促進血管完整性的微rna及其用途的製作方法

2023-09-18 17:42:55 2

專利名稱：促進血管完整性的微rna及其用途的製作方法
促進血管完整性的微RNA及其用途
背景技術：
本申請要求2008年8月11號提交的美國臨時申請序列號61/087，886的優先權， 其全部公開內容通過引用以整體併入本文。本發明在國立衛生研究院經費號為HL53351-06的支持下進行。政府對本發明享有一定權利。1.發明領域本發明主要涉及心臟病學、病理學和分子生物學領域。更具體而言，本發明涉及在內皮細胞和肌肉細胞中通過miR-U6進行的基因調控和細胞生理。此miRNA對保持血管完整性和促進血管修復有重要的作用，因此可將其作為用於疾病治療的調節劑的靶標。2.相關技術內皮細胞(EC)排列在血管結構的內表面，並在血管發育、功能和疾病中具有關鍵性作用(Carmeliet，2003)。在稱為小血管發生(vasculogenesis)的血管形成過程中， EC增殖、遷移並聯合形成初始的血管網絡以作為募集平滑肌細胞的框架。通過血管發生 (angiogenesis)隨後進行的血管出芽使血管系統進一步擴張並使組織血管化。許多生長因子肽通過增強EC的遷移、增殖、存活和細胞間相互作用來促進血管發生。在胚胎發生和成體期的新血管發生中需要VEGF和FGF，其為最強的血管發生生長因子(Cross和Claesson-Welsh，2001)。這些因子與其細胞表面受體的結合激活MAP激酶通路，該通路促進血管發生性生長和成熟。與之相反，MAP激酶信號轉導的抑制降低血管發生(Eliceiri等，1998 ；Giroux等，1999 ；Hood等，2002)，並已將其開發為抗血管發生療法 (Hood 等.，2002 ；Panka 等，2006)。儘管有了這些進展，但是對涉及血管發生以及血管完整性和修復的細胞調控機制的認識仍然十分不足。因此，對這些過程的更完整認識將非常有助於鑑定可在體內調節這些功能(例如在疾病治療中)的物質。發明概述因此，根據本發明，提供了促進血管完整性和/或內皮修復的方法，其包括向有血管損傷風險或具有血管損傷的對象施用miR-U6功能的激動劑。具有血管損傷的對象可能患有心臟組織中血管損傷，如缺血事件，包括包含下列之一的事件梗塞、缺血再灌注損傷或動脈狹窄。血管損傷可以是非心臟組織，可包括外傷或血管滲漏。或者，當對象有血管損傷風險時，該對象可能具有高血壓、心臟肥大、骨質疏鬆、神經退變、纖維化或呼吸窘迫。所述方法還可包括向所述對象施用第二療法。所述對象可以是非人動物或人。所述激動劑可以是miR-U6或miR_U6模擬物。 所述激動劑也可以是包含miR-U6編碼核酸區段的表達載體，所述區段處於在靶細胞(如心臟細胞、平滑肌細胞、內皮細胞或造血細胞、骨髓細胞或心外膜細胞)中有活性的啟動子控制之下。所述啟動子可以是組織選擇性/特異性啟動子，組織選擇性/特異性啟動子是在心臟細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、造血細胞、骨髓細胞或心外膜細胞中有活性的啟動子。 所述表達載體可以是病毒載體或非病毒載體。施用可包括全身性施用，如經口、靜脈內或動脈內途徑。施用也可通過滲透泵或導管進行。可以直接地或局部地施用到血管損傷組織或有血管損傷風險的組織，如心臟組織、 血管組織、骨組織、神經組織、呼吸系統組織、眼組織或胎盤組織。激動劑可以與患者、組織或部位接觸多於 1 次，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或 100次。激動劑可以與所述組織接觸2、3、4、5或6天，1、2、3或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10 或 11 個月、或 1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25 年。在另一個實施方案中，提供了抑制病理性血管化的方法，其包括使有病理性血管化風險或具有病理性血管化的對象與miR-U6拮抗劑接觸。患有病理性血管化的對象可能患有動脈粥樣硬化、視網膜病、癌症或中風。有病理性血管化風險的對象可能患有動脈粥樣硬化、肥胖、哮喘、關節炎、牛皮癬和/或失明。所述對象可以是非人動物或人。所述拮抗劑可以是miR-126的拮抗性miRNA(antag0mir)。靶組織可以是血管系統、平滑肌、眼組織、造血組織、骨髓、肺組織或心臟外膜組織。所述方法還可包括向所述對象施用第二抗血管發生療法。施用包括全身性施用，如經口、靜脈內或動脈內途徑。也可直接地或局部地施用到病理性血管化或具有病理性血管化風險的組織，例如眼組織中、血管組織、骨組織、脂肪組織或肺組織。施用也可通過滲透泵或導管進行。拮抗劑可以與患者、組織或部位接觸多於 1 次，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或 100 次。拮抗劑可以與所述組織接觸2、3、4、5或6天，1、2、3或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個月、或 1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25 年。當在權利要求和/或說明書中，術語「包含」、「包括」未加數量限制時，可以指「一」， 但也可以與「一或更多」、「至少一」以及「一或多於一」的意義相同。應理解，本文討論的任何實施方案可以參照任何本發明方法或組合物實施，反之亦然。此外，可以採用本發明的組合物或藥盒實現本發明的方法。在本申請中，術語「約」用於表示某值，其包括用於確定該值的裝置或方法的誤差的標準差。在權利要求中術語「或」的使用表示「和/或」，除非明確指明其僅表示可替代方案或者所述可替代方案是互斥的，但本公開內容支持表示僅有的可替代方案和「和/或」的定義。在本說明書和權利要求中使用的詞語「包含」(以及其任何變形)、「具有」(以及其任何變形)、「包括」(以及其任何變形、「含有」(以及其任何變形)是包括性或開放性的， 不排除另外的未列舉的要素或方法步驟。從以下詳述中可以明確本發明的其他目的、特點和優點。然而應理解，當說明具體的本發明實施方案時，詳細描述和具體實施例僅通過示例的方式給出，因為本領域技術人員能通過本詳述明確在本發明精神和範圍內的多種變化和修改。


通過參照這些附圖中的一個或多個並結合本文具體實施方案，可更好地理解本發明。
圖IA-B。miR-126的內皮細胞特異表達和基因結構。(圖1A)用RNA印跡
5(northern blot)所檢測到的不同組織和細胞系中miR-126的表達。U6或5s rRNA作為上樣對照。箭頭表示前體miR-126 (pre-miR-126)的位置，三角形表示成熟miR-126。SMC, 小鼠平滑肌細胞系；HUVEC，人臍靜脈內皮細胞(EC)系；P19CL6，P19胚胎癌細胞的衍生物； C2C12，小鼠成肌細胞系；MSl，用SV40大T抗原轉化的小鼠原代胰島內皮細胞；HAEC，人主動脈內皮細胞；SVEC，SV40轉化的小鼠內皮細胞系；Ε0ΜΑ，小鼠血管內皮細胞瘤衍生細胞系。(圖1B)(SEQ ID N0:1)小鼠Egfl7基因的結構。產生內含子7所編碼的莖環形式的 miR-126 (miR-126-3p)和(miR-U6_5p)。顯示miR_U6 的進化保守性(SEQ ID NO 2)。
圖2A-C。指導Egfl7/miR-126內皮細胞特異性表達的順式調控序列。(圖2A) E12. 5 轉基因小鼠胚胎，其帶有由Egfl7/miR-U6基因上遊的5. 4kb 50側翼DNA控制的LacZ轉基因。顯示下列項的EC特異性IacZ表達(a)胚胎整體，以及(b)軟骨膜區域、(c)真皮、 (d)腦和(e)流出道的矢狀切面。比例尺=50mm。(圖2B)在E12. 5的轉基因小鼠中針對 IacZ調節所測的Egfl7/miR-U6基因上遊基因組區段的示意圖。顯示了顯示IacZ內皮細胞特異性表達的轉基因胚胎的部分。下方顯示了 Egfl7/miR-126 50側翼區域的進化保守性。用粉紅和淺藍突出顯示保守的ETS結合位點。(SEQ ID NO :3_8)。(圖2C)通過C0S-7 細胞中編碼Ksl或缺少DNA結合結構域之Ksl突變體(Etsl mut)的表達質粒數量的增加來檢測調控區域1 (區域I-Luc)的基因組片段的激活。將缺失突變引入到ETS結合位點中(區域1 (mut) -Luc) ο Etsl激活區域I-Luc但不激活區域1 (mut) -Luc，MEtsl mut不激活任一構建體。誤差線表示標準偏差。
圖3A-G。miR-126基因的靶向。(圖3A)通過同源重組生成miR_U6突變體小鼠的策略。用側翼為IoxP位點的新黴素抗性表達盒(Neo)替換含有miR-126的96bp Egfl7內含子 序列。通過將雜合小鼠與CAG-Cre轉基因小鼠雜交來去除小鼠生殖細胞系中的Neo。 DTA,白喉毒素A。(圖3B)ES細胞基因組DNA的DNA印跡(southern blot)分析。用ka I 消化DNA。採用50探針或30探針，野生型和突變體(miR-126ne°等位基因)的大小分別為 11.4kb和13.4kb。基因型在上方顯示。(圖3C)通過RT-PCR檢測，分析miR-126nWne。或小鼠的心臟(左)或肺(右)中的Egf 17轉錄本。在底部顯示Egf 17基因結構和外顯子編號。RT-PCR所用的引物基於正向(F)或反向(R)的外顯子編號命名。在上方顯示基因型。用GAPDH作為對照。應注意，如在以7F和8R、6F和9R、8F和10R為引物的RT-PCR 所顯示的，HiiR-I^wne。突變體中Egfl7的表達受到幹擾，以及如使用所示引物的RT-PCR所示，相對於neo表達盒缺失的歸一化。(圖3D)通過WT和miR_126K0小鼠心臟提取物的蛋白質印跡(western blot)對EGFL7和GAPDH蛋白質的檢測。(圖3E)通過心臟和肺的RNA 印跡分析對miR-U6轉錄本的檢測。5S rRNA為上樣對照。(圖3F)miR_126v_互交子代的基因型。顯示了在標示階段每種基因型小鼠的實際和預期數量。(圖3G)miR-126v_互交胚胎的基因型。顯示了每個年齡所分析的miR-126v-子代的數量。嚴重血管缺陷被定義為水腫、出血、嚴重生長遲緩和死亡。少於的野生型或miR-126v_胚胎或新生小鼠顯示出血管異常。
圖4A-F。miR-126無效(Null)小鼠的血管異常。(圖4Α)Ε15· 5的野生型(WT)和 miR-126+(KO)胚胎。如箭頭所示，KO胚胎的亞組顯示出全身水腫和出血。(圖4B)E10. 5 的WT和miR-126K0胚胎顱區的側視圖。箭頭指示的表面腦血管在WT胚胎中很明顯，但在突變體中嚴重缺陷。在右邊顯示了方框指示的顱區中的血管數(η = 6)。(圖4C)P2的視網膜血管化，通過PECAM染色顯示。視網膜中央動脈的位置通過白色虛線界定，突變體中視網膜血管的末端用紅色箭頭指示。標尺=200mm。在右邊顯示相對血管覆蓋(n =幻。(圖4D) 標示基因型的Ε15. 5胚胎的真皮和肝及新生小鼠的肺的矢狀切面Η&Ε染色。上圖和中間圖的比例尺為200mm，下圖的比例尺為500mm。大括號指示KO胚胎組織空間中紅細胞和炎性細胞對真皮的加厚。三角形指示與WT肝臟相比KO肝臟的紅細胞過剩。箭頭指向肺，其中在KO小鼠中肺泡無法擴張。星號指示KO新生小鼠胸腔中的水腫。(圖4E)E15. 5的WT和 KO胚胎中毛細血管的電子顯微鏡照片。括號顯示KO胚胎中血管的損壞。綠箭頭指向WT內皮細胞的緊密聯結，紅箭頭指向在KO胚胎血管外漂浮的紅細胞，而三角形指示KO胚胎血管內皮層變薄。EC，內皮細胞；rbc，紅細胞。(圖4F)E15. 5的KO胚胎中的內皮細胞增殖。與 WT胚胎相比，在KO胚胎中觀察到的BrdU(紅色)和PECAMl (綠色)雙陽性細胞顯著減少。 紅箭頭指向PECAM/BrdU雙陽性細胞，而白箭頭指向PECAM單陽性細胞。用DAPI (藍色)對細胞核染色。誤差線表示標準偏差。在柱圖中顯示了數據統計(P = 0.014)。
圖5A-E。miR_126K0內皮細胞中警損的血管發牛。(圖5A)顯示了從4-6日齡野生型(WT)和miR-126+(K0)小鼠中分離的培養的主動脈環的代表性圖像。在WT外植體中可見大量的內皮生長，但在突變體中沒有。對每種條件下的相對遷移活性進行了定量，在統計柱圖中顯示。誤差線表示標準偏差。(圖5B)顯示了所示基因型小鼠中植入的基質膠栓 (matrigel plug)的PECAMl (綠色)染色的代表性圖像。與WT小鼠相比，在KO小鼠中有 FGF-2的基質膠中觀察到的血管發生顯著減少。在WT和KO小鼠無FGF-2的基質膠栓中沒有觀察到顯著的血管發生。比例尺=60mm。(圖5C)通過用Image J軟體確定PECAM染色面積來定量基質膠栓測定中血管發生的程度。誤差線表示標準偏差。KO與WT基質膠塞相 Kp = O. 0008。(圖5D)在MI後WT和KO小鼠的存活。MI後1周和3周KO小鼠的存活率與WT相比，ρ值為0. 05和0. 014。(圖5E)MI後WT和KO小鼠心臟的組織學分析。圖a_d 顯示了穿過右心室(RV)和左心室(LV)的縱切片。注意突變體心臟心房處的血栓塊，表示心力衰竭。圖e-f顯示用Masson三色法染色的橫切面，以顯示瘢痕形成。注意KO小鼠中心肌的大量缺失。圖g和h顯示了 e和f中加框顯示梗死區的PECAMl染色。注意MI後KO 小鼠的血管系統缺陷。圖a-f中的比例尺等於1cm，圖g和h中的比例尺等於40mm。
圖6A-I。miR_U6對血管發生生長因子信號轉導的調控。(圖6A)miR_U6增強了 FGF依賴性ERK1/2磷酸化。用表達LacZ或miR-126的腺病毒感染HUVEC細胞，並用 FGF-2 (lOng/ml)處理標示的時間。用所示的抗體對細胞裂解物進行免疫印跡以確定磷酸化的和總的ERKl/^2水平。Ad-miR-U6增強了 FGF-2依賴性ERKl/^2磷酸化。(圖6B)miR_U6 的敲除減少了 VEGF依賴性ERK1/2磷酸化。用2，-O-甲基-miR_U6反義寡核苷酸或對照寡核苷酸轉染HAEC細胞，並用VEGF(lOng/ml)處理10分鐘。用所示的抗體對細胞裂解物進行免疫印跡以確定磷酸化的和總的ERK1/2水平。用GAPDH為上樣對照。(圖6C) miR-126 與不同物種中Spred-I 30非翻譯區(UTR) (SEQ ID NOS :9_14)的序列比對。(圖6D)通過 E15. 5WT和miR-U6K0胚胎的卵黃囊提取物的蛋白質印跡對Spred-1、CRK和GAPDH的檢測。 (圖 6E)miR-U6 靶向 Spred-I 30UTR。將 Spred-ImRNA 的 3，UTR，以及在與miR_U6種子區域 (seed region) (GGTACGA至TTGGAAG)互補的區域中經改造具有突變的Spred m3，UTR，插入到pMIR-REPORT載體(Ambion)。miR_U6突變體(miR_U6m)構建物由下列項組成突變為GCATGG 的 miR-U6-3p 序列 CGTACC，以及突變為 CCATGC 的 miR-U6_5p 序列 GGTACG。用標示的質粒組合進行C0S-7細胞的轉染。用CMV-bGAL作為轉染效率的內對照。誤差線表示標準偏差。顯示了 P值；ns，不顯著。(圖6F)miR-126過表達或敲除後的相對Spred-ImRNA表達水平。將HUVEC或HAEC細胞進行標示的處理，通過實時PCR確定Spred-ImRNA的水平。GAPDH 為對照。誤差線表示標準偏差。顯示了 P值。(圖6G)miR-126+內皮細胞中Spred-ImRNA 的上調。用實時PCR以L7作為對照確定了 Spred-ImRNA的水平。誤差線表示標準偏差。KO 與WT相比，ρ = 0.01。(圖6H)顯示了從5和6日齡的野生型(WT)和miR_U6K0小鼠中分離的培養的主動脈環的代表性圖像。在WT外植體中Spred-I的腺病毒過表達損害了內皮細胞生長，而miR-126K0小鼠外植體中siRNA介導的Spred-I敲低(knockdown)增強了內皮細胞的生長。如在統計柱圖中所示，對每種條件下的相對遷移活性進行定量。誤差線表示標準偏差。(圖61) HUVEC細胞對VEGF應答的劃痕測定(scratch-wound assay)。用反義RNA敲低miR-U6的表達削弱了 EC的遷移，而在miR_U6反義RNA的存在下，用siRNA 敲低Spred-I恢復了遷移。用紅色虛線指示了劃痕的邊緣。定量了遷移的細胞，如在統計柱圖中所示。誤差線表示標準偏差。
圖7。miR-126在血管發牛中功能的樽型。VEGF和FGF與其在EC上受體的結合激活了 MAP激酶信號轉導通路，所述通路到達細胞核激活參與血管發生的基因的轉錄。miR-126 抑制Spred-I的表達，Spred-I是Ras/MAP激酶信號轉導的負調控子。因此，miR_U6功能的喪失減弱了應答於VEGF和FGF的MAP激酶信號轉導，而miR_U6功能的獲得增強了血管發生信號轉導。
圖8。Pri-miR-126及其宿主基因Etf 17的內皮細胞特異性表達。用內含子7作為 pri-miR-126的探針，用Egfl7cDNA片段作為Egfl7的探針。標記表示E8. 5、E10. 5和E14. 5 的節間血管(黑色三角形)、背主動脈(黑色箭頭)、心內膜(白色三角形)和肝(白色箭頭) 中pri-miR-126和Egf 17的內皮細胞特異性表達。黑色標尺=200 μ m，白色標尺=1600 μ m。
具體實施例方式近期的研究顯示，微RNA在心血管系統對損傷和脅迫的應答中起重要作用 (Latronico 等，2007 ；van Rooij 和 Olson, 2007)。miRNA 表示一類 22 個核苷酸的非編碼 RNA，其通過靶向mRNA以實現切割或翻譯抑制來調控基因表達(Bartel，2004)。在人和其他真核物種中已鑑定到多於500種miRNA，其中約三分之一由蛋白質編碼基因的內含子所編碼。miRNA首先轉錄為大pri-miRNA，其通過連續的步驟被加工產生雜合雙鏈RNA。雜合雙鏈的 miRNA 鏈併入 RNA 誘導沉默複合體(RNA-induced silencing complex (RISC))中，在其中它能夠通過在3』非翻譯區的互補序列靶向特異性mRNA (He和Harmon，2004)。雜合雙鏈中的相對鏈(稱為星(*)鏈)通常被降解。
現在，發明人證明內皮細胞特異性miRNA——miR-126——在體內調控血管發生。 在突變小鼠亞組中，小鼠中miR-126的靶向缺失導致血管滲漏、出血和胚胎死亡。這些血管異常可以歸因於血管發生生長因子信號轉導的降低，從而導致EC生長、出芽和粘附的減少。存活的突變體動物亞組易於在具有梗死的缺陷性血管化的心肌梗死後發生心臟破裂以及死亡。miR-126的促血管發生作用與其對Spred-I (MAP激酶信號轉導的負調節物)的抑制相關。因此，在不存在miR-126時，Spred-I的表達提高，減少了 VEGF和FGF的細胞內血管發生信號的傳遞。
根據這些發現，發明人認為miR-126的作用是血管發生信號轉導的內皮細胞特異性調節物。在疾病期間，內皮在心血管內穩態和重構(remodeling)中起到多種多樣的作用，包括控制血管伸縮性和滲透性、平滑肌細胞生長和增殖、白細胞粘附、凝結和血栓形成。 已經提出miRNA在體外調控EC基因的表達和功能(KuetAacher等，2007 ；Suarez等，2007)， 但是還沒有針對在體內miRNA在EC生物學中功能的研究。在血管完整性和血管發生以及 MI後存活中需要miR-U6的發現提示，在缺血的心肌中提高miR-U6可以增強心臟的修復。 相反地，減少miR-126的表達可能在調節病理性血管化中有效，所述病理性血管化如癌症、 動脈粥樣硬化、視網膜病和中風。最近，已有報導稱miR-U6抑制腫瘤發生，以及在轉移的乳腺腫瘤中下調，儘管沒有確定其下調的具體細胞類型和可能介導這些作用的miR-U6靶標(Tavazoie等，2008)。本發明人認為，將會發現miR_U6和其他miRNA在組織重構和疾病中起重要作用。下面更詳細地討論本發明的這些和其他方面。
I. miRNA A.背景 2001年，多個小組採用新的克隆方法在秀麗隱杆線蟲(C. elegans)、果蠅 (Drosophila)和人中分離和鑑定了一大類「微 RNA」(miRNA) (Lagos-Quintana 等，2001 ；Lau 等，2001 ；Lee和Ambros，2001)。已經在似乎不具有內源性siRNA的植物和動物(包括人) 中鑑定出幾百種miRNA。因此，儘管與siRNA類似，但是miRNA仍然是不同的。
目前為止觀察到的miRNA的長度約為21_22個核苷酸，它們來自於更長的前體，所述前體轉錄自非蛋白質編碼基因。參見Carrington等的綜述^00 。所述前體形成在自互補區域彼此折回的結構；而後它們被核酸酶所加工，在動物中是Dicer，在植物中是DCL1。 miRNA分子通過與其靶標的精確或非精確鹼基配對來幹擾翻譯。
miRNA由RNA聚合酶II轉錄，可來自於個體miRNA基因、蛋白質編碼基因的內含子或者經常編碼多個緊密相關的miRNA的多順反子轉錄本。在細胞核中由RNase Drosha 將通常幾百個鹼基長度的前體miRNA加工成70-100nt的髮夾狀前體。在轉運到細胞質後， 所述髮夾被Dicer進一步加工生成雙鏈miRNA。而後成熟的miRNA鏈整合入RNA誘導沉默複合體(RISC)，在其中miRNA通過鹼基互補與其靶標mRNA結合。相對較少的情況是，miRNA 鹼基對與mRNA靶標完全配對，則其促進mRNA的降解。更常見的是，miRNA與靶標mRNA形成不完全配對的雜合雙鏈，這影響mRNA的穩定性或抑制mRNA的翻譯。
miRNA的5』部分跨越2-8個鹼基，稱為「種子(seed) 」區，其對靶標識別尤其重要 (Krenz和Robbins，2004 ；Kiriazis和Krania，2000)。種子的序列以及靶標序列的進化保守性形成了目前多個靶標預測模型的基礎。儘管有越來越多可用的預測miRNA及其靶標的複雜計算方法，但是靶標的預測仍是重大的挑戰並需要實驗的驗證。由於單個miRNA具有與數百種潛在的高親和性和低親和性mRNA靶標鹼基配對的能力，以及多個miRNA靶向單個 mRNA,因此使得將miRNA的功能歸於調控特異性mRNA靶標更為複雜。
第一個miRNA被鑑定為秀麗隱杆線蟲中發育時序的調控子，這表明，一般來講， miRNA可能通過關閉特異性靶標而在不同發育階段的轉換中起決定性調控作用(!^atkin 等，2000 ；Lowes等，1997)。然而，隨後的研究提出，除了用作打開-關閉的「開關」之外，
9miRNA更常見的功能是通過抑制對特定細胞類型來說不適宜的蛋白質的表達，或通過調整蛋白質的量，來調節或微調細胞表型。還提出miRNA通過避免基因表達的劇烈波動來為細胞表型提供健壯性(robustness)。
隨著科學家開始理解這些分子在真核基因表達調控中所起的廣泛作用，針對微 RNA的研究正在增加。兩個研究最透徹的miRNA(lin-4和let_7)通過調節關鍵mRNA家族的翻譯來調節秀麗隱杆線蟲的發育時序(在I^Squinelli，2002中綜述)。已經在秀麗隱杆線蟲、果蠅和人中鑑定出幾百種miRNA。如對於調控基因表達的分子可以預計的，已經顯示在組織和發育階段之間miRNA的水平有不同。此外，一項研究顯示兩種miRNA的表達下降與慢性淋巴細胞性白血病緊密相關，這為miRNA和癌症提供了可能的聯繫(Calin，2002)。 儘管該領域還很年輕，仍然認為在高等真核生物中miRNA在調控基因表達上與轉錄因子同樣重要。
對於miRNA在細胞分化、早期發育以及如凋亡和脂肪代謝的細胞過程中起重要作用有幾個實例。在秀麗隱杆線蟲發育中，lin-4和let-7均調控從一個幼蟲狀態到另一個的轉化過程(Ambros，2003)。Mir-14和bantam是果蠅中調控細胞死亡的miRNA，其調控顯然是通過調控參與凋亡的基因表達(Brennecke等，2003，Xu等，2003)。已經提出miR-14參與脂肪代謝(Xu等，200 。Lsy-6和miR-273是秀麗隱杆線蟲中調節感化性神經元不對稱性的miRNA (Chang等，2004)。另一種調節細胞分化的動物miRNA是miR-181，其指導造血細胞分化(Chen等，2004)。這些分子代表了已知功能的動物miRNA的全部範圍。毋庸置疑， 對miRNA功能的進一步理解將揭示作用於正常發育、分化、細胞間和細胞內信息傳遞、細胞周期、血管發生、凋亡以及許多其它細胞過程的調控網絡。考慮到它們在眾多生物功能中的重要作用，miRNA有可能為治療幹預或診斷分析提供重要意義。
表徵諸如miRNA的生物分子的功能通常涉及將該分子引入細胞或將分子從細胞中去除並測定結果。如果將miRNA引入細胞後導致凋亡，則該miRNA毫無疑問地參與了凋亡通路。已經描述了在細胞中引入或去除miRNA的方法。兩個近期的出版物描述了可以用於抑制特定miRNA活性的反義分子(Meister等，2004 ；Hutvagner等，2004)，其他人已經在心臟中證明了它們的功能性，在心臟中它們有效地敲低miR-133和miR-1 (Care等2007 ；Yang 等2007)。其它出版物描述了由內源RNA聚合酶所轉錄並在轉染進細胞後產生特定miRNA 的質粒的用途Geng等，2002)。這兩套試劑已經用於單個miRNA的評估。
B. miR-126 根據近期將miRNA與心血管發育和疾病聯繫起來的研究，本發明人檢索了公共資料庫以尋找顯示為限制於心血管組織的miRNA。在幾個此類miRNA中，miR-U6在具有高血管組分的組織(如心臟和肺)中顯示出富集(Lagos-Quintana等，2002)。對斑馬魚miRNA 表達譜的研究也顯示miR-U6對血管系統特異(Wienholds等，2005)。
RNA印跡分析顯示miR_U6在大範圍的組織中表達，在肺和心臟中表達最多，這與之前的研究一致(Harris 等，2008 ；Lagos-Quintana 等，2002 ；Musiyenko 等，2008)。 miR-126*只檢測到痕量水平的表達(數據未顯示)。對細胞系的調查顯示miR-U6在原代人臍靜脈EC (HUVEC)和多種EC細胞系中表達，包括MS1、HAEC和EOMA細胞系，但不在SV40 轉化EC(SVEC)或非內皮細胞類型中表達。
從河豚到人(Homosapiens)中，miR_U6 (也稱為 miR-U6_3p)和
10miR-126* (miR-126-5p)是保守的(microrna. sanger. ac. uk/sequences/index, shtml)。在哺乳動物和鳥類中，由EGF樣結構域7 (Egf 17)基因的內含子7編碼miR-126和miR-126*, 所述Egf 17基因編碼EC特異性分泌肽，已有報導稱所述分泌肽是平滑肌細胞遷移的化學吸引劑和抑制劑(Campagnolo 等，2005 ；Fitch 等，2004 ；Parker 等，2004 ；Soncin 等，2003)。 miR-126在組織和細胞系中的表達譜與Egf 17的平行(Fitch等，2004 ；Soncin等，2003)，這與該miRNA加工自前體Egfl7mRNA的內含子RNA序列的結論相符。
已經鑑定了來自於多種不同生物體(小鼠、人、大鼠、狗、雞、斑馬魚、河豚)的 miR-126，它們的序列完全保守 UCGUACC⑶GAGUAAUAAUGCG (SEQ ID NO 1) C. miR-126的激動劑和拮抗劑 miR-U6的激動劑通常採用三種形式的一種。第一種是miR-126自身。這種分子可以通過如注射或輸注的方式遞送到靶細胞，任選地在如脂質(如脂質體或脂質乳劑)的遞送載體中。第二種，可以採用驅動miR-U6表達的表達載體。多種表達載體的組成和結構將在本文的其他部分描述。第三種，可以採用區別於miR-126的起上調、穩定或增強miR-126 活性功能的試劑，包括小分子。這些分子包括「模擬物」，模擬物是模擬miR-U6的功能以及有可能模擬其形式的分子，但是在化學結構上與其不同。
可以通過「拮抗miRNA(antagomir) 」實現miRNA功能的拮抗。由Kriitzfeldt及同事首先描述(Kriltzfeldt等.，2005)，拮抗miRNA是單鏈經化學修飾的核糖核苷酸，其與 miRNA序列至少部分互補。拮抗miRNA可以包含一個或更多經修飾的核苷酸，如2』 -0-甲基-糖修飾。在一些實施方案中，拮抗miRNA只包含經修飾的核苷酸。拮抗miRNA還可以包含一個或更多硫代磷酸酯連接以得到部分或全部的硫代磷酸酯骨架。為了便於體內遞送和穩定，可以在其3』端將拮抗miRNA與膽固醇部分連接。適於抑制miRNA的拮抗miRNA長度可以是約15至約50個核苷酸，長度更優選約18至約30個核苷酸，長度最優選約20至約25個核苷酸。「部分互補」是指序列與目的多核苷酸序列至少約75% ΑΟ^Αδ^ΑΟ^、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %互補。拮抗miRNA與成熟miRNA序列可以至少約75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%互補。在一些實施方案中，拮抗miRNA可以與成熟miRNA序列基本互補，即與靶標多核苷酸序列至少約95 %、96 %、97 %、98 %或99 %互補。 在另一些實施方案中，拮抗miRNA與成熟miRNA序列100%互補。
還可以通過施用反義寡核苷酸對miRNA的功能進行抑制。所述反義寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。優選地，所述反義寡核苷酸具有至少一個化學修飾。反義寡核苷酸可以包括一個或更多「鎖核酸(locked nucleic acid) 」。「鎖核酸」(LNA)是經修飾的核糖核苷酸，其在核糖部分的2』和4』碳之間含有額外的連接，導致「鎖(locked) 」構型， 其使含有LNA的寡核苷酸的熱穩定性提高。或者，反義寡核苷酸可以包含肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)，其包含基於肽的骨架而不是糖-磷酸骨架。反義寡核苷酸可以包含的其他化學修飾包括但不限於糖修飾，如2』 -0-烷基(如2』 -0-甲基、2』 -0-甲氧乙基)、 2』 -氟代，和4』硫代修飾；以及骨架修飾，如一個或更多硫代磷酸酯、嗎啉代或膦醯羧酸酯鍵(參見，例如，美國專利6，693，187和7，067，641，其通過全文引用併入本文)。在一些實施方案中，適合的反義寡核苷酸是2』 -0-甲氧乙基「間隔體(gapmer) 」，其在5』和3』端均含有2』 -0-甲氧乙基修飾的核糖核苷酸，並且中間至少有十個脫氧核糖核苷酸。這些「間隔體」能夠引發RNA靶標的RNase H依賴性降解機制。其他增強穩定性並提高有效性的反義寡核苷酸修飾(如在美國專利6，838，觀3中描述的，其通過全文引用併入本文)為本領域已知並適合用於本發明的方法中。用於抑制microRNA活性的特定反義寡核苷酸的長度為約19至約25個核苷酸。反義寡核苷酸可以包含與成熟miRNA序列至少部分互補的序列，例如，與成熟 miRNA 序列至少約 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%互補。在一些實施方案中，反義寡核苷酸可以與成熟miRNA序列基本互補，即與靶標多核苷酸序列至少約95%、96(%、97(%、98(%或99(%互補。在一個實施方案中，反義寡核苷酸包含與成熟miRNA序列100%互補的序列。
另一種抑制miR_U6功能的方法是施用抑制性RNA分子，其與成熟miR_U6序列具有至少部分序列同一性。該抑制性RNA分子可以是雙鏈、小幹擾RNA(siRNA)或包含莖環結構的短髮夾RNA分子(shRNA)。抑制性RNA分子的雙鏈區可以包含與成熟miRNA序列具有至少部分同一性的序列，如約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些實施方案中，抑制性RNA的雙鏈區包含與成熟miRNA序列至少具有顯著同一性。 「顯著同一性」是指與目的多核苷酸序列具有至少約95196197198%或99%同一性的序列。在其他一些實施方案中，抑制性RNA分子的雙鏈區可與靶標miRNA序列具有100%的同一性。
在本發明的其他一些實施方案中，miR-126的抑制劑可以是抑制性RNA分子，如核酶、siRNA或shRNA。在一個實施方案中，miR-499的抑制劑是含有雙鏈區的抑制性RNA分子，其中雙鏈區所含的序列與成熟miR-U6序列具有100%的同一性。在一些實施方案中， 抑制劑是含有雙鏈區的抑制性RNA分子，其中所述雙鏈區包含與成熟miR-U6序列具有約 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的序列。
II.血管發生，miR-126 和 Sprechl 以下報告的研究結果顯示miR_U6在體內血管發生和血管完整性的保持上具有重要作用。miR-126的作用似乎反映(至少部分地)在其對用作血管發生強力誘導劑的 VEGF和FGF下遊的MAP激酶信號轉導的增強(圖7)。作為Ras/MAP激酶通路細胞內抑制劑的Spred-I用作miR-126的抑制靶標。因此，無miR-126存在時，Spred-I表達提高，導致血管發生信號轉導的抑制。相反，miR-126的過表達緩解了 Spred-I對VEGF和FGF激活的信號轉導通路的抑制作用，利於血管發生。
與這些發現一致，EC中Spred-I的過表達削弱了血管發生和細胞遷移，與miR-126 功能喪失表型類似，而在培養的EC中，敲低Spred-I的表達增強了血管發生並挽救miR-126 功能喪失表型。有意思的是，只有miR-126+胚胎的亞組死於因血管破裂的胚胎死亡，而其他存活到成年，這表明該miRNA調控基因表達程序，而不是作為血管發生的「打開-關閉」開關。
除了在胚胎發生時的正常血管發育中必需之外，在MI後，當在梗塞部位的損傷血管引發新血管發生以恢復流向受損心肌壁的血流時，miR-U6的功能似乎很重要。在脅迫條件下，如MI後的心臟，由於需要新血管發生(neoangiogenesis)的血管發生信號，miR-126 的作用可能更加重要。關於這點，應答於心肌的局部缺血，VEGF和FGF的表達升高，這對局部缺血的心肌中側支血管的發育很關鍵(Semenza，2003)。心臟損傷除了激活臨近EC的遷移和增殖外，也導致循環的造血祖細胞歸巢到局部缺血部位並幫助心臟修復(Kocher等，2001 ；Takahashi等，1999)。miR_U6在造血幹細胞中表達，並因此可能在該細胞類群的再生功能中起作用(Garzon 等，2006 ；Landgraf 等，2007)。
A. miR-126對血管發生的控制 例如VEGF和FGF的血管發生生長因子通過激活MAP激酶通路來調節EC的增殖、 遷移和粘附，MAP激酶通路終止於細胞核以提高血管發生和血管完整性所需基因的表達。 與miR-U6功能喪失相關的異常與在EC中抑制MAP激酶信號轉導而導致的血管缺陷類似 (Hayashi 等，2004)。
與miR-U6通過阻礙Spred-I的表達而促進血管發生的結論一致，Spred-I抑制細胞運動和Mio介導的肌動蛋白再組織(Miyoshi等，2004)，這兩者是對血管發生很重要的過程。Spred-I和其他Spred家族成員作為生長因子誘導之ERK激活的膜結合抑制子起作用，並阻斷應答於生長因子信號的細胞增殖和遷移(Wakioka等，2001)。Spred蛋白質的抑制性作用通過幹擾Raf的磷酸化和激活介導，Raf是MAP激酶通路的上遊激活子。在三種 Spred蛋白質中，只有Spred-I包含miR-126的預測靶序列。儘管這些結果與Spred-I作為miR-U6促血管發生作用的中介物發揮重要作用的結論一致，但miR-126的作用有可能反映為多個調節血管發生和血管完整性的靶蛋白的聯合作用。
因此，本發明提供了在有此需要的對象中促進血管發生的方法，其包括向所述對象施用至少一種miR-126的激動劑。在一個實施方案中，所述方法還包括施用第二促血管發生劑。所述第二促血管發生劑可包括但不限於VEGF、FGF、IL-8、CCNl和Ang_2。
在另一個實施方案中，本發明提供了在細胞中調控MAP激酶信號轉導的方法，其包括將細胞與至少一種miR-U6活性調節劑相接觸。在一些實施方案中，在與miR-U6拮抗劑接觸的細胞中MAP激酶信號轉導降低。在另一些實施方案中，在與miR-U6激動劑接觸的細胞中MAP激酶信號轉導增強。在一個實施方案中，所述細胞是內皮細胞。在另一個實施方案中，所述細胞是造血幹細胞。
B. miR-126的生物發生 根據miR-U6和Egfl7mRNA的共表達，以及本發明人對miR_U6產生自Egfl7前體mRNA亞群中保留內含子的發現(未發表數據)，本發明人得出了 miR-U6來自Egf 17前體mRNA的結論。儘管具有獨立於其宿主基因轉錄的內含子miRNA，但是至今為止發現的所有這些miRNA均轉錄自mRNA的相對鏈，這與miR_U6和Egfl7mRNA相反。此外，內皮特異性表達需要Ets結合位點，但在Egfl7基因的內含子7中沒有這類位點。
最近，已有報導稱Egf 17敲除小鼠顯示出與miR-126無效小鼠極其類似的血管異常(khmidt等，2007)。已有報導稱這些小鼠中的缺失突變導致Egfl7轉錄本的缺乏，這提示miR-126的表達也被阻止。然而，沒有檢測miR-126的表達。因此，這些突變體小鼠的表型真實地反映miR-U6功能喪失的可能性有待考察。
日益明顯的是，miRNA整合進蛋白質編碼基因的內含子代表了 miRNA的表達和調節性功能與蛋白質表達基因相互協調的普遍機制。作為這類共調節的另一個實例，本發明人之前提出，由α-肌球蛋白重鏈(MHC)基因的內含子編碼的miR-208在調控網絡中用於控制心臟脅迫應答(van Rooij等，2007)。miRNA併入組織特異性基因的內含子為確保 miRNA與其所調控的基因程序的共調節提供了有效機制。
III.治療疾病狀態的方法 本發明提供了通過向對象施用miR_U6激動劑或拮抗劑來治療多種疾病狀態的方法。出於本申請的目的，治療包括減少與以下討論的疾病狀態相關的一個或更多症狀。任何水平的改善都視為治療，並且對改善的具體水平或「治癒」沒有要求。如果症狀穩定，即疾病狀態沒有惡化，對於治療也是足夠的。
本發明提供了促進血管完整性和/或血管修復的方法，其包括向患有血管病症的對象施用miR-U6功能的激動劑。所述血管病症可以包括但不限於心肌梗死、缺血再灌注損傷、狹窄、纖維化、血管外傷以及血管滲漏。
A.損害血管完整性和/或導致需要血管修復的病症 如以上所討論的，本發明提供了 miR_U6激動劑用於改善血管組織完整性以及在損傷(包括缺血損傷)後促進血管修復和新血管形成(neovascularization)的用途。尤其考慮用本發明治療以下疾病狀態/病症，但這些不是限制性的。
治療方案會根據臨床情況而變化。然而，在大部分情況下，似乎適合長期維持治療。也可能需要用miR-U6的調節劑間歇地治療血管病症，如在疾病發展的短暫窗口期內。
心肌梗死。在供向部分心臟的血液供給受阻時發生心肌梗死(Myocardial infarcti0n，MI)。這通常是由於易損的動脈粥樣硬化斑塊破裂後的冠狀動脈閉塞(阻塞)， 所述動脈粥樣硬化斑塊是動脈壁上脂類(如膽固醇)和白細胞(尤其是巨噬細胞)的不穩定集合體。如果在足夠長的時間內沒有治療，所導致的缺血(血液供應受限)和氧氣缺乏可造成心臟肌肉組織(心肌)的損傷和/或死亡(梗死)。
急性心肌梗死(AMI)的典型症狀包括突發胸痛(通常波及到左臂或脖子的左側)、 呼吸急促、噁心、嘔吐、心悸、流汗和焦慮(通常描述為末日將近的感覺)。女性發生的典型症狀可能比男性少，最普遍的是呼吸急促、虛弱、消化不良感和疲勞。所有心肌梗死中大約四分之一是無症狀的，沒有胸痛或其他症狀。心臟病發作是醫療緊急事件，建議發生胸痛的人通知其緊急醫療機構，因為迅速地治療是有利的。
對疑似急性心肌梗死的立即治療包括氧氣、阿司匹林以及舌下施用三硝酸甘油 (口語中稱為硝化甘油並簡寫為NTG或GTN)。經常還給予疼痛緩解劑，典型的是硫酸嗎啡。 患者將接受多種診斷檢測，如心電圖(ECG、EKG)、胸部X光透視和檢查心臟標記物升高的血液檢測(檢查心肌損傷的血液檢測)。最經常採用的標記物是肌酸激酶-MB (CK-MB)級分和肌鈣蛋白I(TnI)或肌鈣蛋白T(TnT)水平。基於ECG，區分ST段抬高心肌梗死(STEMI)或非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)。大部分STEMI病例用溶栓進行治療，或者，如果可能，用經皮冠狀動脈介入(PCI，血管成形術和支架植入)進行治療，只要醫院有冠狀動脈造影設備。 NSTEMI用藥物治療，儘管在入院時經常實施PCI。在具有多個阻塞並相對穩定的患者中，或在少數極端緊急的病例中，對阻塞的冠狀動脈進行搭橋手術是一種選擇。
缺血再灌注損傷。至少部分缺血再灌注損傷是由於損傷組織的炎性應答。被新返回的血液輸送到區域中的白細胞應答於組織損傷而釋放大量炎性因子(例如白細胞介素) 以及自由基。恢復的血流將氧重新引入細胞，其損傷細胞蛋白質、DNA和細胞膜。繼而，細胞膜的損傷可導致更多自由基的釋放。這些活性反應成分也可以在氧化還原信號中間接作用以啟動凋亡。白細胞也可能在小毛細血管中堆積、阻塞毛細血管並導致進一步的缺血。
再灌注損傷在腦的缺血級聯反應中起作用，所述級聯反應在中風和腦損傷中涉及。還認為缺血與再灌注損傷的重複發作是導致慢性創傷(如褥瘡和糖尿病性足部潰瘍)
14形成和不能癒合的因素。持續的壓力限制血液供應並導致缺血，而在再灌注過程中發生炎症。當此過程重複時，其最終會損傷組織以致形成創傷。
已經在研究來源於超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和小麥醇溶蛋白的膳食補充物Glisodin緩解缺血再灌注損傷的能力。對作為心臟手術常見程序的主動脈夾閉(aortic cross-clamping)的研究證明了很大的潛在益處，進一步研究正在進行中。
狹窄。狹窄是血管或其他管狀器官或結構的異常變窄。血管類型的狹窄常伴隨著流經狹窄血管的湍流引起的噪音(雜音)。可通過聽診器聽到該雜音。其他或更可靠的診斷狹窄的方法是影像方法，包括超聲、磁共振成像/磁共振血管造影、計算機斷層照相/CT-血管造影，其將解剖學成像(即血管的可見狹窄)與血流現象的顯示(使體液通過身體結構的運動可視化)相組合。血管狹窄包括間歇性跛行綜合症(外周動脈狹窄)、心絞痛(冠狀動脈狹窄)、易於導致中風和短暫腦缺血發作的頸動脈狹窄和腎動脈狹窄。
其他病症。可以用miR_U6或其激動劑治療的病症還有外傷和血管滲漏。
風險。本發明還設想治療具有任何上述疾病狀態風險的對象。這些對象可包括那些患纖維化、高血壓、心肌肥厚、骨質疏鬆、神經退變和/或呼吸窘迫的人。
B.病理性新血管形成 如以上所述，本發明提供miR-126的拮抗劑用於阻止導致或有助於疾病發生的新血管形成的用途。尤其設想根據本發明的治療用於以下疾病狀態/病症，但不限制於此。
本發明提供在有此需要的對象中抑制病理性血管形成的方法，其包括向對象施用 miR-126的拮抗劑。與病理性血管形成相關的病症包括但不限於動脈粥樣硬化、視網膜病、 癌症和中風。
早期動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化是影響動脈血管的疾病。其是動脈壁上的慢性炎性應答，很大程度上是由於在功能性高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL) 沒有從巨噬細胞充分去除脂肪和膽固醇的情況下巨噬細胞類白細胞的積累，並且由低密度 (尤其是小顆粒)脂蛋白(攜帶膽固醇和甘油三酯的血漿蛋白質)所促進。其通常被稱為動脈「硬化」。是由於動脈內多個斑塊的形成所導致的。
動脈粥樣硬化由低密度脂蛋白膽固醇(LDL) ( 口語中成為「壞膽固醇」)發展而來。 當該脂蛋白通過動脈壁時，氧自由基與其反應形成氧化-LDL。身體的免疫系統通過派遣專門的白細胞(巨噬細胞和T淋巴細胞)吸收氧化-LDL來應答。但是，這些白血細胞不能處理氧化-LDL，並最終漲大並破裂，將更大量的氧化膽固醇沉積入動脈壁。這誘發了更多的白細胞，並繼續此循環。最終，動脈發炎。膽固醇斑使肌細胞增大並在所影響的區域形成硬蓋。此硬蓋導致動脈的狹窄，減少血流並使血壓升高。
動脈粥樣硬化通常起始於青春期早期，並經常在大部分主動脈中發現，但其是無症狀的並且在一生中不能被大部分診斷方法所檢測到。緊鄰急性動脈粥樣硬化前的階段稱為亞臨床動脈粥樣硬化。最常在幹擾供應心臟的冠脈循環或供應腦的腦循環時成為嚴重的症狀，一般來講，認為其是導致中風、心臟病發作、多種心臟病包括充血性心力衰竭和大部分心血管疾病的最重要原因。手臂中或者更常見於腿部動脈中的導致血流減少的粉瘤 (atheroma),稱為夕卜周雲力脈閉塞性疾病(peripheral artery occlusive disease, PA0D)。 大部分動脈血流中斷事件發生於具有少於50%腔變窄(平均 20%狹窄)的位置。
儘管此病程傾向於在數十年內緩慢進展，但是其通常保持為無症狀直到粉瘤阻礙了動脈中的血流。這通常是粉瘤的破裂，形成凝塊和腔內凝塊的纖維組織化，覆蓋破裂但仍產生狹窄，或者隨著時間以及重複破裂後，導致持久的通常是局部的狹窄。狹窄可以是緩慢進展的，而斑塊破裂是突發事件，其尤其發生在具有較薄/較弱的已變得「不穩定」的纖維帽的粉瘤中。
隨著時間產生大多數狹窄的過程如下，未引發整個腔閉塞的重複斑塊破裂與破裂上的凝塊補片和穩定該凝塊的癒合應答相組合。狹窄區域傾向於變得更穩定，儘管在這些狹窄區血流速度增加。絕大部分血流停止事件發生於大的斑塊，其在破裂前產生非常少的狹窄(如果有的話)。
根據臨床試驗，隨後破裂導致完全的動脈封閉的斑塊處狹窄平均為20%。大部分嚴重的臨床事件不發生在產生高程度狹窄的斑塊。根據臨床試驗，只有14%的心臟病發作由在血管封閉之前產生75%或更多狹窄的斑塊處的動脈封閉產生。
如果將軟的粉瘤與動脈血流分開的纖維蓋破裂的話，則暴露並釋放組織片段，血液進入壁內的粉瘤，並且有時導致粉瘤大小的突然膨脹。組織片段非常促進凝塊形成，其含有膠原蛋白和組織因子；它們激活血小板並激活凝血系統。結果是形成覆蓋粉瘤的血栓 (血液凝塊)，其嚴重地阻礙血流。隨著血流的阻礙，下遊組織缺乏氧和養分。如果這發生在心肌，則會產生心絞痛(心部胸痛)或心肌梗死(心臟病發作)。
如果動脈粥樣硬化導致症狀，則可治療一些症狀例如狹心痛。非藥物手段通常是治療的第一方法，如戒菸和經常進行運動。如果這些方法不奏效，藥物通常是治療心血管疾病的下一步驟，並且隨著改進，其越來越多地成為長期內最有效的方法。然而，藥物通常因它們的價格、專利控制和偶發的不利作用而受批評。
通常，稱為他汀類(statins)的一組藥物是最常用的並最廣泛地被用於治療動脈粥樣硬化。它們具有相對較少的短期或長期不利副作用，並且多個比較性治療/安慰劑試驗相當一致地顯示，在臨床試驗中其在降低動脈粥樣硬化疾病「事件」中有很好的作用並具有通常 25%的比較性死亡率降低，儘管一項研究設計(ALLHAT)不是十分有利。
通過IVUS (血管內超聲評估)，最新的他汀——羅舒伐他汀(rosuvastatin)首先證實消退冠狀動脈中的動脈粥樣硬化斑塊。進行該研究證明了在患活躍期/有症狀疾病的人中2年的時間段內主要針對動脈粥樣硬化體積的作用(心絞痛頻率也顯著降低)，而非對預計需要更長試驗時間的整體臨床結果的作用；這些更長期的試驗仍在進行中。
然而對於大部分人，將它們的生理行為從通常高風險變為極大降低的風險需要無限期地每天服用幾種化合物的組合。越來越多的人治療試驗已完成以及正在進行，其證明採用更複雜和有效的治療方案對這些人的結局有改善，所述治療方案將生理行為模式改變為更近似於人在脂肪條紋開始形成之前的童年時期所顯示的。
視網膜病。視網膜病是表示眼部視網膜一些非炎性損傷形式的通用術語。最常見的是血液供應問題導致此病症的形成。視網膜病經常是全身性疾病的眼部表現。視網膜病在眼底檢查時由驗光師或眼科學家所診斷。治療取決於疾病的成因。
視網膜病的主要原因是糖尿病-糖尿病性視網膜病；高動脈壓-高血壓性視網膜病；新生兒早熟-早熟視網膜病(retinopathy of prematurity, R0P)；鐮刀形紅細胞白血病；遺傳性視網膜病；直接陽光暴露-陽光視網膜病；醫藥產品-藥物相關視網膜病；以及視網膜靜脈或動脈閉塞。視網膜病的很多類型是進展性的並可導致失明或嚴重視覺喪失或損傷，尤其是如果影響了角膜斑翳。
中風。中風是由於向腦供血的血管障礙導致的快速發生的腦功能喪失。這可以是因為由血栓形成或栓塞導致的缺血(血液供應缺乏)，或由於出血。如果不迅速診斷並治療，其可導致永久性神經損傷、併發症和死亡。中風的風險因素包括高齡、高血壓(血壓高)、中風病史或短暫性腦缺血發作(transient ischemic attack，TIA)、糖尿病、高膽固醇、吸菸、心房纖維性顫動、含雌激素形式的激素避孕、有先兆的偏頭痛、和血栓形成傾向 (血栓形成的傾向)、卵圓孔未閉和幾種罕見疾病。高血壓是最重要的可變中風風險因素。
世界衛生組織在1970年間提出的中風的傳統定義為「持續超過M小時或在M 小時內致死的腦血管神經功能缺損」。該M小時限制將中風與短暫性腦缺血發作區分，短暫性腦缺血發作是在M小時內完全消退的中風症狀的相關症候群。隨著在早期給予時可減輕中風嚴重程度的治療的獲得，許多人現在更願採用替代性概念，如腦中風發作(brain attack)和急性缺血性腦血管症候群(分別取自心臟病發作和急性冠狀動脈症候群)，其反映了中風症狀的緊急性和快速處理的需要。
有時將中風與溶栓(「去除凝塊」)一起治療，但是通常伴隨支持性治療(如物理療法或工作療法)以及用抗血小板藥物(阿斯匹林和經常用的潘生丁)、血壓控制、他汀類和抗凝劑的二級預防(在選定的患者中)。
可以將中風分為兩個主要類型缺血性和出血性。缺血性的是由於供血的中斷，而出血性是由於血管或異常血管結構的破裂。80%的中風是由於缺血；剩餘的是由於出血。
在缺血性中風中，對部分腦的供血減少，導致該區域腦組織的功能障礙和壞死。這種情況的產生原因有4個血栓形成(由局部形成的血液凝塊導致的血管阻礙)、栓塞(同上，由於來自身體其他部位的栓塞，參見下述)、全身性灌注不足(供血的總體下降，例如休克中)和靜脈血栓形成。無明顯解釋的中風稱為「隱源性」(原因未知)。
在血栓形成性中風中，通常在粥樣硬化斑塊周圍形成血栓(血液凝塊)。由於動脈是逐漸堵塞的，有症狀的血栓性中風的發作更慢。如果血栓破裂，血栓自身(即使未遮蔽血管)可導致栓塞中風(見下文)，此時稱其為「栓塞」。血栓形成性中風可根據形成血栓的血管類型分為兩類-大血管病或小血管病。
栓塞型中風是指栓塞對動脈的阻塞，栓塞是源自別處的在動脈血流中運動的顆粒或碎片。栓塞最常見的是血栓，但是還可以是一些其他物質，包括脂肪(例如，來自斷骨中的骨髓)、氣體、腫瘤細胞或細菌團(通常來自感染性內心膜炎)。由於栓塞來自於別處，局部治療只臨時解決問題。因此，必須鑑定栓塞的來源。由於栓塞堵塞是突然發生的，症狀通常在開始時就是最嚴重的。症狀也可以是暫時的，因為栓塞被部分再吸收以及運動到不同的位置或者完全分散。栓塞最常見產生自心臟(尤其在心房纖維性顫動中)，但也可來源於動脈樹的其他位置。在反常栓塞(paradoxical embolism)中，深靜脈血栓栓塞通過心臟中房間隔缺損或室間隔缺損進入腦。
心臟起因可分為高和低風險 高風險心房纖維性顫動和陣發性心房纖維性顫動，二尖瓣風溼性疾病或主動脈瓣疾病，人工心臟瓣膜，心房或心室的已知心臟血栓，病態竇房結症候群，持久的心房撲動， 近期的心肌梗死，慢性心肌梗死並且射血分數< 觀％，有症狀的充血性心力衰竭並且射血分數< 30%，擴張性心肌病，Libman-Sacks心內膜炎，Marantic心內膜炎，感染性心內膜炎，乳頭狀彈性纖維瘤，左心房粘液瘤和冠狀動脈搭橋(coronary artery bypass graft, CABG)手術。
低風險/潛在二尖瓣環的鈣化，卵圓孔未閉(patent foramen ovale，PF0)，房間隔動脈瘤，具有卵圓孔未閉的房間隔動脈瘤，無血栓的左心室動脈瘤，超聲波心動描記法中分離的左心房「煙霧狀」(無二尖瓣狹窄或心房纖維性顫動)，升主動脈或近端拱(proximal arch)的複雜粉瘤。
全身性灌注不足是身體的所有部分血流減少。最經常是由於心動停止或心律失常導致的心臟泵功能衰竭，或由於心肌梗塞、肺栓塞、心包積液或出血導致的心臟輸出降低。 低氧(血液氧含量低)可促成灌注不足。由於血流減少是全身性的，腦的所有部分都可受影響，尤其是「水源」區域-由主要腦動脈供血的邊界區區域。流向這些區域的血流不一定停止，而是可能減少到腦損傷發生的程度。此現象也可被稱為「最後的草場」，這是指在灌溉中最後的草場得到最少量的水。
腦靜脈竇血栓由於局部靜脈壓的增加而導致中風，增加的局部靜脈壓超過了動脈產生的壓力。梗死更有可能導致缺血性轉化(血液向受損區域滲漏)而不是其他類型的缺血性中風。
缺血性中風是由於阻塞腦動脈的血栓(血液凝塊)，當發現這種類型的中風時，根據原因，給予患者抗血小板藥物(阿斯匹林、氯吡格雷、潘生丁)或抗凝結藥物(華法令)。 必須用醫學影像排除出血性中風，因為這種治療對出血性中風患者有害。
在中風中保護腦的其他即時措施包括確保血糖儘可能地正常(如在已知的糖尿病患者開始進行胰島素按比例增減(sliding scale))，並且使中風患者得到充分的氧和靜脈流體。可以放置患者以使他或她的頭部在擔架上水平，而不是坐起，因為研究顯示這增加到腦的血流。缺血性中風的另外療法包括阿斯匹林(每天50至325mg)，氯吡格雷(每天 75mg)和阿斯匹林和潘生丁的組合的緩釋O5/200mg，每天兩次)。
在中風後血壓立即提高是常見的。研究顯示儘管高血壓導致中風，但是這在緊急情況下實際上是有利的，其使血更好地流往大腦。
如果研究顯示為頸動脈狹窄，並且患者在受影響一側有殘留功能，則若在中風後快速實施頸動脈內膜切除術(手術去除狹窄)，可降低復發的風險。
如果中風是具有心源性栓塞的心律失常的結果，則治療心律失常並用華法令或高劑量阿斯匹林抗凝血可降低復發的風險。根據CHADS/CHADS2系統確定對普通心律失常、心房纖維性顫動的中風預防治療。
在越來越多的中風初級處理中心，採用藥物組織纖溶酶原激活劑(tPA)的藥理性溶栓(「凝塊破裂」)用於溶解凝塊並解除動脈阻礙。然而，在急性中風中採用tPA是有爭議的。對急性缺血性中風的另一種幹預是直接去除侵害性血栓。這通過向股動脈插入導管， 將其導入腦循環，並採用螺旋鑽樣裝置套住凝塊，然後將凝塊從身體中取出來實現。抗凝血可預防中風復發。在患非瓣膜心房纖維性顫動的患者中，抗凝血可減少中風60%，而抗血小板劑可減少中風20%。然而，近期的元(meta)分析顯示在栓塞性中風後過早抗凝血是有害的。
癌症。癌症包含一類疾病，其中一組細胞顯示失控的生長(分裂超出了正常限制)、侵襲(侵入並破壞鄰近組織)以及有時發生轉移(通過淋巴或血液擴散到身體的其他
18位置)。癌症的這三個惡性特徵將他們與良性腫瘤區分，良性腫瘤是自限性的，不侵襲或轉移。大部分癌症形成腫瘤但是一些癌症不會，如白血病。涉及癌症研究、診斷、治療和預防的醫學分支是腫瘤學。
幾乎所有的癌症都是由轉化細胞的遺傳物質異常引起的。這些異常可能是由於致癌物的影響，如吸菸、放射、化學物或感染性物質。其他促成癌症的遺傳異常可能在DNA複製錯誤中隨機地獲得，或者是遺傳的，並因而在出生時的所有細胞中存在。癌症的遺傳性通常受致癌物和宿主基因組複雜相互作用的影響。已越來越多地認識到癌症發病機理遺傳學的新方面的重要性，如DNA甲基化和微RNA。
診斷通常需要病理學家對組織活檢樣本進行組織學檢查，儘管起初的惡性指徵可能是症狀或放射照相的異常。根據具體的類型、部位和階段，大部分癌症可被治療，一些可治癒。一旦被診斷，通常用手術、化學療法和放射療法的組合治療癌症。
放射療法(也稱為放療、X-射線治療或輻射)是用電離輻射殺死癌症細胞並縮小腫瘤。放射治療可通過體外放射治療(external beam radiotherapy,EBRT)在外部施用或通過近距放射治療在內部施用。放療可用於治療幾乎每一種類型的實體瘤，包括腦、胸、子宮頸、喉、肺、胰、前列腺、皮膚、胃、子宮或軟組織肉瘤癌症。放療也可用於治療白血病和淋巴瘤。對每個位點的放療劑量取決於多個因素，包括每個癌症類型的放射敏感性以及是否在附近存在可被放射損傷的組織和器官。因此，像每種形式的治療一樣，放射治療不是沒有副作用的。
化學療法是用可損傷癌細胞的藥物治療癌症。在目前的應用中，術語「化學療法」 通常指普遍影響正在快速分裂的細胞的細胞毒藥物，其與靶向治療相對(見以下所述)。 化學療法藥物以多種可能的方式幹擾細胞分裂，如幹擾DNA複製或新形成染色體的分離。 大部分形式的化學療法靶向所有快速分裂細胞並不對癌細胞有特異性，儘管其由於下述原因可具有一定程度的特異性許多癌細胞無法修復DNA損傷，而正常細胞通常可以。因此，化學療法有損傷健康組織的可能，尤其是具有高更新速度的那些組織(例如，腸內層 (intestinal lining))。這些細胞通常在化學療法後自我修復。因為一些藥物聯用時比單獨使用效果更好，所以經常同時給予兩種或更多種藥物。這稱為「聯合化學療法」，並且事實上，大部分化學療法方案是以組合給出的。
靶向治療最早在1990年代末期出現，它對一些類型的癌症治療有顯著的影響，並且是目前非常活躍的研究領域。靶向治療使用對癌細胞失調蛋白質具有特異性的藥劑。小分子靶向治療藥物通常是癌細胞中突變、過表達或其他關鍵蛋白質中酶結構域的抑制劑。 著名的實例是酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼和吉非替尼。
單克隆抗體治療是另一種策略，其中治療劑是與癌細胞表面蛋白質特異結合的抗體。實例包括在乳腺癌中採用的抗HER2/neU抗體曲妥珠單抗(赫賽汀)以及在多種B細胞惡性腫瘤中採用的抗CD20抗體利妥昔單抗。
靶向治療還可涉及小肽作為「歸巢裝置」，其可與細胞表面受體結合或影響腫瘤周圍的細胞外基質。連接到這些肽上的放射性核素(如RGD)如果在癌細胞周圍衰變的話，則最終殺傷細胞。這些結合基序的寡聚體或多聚體尤其受到關注，因為其可導致腫瘤特異性和親和性的增加。
光動力治療(photodynamic therapy,PDT)是涉及光敏劑、組織氧和光(通常採用雷射)的三重性癌症治療。PDT可用於治療基底細胞癌(basal cell cancer, BCC)或肺癌； PDT還可用於去除手術切除大型腫瘤後的微量惡性組織。
癌症的免疫治療表示設計成誘導患者自身的免疫應答來抵抗腫瘤的一類多種多樣的治療策略。目前用於產生針對腫瘤的免疫應答的方法包括對淺表性膀胱癌的膀胱內 BCG免疫治療，以及採用幹擾素或其他細胞因子在腎細胞癌和黑素瘤患者中誘導免疫應答。 產生特異免疫應答的疫苗是針對多種腫瘤的大量研究的主題，特別是惡性黑素瘤和腎細胞癌。Sipulencel-T是處於後期臨床研究的針對前列腺癌的類疫苗策略，其中在來自患者的樹突細胞中裝載前列腺酸性磷酸酶肽以誘導對前列腺來源細胞的特異性免疫應答。
可認為異體造血幹細胞移植(來自遺傳學不同供體的「骨髓移植」)是免疫治療的一種形式，因為在已知的移植物對抗腫瘤作用現象中，供體的免疫細胞經常會攻擊腫瘤。因此，對於幾種癌症類型，異體HSCT與自體移植相比具有更高的治癒率，儘管副作用也更嚴重。
可通過提供或阻斷某些激素來抑制一些癌症的生長。激素敏感腫瘤的常見實例包括一些類型的乳腺和前列腺癌。去除或阻斷雌激素或睪酮通常是重要的額外治療。在一些癌症中，施用激素激動劑(如孕激素)可對治療有利。
血管發生抑制劑阻止腫瘤存活所需的血管大量生長(血管發生)。它們中的一些 (如貝伐單抗)已被批准且正在臨床應用。抗血管發生藥物的一個主要問題是在普通細胞和癌症中，許多因素刺激血管生長。抗血管發生藥物只靶向一個因素，因此其他因素繼續刺激血管生長。其他問題包括給藥途徑、穩定性和活性的保持以及對腫瘤血管系統的靶向。
風險。本發明還設想治療具有任何上述疾病狀態風險的對象。這些對象包括患動脈粥樣硬化、肥胖症、哮喘、關節炎、牛皮癬和/或失明的人。
C.聯合治療 在另一個實施方案中，預計將miR-126的調節劑與其他治療形式組合使用。因此， 除以上所述的治療外，還可對患者提供更多的「標準」藥物治療。組合可通過將細胞、組織或對象與單一組合物或包含兩種藥劑的藥物製劑接觸來實現，或者通過將細胞與兩種不同的組合物或製劑同時接觸來實現，其中一種組合物包含表達構建體，另一個包含藥劑。或者，採用miR-U6調節劑的治療可在施用其他藥劑之前或之後間隔幾分鐘至幾周進行。在其他藥劑和表達構建體分開施用到細胞的實施方案中，通常確保每次遞送之間的時間段不太長，以使藥劑和表達構建體仍能在細胞、組織或對象中發揮有力的組合作用。在這些情況下，預計通常應將細胞與兩種形式在約12-24小時的時間間隔內接觸，更優選地，在約6-12 個小時的時間間隔內，最優選延遲時間僅約12小時。然而在一些情況下，理想的是顯著延長治療時間間隔，在各個施用之間間隔幾天0、3、4、5、6或7)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或 8)。
另外可預計，將需要多於一次的miR_U6調節劑或其他藥劑的施用。為此，可採用多種組合。例如，當miR-126的調節劑為「A」，另一種藥劑為「B」時，下列基於3和4次總施用的排列是示例性的 A/'KB/%/BB/'KA/%/BB/%'KA/%/BB/7B/%'KB/%%/B A/7A//BA/%7A//BA/%%'KB/%%B/%%/AB/%/BB/%'K A/%%/BB/%%A/%'KA/%'KA//BB/7A//BB/%/B 同樣設想了其他組合。
D.藥物治療劑 本領域技術人員公知藥物治療劑和給藥方法、劑量等(參見如，「I^hysicians Desk Reference,，，Klaassen "The Pharmacological Basis of Therapeutics,，，「Remington's Pharmaceutical Sciences,，，禾口"The Merck Index,Eleventh Edition,，，,相關部分通過弓| 用併入本文)，並可參考本文的公開內容與本發明向結合。根據接受治療的對象的情況會對劑量進行一些必要的變更。在任何情況下，負責給藥的人員應確定對單個對象的適合劑量， 並且這種對象確定在本領域普通技術人員的技術範圍內。
可用於本發明的藥物治療劑的非限制性實例包括抗高脂蛋白劑、抗動脈粥樣硬化劑、抗血栓形成/溶纖劑、凝血劑、抗心律失常劑、抗高血壓劑、血管收縮劑、充血性心力衰竭的治療劑、抗心絞痛劑、抗菌劑或其組合。還設想將以上IIIA-B部分討論的藥劑/療法與miR-U6調節劑相組合。
E.治療的調節 本發明還設想在治療後除去或清除miR_U6激動劑或拮抗劑的方法。該方法可包括在靶組織中過表達miR-U6拮抗劑的結合位點。在另一個實施方案中，本發明提供了在治療後除去或清除miR-126的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在靶組織中過表達 miR-126的結合位點區域。所述結合位點區域優選地包含miR-U6種子區序列。在一些實施方案中，結合位點可包含來自miR-U6 —個或更多靶標(Spred-I)的3』 UTR的序列。在另一個實施方案中，可以在miR-U6後施用miR-U6拮抗劑以減弱或停止miRNA的功能。
F.藥物製劑和施用給患者的途徑 當設想臨床應用時，會將藥物組合物製備成適於預定應用的形式。一般而言，這要求製備的組合物基本無熱原並且沒有其他會對人和動物造成損害的雜質。
一般需要使用適合的鹽和緩衝液以使遞送載體穩定並允許被靶細胞所攝入。當將重組細胞引入患者中時也會利用緩衝液。本發明的含水組合物包含有效量的載體或細胞， 其溶解或分散在可藥用載體或含水基質中。用詞「可藥用」或「藥理學可接受」是指當施用給動物或人時，不產生不利的、過敏的或其他不理想反應的分子實體和組合物。如本文所用，「可藥用載體」包括可用於製備藥物(例如適於施用給人的藥物)的溶劑、緩衝液、溶液、 分散基質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲或延遲吸收劑等。這些介質和試劑用於藥物活性物質的用途是本領域公知的。除非任何傳統介質或試劑與本發明活性成分不相容，否則考慮將其用於治療組合物中。只要不使組合物的載體或細胞失活，也可在組合物中併入補充性活性成分。
本發明的活性化合物可以包含經典的藥物製劑。可通過任何常見途徑進行本發明這些組合物的施用，只要通過這些途徑可抵達靶組織。這包括口服、鼻內或口含。或者，可通過真皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈內注射施用，或通過直接注射入心臟組織施用。這些組合物通常以可藥用組合物的形式施用，如以上所述。
活性化合物還可腸胃外或腹膜內施用。例如，游離鹼或可藥用鹽形式的活性化合物溶液可在適當地與表面活性劑(例如羥丙基纖維素)混合的水中製備。也可在甘油、液體聚乙二醇和其混合物以及在油中製備分散體系。在正常的儲藏和使用條件下，這些製劑通常包含防腐劑以防止微生物的生長。
適於注射用途的藥物形式包括，例如，無菌水溶液或懸液和用於臨時製備無菌注射溶液或懸液的無菌粉末。一般地，這些製劑是無菌的，並且為易於注射程度的流體。製劑在製造和儲存條件下應是穩定的，並且應針對抗微生物(如細菌和真菌)汙染作用進行保存。適合的溶劑或分散介質可包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，適合的其混合物，以及植物油。可以通過使用包衣(如卵磷脂)，就分散體系的情況來說通過維持所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑，來維持合適的流動性。預防微生物的作用可通過多種抗菌劑和抗真菌劑來實現，如苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，優選包括等滲劑，如糖或氯化鈉。注射組合物的延長吸收可通過在組合物中使用延遲吸收劑來實現，如單硬脂酸鋁和明膠。
可通過根據需要將適當量的活性化合物和任何其他成分(例如以上列舉的)併入溶劑中，然後過濾除菌，來製備無菌注射用溶液。一般地，通過將多種無菌活性成分併入包含有基本分散基質和其他所需的成分(如以上列舉的)的無菌載體中來製備分散劑。對於用於製備無菌注射用溶液的無菌粉末的情況，優選的製備方法包括真空乾燥和冷凍乾燥技術，其從預先過濾除菌的溶液中產生活性成分及任何額外所需成分的粉末。
對於口服施用，本發明的多肽通常可與賦形劑合併，並且以非食用的漱口水和潔牙劑的形式使用。可通過將所需量的活性成分整合入適合的溶劑(如硼酸鈉溶液(Dobell 溶液))中來製備漱口水。或者，可將活性成分合併入含有硼酸鈉、甘油和碳酸氫鈉的抗菌洗液中。活性成分也可分散在潔牙劑中，其包括凝膠、膏劑、粉劑和漿劑。可將治療有效量的活性成分加入牙膏中，其中可包含水、粘合劑、磨料、調味劑、起泡劑和溼潤劑。
本發明的組合物通常可製備成中性或鹽形式。可藥用鹽包括，例如，源自無機酸 (如鹽酸或磷酸)或有機酸(如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成鹽(通過蛋白質的游離氨基形成)。以蛋白質的游離羧基形成的鹽也可源自無機鹼(如鈉、鉀、銨、鈣、鐵的氫氧化物)或有機鹼(如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等)。
製備後，溶液優選以與製劑相容的方式並且以治療有效的量施用。製劑可以多種劑型方便地施用，如注射用溶液、藥物釋放膠囊等。例如對於在水溶液中的腸胃外施用，通常該溶液被合適地緩衝並且稀釋溶液使其等滲，例如採用足夠的鹽水或葡萄糖。這些含水溶液可用於，例如，靜脈內、肌內、皮下和腹膜內施用。優選地，如本領域技術人員已知的， 尤其是在本發明公開內容的啟發下，可採用無菌含水基質。例如，單次劑量可溶解在Iml 的等滲NaCl溶液中，並加到IOOOml皮下輸注流體中或注射到預定的輸注位置(參見，例如，「Remington' s Pharmaceutical Sciences"第 15 版，1035-1038 和 1570-1580 頁)。 根據接受治療的對象的情況會對劑量進行一些必要的變更。在任何情況下，負責給藥的人員會確定對單個對象的適合劑量。此外，對於人的給藥，製劑應符合FDA生物製品標準要求的無菌性、熱原性、普遍安全性和純度的標準。
IV.藥盒 本文所述的任何組合物可包含在藥盒中。在一個非限制性實例中，將單獨的miRNA 調節劑(例如，miRNA、表達構建體、拮抗miRNA)包含在藥盒中。所述藥盒還可包含水和雜交緩衝液以便於miRNA兩條鏈的雜交。所述藥盒還可包含一種或更多種轉染試劑以便於將 miRNA遞送到細胞。
藥盒的組分可包裝在含水基質中或以冰凍乾燥的形式包裝。藥盒的容器裝置通常包括至少一個小管、試管、燒瓶、小瓶、注射器或其他容器裝置，組分可放入其中，優選地其為合適分裝的。當藥盒中存在多於一種成分時(標記試劑和標記物可包裝在一起)，所述藥盒通常還包含第二、第三或其他額外的容器，其中分別放置額外的組分。然而，在一個管中可包含組分的多種組合。本發明的藥盒通常還包括含有核酸的裝置，以及其他任何密封的試劑容器以用於銷售。這些容器可包括注射或吹塑塑料容器，其中裝有所需的管。
當在一種和/或更多種液體溶液中提供藥盒的組分時，液體溶液為水溶液，尤其優選無菌水溶液。
然而，藥盒的組分可以乾粉形式提供。當試劑和/或組分以乾粉形式提供時，可通過加入合適的溶劑重構乾粉。設想溶劑可在另外的容器裝置中提供。
容器裝置通常包括至少一個小管、試管、燒瓶、小瓶、注射器和/或其他容器裝置， 其中放置核酸製劑，優選地，其被恰當地分配。藥盒還可包含第二容器裝置用於包含無菌的，可藥用緩衝液和/或其他稀釋液。
本發明的藥盒還通常包含用於將小瓶密封以銷售的裝置，例如，注射和/或吹塑塑料容器，其中裝有所需的管。
這些藥盒還可包含保護或維持miRNA或使其免於降解的成分。這些成分可無 RNase或保護其受RNase作用。這些藥盒通常包括在合適的工具中的對每個單獨的試劑或溶液的分別的容器。
藥盒還包括使用藥盒組分及使用其他任何未包含在藥盒中的試劑的說明書。說明書中可包含可實施的變化。
這些試劑包含在本發明藥盒的實施方案中。然而，這些藥盒不限於以上定義的特定項，並可包含任何用於處理或測定miRNA的試劑。
V.篩選方法 本發明還包括在預防或治療上述疾病中所用的鑑定miR-U6調節劑的方法。這些測定可包括隨機地篩選候選物質的大型文庫；或者，測定可用於關注特定化合物類別，該特定化合物類別的選擇是著眼於認為能使它們更有可能調節miR-U6的表達和/或功能的結構特性。
為了鑑定miR_U6的調節物，通常會測定miR_U6在存在或缺乏候選物質時功能。 例如，方法通常包括 (a)提供候選調節物； (b)將候選調節物與miR_U6混合； (c)測量 miR-126 的活性 (d)將步驟(C)的活性與缺乏候選調節物的活性相比。
其中所測量活性的差異表明候選調節物的確是miR-126的調節物。
測定還可在分離的細胞、器官或在活生物體中進行。
當然，應理解，本發明的所有篩選方法本身均是可用的，儘管的確可能發現不了有效的候選。本發明提供篩選這些候選的方法，不只是發現它們的方法。
A.調節物 如本文所用，術語「候選物質」是指任何可潛在地調控miR-126的血管發生調節方面的分子。通常需要多種商業來源的分子文庫，認為它們「窮舉」鑑定有效化合物的能力滿
23足有效藥物的基本標準。篩選這些文庫(包括組合產生的文庫(如拮抗miRNA文庫))是篩選大量相關(和不相關)化合物活性的快速有效方法。組合方法還通過對有活性但其他方面不理想的化合物產生第二、第三和第四代化合物來使自身快速地發展為潛在的藥物。
B.體外測定 快速、經濟且簡便的進行操作的測定是體外測定。這些測定通常使用分離的分子， 可快速以及大量地進行，因而增加了在短時間內獲得的信息量。可採用多種載體進行測定， 包括試管、培養板、培養皿和其他表面，如量尺或珠子。
在WO 84/03564中描述了高通量篩選化合物的技術。可在固體基質(如塑料釘或其他表面)上合成大量的小核酸。可快速篩選這些分子抑制miR-126的能力。
C.細胞內(In cyto)測定 本發明還包括根據化合物在細胞內調節miR_U6活性和表達的能力來對化合物進行的篩選。可採用多種細胞系(包括那些從內皮細胞和造血細胞衍生的細胞系)來進行這些篩選測定，包括為此目的特別改造的細胞。
本發明還包括對miR-126靶基因表達的檢測，以確定miR_U6的活性是否被調節。 因此，作為篩選策略的一部分，可檢測在表3或4中給出的任何基因靶標，並且有利地可檢測多個這些靶標。
D.體內測定 體內測定涉及上述血管疾病的多種動物模型的使用，包括經改造以具有特定缺陷，或攜帶標記的轉基因動物，所述標記可用於測量候選物質到達並作用生物體內不同細胞的能力。由於小鼠的大小，方便處理，以及其生理和遺傳組成方面的信息，小鼠是優選的實施方案，尤其是轉基因小鼠。然而，其他動物也適合，包括大鼠、兔、倉鼠、豚鼠、沙鼠、土撥鼠、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬和猴(包括黑猩猩、長臂猿和狒狒)。可採用源自任何這些物種的動物模型進行抑制劑的測定。
用檢測化合物處理動物將涉及向動物施用合適形式的化合物。施用可以通過任何可用於臨床目的的途徑。在體內確定化合物的有效性可能涉及多種不同標準。並且，與體外或細胞內測定相比，可在動物中以更有意義的方式測定毒性和劑量反應。
VI.用於克隆、基因轉移和表達的載體 在一些實施方案中，採用表達載體來表達miR_U6或相關分子(如拮抗miRNA)。表達需要在載體中提供合適的信號，並包括多種調控元件，如病毒和哺乳動物來源的增強子/ 啟動子來引導目的基因在宿主細胞中的表達。還定義了設計為優化信使RNA在宿主細胞中穩定性和翻譯能力的元件。還提供了使用多個顯性藥物選擇標記來建立永久、穩定表達產物的細胞克隆的情況，以及將藥物選擇標記的表達與多肽的表達相連的元件。
A.調控元件 在本申請中，術語「表達構建體」是指任何類型的基因構建體，其含有編碼基因產物的核酸，所述產物中部分或全部核酸編碼序列能被轉錄。通常，編碼基因產物的核酸在啟動子的轉錄控制下。「啟動子」是指被細胞的合成機器或引入的合成機器(需要其來起始特定基因的轉錄)識別的DNA序列。術語「在轉錄控制下」是指啟動子相對於核酸處於正確的位置和方向從而控制RNA聚合酶起始和基因表達。
本文所用術語啟動子是指一組轉錄控制模塊，其聚集在RNA聚合酶II的起始位點周圍。有關啟動子如何組織的大部分理論都來自於對幾個病毒啟動子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉錄單元的啟動子。更多的近期工作豐富了這些研究，並顯示啟動子包括分離的功能模塊，每個由約7_20bp的DNA組成，並包含一個或更多個轉錄激活或抑制蛋白的識別位點。
在每個啟動子中至少一個模塊的功能是提供RNA合成的起始位點。最熟知的實例是TATA盒，但在一些沒有TATA盒的啟動子中(如哺乳動物晚期脫氧核苷酸基轉移酶基因的啟動子和SV40晚期基因的啟動子)，與起始位點自身重疊的分離的元件幫助固定起始位置。
另外的啟動子元件調控轉錄起始的頻率。通常這些位於起始位點上遊30_110bp 區域，儘管近期顯示許多啟動子在起始位點下遊也含有功能元件。啟動子元件之間的間隔經常是可改變的，因而當元件相對於彼此顛倒或移動時，啟動子仍保有功能。在tk啟動子中，啟動子元件之間的間隔可增加至50bp，再增加活性才會開始降低。根據啟動子，似乎單個元件可共同或分別行使功能來激活轉錄。
在其他一些實施方案中，可採用人巨細胞病毒(CMV)立即早期基因啟動子、SV40 早期啟動子、勞氏肉瘤病毒長末端重複、大鼠胰島素啟動子和3-磷酸甘油醛脫氫酶來獲得目的編碼序列的高水平表達。還設想採用本領域公知的其他病毒或哺乳動物細胞或噬菌體啟動子來獲得目的編碼序列表達的用途，只要對於給定目的來說表達水平是足夠的。
通過採用具有公知特性的啟動子，可優化轉染或轉化後目的蛋白質表達的水平和模式。而且，選擇應答於特定生理信號而調控的啟動子可允許基因產物的可誘導表達。表 1和2列出了在本發明內容中可用於調控目的基因表達的幾種調控元件。該列表不是為了窮舉在基因表達啟動中涉及的所有可能元件，而僅為其示例。
增強子是提高啟動子轉錄的基因元件，其位於同一 DNA分子的較遠位置。增強子的構成與啟動子十分相似。即，他們包括很多單獨的元件，每個結合一種或更多種轉錄蛋白質。
增強子和啟動子的基本區別是在作用上。增強子區域作為整體必須能在遠端刺激轉錄；這對啟動子區域或其組成元件來說是不需要的。另一方面，啟動子必須具有一個或更多個在特定位點並以特定方向指導RNA合成起始的元件，而增強子沒有這些特點。啟動子和增強子經常重疊或連續，經常顯示出類似的模塊結構。
以下是可與表達構建體中編碼目的基因的核酸組合使用的病毒啟動子、細胞啟動子/增強子和可誘導啟動子/增強子的列表(表1和表幻。此外，還可採用任何啟動子/ 增強子組合(按照真核啟動子資料庫EPDB)來指導基因表達。如果提供適合的細菌聚合酶 (作為遞送複合物的一部分或額外的基因表達構建體)，則真核細胞可支持一些細菌啟動子的胞漿轉錄。

權利要求
1.促進血管完整性和/或血管修復的方法，其包括向有血管損傷風險或患有血管損傷的對象施用miR-126功能的激動劑。
2.權利要求1的方法，其中所述對象患有血管損傷。
3.權利要求2的方法，其中所述血管損傷發生在心臟組織。
4.權利要求2的方法，其中所述血管損傷包括缺血性事件。
5.權利要求4的方法，其中所述缺血性事件包括梗塞、缺血再灌注損傷或動脈狹窄。
6.權利要求2的方法，其中所述血管損傷發生在非心臟組織。
7.權利要求6的方法，其中所述血管損傷包括外傷或血管滲漏。
8.權利要求1的方法，其中所述對象有血管損傷風險。
9.權利要求8的方法，其中所述對象患高血壓、晚期動脈粥樣硬化心臟肥大、骨質疏鬆、神經退變、纖維化或呼吸窘迫。
10.權利要求1的方法，其中所述對象為非人動物。
11.權利要求1的方法，其中所述對象是人。
12.權利要求1的方法，其中所述激動劑是miR-126。
13.權利要求1的方法，其中所述激動劑是miR-126的模擬物。
14.權利要求1的方法，其中所述激動劑是表達載體，其包含處於在靶細胞中有活性的啟動子控制之下的miR-U6編碼核酸區段。
15.權利要求14的方法，其中所述靶細胞為內皮細胞或造血細胞。
16.權利要求14的方法，其中所述啟動子是組織選擇性/特異性啟動子。
17.權利要求16的方法，其中所述組織選擇性/特異性啟動子在內皮細胞或造血細胞中有活性。
18.權利要求14的方法，其中所述表達載體是病毒載體。
19.權利要求14的方法，其中所述表達載體是非病毒載體。
20.權利要求1的方法，其還包括向所述對象施用第二治療。
21.權利要求1的方法，其中施用包括全身性施用。
22.權利要求21的方法，其中全身性施用是經口、靜脈內或動脈內施用。
23.權利要求1的方法，其中施用是通過滲透泵或導管進行。
24.權利要求1的方法，其中施用是直接或局部施用到血管損傷組織或有血管損傷風險的組織。
25.權利要求M的方法，其中所述組織是心臟組織、血管組織、骨組織、神經組織、呼吸系統組織、眼組織或胎盤組織。
26.在有此需要的對象中抑制病理性血管化的方法，其包括向有病理性血管化風險或患有病理性血管化的對象施用miR-126的拮抗劑。
27.權利要求沈的方法，其中所述對象患有病理性血管化。
28.權利要求27的方法，其中所述病理性血管化包括早期動脈粥樣硬化、視網膜病、癌症或中風。
29.權利要求沈的方法，其中所述對象具有病理性血管化的風險。
30.權利要求四的方法，其中所述對象患高脂血症、肥胖症、哮喘、關節炎、牛皮癬和/ 或失明。
31.權利要求沈的方法，其中所述對象是非人動物。
32.權利要求沈的方法，其中所述對象是人。
33.權利要求沈的方法，其中所述拮抗劑是miR-U6拮抗miRNA。
34.權利要求沈的方法，其中所述拮抗劑被遞送到血管組織、平滑肌、眼組織、造血組織、骨髓、肺組織或心外膜組織。
35.權利要求沈的方法，其還包括向所述對象施用第二抗血管發生治療。
36.權利要求沈的方法，其中施用包括全身性施用。
37.權利要求36的方法，其中全身性施用是經口、靜脈內、動脈內施用。
38.權利要求沈的方法，其中所述施用是直接或局部施用到病理性血管化或具有病理性血管化風險的組織。
39.權利要求38的方法，其中所述組織是眼組織、血管組織、骨組織、脂肪組織或肺組織。
40.權利要求沈的方法，其中施用通過滲透泵或導管進行。
全文摘要
本發明涉及稱為miR-126的微RNA的鑑定，其是內皮細胞血管完整性的調節劑。該內皮細胞限制性微RNA在體內介導發育性血管發生，在小鼠中miR-126的靶向缺失使得因血管完整性的喪失以及內皮細胞增殖、遷移和血管發生的缺陷而導致血管滲漏、出血和部分胚胎死亡。這些血管異常類似於血管發生生長因子例如VEGF和FGF的信號轉導降低所造成的後果。這些發現對涉及血管發生異常和血管滲漏的多種疾病是重要的治療啟示。本文公開了通過調節miR-126的功能治療特徵為局部缺血、血管損傷和病理性新血管形成的疾病的方法。
文檔編號A61K31/7088GK102186483SQ200980137927
公開日2011年9月14日 申請日期2009年8月11日 優先權日2008年8月11日
發明者埃裡克·奧爾松, 王樹生 申請人:德克薩斯大學系統董事會