一種基於發卡結構的目標區域捕獲方法及其應用與流程

2023-05-26 17:38:16

本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種目標區域的捕獲方法，尤其涉及一種基於發卡結構的目標區域捕獲方法及其應用。
背景技術：
：基於二代測序的目標區域捕獲方法為生命科學研究及精準醫學帶來了強有力的技術手段。與全基因組測序相比，目標區域的捕獲富集測序極大的降低了成本，提高了對目標基因檢測的質量，減輕了冗餘的數據分析過程。目前已開發了多種目標區域的捕獲策略，主要有多重PCR捕獲、固相晶片捕獲、液相探針捕獲及分子倒置探針捕獲等。多重PCR捕獲技術是應用較為廣泛的一種捕獲技術。該技術應用多對引物同時擴增多個目標區域進行測序。設計思路簡單，成本低廉，便於操作，靈敏度高。但是，大量引物對的相互幹擾，往往產生大量非特異擴增，同時會出現某些捕獲區域擴增失敗的可能。固相晶片捕獲技術是將捕獲探針原位合成在DNA晶片上，通過與構建完成的文庫雜交，洗去非特異雜交文庫，保留捕獲區域後進行測序的技術。通常一個樣本需要一塊捕獲晶片，捕獲探針長度為60-90個鹼基，捕獲區域為3-5Mb。該方法探針獲得簡單，捕獲區域大；但是操作複雜，實驗時間長，通量低，靈敏度低，需要大量樣本進行文庫構建後再捕獲。液相探針捕獲技術是基於固相探針合成方法的改進。該方法通過體外轉錄固相探針產生生物素標記的RNA探針，在溶液中進行雜交富集，獲得捕獲的目標區域。液相捕獲技術可以實現高通量樣本操作，捕獲特異性高；但是探針製作複雜，價格昂貴，RNA探針本身的易降解問題對操作要求高。分子倒置探針捕獲技術是基於酶學方法的改進。分子倒置探針由捕獲區域兩端特異性靶向序列和連接臂構成，由一種DNA聚合酶填補2條特異性靶向序列間的間隙從而環化，獲得目標捕獲區域。該方法無需將樣本事先機械打斷構建文庫，特異性高，操作簡便。但是分子倒置探針的獲得成本昂貴，且設計複雜。技術實現要素：解決的技術問題：為了克服現有技術的不足，獲得一種特異性強、靈敏度高，且能夠兼容高、低通量，成本低廉的目標區域捕獲方法，本發明提供了一種基於發卡結構的目標區域捕獲方法及其應用。技術方案：一種基於發卡結構的目標區域捕獲方法，包括以下步驟：第1步、向包含目標捕獲區域的基因組試樣中，加入至少一條上遊引物，進行單向擴增反應並形成發卡結構；擴增體系中還包括dNTPs、Taq酶和緩衝液；第2步、將第1步的單向擴增產物置於冰上，冷卻；第3步、採用單鏈DNA外切酶對第2步的非特異性擴增產物進行消化，並利用磁珠富集法進一步純化，收集具有發卡結構的目標捕獲序列；第4步、向具有發卡結構的目標捕獲序列中加入至少一條下遊引物，進行富集擴增，擴增體系中還包括dNTPs、Taq酶和緩衝液。優選的，所述上遊引物5』端為目標捕獲區域下遊的反向互補序列，用於與單向擴增得到的目標捕獲區域下遊退火形成發卡結構；上遊引物3』端為目標捕獲區域上遊特異性擴增序列，用於擴增目標捕獲區域；其中，上遊引物5』端反向互補區域的Tm值大於55℃。優選的，所述上遊引物5』端反向互補區域的Tm值為70～80℃，且大於3』端特異性擴增序列的Tm值。優選的，所述單鏈DNA外切酶具有3』-5』核酸外切酶活性或5』-3』核酸外切酶活性。優選的，所述單鏈DNA外切酶為核酸外切酶I、核酸外切酶T或核酸外切酶RecJ。優選的，所述下遊引物為上遊引物中5』端互補序列的部分序列。優選的，所述下遊引物為上遊引物5』端互補序列中靠近3』端的序列。所述方法在核酸檢測領域中的應用。優選的，所述方法用於檢測人BRCA1/2基因全部外顯子。進一步的，所述方法用於檢測人BRCA1/2基因全部外顯子採用的上遊引物為SEQIDNO:1～41，下遊引物為SEQIDNO:42～82。表1檢測人BRCA1/2基因全部外顯子的上遊引物其中，引物5』端單下劃線的序列為下遊捕獲區域反向互補序列，引物3』端雙下劃線的序列為上遊捕獲區域特異性擴增序列。表2檢測人BRCA1/2基因全部外顯子的下遊引物有益效果：(1)僅有上遊引物3』端擴增的產物能與上遊引物5』端形成發卡結構的捕獲區域，因而特異性強；(2)形成的發卡結構序列特殊，使得下遊引物組可以對目標捕獲區域進行指數擴增，因而極少量基因組即可達到後續檢測需要，靈敏度高；(3)用於本方法的引物組可以通過DNA晶片技術合成引物池，因而可以同時檢測數千個目標區域，實現高、低通量的兼容；(4)本發明的方法設計簡單，僅需設計目標捕獲區域的上下遊引物，避免固相或液相捕獲方法的設計大量全區域捕獲探針的麻煩；(5)所述方法無需採用生物素等物質標記引物，從而降低了檢測成本。附圖說明圖1是本發明目標區域捕獲方法的流程圖；圖2是實施例1中BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子的捕獲電泳圖。具體實施方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1分別捕獲BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子。為了完全覆蓋外顯子區域，分別設計了長度為510bp、1476bp和5100bp的捕獲區域，完全覆蓋了BRCA2基因的第8、第10、第11全外顯子。根據BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子序列，分別設計上遊擴增引物和下遊擴增引物：第8外顯子上遊擴增引物序列為SEQIDNO：83(5』-3』)：AACAGAGAGACAGCAGAGTTTCACAGGAAGTTAACAGCATCATCTGACTTTCCAACT引物5』端下劃線部分為下遊捕獲區域反向互補序列，Tm值為69.8℃；引物3』端波浪線部分為上遊捕獲區域特異性擴增序列，Tm值為59.8℃；第10外顯子上遊擴增引物序列為SEQIDNO：84(5』-3』)：CCATGTTTGAGTGACCTGATTCTAAACACTGGGAAGAACAGGAGAAGGGGTGACT引物5』端下劃線部分為下遊捕獲區域反向互補序列，Tm值為71.2℃；引物3』端波浪線部分為上遊捕獲區域特異性擴增序列，Tm值為60.6℃；第11外顯子上遊擴增引物序列為SEQIDNO：85(5』-3』)：ACTCTTAATTGTTAGCATACCAAGTCTACTGAATAAACACCACTGTGCCCAAACACTACCTT引物5』端下劃線部分為下遊捕獲區域反向互補序列，Tm值為69.2℃；引物3』端波浪線部分為上遊捕獲區域特異性擴增序列，Tm值為59.3℃。第8外顯子下遊擴增引物序列為SEQIDNO：86(5』-3』)：GACAGCAGAGTTTCACAGGAAGTTA；Tm值為60℃；第10外顯子下遊擴增引物序列為SEQIDNO：87(5』-3』)：TGAGTGACCTGATTCTAAACACTGG；Tm值為60.4℃；第11外顯子下遊擴增引物序列為SEQIDNO：88(5』-3』)：TAGCATACCAAGTCTACTGAATAAACAC；Tm值為58.6℃；捕獲BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子的方法，包括以下步驟：第1步、向包含BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子的基因組試樣中，加入上遊引物SEQIDNO：83～85，進行單向擴增反應，形成發卡結構；擴增體系和程序分別如表3、4所示：表3反應組分體積(μL)2XExTaqHotStartMasterMix12.5上遊引物(10μM)0.5模板DNA(10ng)1sdH2O11總體積25表4步驟溫度時間預變性198℃2min變性298℃10s退火360℃2min延伸472℃3min變性598℃2min退火670℃3min第2步、將第1步的單向擴增產物置於冰上，冷卻5min；第3步、採用單鏈DNA外切酶對第2步的非特異性擴增產物進行消化，消化的體系及條件如表5、6所示；並利用磁珠富集法進一步純化，收集具有發卡結構的目標捕獲序列；表5表6步驟溫度時間溫浴137℃30min第4步、向磁珠富集純化後的擴增產物中加入下遊引物SEQIDNO：86～88，進行富集擴增，擴增體系和程序如表7、8所示。表7反應組分體積(μL)2XExTaqHotStartMasterMix12.5下遊引物(10μM)1純化產物11.5總體積25表8步驟溫度時間預變性198℃2min變性298℃10s退火360℃1min延伸472℃3min返回步驟2循環30次5延伸672℃10min保持74℃10min將下遊引物富集擴增後的目標片段進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示，BRCA2基因的第8、第10和第11全外顯子均被捕獲。實施例2同時捕獲BRCA1/2基因的全部外顯子，根據BRCA1/2基因的全部外顯子序列設計引物，上遊引物序列為SEQIDNO：1～41，下遊引物序列為SEQIDNO：42～82。一種捕獲BRCA1/2基因的全部外顯子的方法，包括以下步驟：第1步、向包含目標捕獲區域的基因組試樣中，加入上遊引物，進行單向擴增反應，形成發卡結構；擴增體系和程序如表9、10所示；表9反應組分體積(μL)2XExTaqHotStartMasterMix12.5上遊引物組(每組分1μM)2.5模板DNA(10ng)1sdH2O9總體積25表10步驟溫度時間預變性198℃2min變性298℃10s退火360℃2min延伸472℃3min變性598℃2min退火670℃3min第2步、將第1步的單向擴增產物置於冰上，冷卻5min；第3步、採用單鏈DNA外切酶對第2步的非特異性擴增產物進行消化，消化體系及條件如表11、12所示；並利用磁珠富集法進一步純化，收集具有發卡結構的目標捕獲序列；表11反應組分體積(μL)上述反應組分2510XReactionBuffer5ExonucleaseI(20U/μL)1sdH2O19總體積50表12步驟溫度時間溫浴137℃30min第4步、向具有發卡結構的目標捕獲序列中加入至少一條下遊引物，進行富集擴增，擴增體系和程序如表13、14所示。表13反應組分體積(μL)2XExTaqHotStartMasterMix25下遊引物組(每組分1μM)5純化產物20總體積50表14步驟溫度時間預變性198℃2min變性298℃10s退火360℃1min延伸472℃3min返回步驟2循環15次5延伸672℃10min保持74℃10min將下遊引物富集擴增後的目標片段採用illumina公司NexteraDNALibraryPrepKit進行文庫構建，並測序分析。結果如表15所示，一組樣本檢測結果中，目標基因的30X捕獲覆蓋度所佔比例均大於99％，顯示基本能夠完全捕獲目標區域。表15目標基因捕獲的覆蓋度統計當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp