα中再培養6天，並用PMA和離子黴素活化1h或6h。檢測CD14衍生的DC，但不是CD1a衍生的DC中的表達，並且該表達被PI活化下調。在用PMA和離子黴素活化的單核細胞中檢測到更小的信號，在未活化的和用PMA、離子黴素活化的PBL中檢測到非常弱的信號。在用PMA、離子黴素活化的各種細胞T細胞、粒細胞或B細胞中沒有檢測到信號。
評估了巨噬細胞的表達，並在用PMA、離子黴素活化的單核細胞；和PBL(未活化的或用PMA、離子黴素活化的)中檢測到信號。
通過RT-PCR在下面的細胞類型中沒有檢測到SDCMP3表達朗格漢斯細胞、外周血和扁桃體CD11 c+或CD11 c-陰性DC(用或不用PMA和離子黴素，或IL-3和抗-CD40活化)、B細胞(用或不用PMA和離子黴素，或抗-CD40 mAB活化)、T細胞(用或不用PMA和離子黴素，或抗-CD3和抗-CD28mABs活化)。
通過cDNA序列資料庫中的序列表達，在來自DC、活化的單核細胞，和睪丸腫瘤的文庫中檢測到序列。
SDCMP3的鼠同系物(1469D4)包括其CRD中的甘露糖識別基序(EPN)。此外，該小鼠凝集素具有糖-結合蛋白的特徵性共有WND序列。因此，可以預期1469D4將能夠結合甘露糖。由於微生物的細胞壁富含甘露糖，可能抗原呈遞細胞(DC)能夠利用凝集素捕獲並隨後通過胞外酶活性降解微生物抗原。
通過與以密切相關的形式存在的其他C-型凝集素類比，可以預測可以從人細胞鑑定SDCMP3的甘露糖-結合形式。樹突細胞上的甘露糖結合活性將代表上調靶標，用以在感染性疾病的治療中得到潛在益處。SDCMP3的另一可能的功能可以作為DC和表達配體的其他細胞類型，例如，T細胞之間的粘附分子，從而調節免疫應答。
SDCMP3的序列同源性和染色體定位強烈表明其是IRS基因的新的C-型凝集素家族的一員。SDCMP3的序列將用於通過生物信息學和PCR技術鑑定該家族的其他成員。通過與其他IRS分子類比，預測SDCMP3結合在細胞表面的信號受體複合體中。基於其在DC和單核細胞中的受限表達，SDCMP3將代表調節DC活化的治療性幹預的選擇性靶標。根據所闡明的與抑制(ITIM)或活化(ITAM)IRS-信號途徑的關係，SDCMP3的動員可以抑制或者加強免疫應答。
此外，SDCMP3的受限表達表明可能將藥物選擇性遞送到樹突細胞和單核細胞/巨噬細胞系列的細胞。
通過DNA印跡從來自各種來源的cDNA文庫評估小鼠SDCMP3的分布。將來自初步擴增的cDNA文庫的DNA(5μg)用適宜的限制性內切酶消化以釋放插入片段，在1％瓊脂糖凝膠上電泳並轉移到尼龍膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上。
用於小鼠mRNA分離的樣品包括靜息小鼠成纖維細胞L細胞系(C200)；BrafER(Braf融合到雌激素受體)轉染的細胞、對照(C201)；T細胞，TH1極化的(來自脾臟的Mel14 bright、CD4+細胞，用IFN-γ和抗IL-4極化7天；T200)；T細胞，TH2極化的(來自脾臟的Mel14 bright、CD4+細胞，用IL-4和抗-IFN-γ極化7天；T201)；T細胞，高度TH1極化的(見Openshaw，等人(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗-CD3活化2、6、16h，合併；T202)；T細胞，高度TH2極化的(見Openshaw，等人(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗-CD3活化2、6、16h，合併；T203)；CD44-CD25+前T細胞，從胸腺分選(T204)；TH1 T細胞克隆D1.1，用抗原最後刺激後靜息3周(T205)；TH1 T細胞克隆D1.1，10μg/ml ConA刺激15h(T206)；TH2 T細胞克隆CDC35，用抗原最後刺激後靜息3周(T207)；TH2 T細胞克隆CDC35，10μg/ml ConA刺激15h(T208)；來自脾臟的Mell4+幼稚T細胞，靜息的(T209)；Mel14+T細胞，用INF-γ/IL-12/抗-IL-4極化到Th1 6、12、24h，合併(T210)；Mel14+T細胞，用IL-4/抗-INF-γ極化到Th2 6、13、24h，合併(T211)；未刺激的成熟B細胞白血病細胞系A20(B200)；未刺激的B細胞系CH12(B201)；來自脾臟的未刺激的大B細胞(B202)；來自總脾臟的B細胞，LPS活化的(B203)；來自脾臟的三碘苯甲醯胺基酸葡萄糖富集的樹突細胞，靜息(D200)；來自骨髓的樹突細胞，靜息的(D201)；用LPS活化4小時的單核細胞細胞系RAW 264.7(M200)；用GM和M-CSF衍生的骨髓巨噬細胞(M201)；巨噬細胞細胞系J774，靜息的(M202)；0.5、1、3、6、12h處的巨噬細胞細胞系J774+LPS+、抗IL-10，合併的(M203)；05、1、3、5、12h處的巨噬細胞細胞系J774+LPS+IL-10，合併的(M204)；氣溶膠刺激的小鼠肺組織，Th2引物、氣溶膠OVA刺激7、14、23h，合併(見Garlisi，等人(1995)Clinical Immunology andImmunopathology7575-83；X206)；Nippostrongulus-感染的肺組織(見Coffman，等人(1989)Science 245308-310；X200)；總成人肺，正常的(O200)；總肺，rag1(見Schwarz，等人(1993)Immunodeficiency4249-252；O205)；IL-10K.O.脾臟(見Kuhn等人(1991)Cell 75263-274；X201)；總成人脾臟，正常的(O201)；總脾臟，rag-1(O207)；IL-10K.O.Peyers淋巴集結(O202)；總Peyers淋巴集結，正常的(O210)；IL-10 K.O.腸繫膜淋巴結(X203)；總腸繫膜淋巴結，正常的(O211)；IL-10K.O.結腸(X203)；總結腸，正常的(O212)；NOD小鼠胰腺(見Makino，等人(1980)Jikken Dobutsu291-13；X205)；總胸腺，rag-1(O208)；總腎臟，rag-1(O209)；總心臟，rag-1(O202)；總腦，rag-1(O203)；總睪丸，rag-1(O204)；總肝臟，rag-1(O206)；大鼠正常關節組織(O300)；和大鼠關節炎關節組織(X300)。
在來自骨髓的樹突細胞，靜息的(D201)；和用GM和M-CSF衍生的骨髓巨噬細胞(M201)中檢測到強陽性信號。在總胸腺，rag-1(O208)；和總脾臟，rag-1(O207)中檢測到弱信號。在IL-10 K.O.腸繫膜淋巴結(X203)；總成人肺，正常的(O200)；和總肺，rag1(見Schwarz，等人(1993)Immunodeficiency4249-252；O205)中檢測到幾乎不能檢測到的信號。其他細胞沒有可檢測的信號。強信號表明該標記可用於區分或表徵樹突細胞和/或巨噬細胞群體或亞群。
通過PCR確定SDCMP4分布在GM-CSF和TNFα處理的樹突細胞、用PMA和離子黴素活化的單核細胞；用PMA和離子黴素活化的粒細胞；和PBL中檢測到陽性信號；在TF1、Jurkat、MRC5、JY、U937、CHA細胞系、活化的T細胞或活化的B細胞中沒有發現可檢測的信號；在未活化的或者用PMA和離子黴素活化的DC(來自在GM-CSF和TNFα中培養12天的CD34+祖細胞)中檢測到SDCMP4。還在單核細胞、粒細胞和PBL(未活化的或者用PMA和離子黴素活化的)中檢測到信號。
序列資料庫顯示了原代樹突細胞(經常)；骨髓細胞(一個)；嗜酸性粒細胞(一個)；胎盤扣除的(一個)；和T細胞淋巴瘤(兩個)中的SDCMP4序列。
SDCMP3和SDCMP4基因顯示出與人單核細胞ASGPR的鼠對應物(M-ASGPR)的顯著同源性。同源性在碳水化合物-識別結構域中是重要的，該結構域賦予鼠單核細胞ASGPR對半乳糖和N-乙醯化半乳糖胺(GalNAc)的特異性。Sato，等人(1992)J.Biochem.111331-336。此外，鼠單核細胞ASGPR在其胞質溶膠結構域中有YENL內化信號。CRD序列的系統樹表明小鼠和人SDCMP3與SDCMP2的關係比與SDCMP3的關係更近。這些CRDs似乎相互間的關係比與肝ASGPR的CRD的關係更近。
鼠M-ASGPR作為半乳糖基化糖蛋白內吞的受體(Ozaki，等人(1992)J.Biol.Chem.2679229-9235)，允許通過腫瘤殺傷性巨噬細胞對惡性細胞的識別(Kawakami，等人(1994)Jpn.J.Cancer Res.85744-749)。在該背景中，發現M-ASGPR在攜帶OV2944-HM-1轉移性卵巢腫瘤細胞的小鼠的肺轉移瘤中表達(Imai，等人(1995)Immunol.86591-598)。有趣的是，人M-ASGPR表現出對Tn抗原的顯著特異性(Suzuki，等人(1996)J.Immunol.156128-135)，該抗原具有一簇絲氨酸或蘇氨酸連接的末端GalNac，並且與人癌相關(Springer(1989)Mol.Immunol.261-5；andrntoft，等人(1990)Int.J.Cancer 45666-672)。
基於序列同源性，可以預測SDCMPs也作為半乳糖基化糖蛋白的內吞受體。此外，通過甘露糖受體的配體內化，另一C-型跨膜內吞凝集素導致DC通過MHC II類途徑的高效抗原呈遞。Cella，等人(1997)Current Opinion Immunol.910-16。通過類比，SDCMPs可以在將內化的配體導入抗原呈遞途徑中起類似作用。
從而，SDCMP4可能是在基於免疫的佐劑治療中的潛在高效靶標以將抗原裝入DC從而增強向T細胞的呈遞。這可以用抗原的半乳糖基化形式，或者用偶聯抗原的抗-SDCMP4 mABs體外刺激DC來實現。通過抗原特異的T細胞活化可以體外測定呈遞效率。由於這種方法的內在治療前景，這可以集中在腫瘤相關抗原(TAA)的呈遞。尤其重要的是與惡性黑素瘤相關的TAA。
此外，人M-ASGPR對Tn抗原的特異性使得該癌TAA是選擇靶定SDCMP4的候選者。
如最近所表明的，外來抗原可被加工並以MHC I類途徑呈遞。見Porgador和Gilboa(1995)J.Exp.Med.182255-260；和Paglia，等人(1996)J.Exp.Med.183317-322。專門的受體可能在DC中執行這種功能。
DC中的這些受體可被靶定以幫助產生TAA-特異的細胞毒性T細胞(CTL)，其具有重要的治療潛力，因為CTL似乎與腫瘤排斥的誘導有關。
XV.結合對應物的分離通過利用DC蛋白的結合特異性，就像利用抗體一樣，可以將DC蛋白用作特異結合試劑。將結合試劑如上面描述的，例如用螢光或其他物質標記，或者固定到用於淘選方法的基質。
該DC蛋白用於篩選表現出結合的細胞系。使用標準染色技術檢測或分選細胞內或表面表達的配體，或者通過淘選篩選表面表達轉化細胞。通過各種染色或免疫螢光方法篩選細胞內表達。也見McMahan，等人(1991)EMBO J.102821-2832。
例如，在第0天，用每個小室1ml 10ng/ml溶於PBS的纖連蛋白室溫下預包被2-室permanox載玻片30分鐘。用PBS洗滌一次。然後將1.5ml生長培養基中的COS細胞以2-3×105個細胞/小室鋪板。37℃過夜孵育。
在第一天，對於每個樣品，製備溶於無血清DME的66mg/ml DEAE-葡聚糖、66mM氯喹，和4mg DNA溶液0.5ml。對於每一組，製備陽性對照，例如1和1/200稀釋的人受體-FLAG cDNA，和陰性模擬物。用無血清的DME洗滌細胞。加入DNA溶液並在37℃孵育5小時。除去培養基並加入DME中的10％DMSO 0.5ml並保持2.5分鐘。除去並用DME洗滌1次。加入1.5ml生長培養基並過夜孵育。
在第二天，更換培養基。在第3或4天，固定細胞並染色。用Hank’s緩衝鹽溶液(HBSS)洗滌細胞兩次並在4％多聚甲醛(PFA)/葡萄糖中固定5分鐘。用HBSS洗滌3次。所有液體都除去後，可以將載玻片保存在-80℃。對於每個小室，如下實施0.5ml孵育。用32ml/ml 1MNaN3加入HBSS/皂甙(0.1％)20分鐘。用HBSS/皂甙1×洗滌細胞。向細胞加入蛋白質或蛋白質/抗體複合體並孵育30分鐘。用HBSS/皂甙洗滌細胞兩次。如果適宜，加入第一抗體30分鐘。加入第二抗體，例如，以1/200稀釋的Vector抗-小鼠抗體，並孵育30分鐘。製備ELISA溶液，例如，Vector Elite ABC辣根過氧化物酶溶液，並預孵育30分鐘。每2.5ml HBSS/皂甙使用例如，一滴溶液A(抗生物素蛋白)和一滴溶液B(生物素)。用HBSS/皂甙洗滌細胞兩次。加入ABC HRP溶液並孵育30分鐘。用HBSS洗滌細胞兩次，再次洗滌2分鐘，其封閉細胞。然後加入Vector二氨基苯甲酸(DAB)5到10分鐘。每5毫升玻璃蒸餾水使用2滴緩衝液加4滴DAB加2滴H2O2。小心除去小室並在水中洗滌載玻片。空氣乾燥幾分鐘，然後加入1滴Crystal Mount和蓋玻片。85-90℃烘烤5分鐘。
備選地，使用結合試劑特異的其他單核細胞蛋白以親和純化或者篩選表達受體的細胞。見，例如，Sambrook，等人或Ausubel，等人。
另一策略是通過淘選篩選膜結合的受體。如上述構建受體cDNA。該配體可被固定並用於固定表達細胞。使用識別例如，單核細胞蛋白融合構建體的FLAG序列，或者使用針對第一抗體產生的抗體可以實現固定。循環使用選擇和擴增可以富集適宜的克隆並最終分離表達配體的克隆。
通過單核細胞蛋白可以篩選噬菌體表達文庫。適宜的標記技術，例如，抗-FLAG抗體，將允許特異標記適宜的克隆。
如對本領域中技術人員顯而易見的，可以對本發明做出許多修飾和改變而不背離其精神和範圍。此處描述的特定實施方案僅通過實施例提供，並且本發明僅被所述權利要求書，以及這些權利要求的等價方案的完整範圍所限制。
序列表110Schering Corporation120分離的哺乳動物膜蛋白基因和相關試劑130SF0802 QK WI150US 10/270,4701512002-10-1116010170PatentIn版本3.12101211850212DNA213人220
221CDS222(108)..(593)223
4001gtccctgagc tctagcttct ttaaatgaag ctgagtctct gggcaacatc tttagggaga 60gaggtacaaa aggttcctgg accttctcaa cacagggagc ctgcata atg atg caa 116Met Met Gln1gag cag caa cct caa agt aca gag aaa aga ggc tgg ttg tcc ctg aga 164Glu Gln Gln Pro Gln Ser Thr Glu Lys Arg Gly Trp Leu Ser Leu Arg5 10 15ctc tgg tct gtg gct ggg att tcc att gca ctc ctc agt gct tgc ttc 212Leu Trp Ser Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala Leu Leu Ser Ala Cys Phe20 25 30 35att gtg agc tgt gta gta act tac cat ttt aca tat ggt gaa act ggc 260Ile Val Ser Cys Val Val Thr Tyr His Phe Thr Tyr Gly Glu Thr Gly40 45 50aaa agg ctg tct gaa cta cac tca tat cat tca agt ctt acc tgc ttc 308Lys Arg Leu Ser Glu Leu His Ser Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys Phe55 60 65agt gaa ggg aca aag gtg cca gcc tgg gga tgt tgc cca gct tct tgg 356Ser Glu Gly Thr Lys Val Pro Ala Trp Gly Cys Cys Pro Ala Ser Trp70 75 80aag tca ttt ggt tcc agt tgc tac ttc att tcc agt gaa gag aag gtt 404Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Glu Lys Val85 90 95tgg tct aag agt gag cag aac tgt gtt gag atg gga gca cat ttg gtt 452Trp Ser Lys Ser Glu Gln Asn Cys Val Glu Met Gly Ala His Leu Val100 105 110 115
gtg ttc aac aca gaa gca gag cag aat ttc att gtc cag cag ctg aat 500Val Phe Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Val Gln Gln Leu Asn120 125 130gag tca ttt tct tat ttt ctg ggg ctt tca gac cca caa ggt aat aat 548Glu Ser Phe Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln Gly Asn Asn135 140 145aat tgg caa tgg att gat aag aca cct tat gag aaa aat gtc agg 593Asn Trp Gln Trp Ile Asp Lys Thr Pro Tyr Glu Lys Asn Val Arg150 155 160tgagtgcagt tctggggcct tgtttacata gaaaatctag ggaaattttg ttaggagtta653ctaataatgt taatattggt aattatgata acaggatcta acaattatta agcattacta713aggatatgca ttatctcact taaacttcat gaaaacttct ctttttatga actaatttta773cagataaaaa attaaataac ttgccccaaa tcaataaact aataagatga gaaactggat833gtcaactcca tgtcaag 8502102211162212PRT213人4002Met Met Gln Glu Gln Gln Pro Gln Ser Thr Glu Lys Arg Gly Trp Leu1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Trp Ser Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala Leu Leu Ser20 25 30Ala Cys Phe Ile Val Ser Cys Val Val Thr Tyr His Phe Thr Tyr Gly35 40 45Glu Thr Gly Lys Arg Leu Ser Glu Leu His Sar Tyr His Ser Ser Leu50 55 60Thr Cys Phe Ser Glu Gly Thr Lys Val Pro Ala Trp Gly Cys Cys Pro65 70 75 60Ala Ser Trp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu85 90 95Glu Lys Val Trp Ser Lys Ser Glu Gln Asn Cys Val Glu Met Gly Ala100 105 110His Leu Val Val Phe Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Val Gln
115 120 125Gln Leu Asn Glu Ser Phe Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln130 135 140Gly Asn Asn Asn Trp Gln Trp Ile Asp Lys Thr Pro Tyr Glu Lys Asn145 150 155 160Val Arg2103211630212DNA213小鼠220
221CDS222(1)..(627)223
4003atg gtg cag gaa aga caa tcc caa ggg aag gga gtc tgc tgg acc ctg 48Met Val Gln Glu Arg Gln Ser Gln Gly Lys Gly Val Cys Trp Thr Leu1 5 10 15aga ctc tgg tca gct gct gtg att tcc atg tta ctc ttg agt acc tgt 96Arg Leu Trp Ser Ala Ala Val Ile Ser Met Leu Leu Leu Ser Thr Cys20 25 30ttc att gcg agc tgt gtg gtg act tac caa ttt att atg gac cag ccc 144Phe Ile Ala Ser Cys Val Val Thr Tyr Gln Phe Ile Met Asp Gln Pro35 40 45agt aga aga cta tat gaa ctt cac aca tac cat tcc agt ctc acc tgc 192Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Leu His Thr Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys50 55 60ttc agt gaa ggg act atg gtg tca gaa aaa atg tgg gga tgc tgc cca 240Phe Ser Glu Gly Thr Met Val Ser Glu Lys Met Trp Gly Cys Cya Pro65 70 75 80aat cac tgg aag tca ttt ggc tcc agc tgc tac ctc att tct acc aag 288Asn His Trp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Leu Ile Ser Thr Lys85 90 95gag aac ttc tgg agc acc agt gag cag aac tgt gtt cag atg ggg gct 336Glu Asn Phe Trp Ser Thr Ser Glu Gln Asn Cys Val Gln Met Gly Ala100 105 110cat ctg gtg gtg atc aat act gaa gcg gag cag aat ttc atc acc cag 384His Leu Val Val Ile Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Thr Gln115 120 125cag ctg aat gag tca ctt tct tac ttc ctg ggt ctt tcg gat cca caa 432
Gln Leu Asn Glu Ser Leu Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln130 135 140ggt aat ggc aaa tgg caa tgg atc gat gat act cct ttc agt caa aat 480Gly Asn Gly Lys Trp Gln Trp Ile Asp Asp Thr Pro Phe Ser Gln Asn145 150 155 160gtc agg ttc tgg cac ccc cat gaa ccc aat ctt cca gaa gag cgg tgt 528Val Arg Phe Trp His Pro His Glu Pro Asn Leu Pro Glu Glu Arg Cys165 170 175gtt tca ata gtt tac tgg aat cct tcg aaa tgg ggc tgg aat gat gtt 576Val Ser Ile Val Tyr Trp Asn Pro Ser Lys Trp Gly Trp Asn Asp Val180 185 190ttc tgt gat agt aaa cac aat tca ata tgt gaa atg aag aag att tac 624Phe Cys Asp Ser Lys His Asn Ser Ile Cys Glu Met Lys Lys Ile Tyr195 200 205cta tga 630Leu2104211209212PRT213小鼠4004Met Val Gln Glu Arg Gln Ser Gln Gly Lys Gly Val Cys Trp Thr Leu1 5 10 15Arg Leu Trp Ser Ala Ala Val Ile Ser Met Leu Leu Leu Ser Thr Cys20 25 30Phe Ile Ala Ser Cys Val Val Thr Tyr Gln Phe Ile Met Asp Gln Pro35 40 45Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Leu His Thr Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys50 55 60Phe Ser Glu Gly Thr Met Val Ser Glu Lys Met Trp Gly Cys Cys Pro65 70 75 80Asn His Trp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Leu Ile Ser Thr Lys85 90 95Glu Asn Phe Trp Ser Thr Ser Glu Gln Asn Cys Val Gln Met Gly Ala100 105 110His Leu Val Val Ile Asn Thr Glu Ala Glu Gln Asn Phe Ile Thr Gln
115 120 125Gln Leu Asn Glu Ser Leu Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln130 135 140Gly Asn Gly Lys Trp Gln Trp Ile Asp Asp Thr Pro Phe Ser Gln Asn145 150 155 160Val Arg Phe Trp His Pro His Glu Pro Asn Leu Pro Glu Glu Arg Cys165 170 175Val Ser Ile Val Tyr Trp Asn Pro Ser Lys Trp Gly Trp Asn Asp Val180 185 190Phe Cys Asp Ser Lys His Asn Ser Ile Cys Glu Met Lys Lys Ile Tyr195 200 205Leu21052111018212DNA213人220
221CDS222(160)..(900)223
4005atctggttga actacttaag cttaatttgt taaactccgg taagtaccta gcccacatga 60tttgactcag agattctctt ttgtccacag acagtcatct caggagcaga aagaaaagag120ctcccaaatg ctatatctat tcaggggctc tcaagaaca atg gaa tat cat cct 174Met Glu Tyr His Pro1 5gat tta gaa aat ttg gat gaa gat gga tat act caa tta cac ttc gac 222Asp Leu Glu Asn Leu Asp Glu Asp Gly Tyr Thr Gln Leu His Phe Asp10 15 20tct caa agc aat acc agg ata gct gtt gtt tca gag aaa gga tcg tgt 270Ser Gln Ser Asn Thr Arg Ile Ala Val Val Ser Glu Lys Gly Ser Cys25 30 35gct gca tct cct cct tgg cgc ctc att gct gta att ttg gga atc cta 318Ala Ala Ser Pro Pro Trp Arg Leu Ile Ala Val Ile Leu Gly Ile Leu40 45 50tgc ttg gta ata ctg gtg ata gct gtg gtc ctg ggt acc atg gct att 366
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25 230 235 240Cys Glu Lys Lys Phe Ser Met2452107211880212DNA213人220
221CDS222(160)..(762)223
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221CDS222(108)..(734)223
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權利要求
1.分離的結合化合物，該化合物特異結合含有SEQ ID NO2、4、6、8或10的多肽。
2.權利要求1的結合化合物，其中該結合化合物是抗體或其抗體結合片段。
3.權利要求2的結合化合物，其中抗體結合片段是a)Fv片段；b)Fab片段；或c)Fab2片段。
4.權利要求2的結合化合物，其中抗體是a)多克隆抗體；b)單克隆抗體；或c)人源化抗體。
5.使用權利要求1的結合化合物的方法，該方法包括將結合化合物與含有抗原的樣品接觸以形成結合組合物抗原複合體。
6.權利要求4的方法，其中該a)樣品是生物樣品，包括體液；b)樣品是人；c)抗原在細胞上；d)抗原被進一步純化；或e)方法提供了所述抗原的空間定位或分布。
7.含有權利要求1的結合組合物的檢測試劑盒，和a)關於所述試劑盒中試劑的使用或處理的使用說明材料；或b)隔室，其提供了所述試劑盒的結合組合物或其他試劑的隔離。
8.基本上純或分離的多肽，其特異結合權利要求1的結合化合物。
9.權利要求8的多肽，其中該多肽含有SEQ ID NO2、4、6、8或10。
10.使用權利要求8的多肽的方法，該方法包括將所述多肽與抗體在適於形成抗體多肽複合體的條件下接觸。
11.含有權利要求8的所述多肽的檢測試劑盒，和a)關於所述試劑盒中試劑的使用或處理的使用說明材料；或b)隔室，其提供了所述試劑盒的多肽或其他試劑的隔離。
12.編碼權利要求8的多肽的分離的或純化的核酸。
13.權利要求12的核酸，其含有SEQ ID NO1、3、5、7或9。
14.分離的或純化的核酸，其在嚴格條件下與權利要求12的核酸雜交。
15.含有權利要求12的核酸的表達載體。
16.含有權利要求15的表達載體的宿主細胞。
17.權利要求16的宿主細胞，其中宿主是a)哺乳動物細胞；b)細菌細胞；c)昆蟲細胞；或d)酵母細胞。
18.產生多肽的方法，該方法包括將權利要求16的宿主細胞在適宜條件下培養以表達該多肽並純化該多肽。
19.調節樹突細胞生理或功能的方法，該方法包括將細胞與SEQ IDNO2、4、6、8或10的激動劑或拮抗劑接觸的步驟。
20.權利要求19的方法，其中拮抗劑是抗體。
21.權利要求19的方法，其中該接觸是與抗原，包括細胞表面抗原、MHC I類或MHC II類抗原相聯合。
全文摘要
描述了編碼來自靈長類的各種淋巴細胞蛋白的核酸、與其相關試劑，包括特異抗體，和純化的蛋白。還提供了使用所述試劑的方法和相關的診斷試劑盒。
文檔編號A61K39/395GK1886155SQ200380105581
公開日2006年12月27日 申請日期2003年10月9日 優先權日2002年10月11日
發明者L·查魯斯, A·B·荃, E·E·M·把特斯, D·M·戈曼, S·薩爾蘭德, S·J·E·勒伯格, J·H·小菲利普斯 申請人:先靈公司