檢測寡核苷酸的方法

2023-08-13 14:54:01

專利名稱：檢測寡核苷酸的方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及對樣品中經修飾的核酸寡核苷酸進行檢測和/或定量的方法和組合物。這些方法和組合物可用於對生物樣品中診斷性和/或治療性的合成的 經修飾的寡核苷酸加以檢測和定量，所述寡核苷酸例如適配體、微RNA(HIiRNA)、小幹擾 RNA(siRNA)和其它非編碼RNA(ncRNA)分子、反義寡核苷酸或核酶。
背景技術：
在過去二三十年來，對特定核酸序列的鑑定和定量是分子生物學中人們極感興趣 的領域。對某些核酸及其產物進行鑑定和定量的能力令範圍廣範的多門學科(例如，個體 化醫學，包括分析單核苷酸多態性(SNPs)和評估藥物抗性)取得進展，加深了我們對生物 化學和分子生物學過程的理解，並且在癌症診斷和治療方面有所進展，等等。近來很多興趣集中於某些非編碼性的小RNA分子(特別是小幹擾RNA(SiRNA)和 微RNA(miRNA)及其前體)的新發現的性質和它們對細胞內過程的影響。目前人們相信， siRNA參與基因沉默，而miRNA被認為負責翻譯阻遏(以及在某些情況下，基因沉默)的一 些形式。隨著對這些小RNA分子的興趣極大高漲，科學家卻面臨對這些小分子進行鑑定和 定量的困難任務。siRNA是雙鏈寡核苷酸，其長度典型地為19-23個核苷酸。它們可通過合成獲得， 可被化學修飾，並且目前被開發為潛在候選藥物。此類分子的藥理學性質仍待充分研究，這 需要開發新的生物分析方法，在生物或臨床樣品中對它們加以檢測和定量。雖然過去十年對若干小RNA分子已有很多了解，但是仍有問題尚未闡明。它們的 小尺寸可能帶來問題，特別是對候選小RNA分子進行鑑定和證實有效的方面以及檢測和定 量小RNA分子的已知種類的方面。傳統技術由於靈敏度方面的問題不足以滿足這些需求。 因此，人們需要開發更快更靈敏的方法來檢測小RNA分子。

發明內容
本發明涉及對寡核苷酸分子進行快速檢測和定量的組合物和方法，所述寡核苷 酸分子例如短核酸，例如小幹擾RNA和其它短核酸分子。本發明部分基於下述發現對包 含寡核苷酸結合區域的反轉錄引物的設計對靈敏度來說高度重要。本發明增加的靈敏度 導致能夠檢測單個擴增分子。因此，本發明的方法和組合物提供了改進的、高度靈敏的方 法，用於定量檢測短RNA，例如但不限於脫氧核糖核苷酸構成的寡核苷酸和核糖核苷酸構 成的寡核苷酸，包括但不限於，小RNA分子，例如非翻譯功能性RNA、非編碼RNA(ncRNA)、 小非信使 RNA (snmRNA)、siRNA、tRNA、微小非編碼 RNA (tncRNA)、小調節 RNA (smRNA)、 snoRNA、stRNA, snRNA、miRNA,其包括但不限於 miRNA 前體，例如初級 miRNA(pri-miRNA) 和前體 miRNA(pre-miRNA)等(見，例如 Eddy，NatureReviews Genetics 2 :919_29，2001 ； Storz, Science 296 :1260_63, 2002 ；Buckingham, Horizon Symposia Understanding the RNAissance 1-3,2003)。因此，在一個方面，本發明涉及具有改進的靈敏度的、在樣品中鑑定或定量寡核苷酸分子的方法，所述方法包括將反轉錄引物與寡核苷酸分子雜交，其中，反轉錄引物包含 具有寡核苷酸識別序列的寡核苷酸分子結合部分，所述序列包含位於3』區域與寡核苷酸分 子的區域互補的至少2個核苷酸以及位於5』區域的包含至少2個核苷酸的延伸尾；用第一 延伸酶延伸雜交的反轉錄引物，產生反轉錄產物；將正向引物與反轉錄產物雜交，其中正向 引物包含寡核苷酸分子結合部分，所述部分包含與寡核苷酸分子的區域相同的至少2個核 苷酸；用第二延伸酶延伸雜交的正向引物，產生第一擴增子；將反向引物與第一擴增子雜 交；用第二延伸酶延伸雜交的反向引物，產生與第一擴增子互補的第二擴增子；檢測擴增 產物；以及由此對寡核苷酸分子進行鑑定或定量。該反應可以但不必須包含實時檢測。在 某些實施方式中，擴增步驟包含多路技術。
所述方法可用於快速檢測和定量寡核苷酸分子，例如，小RNA分子、DNA分子、經修 飾的RNA分子、經修飾的DNA分子、適配體、核酶、誘餌(decoy)寡核苷酸、免疫刺激性的寡 核苷酸。寡核苷酸具有包含10-30個核苷酸的長度，它們可被化學修飾。寡核苷酸還可以 是雙鏈分子，例如siRNA。在另一方面，本發明提供了檢測siRNA(其能通過RNAi抑制至少 一種靶基因)的方法。本發明並不限於任何類型的siRNA或靶基因或核苷酸序列。例如， 靶基因可以是細胞的基因、內源基因、病原體相關基因、病毒基因或癌基因。所述方法可用於在體液(例如血漿、腦脊液和尿)中對寡核苷酸分子進行直接檢 測和定量，而無須提取RNA，所述分子例如，小RNA分子、DNA分子、經修飾的RNA分子、經修 飾的DNA分子、適配體、核酶、誘餌寡核苷酸、免疫刺激性的寡核苷酸。本發明公開了反轉錄酶引物，其經工程改造以包含特定的區域，例如，SRS(siRNA 相關序列)序列、探針序列和反向引物序列。探針序列位於選自正向引物和反向引物之間 或者反轉錄酶引物內部的位置。還公開了第一引物組，其包括正向引物和相應的反向引物， 每條都有不尋常地短寡核苷酸結合部分。第一引物和第二引物是未經修飾的引物。或者， 第一引物和第二引物是經修飾的引物。修飾的例子包括但不限於，使用LNA殘基、肽核酸殘 基、2』修飾的RNA殘基、經修飾的核鹼基(nucleobases)或其組合。在某些實施方式中，將寡核苷酸靶與反轉錄酶引物、包含正向引物和反向引物的 第一引物組、第二引物組和延伸酶組合，形成單一反應組合物。單一反應組合物在合適的條 件下發生反應，產生第一產物、第一擴增子、額外的第一擴增子、第二擴增子。在某些實施方 式中，檢測第一擴增子、額外的第一擴增子、第二擴增子或其組合，對寡核苷酸鑑定和/或 定量。在某些實施方式中，檢測包括整合報導基團(integral reporter group)、報導探針、 嵌入劑或其組合。在某些實施方式中，擴增、檢測和定量包含Q-PCR或另外的實時技術。某 些實施方式包含終點檢測技術。在另一實施方式中，雜交發生在兩種分別的反應混合物中，其中，反轉錄酶引物存 在於第一反應混合物中，其被用於產生反轉錄產物；而正向和反向引物存在於第二反應混 合物中，其中，來自第一反應混合物的反轉錄產物在第二反應混合物中被用作為正向和反 向引物的模板。在某些實施方式中，本發明公開的方法包括形成至少兩種不同的反應組 合物，例如但不限於，第一反應組合物和第二反應組合物。一些實施方式還至少包括第三反 應組合物。在一些實施方式中，針對每種寡核苷酸靶，兩組引物組用於在至少兩種不同反應 組合物(包括但不限於，第一反應組合物和多種不同的第二反應組合物，它們可以但並不 必須存在於相同的反應容器中)中進行的三個或四個擴增步驟中。根據此類方法，在第一反應組合物中進行的擴增步驟典型包括(i)使用反轉錄引物、第一引物組的反向引物產 生第一產物，(ii)使用第一產物作為模板，使用第一引物組的相應正向引物，產生第一擴增 子，以及任選地(iii)使用相應第一引物組的額外正向和反向引物，產生額外的第一擴增 子。當第一階段完成後，典型地，通過組合(i)反應的第一反應組合物的全部或部分，(ii) 第二引物組，其可以但並不一定包括通用引物、包含獨特雜交標籤的引物或兩者，(iii)第 三延伸酶以及任選地(iv)報導探針，形成第二反應組合物。在合適的反應條件下，使用額 外的第一擴增子作為模板，產生第二擴增子。在一種實施方式中，反轉錄酶引物的寡核苷酸分子結合部分包含與寡核苷酸分子 至少90%互補的核苷酸序列。在另一實施方式中，反轉錄酶引物的寡核苷酸分子結合部分 包含與寡核苷酸分子互補的大約2-17個核苷酸，其中所述寡核苷酸分子長大約4-19個核 苷酸。在一種實施方式中，反向引物的寡核苷酸分子結合部分包含與寡核苷酸分子的區域 互補的大約2-30個核苷酸。在一種實施方式中，正向引物的寡核苷酸分子結合部分包含與 寡核苷酸分子的區域具有相同序列的大約2-30個核苷酸。目前的教導還提供了特別有用於公開的方法中的報導探針。但是本領域技術人員 將知道，傳統的報導探針也可用於公開的方法。在一種實施方式中，檢測擴增產物的步驟包 括用第一檢測探針檢測第一擴增子，用第二檢測探 針檢測第二擴增子以及用多種檢測探針 檢測第一和第二擴增子兩者。在一種實施方式中，第一檢測探針是雙鏈DNA嵌入劑。在一 種實施方式中，第一檢測探針是SYBR Green0在另一實施方式中，第一和第二檢測探針是 信號發射探針，它們使用Watson-Crick鹼基配對與寡核苷酸分子結合部分結合。信號發射 探針的例子包括但不限於，FAM、VIC、JOE、NED、CY5染料、CY3-染料、TAMRA標記探針和MBG 探針、蠍探針(scorpion probe)和分子信標(beacon)。在一種優選的實施方式中，檢測探 針包含FAM/TAMRA檢測基團。本發明的方法出人意料地實現了對寡核苷酸分子加以定量的靈敏度的提高。在 一種實施方式中，使用信號強度讀出法(readout)進行檢測時，靈敏度以至少10_100，000 倍的因子或者至少100-10，000倍的因子提高。在另一實施方式中，對寡核苷酸加以定量 的靈敏度被提高到能檢測大約1個分子至大約IXIOki個分子以及大約100個分子至大約 1 X IO9個分子的濃度範圍的寡核苷酸分子。本發明的方法和組合物可用於在將寡核苷酸分子施用給受試者之後檢測寡核苷 酸分子，施用通過臨床相關途徑進行，其選自但不限於氣管內、鼻內、腦內、鞘內、結直腸、口 月艮、肌內、關節內、局部(包括陰道)、肺遞送、眼內、腹膜內、靜脈內和皮下施用構成的組。可 用能協助遞送至靶細胞和/或協助被靶細胞吸收的藥物載體來配製寡核苷酸分子。這選自 但不限於中性脂質體、陽離子脂質體或脂複合體(Iipoplexes)、陽離子聚合物或多聚復 合體(polyplexes)、中性聚合物、納米顆粒、雙鏈RNA結合蛋白、磷酸鈣、細胞穿透肽、病毒 蛋白和病毒顆粒、抗體和空細菌包膜。待使用本發明的方法測試的樣品選自流體、組織、細 胞和腫瘤構成的組。本發明還提供了可用於開展公開的方法的試劑盒。在某些實施方式中，試劑盒包 含第一引物組和第一延伸酶。在某些實施方式中，公開的試劑盒還包含第二延伸酶、第三延 伸酶、第二引物組、報導探針、報導基團、反應容器或其組合。本發明教導的這些和其它特徵 在本文中有所示出。
附圖簡述本領域技術人員將理解，下文中的附圖僅用於闡述目的，而非意欲以任何方式限 制本發明教導的範圍。

圖1顯示了使用兩步RT-PCR對血漿中的SiRNA進行定量；圖2顯示了對一步RT-PCR的比較；圖3顯示了基於兩步RT-PCRJi siRNA ND9227進行的檢測的比較，其中使用SYBR Green I或FAM/TAMRA標記的探針作為讀出劑；圖4顯示了對大鼠肺中siRNA進行絕對定量的結果；圖5是使用FAM/TAMRA探針進行的siRNA檢測的示意圖；以及圖6是反轉錄引物所需的最小序列的示意圖。發明詳述應當理解，前述一般性描述和下文的詳細描述都僅是示例性和解釋性的，它們並 不意欲限於本發明教導的範圍。在本申請中，除非有特別的聲明，使用單數時也包括複數。 本文所用的標題僅用於組織的目的，而不應以任何方式將其解釋為限制所描述的主題。為 了任何目的，本申請提到的所有文獻和類似材料，包括但不限於專利、專利申請、文章、書 籍、論文和網際網路網頁都明確通過引用整體併入本文。當併入的文獻和類似材料中一份或 多份與本申請相矛盾時，包括但不限於定義的術語、術語使用、描述的技術等方面矛盾時， 以本申請為準。I.定義術語「短幹擾核酸」、「siRNA」、「短幹擾RNA」、「siRNA」、「短幹擾核酸分子」、「短幹 擾寡核苷酸分子」或「經化學修飾的短幹擾核酸分子」在本文中使用時表示能抑制或下調 基因表達或病毒複製的任何核酸分子，例如通過以序列特異性方式介導RNA幹擾「RNAi」 或基因沉默來實現；見例如 Zamore 等人，2000，Cell, 101,25 33 ；Bass, 2001, Nature, 411, 428 429 ；Elbashir 等人，2001，Nature, 411,494 498 和 Kreutzer 等人，國際 PCT 公開 No. WO 00/44895 ；Zernicka-Goetz 等人，國際 PCT 公開 No. WO 01/36646 ；Fire,國際 PCT 公 開 No. WO 99/32619 ；Plaetinck 等人，國際 PCT 公開 No. WO 00/01846 ；Mello 和 Fire，國際 PCT 公開 No. W001/29058 ；Deschamps-Depaillette,國際 PCT 公開 No. WO 99/07409 和 Li 等人，國際 PCT 公開 No. WO 00/44914 ；Allshire, 2002, Science, 297,18181819 ；Volpe 等 人，2002，Science,297,1833 1837 ；Jenuwein,2002, Science,297，2215 2218 和 Hall 等 A,2002, Science,297,2232 2237 ；Hutvagner 禾Π Zamore，2002， Science,297,2056 60; McManus 等人，2002，RNA,8,842850 ；Reinhart 等人，2002，Gene&Dev.，16，1616 1626 和 Reinhart&Bartel, 2002, Science, 297,1831)。本發明的siRNA分子的非限制性例子示於本 文圖4、6和表II和III中。例如，siRNA可以是包含自身互補的正義和反義區域的雙鏈寡 核苷酸分子，其中，所述反義區域包含與靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互補的核苷 酸序列，及正義區域具有相應於靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。可從兩條分別的寡核 苷酸來裝配siRNA，在這種情況下一條鏈是正義鏈，另一條是反義鏈，其中反義和正義鏈是 自身互補的(即，每條鏈包含與另一條鏈中的核苷酸序列互補的核苷酸序列；例如，在這種 情況下反義鏈和正義鏈形成雙鏈體或雙鏈結構，例如，其中雙鏈區域有大約19個鹼基對)； 反義鏈包含與靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，正義鏈包含對應於靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。或者，從單條寡核苷酸裝配siRNA，其中，siRNA的自身互補正義和反義區域通過基於核酸或不基於核酸的連接子相連。siRNA可以是具有雙鏈體、 不對稱雙鏈體、發卡或不對稱發卡二級結構的寡核苷酸，其具有自身互補的正義和反義區 域，其中，所述反義區域包含與各靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互補的核苷酸序列， 和正義區域(具有與靶核酸序列或其部分相對應的核苷酸序列)。siRNA可以是下述環狀單 鏈寡核苷酸，其具有兩個或多個環結構和包含自身互補的正義和反義區域的莖，其中，所述 反義區域包含與靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，正義區域具有對 應於靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，並且，其中，所述環狀寡核苷酸可經體內或體外加 工，產生能介導RNAi的活性siRNA分子。siRNA還可包含下述單鏈寡核苷酸，其具有與靶核 酸分子或其部分中的核苷酸序列互補的核苷酸序列(例如，在這種情況下此類siRNA分子 不需要在所述siRNA分子內存在與靶核酸序列或其部分對應的核苷酸序列)，其中，所述單 鏈寡核苷酸還可包含末端磷酸基團，例如5』-磷酸(見，例如，Martinez等人，2002，Cell.， 110,563574 和 Schwarz 等人，2002，Molecular Cell，10，537568)或 5'，3' -二磷酸。在 某些實施方式中，本發明的siRNA分子包含分開的正義和反義序列或區域，在這種情況下 所述正義和反義區域通過本領域已知的核苷酸或非核苷酸連接子分子共價連接，或者通過 離子相互作用、氫鍵、範德華相互作用、疏水相互作用和/或堆疊(stacking)相互作用非共 價連接。在某些實施方式中，本發明的siRNA分子包含與靶基因的核苷酸序列互補的核苷 酸序列。在另一實施方式中，本發明的siRNA分子以能抑制靶基因的表達的方式與靶基因 的核苷酸序列相互作用。在本文中使用時，siRNA分子並不限定於僅含RNA的那些分子，其 還可包括經化學修飾的核苷酸和非核苷酸。在某些實施方式中，本發明的短幹擾核酸分子 缺乏含2』-羥基(2』-OH)的核苷酸。申請人在某些實施方式中描述了下述短幹擾核酸，其 不需要有具有2』 -羥基的核苷酸存在來介導RNAi，因此，本發明的短幹擾核酸分子任選地 不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2』-0H的核苷酸)。但是，此類在該siRNA分子內部無 須存在核糖核苷酸來支持RNAi的siRNA分子可具有含具有2』-0H基團的一個或多個核苷 酸的，連接的一個或多個連接子或者其它連接或聯結的基團、基元或鏈。任選地，siRNA分子 可在核苷酸位置的大約5、10、20、30、40或50%上包含核糖核苷酸。本發明的經修飾的短幹 擾核酸分子還可被稱為短幹擾經修飾寡核苷酸「siMON」。在本文中使用時，術語siRNA與用 於描述能介導序列特異性RNAi的核酸分子的其它術語等同，例如，短幹擾RNA(SiRNA)、雙 鏈RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短髮卡RNA(shRNA)、短幹擾寡核苷酸、短幹擾核酸、短幹擾 經修飾寡核苷酸、經化學修飾的siRNA、轉錄後基因沉默RNA(ptgsRNA)等。此外，在本文中 使用時，術語RNAi與用於描述序列特異性RNA幹擾的其它術語等同，例如轉錄後基因沉默、 翻譯抑制或外遺傳(epigenetics)。例如，本發明的siRNA分子可用於在轉錄後水平或轉錄 前水平上對基因進行外遺傳性沉默。在一種非限制性實施例中，通過本發明siRNA對基因 表達的外遺傳調控可由siRNA介導的染色質結構修飾(改變了基因表達)導致(見，例如， Verdel 等人，2004，Science，303，672 676 ；Pal-Bhadra 等人，2004，Science，303，669 672 ； Allshire,2002, Science,297,1818 1819 ；Volpe ^ 人，2002，Science，297，1833 1837 ； Jenuwein, 2002，Science, 297，2215 2218 和 Hall 等人，2002，Science, 297，2232 2237)。
術語「擴增子」在本文中以廣義使用，其包括公開的方法的擴增產物。第一產物 (包括但不限於反轉錄產物)、第一擴增子、額外的第一擴增子、第二擴增子或其組合都落入術語擴增子的意欲範圍。術語「雜交」和「退火」以及這些術語的其它時態和詞型可互換使用，它們表示 一種核酸與另一核酸的核苷酸鹼基配對相互作用，導致雙鏈體、三鏈體或其它更高數量級 的結構形成。一級相互作用典型地是核苷酸鹼基特異性的，例如A:T、A:U和G:C，其通過 Watson-Crick和Hoogsteen型氫鍵實現。在某些實施方式中，鹼基堆疊和疏水相互作用也 有助於雙鏈體穩定性。報導探針和引物與互補及基本互補的靶序列雜交的條件是本領域公 知的，例如，Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B. Hames 禾口 S. Higgins 編著，IRL Press, Washington, D. C. (1985)禾口 J. Wetmur 禾口 N. Davidson，Mol. Biol. 31 :349et seq. (1968)中所述。通常，此類退火是否發生受下述因素的影響引物和報導探針與它們 的互補序列的雜交區域的長度、PH、溫度、是否存在一價和二價陽離子、G和C核苷酸在雜交 區域中的比例、介質粘度以及變性劑的存在，等等。這些變量影響雜交所需的時間。引物或 報導探針中某些核苷酸類似物或溝槽結合子(groove binder)的存在也會影響到雜交條 件。因此，優選的退火條件將取決於特定應用。但是，此類條件可由本領域普通技術人員常 規確定，而無須過多實驗。在本文中使用時，術語「寡核苷酸」、「多核苷酸」、「核酸」和「核酸序列」通常可互 換使用，其包括核苷酸單體的單鏈和雙鏈聚合物，包括通過核苷酸間磷酸二酯鍵，或者核苷 酸間類似物以及聯結的平衡離子，例如H\ NH4+、三烷基銨、四烷基銨、Mg2+、Na+等，連接的 2』 -脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。核酸可完全由脫氧核糖核苷酸構成、完 全由核糖核苷 酸構成或者是其嵌合的混合物。核苷酸單體單元可包含本文所述的任何核苷 酸，其包括但不限於天然存在的核苷酸和核苷酸類似物。核酸大小典型地在數個單體單元 (例如，5-40，本領域中一些時候稱其為寡核苷酸)至數千單體核苷酸單元的範圍內。除非 上下文顯然另有指明或者明確指出不同，核酸序列都以從左到右的方向從5』到3』向顯示， 除非上下文顯然另有指明，在這些序列中，「A」指腺嘌呤，「C」指胞嘧啶，「G」指鳥嘌呤，「T」 指胸腺嘧啶，「U」指尿嘧啶。術語「核苷酸鹼基」在本文中使用時指經取代或未經取代的一個或多個芳香族的 環。在某些實施方式中，一個或多個芳香族的環含有氮原子。在某些實施方式中，核苷酸 鹼基能與互補的核苷酸鹼基形成Watson-Crick或Hoogsteen型氫鍵。示例性的核苷酸鹼 基及其類似物包括但不限於天然存在的核苷酸鹼基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧 啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，以及天然存在的核苷酸鹼基的類似物，其包括但不限於7-脫氮腺 嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、N6-. DELTA. 2-異 戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-. DELTA. 2-異戊烯基_2_甲基硫代腺嘌呤(2ms6iA)、N2- 二甲基 鳥嘌呤(dmG)、7-甲基鳥嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2， 6- 二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、異 鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鳥嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、 O6-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5，6_ 二氫胸腺嘧啶、5，6_ 二氫尿嘧啶、 吡唑並[3,4-D]嘧啶(見，例如U. S. Pat. Nos. 6，143，877和6，127，121以及PCT公開申請 WO 01/38584)、乙烯基腺嘌呤(ethenoadenine)、吲哚(例如硝基吲哚和4-甲基吲哚)和 批口各(例如銷基批口各)。可在例如 Fasman，1989，Practical Handbook of Biochemistry andMolecular Biology,pp. 385-394,CRC Press,Boca Raton,Fla.及其中提到的文獻中找到某些示例性的核苷酸鹼基。術語「核苷酸」在本文中使用時表示包含與糖(例如核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃 糖)及其糖類似物的C-I'碳連接的核苷酸鹼基的化合物。術語核苷酸還包括核苷酸類似 物。糖可以是經取代或未經取代的。經取代的核糖包括但不限於其中一個或多個碳原子， 例如2』 -碳原子，被一個或多個相同或不同-R、-OR、-NR. sub. 2疊氮化物、氰或滷代基團 取代的那些核糖，其中，每個R獨立地是H、C1-C6烷基、C2-C7醯基或C5-C14芳基。示例性的 核糖包括但不限於2' -(C1-C6)烷氧基核糖、2' -(C5-C14)芳氧基核糖、2'，3' -二脫 氫核糖、2'-脫氧-3'-滷代核糖、2'-脫氧-3'-氟核糖、2'-脫氧-3'-氯核糖、 2'-脫氧-3'-氨基核糖、2'-脫氧-3' -(C1-C6)烷基核糖、2'-脫氧_3' -(C1-C6) 烷氧基核糖和2'-脫氧-3' -(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2'-脫氧核糖、2'，3' -二 脫氧核糖、2'-滷代核糖、2'-氟核糖、2'-氯核糖和2'-烷基核糖，例如，2' -0-甲 基，4' -α-異頭核苷酸，1' -α-異頭核苷酸，2' -4'-和3' -4'-連接的和其它「經 鎖定的」或「LNA」，雙環糖修飾物(見例如PCT公開申請Nos. W098/22489、WO 98/39352和 WO 99/14226 以及 Braasch 和 Corey，Chem. Biol. 8 1-7，2001)。「LNA，，或「經鎖定的核酸」 是構象上被鎖住的DNA類似物，從而核糖環受到亞甲基連接的限制，所述亞甲基連接位於 例如但不限於2』 -氧和3』或4』 -碳或3』 -4』 LNA和2』 -5』骨架之間的。這種連接導致的 構象限制通常增加了互補序列的結合親和性，並且增加了此類雙鏈體的熱穩定性。寡核苷 酸內的示例性的LNA糖類似物包括但不限於其中B是任何核苷酸鹼基的結構。
核糖的2』或3』位置可被修飾，其包括但不限於氫、羥基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧 基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基、疊氮基、氰基、氨基(amido)、亞 氨基、氨基(amino)、烷氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括但不限於天然D光學異構體以及L 光學異構體形式(見，例如 Garbesi Nucl. Acids Res. 21 4159-65 (1993) ；Fujimori (1990) J. Amer. Chem. Soc. 112 7435 ；Urata, (1993)Nucleic AcidsSymposium Ser. No. 29 :69_70)。 當核苷酸鹼基是嘌呤(例如A或G)時，核糖的糖與核苷酸鹼基的N. sup. 9-位連結。當核 苷酸鹼基是嘧啶(例如C、T或U)時，戊糖的糖與核苷酸鹼基的Nl-位連結，但假尿苷例外， 其中戊糖的糖與尿嘧啶核苷酸鹼基的C5位連結(見例如Kornberg和Baker，(1992)DNA Replication,2nd Ed. , Freeman,San Francisco, Calif.)。核苷酸的戊糖碳中的一個或多個可被具有下述結構式的磷酸酯取代其中，α是 O至4的整數。在某些實施方式中，α是2，磷酸酯連結到戊糖的3』或5』碳上。在某些實 施方式中，核苷酸是這樣一些，其中，核苷酸鹼基是嘌呤、7_脫氮嘌呤、嘧啶或其類似物。「核 苷酸5，-三磷酸酯」指在5，位具有三磷酸酯的核苷酸，其一些時候被稱為「ΝΤΡ」或「dNTP」 以及「ddNTP」，以特別說明核糖的結構特徵。三磷酸酯基團可包括對若干氧的硫取代，例如， α -硫代核苷酸5，-三磷酸酯。關於核苷酸化學的綜述可在Shabarova，Ζ.和Bogdanov， A. Advanced Organic Chemistry of NucleicAcids, VCH, New York,1994 禾口 Blackburn 禾口 Gait等中找到。術語「核苷酸類似物」在本文中使用時表示這樣的實施方式，其中，核苷酸 的戊糖或核苷酸鹼基或一個或多個磷酸酯可被其各自的類似物替換。在某些實施方 式中，示例性的戊糖類似物是上文描述的那些。在某些實施方式中，核苷酸類似物具 有上文所述的核苷酸鹼基類似物。在某些實施方式中，示例性的磷酸酯類似物包括但不限於烷基磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸 酉旨、石西代 粦酸酉旨(phosphoroselenoates)、二 石西代 粦酸酉旨(phosphorodiselenoates)、 phosphoroanilothioates、苯胺磷酸酯(phosphoroanilidates)、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯 (boronophosphates)等，並可包括聯結的平衡離子。核苷酸類似物的定義中還包括可聚合成寡核苷酸類似物的單體，寡核苷酸類似物 中的DNA/RNA磷酸酯或糖磷酸酯骨架的至少一部分被不同類型的核苷酸間連接代替。示例 性的寡核苷酸類似物包括但不限於肽核酸(PNA)，其中，寡核苷酸的糖磷酸酯主幹被包含 醯胺鍵的肽主幹代替。應當理解，除非上下文顯然另有指明，術語「PNA」在本文中使用時包 括假互補 PNA(pcPNA)(見，例如，Datar 和Kim，Concepts in AppliedMolecular Biology, Eaton Publishing, ffestborough, Mass. ,2003,特別是 74—75 頁；Verma 和 Eckstein, Ann. Rev.Biochem. 67 :99_134，1998 ；Goodchild, Bioconj. Chem.，1 :165_187，1990 ；Braasch 和 Corey, Methods23 :97_107，2001 ；Demidov 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 99 :5953_58，1999)。核酸包括但不限於基因組DNA，cDNA, hnRNA, mRNA, rRNA, tRNA,小RNA分子，其包 括但不限於miRNA和miRNA前體，siRNA，stRNA, snoRNA,其它非編碼RNA (ncRNA)，片段化的 核酸，從核、胞質、亞細胞的細胞器(例如線粒體或葉綠體)獲得的核酸以及從生物樣品上 或之中存在的微生物或DNA病毒或RNA病毒獲得的核酸。核酸可由單種類型的糖基元構成，例如，在RNA和DNA的情況下；或者可由不同 糖基元的混合物構成，例如，在RNA/DNA嵌合體的情況下。在某些實施方式中，核酸是根據 下述結構式的核糖寡核苷酸和2』 -脫氧核糖寡核苷酸其中每個B獨立地是核苷酸或者 核苷酸類似物的鹼基基元，例如，嘌呤、7-脫氮嘌呤、被一個或多個經取代的烴類取代的嘌 呤或嘌呤類似物、嘧啶、被一個或多個經取代的烴類取代的嘧啶或嘧啶類似物、或核苷酸 類似物；每個m定義各核酸的長度，其可從零至數千、數萬或者更多；每個R獨立選自包含 氫、滷素、-R"、-0R"和-NR" R"，其中每個R"獨立地是(C1-C6)烷基、(C2-C7)醯基或 (C5-C14)芳基、氰基、疊氮基的組，或者兩個相鄰的R—起形成鍵，使得核糖是2』，3』-二脫 氫核糖；並且每個R』獨立地是羥基或者其中α是O、1或2。在上文闡述的核糖寡核苷酸和2』 -脫氧核糖寡核苷酸的某些實施方式中，核苷酸 鹼基B與如上文所述的糖基元的Cl』碳共價連結。術語「核酸」、「核酸序列」、「多核苷酸」和 「寡核苷酸」還包括核酸類似物、多核苷酸類似物和寡核苷酸類似物。術語「核酸類似物」、 「多核苷酸類似物」和「寡核苷酸類似物」可互換使用，在本文中它們表示含有核苷酸類似 物或磷酸酯類似物或戊糖類似物的核酸。核酸類似物的定義中還包括這樣的核酸，其中， 磷酸酯或糖磷酸酯連接被其它類型的連接代替，例如，N-(2-氨基乙基)-甘氨酸醯胺和其 它醯胺(見例如 Nielsen 等人，1991，Science 254 1497-1500 ；PCT 公開 No. WO 92/20702 ； U. S. Pat. Nos. 5，719，262 和 5，698，685)；嗎啉代(見例如 U. S. Pat. No. 5，698，685 ； U. S. Pat. No. 5，378，841 ；U. S. Pat. No. 5，185，144)；氨基甲酸酯(見例如 Stirchak & Summerton, J. Org. Chem. 52 -.4202,1987)；亞甲基(甲基亞氨基)(見例如 Vasseur 等人， J.Am· Chem. Soc. 114:4006,1992) ；3'-硫甲縮酸(3' -thioformacetals)(見例如 Jones 等人，1993，J. Org. Chem. 58 2983)；氨基磺酸酯(見例如 U. S. Pat. No. 5，470，967) ；2-氨 基乙基甘氨酸，通常稱為PNA(見例如PCT公開No. WO 92/20702 ；Nielsen, Science 254 1497-1500，1991)和其它(見例如 U. S. Pat. No. 5，817，781 ；Frier&Altman, Nucl. AcidsRes.25:4429，1997以及其中引用的文獻)。磷酸酯類似物包括但不限於(i)Cl_C4烷基磷酸酯，例如甲基磷酸酯；(ii)氨基磷酸酯；(Ui)C1-C6烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷 酸酯和(ν) 二硫代磷酸酯。還見 Scheit，Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, (1980) ；Englisch, Agnew.Chem. Int. Ed. Engl. 30 :613_29,1991 ；Agarwa1, Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Humana Press,1994 禾口 S. Verma 禾口 F. Eckstein,Ann. Rev. Biochem. 67 :99_134，1999。術語「報導基團」在本文中以廣義使用，其表示任何可被鑑定的標籤、標記或基元。 本領域技術人員將知道，很多不同種類的報導基團可用於本發明的教導中，可獨立使用或 與一種或多種不同的報導基團組合使用。術語報導基團還包括多元間接報導系統的元件， 這包括但不限於，親和性標籤；以及多元相互作用報導基團或報導基團對，例如，螢光報導 基團-淬滅劑對，這包括但不限於，包含螢光淬滅劑和黑暗淬滅劑(也被稱為非螢光淬滅劑 (NFQ))的對。術語「閾值循環」或「CT」在提到定量或實時分析方法時使用，就本發明教導的目 的而言，其表示待分析物、擴增子及包括但不限於它們中任何的一條或兩條鏈的量達到固 定閾值或限制時的分次的循環數。可通過使用者人工設定閾值，或者通過實時儀器的軟體 來確定。示例性的實時儀器包括ABI PRISM 7000序列檢測系統、ABI PRISM 7700序列 檢測系統、ABI PRISM 7900HT序列檢測系統、ABI PRISM 7300實時PCR系統(Applied Biosystems) >Smart Cycler 系統(Cepheid,由 FisherScientific 提供)>LightCycler 系 統(Roche Molecular)和 Mx4000 (Stratagene，La Jolla，Calif.)。在某些實施方式中，此 類實時定量包含報導探針(其包括但不限於傳統的報導探針和本發明教導的報導探針)， 嵌入染料(這包括但不限於FAM/TAMRA探針、溴化乙啶和SYBR Green I或其等同物)或 者此類報導探針和嵌入染料。關於實時分析的描述可在Essentials of Real Time PCR， Applied Biosystems P/N 105622,2002 ；PCR :The Basics from background to bench, McPherson和 Moller，BiosScientific Publishers Limited,Oxford UK,2000(" PCR :The Basics")，特別是 3. 3 部分；Real-Time PCR :An Essential Guide, Edwards 等人，eds.， Horizon Bioscience, Norwich, UK 禾口 Handbook of Fluorescent Probes andResearch Products,9. sup. th ed. ,R. Haugland,Molecular Probes,Inc. ,2002(" Molecular Probes Handbook")，特別是8. 3部分等中找到。術語「第一產物」指這樣的核苷酸序列，其在當第一引物組的反向引物(與相應靶 核苷酸的第二區域雜交)在引物延伸反應中被延伸酶延伸時產生。當靶寡核苷酸是RNA分 子，例如但不限於小RNA分子時，第一產物可被稱為反轉錄產物。本領域技術人員將知道， 根據本發明教導，第一產物的產生至少與傳統RT-PCT技術中產生逆轉錄本類似。在本文中使用時，術語「寡核苷酸結合部分」指正向引物中與相應靶的第一區域相 同的序列，或者反向引物中與相應靶的第二區域互補的序列。本領域技術人員將知道，當靶 是多核苷酸時，術語「寡核苷酸結合部分」可與術語結合寡核苷酸部分互換使用，當靶是小 RNA分子時，術語「小RNA分子結合部分」可與術語寡核苷酸結合部分互換使用。因此，術 語寡核苷酸結合部分、結合寡核苷酸部分和小RNA分子結合部分在分別提到一般性的靶序 列、寡核苷酸靶和小RNA分子靶時使用。術語「引物結合部分」指第一引物組的正向引物或 反向引物中與第二引物組中的相應引物特異性雜交的序列。典型地，第二引物組的引物被用於使第一產物、第一擴增子、額外的第一擴增子或其組合得以擴增，這包括但不限於包括 多個擴增循環，例如PCR的技術。在某些實施方式中，第二引物組的引物被用於擴增相應的 第一產物、相應的第一擴增子的鏈、相應的額外的第一擴增子的鏈、相應的第二擴增子的鏈 或其組合。術語「通用鹼基」或「通用核苷酸」在本文中一般可互換使用，其表示可取代寡核苷 酸中天然核苷酸或天然鹼基中超過一個的核苷酸類似物(包括核苷類似物)。通用鹼基典 型含有芳香環基元，其可以含有或可以不含氮原子，並且通常使用芳香環堆疊，以穩定雙鏈 體。在某些實施方式中，通用鹼基可與戊糖的c-r碳共價連結以形成通用核苷酸。在某些實 施方式中，通用鹼基不與其它核苷酸鹼基形成特異性的氫鍵。在某些實施方式中，核苷酸鹼 基可通過疏水堆疊與相同核酸鏈上相鄰的核苷酸鹼基相互作用。通用核苷酸和通用鹼基包 括但不限於脫氧-7-氮雜吲哚三磷酸酯(d7AITP)、脫氧異喹諾酮(deoxyisocarbostyril) 三磷酸酯(dICSTP)、脫氧丙炔基異喹諾酮三磷酸酯(dPICSTP)、脫氧甲基-7-氮雜吲哚 三磷酸酯(dM7AITP)、deoxylmPy triphosphate (dlmPyTP) (dlmPyTP)、脫氧 PP 三磷酸酯 (dPPTP)、脫氧丙炔基-7-氮雜吲哚三磷酸酯(dP7AITP)、3-甲基異喹諾酮(MICS)、5_甲基 異二價碳基(5-methyl isocarbyl) (5MICS)、咪唑4_甲醯胺、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、次 黃嘌呤、肌苷、脫氧肌苷、5-氟脫氧尿苷、4-硝基苯並咪唑(4-nitrobenzimidizole)和PNA 鹼基，包括PcPNA鹼基。關於通用鹼基的描述可在Loakes，Nucl. Acids Res. 29 =2437-47, 2001 ；Berger 等人，Nucl. Acids Res. 28 :2911_14，2000 ；Loakes 等人，J. Mol. Biol. 270 426-35，1997 ；Verma 和 Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 67 :99_134，1998 ；公開的 PCT 申請 No. US02/33619 和 U. S. Pat. Nos. 6，433，134 和 6，433，134 等中找到。術語「寡核苷酸靶」、「靶寡核苷酸」或「靶」表示將要使用本發明教導的方法和試 劑盒對其身份、存在、不存在和/或量加以評估的核酸序列。在某些實施方式中，靶序列包 含寡核苷酸，其可包含或可不包含脫氧核糖核苷酸，或者RNA分子，例如miRNA前體，這包括 但不限於初級miRNA、前體miRNA或初級miRNA和前體miRNA。在一些實施方式中，寡核苷 酸靶包含小RNA分子，這包括但不限於miRNA、siRNA、stRNA、snoRNA、其它ncRNA等。術語「報導探針」指核苷酸、核苷酸類似物或者核苷酸及核苷酸類似物的序列，其 與擴增子結合或退火，當被檢測時(包括但不限於強度或發射波長的變化)用於對相應 的靶寡核苷酸進行鑑定和/或定量。大多數報導探針可基於其作用模式加以分類，例如 但不限於核酸酶探針，包括但不限於TaqMan 探針(見例如Livak，Genetic Analysis BiomolecularEngineering 14 :143_149,1999 ；Yeung 等人』 BioTechniques 36 :266_75， 2004)；延伸探針，例如蠍引物、Lux 引物、Amplifluors等；雜交探針，例如分子信標、 Eclipse探針、點亮(light-up)探針、單標記報導探針的對、雜交探針對等；或其組合。在 某些實施方式中，報導探針包含醯胺鍵、LNA、通用鹼基或其組合，並且包含莖_環和無莖報 道探針構型。某些報導探針是經單標記的，而其它一些報導探針是雙標記的。在相鄰雜交 探針之間包含FRET的雙探針系統也在術語報導探針的意欲範圍內。在某些實施方式中，報導探針包含螢光報導基團、淬滅劑報導基團(包括但不限 於黑暗淬滅劑和螢光淬滅劑)、親和性標籤、雜交標籤、雜交標籤互補體或其組合。在某些實 施方式中，包含雜交標籤互補體的報導探針與相應雜交標籤退火，多組分報導基團的成員 之一與包含多組分報導基團的相應成員的報導探針結合，或其組合。示例性報導探針包括TAM/FAMRA探針、TaqMan探針；蠍探針(也被稱為蠍引物)、Lux 引物、FRET引物、Ec 1 ipse 探針、分子信標，包括但不限於基於FRET的分子信標、多色分子信標、適配體信標、PNA信標 和抗體信標；經報導基團標記的PNA鉗夾、經報導基團標記的PNA開啟子(openers)、經報 道基團標記的LNA探針以及包含納米晶體的探針、金屬納米顆粒和類似的雜交體探針(見 例如 Dubertret 等人，Nature Biotech. 19 365-70,2001 ；Zelphati 等人，BioTechniques 28 :304-15，2000)。在某些實施方式中，報導探針檢測包含螢光偏振檢測(見例如Simeonov 和 Nikiforov, Nucl. AcidsRes. 30 :e91，2002)。除了此類傳統的報導探針之外，本發明教導的報導探針可用於對相應靶寡核苷 酸進行檢測、鑑定和定量。本發明教導的報導探針包括缺口探針、某些嵌合探針和包含嵌 合序列的缺口探針。缺口探針被設計為與擴增子中是小RNA分子的缺口序列的副本的序 列(即，小RNA分子中與相應正向引物的寡核苷酸結合部分不相同並且與相應反向引物的 寡核苷酸結合部分也不互補，但位於這些序列之間的序列)特異性雜交。報導探針包括 (i)同源多聚探針以及(ii)異源多聚探針或嵌合探針。本發明教導的示例性同源多聚探 針包括但不限於，DNA探針、RNA探針、LNA探針、2' 0-烷基核苷酸探針、氨基磷酸酯探針 (phosphoroamidite)(例如但不限於，N3' -P5'氨基磷酸酯探針和嗎啉代氨基磷酸酯探 針)、2'-氟-阿拉伯糖核酸(FANA)探針、環己烯核酸(CeNA)探針、三環-DNA(tcDNA)探 針和 PNA 探針(見，例如 Kurreck，Eur. J. Biochem.，270 1628-44，2003)。嵌合探針包括但 不限於DNA-PNA嵌合探針、DNA-LNA嵌合探針、DNA-2' 0-烷基嵌合探針等。在某些實施方 式中， 此類DNA嵌合探針包含通常(但非總是)位於探針5』末端的至少兩個脫氧核糖核苷 酸。報導探針還包含報導基團，在某些實施方式中，其包含螢光報導基團-淬滅劑對。 在某些實施方式中，報導探針被設計為，僅與擴增子中發現的缺口序列或缺口序列的互補 序列雜交。本領域技術人員將知道，甚至存在人造「引物二聚體」(其一些時候伴隨某些擴 增技術並且可能含有靶寡核苷酸共有的一些序列)時，也僅真正的擴增子將含有缺口序列 或其互補序列，並且由此可與公開的僅與缺口雜交的報導探針穩定雜交(假設適當的嚴緊 度條件，本領域技術人員理解，其可使用多種公知算法來計算或根據經驗確定)。在某些實 施方式中，報導探針的擴增子結合部分被設計為，與擴增子中發現的缺口序列或缺口序列 互補序列雜交，並且也與缺口序列相鄰的幾個核苷酸雜交，典型地為擴增子缺口序列一側 或兩側的一個或兩個額外的核苷酸。在某些實施方式中，本發明公開了嵌合報導探針，其包含報導基團、兩個或多個 脫氧核糖核苷酸以及下遊的數個核苷酸類似物。典型地，選擇此類核苷酸類似物，因為它 們不易用作為DNA聚合酶或反轉錄酶的模板，並且因此在引物延伸反應期間不會被擴增。 示例性的不可延伸的核苷酸類似物包括但不限於，經鎖定的核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和 2' 0-烷基核苷酸，例如但不限於2' 0-甲基核苷酸和2' 0-乙基核苷酸。在某些實施方 式中，嵌合報導探針包含報導基團和位於至少四個PNA上遊的至少兩個脫氧核糖核苷酸。 在某些實施方式中，嵌合報導探針包含螢光報導基團-淬滅劑對。在某些實施方式中，螢光 報導基團位於至少兩個脫氧核糖核苷酸上遊或者與兩個脫氧核糖核苷酸中至少一個連結， 並且淬滅劑位於下遊(或者反過來)，以形成螢光報導基團_淬滅劑對，其可以或可以不包 含螢光共振能量轉移(FRET)。本領域技術人員將知道，此類報導探針可特別有用於某些檢測技術，例如，核酸酶檢驗，這包括但不限於TaqMan. RTM.檢驗。公開的第一引物組包括正向引物和反向引物，每種包含顯著地較短寡核苷酸結合 部分，即，正向引物含不超過2個的與第一靶區域具有相同序列的核苷酸，反向引物含不超 過2個的與第二靶區域互補的核苷酸。在某些實施方式中，正向引物的寡核苷酸結合部分 有2、3、4、5、6或7個核苷酸，其與靶的相應第一區域具有相同序列。在某些實施方式中，反 向引物的寡核苷酸結合部分有2、3、4、5、6或7個核苷酸，其與靶的相應第二區域互補。在 某些實施方式中，正向引物和反向引物還包含位於寡核苷酸結合部分上遊的額外部分，且 可以(但不必一定)是引物結合部分。當其存在的時候，可將此類引物結合部分設計為與 相應第二引物組的各引物選擇性雜交。因此，當併入擴增子時，使用相應的第二引物組和合 適延伸酶的額外擴增是可能的。本發明教導的第二引物組包含第一引物和第二引物，它們被設計為分別和擴增子 中與相應第一引物組的正向和反向引物的引物結合部分對應的區域退火。在某些實施方式 中，第二引物組的引物是通用引物。在某些實施方式中，第二引物組包含通用正向引物和通 用反向引物。在某些實施方式中，第二引物組的引物還包含雜交標籤、親和性標籤、報導基 團或其組合。在某些實施方式中，雜交標籤允許相應擴增子得以被鑑定。在某些實施方式 中，第二引物組的第一引物包含第一通用引導(priming)序列，同時相應第二引物組的第 二引物包含第二通用引導序列。在某些實施方式中，第二引物組的一條引物包含通用引導 序列，而相應第二引物組的另一條引物包含雜交標籤，其包括但不限於，隨後可用於鑑定相 應的擴增子的獨特的雜交標籤。本發明教導的第一引物組的引物、第二引物組的引物和報導探針的結合部分長 度足以允許與相應靶序列、相應擴增子的互補區域特異性退火。用於設計序列特異性核 酸引物和報導探針的標準是本領域公知的。關於核酸引物和報導探針設計的詳細報導 可在 Diffenbach 禾口 Dveksler，PCRPrimer，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press (1995) ；R. Rapley, The Nucleic Acid Protocols Handbook (2000)，Humana Press， Totowa，N. J. ( " Rapley ) ;Schena 和 Kwok 等人，Nucl. Acid Res. 18 :999_1005 (1990) 等中找到。引物和報導探針設計軟體程序也是商業可獲得的，其包括但不限於=Primer Express, Applied Biosystems ；PrimerPremier and Beacon Designer 軟 件，PREMIER Biosoft International, PaloAlto, Calif. ；Primer Designer 4, Sci—Ed 軟體，Durham, N. C. ；PrimerDetective, ClonTech, Palo Alto, Calif. ；Lasergene, DNASTAR, Inc., Madison, Wis. ；Oligo 軟 件，National Biosciences, Inc., Plymouth, Minn. ；iOligo, Caesar 軟體,Portsmouth,N. H.禾口 RTPrimerDB (網際網路上 realtimeprimerdatabase. ht. st 或 medgen31. urgent, be/primerdatabase/index)(還見 Pattyn 等人，Nucl. Acid Res. 31 122-23,2003)。本領域技術人員理解，可使用本發明的教導和本領域已知的常規方法，經驗性地 確定適用於公開的方法和試劑盒的引物和報導探針，而無須過多實驗。例如，可使用計算 機算法，通過從相關科學文獻(包括但不限於合適的資料庫)選擇候選靶寡核苷酸，來 獲得合適的引物、引物組和報導探針(見，例如miRNA Registry，網際網路上sanger-ac. uk/Software/Rfam/miRNA/index ；MiRscan,可於 genes/mit. edu/mirscan 網絡獲得； miRseeker ；和 Carter 等人，Nucl. Acids Res. 29 (19) :3928_38，2001)。當確定了目的寡核苷酸之後，可使用公知的合成技術，來合成測試引物和/或報導探針，可在公開的 方法和試劑盒中對其適用性加以評估(見例如Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry, Beaucage 等人編輯，John Wiley & Sons，NewYork, N. Y.，包括 2004 年 8 月的 更新("Beaucage 等人，，)；Blackburn 禾口 Gait ；Glen Research 2002 Catalog, Sterling, Va. ；The Glen Report 16(2) 5,2003, Glen Research ；Synthetic Medicinal Chemistry 2003/2004，Berry 禾口 Associates，Dexter, Mich.禾口 PNA Chemistry for the Expedite 8900Nucleic Acid Synthesis System User' s Guide, Applied Biosystem)。本令頁域技 術人員將知道，可通過併入小溝槽結合子、用合適的核苷酸類似物取代核苷酸(即嵌合探 針)，或使用包含合適類似物的同源多聚探針(包括但不限於PNA寡聚探針或LNA寡聚探 針，其有或沒有溝槽結合子)等，來增加引物或報導探針的熔融溫度(Tm)。
術語「延伸酶」指能催化雜交的引物以模板依賴性方式在合適的反應條件(包括 但不限於，合適的核苷酸三磷酸酯、輔助因子、緩衝液等)下5』 -3』延伸的多肽。典型地， 延伸酶是DNA聚合酶，例如但不限於RNA依賴性的DNA聚合酶(其包括但不限於反轉錄 酶)，DNA依賴性的DNA聚合酶，其包括這樣的DNA聚合酶至少在某些條件下，具有這些 DNA聚合酶類別中的兩種的性質，其包括這些中每種的酶活性突變體或變體。在某些實施 方式中，延伸酶是反轉錄酶，包括其酶活性突變體或變體，例如但不限於，逆病毒反轉錄酶， 例如禽類成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶和莫洛尼小鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶。在 某些實施方式中，延伸酶是DNA聚合酶，這包括其酶活性突變體或變體。某些DNA聚合酶 在一定條件下具有反轉錄酶活性，例如但不限於，嗜熱棲熱菌屬(ThermusthermophiIus) 的DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶，E.C. 2. 7. 7. 7)，其在存在Mn2+而不是Mg2+時展示出反 轉錄活性(還見GeneAmp AccuRT RNAPCR試劑盒和Hot Start RNA PCR試劑盒，其包 含源於嗜熱棲熱菌屬Z05種的重組聚合酶，兩者均來自Applied Biosystems) 0類似地， 某些反轉錄酶在某些反應條件下具有DNA聚合酶活性，這包括但不限於AMV反轉錄酶和 MMLV反轉錄酶。對用於公開的方法和試劑盒的合適的DNA聚合酶的描述可在Lehninger Principles of Biochemistry,第三版，Nelson 禾口 Cox, Worth Publishing, New York, N. Y.，2000 ( 「 Lehninger 「)，特別是第 26 和 29 章；R. M. Twyman, Advanced Molecular Biology :A ConciseReference. Bios Scientific Publishers, New York, N. Y. (1999)禾口 EnzymaticResource Guide !Polymerases, Promega, Madison, Wis. (1998)等中找至丨J。其酶 活性突變體或變體也明確處於術語延伸酶的意欲範圍內，經修飾以賦予不同的溫度敏感性 性質的酶也在內(見，例如，U. S. Pat. Nos. 5，773，258 ；5，677，152 和 6，183，998)。在某些實施方式中，引物、擴增子或引物和擴增子包含報導基團。在某些實施方式 中，包含報導基團的引物通過引物延伸併入擴增子。在某些實施方式中，當經報導基團標 記的dNTP在引物延伸或其它擴增技術階段併入的情況下，擴增子包含併入進擴增子的報 道基團。報導基團可在合適的條件下發射螢光、化學發光、生物發光、磷光或電化學發光信 號。示例性的報導基團包括但不限於螢光團、放射性同位素、色原、酶、抗體(包括但不限 於表位標籤)、半導體納米晶體(例如量子點(quantum dots))、重金屬、染料、磷光基團、化 學發光基團、電化學檢測基元、親和性標籤、結合蛋白、磷光體、稀土螯合劑、過度金屬螯合 齊U、近紅外染料(其包括但不限於"Cy7SPh. NCS」、「Cy70phEt. NCS」、「Cy70phEt. CO2Su"和 IRD800(還見 J. Flanagan 等人，Bioconjug. Chem. 8 :751-56 (1997)和 DNA Synthesis withIRD800 Phosphoramidite，LI-COR Bulletin #111，LI—COR，Inc.，Lincoln, Nebr.))、電化 學發光標記(包括但不限於三聯吡啶(triS(bipyridal))釕(II)(也被稱為Ru (bpy) 32+)、 0s(l, 10-菲咯啉)2雙(二苯基膦基)乙烷2+ (也被稱為Os (phen) 2 (dppene)2+)、魯米諾/過 氧化氫、Al (羥基喹啉-5-磺酸)、9，10- 二苯基蒽-2-磺酸酯和tris (4-乙烯基-4'-甲 基_2，2' -二吡啶基)釕(11)(也被稱為Ru(v-bpy32+)))等。術語報導基團還包括多元間接報導系統的元件，其包括但不限於，親和性標籤 (例如生物素抗生物素蛋白、抗體抗原、配體受體(包括但不限於結合蛋白與它們的 配體))等，其中，一個元件與系統的一個或多個其它元件相互作用，以實現針對可檢測信 號的潛力。示例性的多元報導系統包括包含生物素受體基團的寡核苷酸和綴合有鏈黴 抗生物素的螢光團，或者反過來；包含DNP報導基團的寡核苷酸和經螢光團標記的抗DNP 抗體；等等。在某些實施方式中，報導基團，特別是多元報導基團，並不一定用於檢測，而 是用作為親和性標籤用於分離/分開，這例如但不限於，生物素報導基團和鏈黴抗生物素 塗布的底物，或者反過來；地高辛報導基團和包含抗地高辛抗體或地高辛結合適配體的 底物；DNP報導基團和包含抗DNP抗體或DNP結合適配體的底物；等等。關於將報導基 團和寡核苷酸，寡核苷酸，肽，抗體和其它蛋白，單、二和寡糖、有機分子等連結的詳細方 案可在 G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 ； Beaucage 等 人；Molecular Probes Handbook 禾口 PierceApplications Handbook and Catalog 2003-2004,Pierce Biotechnology,Rockford,111. ,2003 ("Pierce Applications Handbook」)等中找到。
多元相互作用報導基團也在術語報導基團的範圍內，例如螢光-淬滅劑對，這包 括但不限於螢光淬滅劑和黑暗淬滅劑(也被稱為非螢光淬滅劑)。螢光淬滅劑可吸收螢光 團發射的螢光信號，吸收足夠的螢光能量之後，螢光淬滅劑可發射出特徵波長的螢光，例如 螢光共振能量轉移。例如(但非限制)，FAM-TAMRA對可在492nm處(FAM的激發峰)被照 射，並在580nm處(TAMRA的發射峰)發射螢光。與螢光報導基團合適配對的黑暗淬滅劑從 螢光團吸收螢光能量，但是自身並不發螢光。相反，黑暗淬滅劑消耗吸收的能量(典型地， 作為熱)。示例性的黑暗或非螢光淬滅劑包括Dabcyl、黑洞淬滅劑、Iowa Black、QSY-7、 AbsoluteQuencherjclipse非螢光淬滅劑、金屬簇(例如金納米顆粒)等。某些包含螢光 團-淬滅劑的經雙標記的探針可在對中成員物理分離時發射螢光，例如但不限於，核酸酶 探針，例如TaqMan 探針。包含螢光團-淬滅劑對的其它一些經雙標記的探針可在對中成 員空間上分離時發射螢光，例如但不限於雜交探針(例如分子信標)或延伸探針(例如蠍 引物)。螢光團_淬滅劑對是本領域公知的，它們可廣泛地用於多種報導探針中(見例如 Yeung ^A, BioTechniques36 266-75,2004 ；Dubertret 等)κ, Nat. Biotech. 19 365-70, 2001 和 Tyagi 等人，Nat. Biotech. 18 :1191_96，2000)。在某些實施方式中，報導基團包含電化學發光基團，其在合適的條件下，能發射 可檢測到的電產生的化學發光(ECL)。ECL中，電化學發光基元的激發是電化學驅動的， 化學發光的發射可被光學檢測到。示例性的電化學發光報導基團種類包括Ru (bpy) 32+和 Ru(v-bpy)32+(發射波長為 620nm)、Os (phen) 2 (dppene) 2+(發射波長為 584nm)、魯米諾 / 過 氧化氫(發射波長為425nm)、AI (羥基喹啉_5_磺酸)(發射波長為499nm)和9，10- 二 苯基蒽-2-磺酸酯(發射波長為428nm)等。經修飾從而適應摻入探針的這三種電化學發光報導基團種類的形式是商業可獲得的，或者可使用本領域已知的技術來合成，無須過多 實驗。例如，已經描述了用於通過氨基連接子基團與核酸序列偶聯的Ru(bpy)32+N-羥基琥 珀醯亞胺酯(見U. S. Pat. No. 6，048，687)；可使用類似方法合成Os (phen) 2 (dppene)2+和 Al(HQS)33+的琥珀醯亞胺酯並將其與核酸序列連結。可使用商業可獲得的ru-亞磷醯胺 (IGEN International, Inc.，Gaithersburg, Md.)，將 Ru(bpy)32+ 電化學發光報導基團以合 成方式併入核酸序列(見例如 Osiowy, J. Clin. Micro. 40 =2566-71, 2002)。此外，釕、鋨、鉬、鈀和其它過度金屬的其它多聚芳香族化合物已展示出電化 學發光性質。關於ECL和電化學發光基元的詳細描述可在A. Bard和L. Faulkner， Electrochemical Methods, John Wiley & Sons(2001) ；Μ· Collinson禾口Μ· Wightman,Anal. Chem. 65 2576(1993) ；D.Brunce 禾口 Μ· Richter，Anal. Chem. 74 :3157 (2002) ；A. Knight, Trends in Anal. Chem. 18 47(1999) ；B. Muegge 等 A, Anal. Chem. 75 1102 (2003)； H. Abrunda 等人，J. Amer. Chem. Soc. 104 2641 (1982) ；K. Maness 等人，J. Amer. Chem. Soc. 118 :10609 (1996) ；M. Collinson 和 R. ffightman, Science268 1883et seq. (1995) 和U. S. Pat. No. 6，479，233等中找到(關於磷光鑭系和過度金屬報導基團的討論還見 0' Sullivan 等人，Nucl. Acids Res. 30 :ell4，2002)。II.技術本發明的方法涉及對目的已知寡核苷酸加以定量，其特別涉及(但不限於)小RNA 分子，例如miRNA、siRNA、stRNA和其它ncRNA。在此類方法中，靶寡核苷酸的序列是已知的， 可基於已知序列來設計第一引物組(例如反轉錄酶、正向、反向引物)和報導探針。可將第 二引物組設計來用作為(i)用於各第一擴增子和額外的第一擴增子的擴增引物，其可以 編碼或不編碼用於隨後分離和/或鑑定的靶特異性雜交標籤，(ii)通用引物，例如但不限 於對多種第一擴增子和/或額外的第一擴增子的多路擴增，典型地，以均一方式進行，或者 (iii)通用引物和編碼靶特異性雜交標籤的靶特異性引物的組合。公開的其它一些方法涉及對未知靶寡核苷酸的鑑定，其特別涉及但不限於小RNA 分子，例如miRNA、siRNA、stRNA和其它ncRNA。目的序列不是已知的，雖然序列信息可部 分已知或可被預測。就闡述目的而非限制而言，若干miRNA預測算法是可獲得的(見，例 如，MiRscan,可從 genes/mit. edu/mirscan 獲得；miRseeker ；禾口 Carter 等人，Nucl. Acids Res. 29(19) :3928_38，2001)。可對科學文獻和可獲得的資料庫(見，例如，miRNARegistry， 可從sanger-ac. uk/Software/Rfam/miRNA/index網際網路獲得)加以分析，以在潛在miRNA 靶的一個或兩個末端鑑定出可能的同源性區域，可使用常規實驗對其進行進一步評估。針 對可能的莖環結構，對gDNA的生物信息學檢索也可顯示出潛在的miRNA靶，用於根據本發 明的教導對其加以評估。此外，可使用公開的方法和組合物，經驗性地對未知序列加以鑑 定。在一些實施方式中，用於鑑定寡核苷酸靶(包括但不限於小RNA分子)的第一引物組 中的一條或兩條引物包含寡核苷酸結合部分，其中包括至少2、3、4、5、6或7個隨機或簡併 核苷酸，這包括但不限於通用鹼基。本發明部分基於下述發現反轉錄酶引物的設計對於方法靈敏度來說是極其重要 的。對反轉錄酶(RT)引物的設計對於獲得大的動態範圍來說是重要的。RT-引物可歸為三 部分，即A. SRS序列(SiRNA相關序列)
B.探針序列C.反向引物序列A. SRS 序列當存在與RT-引物3』末端的最後兩個核苷酸互補的可少至2個核苷酸時，反轉錄 酶能將RNA或DNA分子轉錄為cDNA。關於反轉錄酶引物的設計，適用特別的規則。重要的 是，⑴在RT-引物設計中，防止SRS序列的3』末端以序列組合GC、CG、AT或TA結尾，因為 該RT-引物能形成二聚體並自身轉錄。為避免這種情況，如果3』末端具有任何上述序列，應 當延長或縮短SRS序列，使得其以GT、GA、CT或CA結尾；⑵在RT-引物設計中防止與SRS 序列的3』末端的互補重複。例如，如果3』末端編碼GT，則在RT-引物內部的任何地方都不 能允許AC存在。如果在SRS序列中有AC序列，則延長或縮短SRS序列；以及(3) SRS序列 長度可在少至2個至11個核苷酸的範圍內變化。例如，SRS序列覆蓋siRNA序列的大部分 是可能的，例如，如果siRNA有19個核苷酸長，那麼SRS序列可以有17個核苷酸長。B.探針序列探針序列大小可在17至30個核苷酸之間變化。序列可與正義或反義鏈互補。探 針序列並不限於RT-引物，但是其可以跨越siRNA序列的一部分。可用不同的螢光標記(例 如VIC、JOE、TAMRA, FAM、CY3、CY5等)組合不同的淬滅劑(例如TAMRA、BHQ等)對探針加 以標記。在PCR中使用經特異性標記的探針允許進行多路RT-PCR。這允許在相同生物樣品 中同時測量例如siRNA水平、siRNA-靶mRNA水平和內對照。C.反向引物序列反向引物序列長度可變化，但當與正向引物組合使用時，必須要能產生唯一的PCR產物。當設計引物用於反應時，在反向引物的3』末端和反轉錄引物的3』末端之間沒有 序列重疊。關於正向引物和反轉錄引物，如果有太多的序列重疊，將導致反轉錄引物以不依 賴模板的方式擴增。在正向引物和反向引物的3』末端之間有少至3個核苷酸的重疊是足 夠的。為防止這種情況，可使得重疊最小化為最多2個核苷酸的重疊。雖然這些方法的某些實施方式使用「RT-PCR-PCR樣」的擴增技術，但也可考慮其 它擴增技術。此外，公開的方法的某些實施方式包含單一反應組合物(其中產生擴增子)。 其它一些實施方式包含兩種或多種反應組合物，包括但不限於多種形式，其中包含第一反 應組合物(其中產生第一產物、第一擴增子和額外的第一擴增子)和多種不同的第二反應 組合物(其中產生第二擴增子)。就闡述目的而言(但不以任何方式限制本發明的教導)，關於某些公開的方法的 一些方法的綜述參見圖1。示例性的siRNA靶與第一引物組的相應反轉錄引物雜交，在存在 延伸酶的情況下，雜交的反轉錄引物延伸，形成單鏈拷貝DNA。本領域技術人員將知道，根據 傳統方法，在反轉錄引物可結合之前，對雙鏈siRNA進行變性(例如但不限於95°C 5分鐘)， 這通常在熱循環儀中進行。令人吃驚地，本發明的發明人觀察到，當靶是雙鏈siRNA時，反 轉錄引物可等溫併入，即無需變性步驟。在不受限於特定理論基礎的情況下，這可能是由於 siRNA-第一靶雙鏈體的濃度(典型地在10_15(fM)至10_12(pM)的範圍)相對第一引物組的 濃度(典型地在10_8(nM)至10_6( μ M)的範圍)導致的。在這些條件下，反轉錄引物可置換 siRNA-雙鏈體的5』末端，並可通過延伸酶而延長，甚至是在酶活性的非最優溫度下也可實現。例如，在其中靶是小RNA分子的某些實施方式中，在大約20°C孵育第一反應組合物若 幹分鐘(例如但不限於10-30分鐘)，然後將溫度升高至最優，或者至少增強延伸酶(典型 地，在此實施方式中是反轉錄酶)的活性。因此，在某些實施方式中，在產生單鏈拷貝DNA 的步驟之前，包括變性步驟，而在其它一些實施方式中，這是任選進行的。反應組合物的溫 度升高，以失活反轉錄酶(如果有的話)和/或活化第二延伸酶(如果適用的話，例如，「熱 啟始」聚合酶)。在第二反應中，在合適的反應條件下，正向引物與單鏈拷貝DNA雜交，其被第二延 伸酶(例如「熱起始」聚合酶)延伸，形成第一擴增子。在第二步驟中，反應組合物變性(例 如但不限於95°C或以上10-20秒)之後，將溫度降低(至例如但不限於大約60°C大約1 分鐘)，以允許反向引物與第一擴增子雜交，正向引物與單鏈拷貝DNA雜交，接著通過第二 延伸酶延伸這兩條引物。然後在變性溫度和退火/延伸溫度(例如，但不限於95°C或更高 10-20秒，然後大約60°C大約1分鐘)之間將反應組合物循環有限次循環(例如但不限於 35至50個循環)，以產生第一擴增子和額外的第二擴增子。在某些實施方式中，第一擴增子和額外的第一擴增子產生之後，加入第二引物組 以及任選加入延伸酶，形成第二反應組合物。在下文討論的其它一些實施方式中，在第一反 應組合物中包括第二引物組。將反應組合物加熱至足以使得第一擴增子和額外的第一擴增 子變性的溫度。冷卻反應混合物，以允許第二引物組的引物與第一擴增子或額外的第一擴 增子的分開的鏈雜交，通過延伸酶延伸第二引物組的雜交引物，產生第二擴增子，根據需要 重複循環。
在一種實施方式中，正向和反向引物是未經修飾的引物。在另一實施方式中，正向 或反向引物可經過修飾。此類修飾有助於增強引物針對靶的親和性和/或特異性。修飾的 例子包括但不限於2』 -烷氧基核糖核苷酸、2』烷氧基烷氧基核糖核苷酸、經鎖定的核酸核 糖核苷酸(LNA)、2』 -氟核糖核苷酸、嗎啉代核苷酸。在另一實施方式中，經修飾的核苷酸選自具有經修飾的下述核苷間連接的核苷 酸，所述連接選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯和醯胺連接。在某些實施方式中，加入第二引物組和任選的延伸酶時，向第二反應組合物中加 入報導探針。在其它一些實施方式中，在之後的步驟中加入報導探針。本領域技術人員將 知道，當檢測包含在核酸酶檢驗(包括但不限於TaqMan 檢驗)或探針延伸檢驗中使用報 道探針時，需要在反應組合物中包括合適的DNA聚合酶(其可以或可以不與第二延伸酶相 同)。循環反應(這取決於所使用的檢測檢驗的本質和報導探針)，檢測報導探針，對相應 的靶加以鑑定或定量。本領域技術人員將知道，檢測可包含多種具有不同作用機制的報導探針，並且，檢 測可以以實時或終點模式進行。還將知道，檢測可包含併入擴增子的報導基團，其可作為 經標記引物的一部分或者由於在擴增期間併入了經標記的dNTPs而併入，或者與擴增子連 結，這例如但不限於通過包含報導基團的雜交標籤互補序列或者通過連接子臂(整合的或 與擴增子連結)來進行。在公開的方法的某些實施方式中，形成單一反應組合物，在相同反應組合物中，典 型地在相同反應容器中，進行2、3或4個擴增步驟(取決於反應形式)。根據公開的方法的 某些實施方式中，第一反應組合物包含寡核苷酸靶、第一引物組和延伸酶；產生並檢測第一產物、第一擴增子、額外的第一擴增子或其組合；對靶寡核苷酸進行鑑定和/或定量。在某些實施方式中，單一反應組合物還包含第二引物組。第二引物組的第一和第 二引物用於擴增第一擴增子和/或額外的第一擴增子，產生第二擴增子。在某些實施方式 中，第二引物組的引物是通用引物。在某些實施方式中，第二引物組的兩條引物都包含通用 引物。在某些實施方式中，第二引物之一是通用引物，相應引物包含雜交標籤，該標籤典型 地編碼靶特異性序列，隨後可用其將第二擴增子與其相應的寡核苷酸靶關聯起來。在某些 實施方式中，第二引物組的引物包含親和性標籤。在某些實施方式中，用第二引物組的額外 的引物來循環第二擴增子，產生更多的第二擴增子。在某些實施方式中，檢測第二擴增子或 其代替品，對相應的寡核苷酸靶進行鑑定和/或定量。在某些實施方式中，寡核苷酸靶包含小RNA分子，延伸酶包含反轉錄酶或具有反 轉錄酶活性的DNA聚合酶，第一產物包含反轉錄產物。在某些實施方式中，使用至少兩種不 同的延伸酶，其中包括反轉錄酶和DNA聚合酶。在某些實施方式中，公開的方法包括形成至少兩種不同的反應組合物。大體上，針 對每種寡核苷酸靶，兩組引物組被用於在兩種不同的反應組合物中進行的三個或四個擴增 步驟中，所述步驟可以但是不必須發生於相同反應容器中。典型發生的擴增步驟包括將反 轉錄引物與寡核苷酸分子雜交，其中，反轉錄引物包含具有寡核苷酸識別序列的寡核苷酸 分子結合部分，所述序列包含位於3』區域與寡核苷酸分子的區域互補的至少2個核苷酸以 及位於5』區域的包含至少2個核苷酸的延伸尾；用第一延伸酶延伸雜交的反轉錄引物，產 生反轉錄產物；將正向引物與反轉錄產物雜交，其中正向引物包含寡核苷酸分子結合部分， 所述部分包含與寡核苷酸分子的區域相同的至少2個核苷酸；用第二延伸酶延伸雜交的正 向引物，產生第一擴增子；將反向引物與第一擴增子雜交；用第二延伸酶延伸雜交的反向 引物，產生與第一擴增子互補的第二擴增子；檢測擴增產物；以及由此對寡核苷酸分子進 行鑑定或定量。該反應可以但不必須包含實時檢測。在某些實施方式中，擴增步驟包含多 路技術。根據本發明的寡核苷酸靶可源於任何活的或者曾經活的生物，其包括但不限於原 核生物、古細菌(archaea)、病毒和真核生物。寡核苷酸靶還可以是合成的。寡核苷酸靶可 來自核，典型地是基因組DNA (gDNA)和RNA轉錄產物(包括但不限於某些miRNA前體和其它 一些小RNA分子)，或者可以是核外的，例如，胞質、質粒、線粒體、病毒等。本領域技術人員 知道，gDNA不僅包括全長材料，其還包括通過任何手段(例如但不限於，酶消化、超聲波處 理、剪切力等)產生的片段。在某些實施方式中，寡核苷酸靶可以以雙鏈或單鏈形式存在。多種方法可用於獲得用於本發明教導的方法和試劑盒的寡核苷酸靶。當從生物 基質獲得靶序列時，典型地，使用某些分離技術，包括但不限於(1)有機提取接著進行乙 醇沉澱，例如使用苯酚/氯仿有機試劑(見例如Ausbel等人，特別是第1卷，第2章，第 I部分)，在某些實施方式中，使用自動提取儀，例如Model 341 DNA Extractor (Applied Biosystems)來進行；(2)固定相吸附方法(見，例如 U. S. Pat. No. 5，234，809 ；Walsh 等 人，BioTechniques 10 (4) :506_513 (1991))和(3)鹽誘導的 DNA 沉澱技術(見例如 Miller等人，Nucl. Acids Res. 16(3) :9_10，1988)，此類製備方法典型地被稱為「鹽析」方 法。在某些實施方式中，上述分離方法之前可進行酶消化步驟，以幫助從樣品消除不想要 的蛋白質，例如用蛋白酶K或其它類似蛋白酶進行處理。見，例如，U.S.專利申請Ser.No. 09/724，613 ；還見 U. S.專利申請 Ser.Nos. 10/618，493 和 10/780, 963 以及 U. S.臨時 專利申請Ser. Nos. 60/499，082和60/523，056。還可使用多種可商業獲得的試劑盒和儀 器來獲得靶寡核苷酸，這包括但不限於小RNA分子及其前體，例如但不限於ABI PRISM . TransPr印系統、BloodPi^p . Chemistry、ABIPRISM 6100 Nucleic Acid Pr印Station 和 ABI PRISM 6700 自動核酸工作站(所有都來自 Applied Biosystems) ；SV96 Total RNA 分離系統和 RNAgents .總 RNA 分離系統(Promega，Madison, Wis.) ；mirVanamiRNA 分離 試劑盒(Ambion，Austin，Tex.)和Absolutely RNA 純化試劑盒和Micro RNA分離試劑盒 (Stratagene, La Jolla, Calif.)。
在某些實施方式中，可對樣品中的寡核苷酸分子進行限制酶切割，可將得到的限 制性片段用作為寡核苷酸靶。不同的寡核苷酸靶可以是單條連續核酸的不同部分，或者 可以處於不同核酸上。單條連續核酸的不同靶序列可以重疊或者可以不重疊。某些寡 核苷酸靶還可以存在於其它靶序列內部，這包括但不限於初級miRNA(pri-miRNA)、前體 mi RNA (pre-miRNA)、mi RNA、mRNA 和 si RNA。公開的方法的某些實施方式包括產生第一產物的步驟、產生第一擴增子的步驟、 產生額外的第一擴增子的步驟、產生第二擴增子的步驟、產生更多第二擴增子的步驟或其 組合。在某些實施方式中，這些步驟中的至少一些在第一反應組合物中同時或者接近同時 發生。在某些實施方式中，這些步驟中的一些發生於第一反應組合物中，其它一些步驟發生 於第二反應組合物或者第三反應組合物中。本發明教導的某些試劑盒包含擴增手段。根據本發明教導的擴增包括通過其能複製靶寡核苷酸和/或擴增子的至少一部 分的任何手段，典型地，以模板依賴性方式複製，所述手段包括但不限於用於(線性或指 數)擴增核酸序列的多種多樣的技術。用於進行擴增步驟的示例性技術包括聚合酶鏈式反 應(PCR)、引物延伸(包括但不限於反轉錄)、鏈置換擴增(SDA)、多置換擴增(MDA)、基於核 酸鏈的擴增(NASBA)、滾環擴增(RCA)、轉錄介導的擴增(TMA)、轉錄等，這也包括其多路版 本或其組合。對此類技術的描述可在Sambrook和Russell ；Sambrook等人；Ausbel等人； PCR Primer :A LaboratoryManual, Diffenbach 編輯，Cold Spring Harbor Press (1995)； The ElectronicProtocol Book, Chang Bioscience (2002) ；Msuih等人，J. Clin. Micro. 34 : 501-07(1996) ； Rap ley ；U. S. Pat. Nos. 6，027，998 和 6，511，810 ；PCT 公開 Nos. WO 97/31256 和 WO 01/92579 ；Ehrlich等人，Science 252 1643-50 (1991) ；Innis 等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990) ；Favis 等人，Nature Biotechnology 18:561-64(2000)和 Rabenau 等人，Infection 28:97-102(2000)等中找 到。在某些實施方式中，擴增包含順序步驟的循環(i)將引物與靶寡核苷酸和/或擴 增子(包含互補或基本互補的序列)雜交；(ii)延伸經雜交的引物，由此以模板依賴性方 式合成核苷酸的鏈；以及(iii)變性新形成的核酸雙鏈體，以分離鏈。循環可以重複或者可 以不重複，這根據需要決定。擴增可包含熱循環或者可以以等溫方式進行。在某些實施方 式中，剛產生的核酸雙鏈體最初並不被變性，而是以其雙鏈形式用於一個或多個後續步驟， 可檢測任意一條或兩條鏈，但必須如此。在某些實施方式中，產生單鏈擴增子，例如但不限 於不對稱PCR。引物延伸是擴增技術，其包括使用擴增手段(例如延伸酶，例如但不限於DNA聚合酶(包括但不限於反轉錄酶))，以5』到3』的方向，延長退火到模板上的引物。根據某些實 施方式中，採用合適的緩衝液、鹽、PH、溫度和核苷酸三磷酸酯(包括其類似物)，延伸酶將 與模板鏈互補的核苷酸從退火引物的3』末端開始合併進去，產生互補鏈。在某些實施方式 中，用於引物延伸的延伸酶缺乏或基本上缺乏5』 -外切核酸酶活性。本領域技術人員將理解，多種不同的酶，包括但不限於延伸酶，可用於公開的方 法和試劑盒，例如但不限於，從耐熱或極端耐熱的原核生物、真核生物或古生物分離的那 些。本領域技術人員還將理解，酶，例如聚合酶(包括但不限於DNA依賴性的DNA聚合 酶和RNA依賴性的DNA聚合酶)，不僅包括天然存在的酶，還包括重組的酶以及此類酶 的酶活性片段、切割產物、突變體或變體，例如但不限於Klenow片段、Stoffel片段、Taq FS (Applied Biosystems)、9Nm . DNA 聚合酶(New England BioLabs, Beverly, Mass.)和 突變體酶(包括但不限於天然存在的和人工製造的突變體)，其被描述於Luo和Barany， Nucl. Acids Res. 24 :3079_3085 (1996)，Eis 等人，Nature Biotechnol. 19 :673_76 (2001) 和U. S. Pat. Nos. 6，265，193和6，576，453中。經可逆修飾的聚合酶，例如但不限於 U. S. Pat. No. 5，773，258中描述的那些，也在本文公開的教導內。本發明的教導還包括多 種基於尿嘧啶的去汙染策略，其中，例如可將尿嘧啶加入到擴增反應中，用多種糖基化酶 處理除去隨後的遺留產物(見例如U. S. Pat. No. 5，536，649)。本領域技術人員將理解， 具有想要的酶活性的任何蛋白質都可用於公開的方法和試劑盒中。對DNA聚合酶(包括 反轉錄酶、尿嘧啶N-糖基化酶等)的描述可在Twyman，Advanced Molecular Biology, BIOS ScientificPublishers, 1999 ；Enzyme Resource Guide,rev. 092298,Promega,1998 ； Sambrook 禾口 Russell ；Sambrook 等人 ；Lehninger ；PCR :The Basics 禾口 Ausbel 等人等中找 到。公開的方法和試劑盒的某些實施方式包括分離(作為分離步驟或作為用於檢測 的步驟的一部分)手段。分離包括從擴增子除去至少一些未反應組分或至少一些試劑的任 何工藝。在某些實施方式中，將擴增子與未反應組分和試劑(包括但不限於，反應組合物中 存在的未反應的分子種類、延伸酶、引物、輔助因子、dNTP等)分開。本領域技術人員將知 道，在本文公開的方法和試劑盒中可使用多種公知的分離手段，因此所使用的分離技術並 非是對公開的方法的限制。用於進行分離步驟的示例性的手段/技術包括凝膠電泳，其例如但不限於等電聚 焦和毛細電泳；介電電泳；流式細胞術(包括但不限於使用珠粒、微球等的螢光活化分選 技術)；液相色譜(包括但不限於HPLC、FPLC、尺寸排阻(凝膠過濾)色譜、親和色譜、離 子交換色譜、疏水相互作用色譜、免疫親和色譜和反相色譜)；親和標籤結合(例如，生物 素-抗生物素蛋白、生物素-鏈黴抗生物素、麥芽糖-麥芽糖結合蛋白(MBP)和鈣-鈣結 合肽)；適配體_靶結合；雜交標記_雜交標記互補退火；質譜(包括但不限於MALDI-T0F、 MALDI-TOF-TOF、串聯質譜(MS-MS)、LC-MS 禾Π LC-MS/MS)；微流體設備(microfluidic device)等。對分離技術和分離-檢測技術的討論可在Rapley ；Sambrook等人；Sambrook 禾口 Russell ；Ausbel 等人；Molecular Probes Handbook ；Pierce Applications Handbook ； Capillary Electrophoresis :Theory and Practice, P.Grossman 禾口 J. Colburn, eds., Academic Press,1992 ；The Expanding Role of MassSpectrometry in Biotechnology, G. Siuzdak, MCC Press, 2003 ；PCT 公開 No. WO 01/92579 和 Μ. Ladisch, BioseparationsEngineering :Principles, Practice, and Economics，John Wiley & Sons，2001等中找到。在某些實施方式中，檢測步驟包括使用儀器對擴增子進行分離和/或檢測，即，使 用自動或半自動檢測手段，其可以(但不必須)包含計算機算法。在某些實施方式中，檢 測步驟與分離步驟組合或是分離步驟的延續，例如但不限於，包含螢光掃描儀和製圖、記錄 或讀出組分的毛細管電泳儀器；偶聯有質譜儀的毛細管電泳儀器；偶聯有吸光度監測儀或 螢光掃描儀和圖像記錄儀或質譜儀的色譜柱；或具有數據記錄設備(例如掃描儀或CCD照 相機)的微陣列。在某些實施方式中，檢測步驟與擴增步驟和定量和/或鑑定步驟組合， 例如但不限於，實時分析，例如Q-PCR。用於進行檢測步驟的示例性手段包括毛細管電泳儀 器，例如但不限於 ABI PRISM . 3100 Genetic 分析儀，ABI PRISM 3100-Avant Genetic 分析儀，ABIPRISM 3700 DNA 分析儀，ABI PRISM 3730 DNA 分析儀，ABIPRISM 3730x/ DNA分析儀(全部來自 Applied Biosystems) ；ABIPRISM 7300 實時PCR系統；ABI PRISM 7700序列檢測系統；質譜儀和微陣列以及相關軟體，例如具有Applied Biosystems 1700 化學發光微陣列分析儀的Applied Biosystems陣列系統和可從Affymetrix，Agilent, Illumina和Amersham Biosciences等獲得的其它可商業獲得的陣列系統(還見Gerry等 人，J. Mol. Biol. 292 :251_62，1999 ；De Bellis 等人，MinervaBiotec 14 :247_52，2002 和 Stears等人，Nat. Med. 9 140-45，包括增刊，2003)。用於報導基團檢測、數據收集和分析的 示例性軟體包括GeneMapper 軟體、GeneScan 分析軟體和Genotyper 軟體(全部來自 AppliedBiosystems)。在某些實施方式中，分離或檢測包括流式細胞方法，包括但不限於螢光活化分選 (見例如Vignali，J. Immunol. Methods 243 :243_55，2000)。在某些實施方式中，檢測包括 使用遷移率依賴性的分離技術，例如毛細管電泳，分離擴增子和/或擴增子代替品；使用例 如但不限於螢光掃描儀，檢測洗出液，以檢測洗脫的擴增子；以及評估擴增子的螢光譜，典 型地使用檢測和分析軟體，例如使用GeneScan 分析軟體的ABI PRISM Genetic分析儀 (兩者均來自Applied Biosystems)來進行。在某些實施方式中，測定包括平板讀數儀和合 適的光源。在某些實施方式中，檢測包括單鏈擴增子或擴增子代替品，例如但不限於，整合進 被檢測的單鏈分子中的報導基團的檢測，例如，併入擴增子的螢光報導基團或釋放的雜交 標籤互補序列(示例性的擴增子代替品)的報導基團；與被檢測的單鏈擴增子雜交的分子 上的報導基團，例如報導探針。在某些實施方式中，檢測雙鏈擴增子。典型地，通過三鏈體形成，或通過雙鏈分子 的局部開放，使用例如但不限於PNA開啟子、PNA鉗夾和三鏈體形成寡核苷酸(TFOs)(經 報導基團標記或與經標記的物體(例如分子信標)聯合使用)，來檢測此類雙鏈擴增子或 擴增子代替品(見，例如，Drewe 等人，Mol. Cell. Probes 14 :269_83，2000 ；Zelphati 等 人，BioTechniques 28 :304_15，2000 ；Kuhn 等人，J. Amer. Chem. Soc. 124 1097-1103，2002 ； Knauert 禾口 Glazer，Hum. Mol. Genet. 10 :2243_2251，2001 ；Lohse 等人，Bioconj. Chem. 8 503-09，1997)。在某些實施方式中，擴增子和/或擴增子代替品包含同型嘌呤序列的片斷。III.經修飾的核苷酸在一種實施方式中，本發明涉及經化學修飾的核酸分子，例如，短幹擾核酸分子， 其中所述化學修飾包含與核酸分子共價連結的綴合物。綴合物的非限制性例子包括但不限於2』 _烷氧基核糖核苷酸、2』烷氧基烷氧基核糖核苷酸、經鎖定的核酸核糖核苷酸(LNA)、 2』_氟核糖核苷酸、嗎啉代核苷酸。在另一實施方式中，經修飾的核苷酸選自具有經修飾的 下述核苷間連接的核苷酸，所述連接選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硼代磷 酸酯和醯胺連接。
在一種實施方式中，本發明的綴合物分子包含協助將經化學修飾的核酸分子例如 siRNA分子遞送到生物系統(例如細胞)中的分子。在另一實施方式中，與經化學修飾的 siRNA分子連結的綴合物分子是聚乙二醇、人血清清蛋白或能介導細胞吸收的細胞受體的 配體。在2002年7月22日提交的Vargeese等人，U. S. Ser. No. 10/201，394中描述了一些 特別的綴合物分子的例子，該文獻通過引用併入本文。可針對改善的藥物代謝動力學曲線、 生物利用率和/或siRNA構建體的穩定性(同時保持siRNA介導RNAi活性的能力)，對本 發明siRNA分子使用的綴合物的種類和綴合的程度加以評估。由此，本領域技術人員可對 經多種綴合物修飾的siRNA分子加以篩選，以確定siRNA綴合物複合體是否具有改進的性 質同時又保持介導RNAi的能力，例如在動物模型中進行，這是本領域通常已知的。還可用 能協助遞送到靶細胞和/或協助靶細胞吸收的藥物載體來配製經化學修飾的核酸分子。選 自但不限於中性脂質體、陽離子脂質體或脂複合體、陽離子聚合物或多聚複合體、中性聚 合物、納米顆粒、雙鏈RNA結合蛋白、磷酸鈣、細胞穿透肽、病毒蛋白和病毒顆粒、抗體和空 細菌包膜。在一種實施方式中，本發明涉及下述短幹擾核酸siRNA分子，其包含核苷酸、非核 苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸，例如適配體。「適配體」或「核酸適配體」在本文中使用 時表示與靶分子特異性結合的核酸分子，其中，所述核酸分子具有下述序列，所述序列包含 在其天然設置下能被靶分子識別的序列。或者，適配體可以是這樣的核酸分子當靶分子 天然並不與核酸結合的情況下，其可與靶分子結合。靶分子可以是任何目的分子。例如， 適配體可用於與蛋白質的配體結合結構域結合，由此阻止天然存在的配體與蛋白質的相互 作用。這是非限制性的例子，本領域技術人員將知道，可使用本領域通常已知的技術，容 易產生其它實施方式(見，例如，Gold 等人，1995，Annu. Rev. Biochem.，64，763 ；Brody ^P Gold,2000，J. Biotechnol. ,74,5 ；Sun,2000, Curr. Opin. Mol. Ther. ,2,100 ；Kusser,2000, J. Biotechnol. ,74,27 ；Hermann 禾口 Patel，2000，Science,287,820 禾口 Jayasena，1999， Clinical Chemistry,45,1628.)。修飾的例子包括但不限於帽區域的修飾。「帽結構」表示這樣的化學修飾，其被摻 入寡核苷酸的任一末端(見，例如Adamic等人，U. S. Pat. No. 5，998，203，其通過引用併入本 文)。這些末端修飾保護核酸分子抵擋外切核酸酶的降解，並且可幫助遞送和/或在細胞內 定位。帽可存在於5』-末端(5』-帽)或3』-末端(3』-帽)，或者可存在兩個末端。在一 些非限制性的例子中，5』 -帽包括但不限於甘油基，反轉(inverted)脫氧無鹼基殘基(基 元)；4'，5'-亞甲基核苷酸；1_(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸；碳環型核 苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α -核苷酸；經修飾鹼基核苷酸；二硫代磷酸酯 連接；蘇-戊呋喃糖基核苷酸；非環式3'，4' _開環核苷酸；非環式3，4-二羥基丁基核苷 酸；非環式3，5-二羥基戊基核苷酸，3' -3'-反轉核苷酸基元；3' -3'-反轉無鹼基基 元；3' -2'-反轉核苷酸基元；3' -2'-反轉無鹼基基元；1，4-丁二醇磷酸酯；3'-氨 基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3'-磷酸酯；3'-巰基磷酸酯；二硫代磷酸酯；或橋聯或非橋聯甲基膦酸酯基元。3』_帽的非限制性例子包括但不限於甘油基，反轉脫氧無鹼基殘基(基元)； 4'，5'-亞甲基核苷酸；1_(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸；碳環型核苷 酸；5』 -氨基烷基磷酸酯；1，3- 二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基 磷酸酯；1，2_氨基十二烷基磷酸酯；羥基丙基磷酸酯；1，5_失水己糖醇核苷酸；L-核苷 酸；α -核苷酸；經修飾鹼基核苷酸；二硫代磷酸酯；蘇-戊呋喃糖基核苷酸；非環式3'， 4' _開環核苷酸；3，4-二羥基丁基核苷酸；3，5-二羥基戊基核苷酸，5' -5'-反轉核苷 酸基元；5' -5'-反轉無鹼基基元；5'-氨基磷酸酯；5'-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷 酸酯；5』-氨基；橋聯或非橋聯5'-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，橋聯或 非橋聯甲基膦酸酯和5，-巰基基元(更多細節參見Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925 ；其通過引用併入本文)。在另一絲實施方式中，本發明涉及本發明的SiRNA分子的綴合物和/或複合體。 此類綴合物和/或複合體可用於協助將SiRNA分子遞送進生物系統(例如細胞)。本發明 提供的綴合物和複合體可通過將治療性化合物轉運經過細胞膜、改變藥物代謝動力學和/ 或調節本發明的核酸分子定位來施加治療作用。本發明包括對用於遞送分子(包括但不 限於小分子、脂類、膽固醇、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗體、毒素、負電荷聚合物和其它聚合 物，例如蛋白質、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或聚胺)穿過細胞膜的新穎綴合物和複合 體的設計和合成。通常，描述的轉運蛋白被設計為或者單個使用或作為多組分系統的一部 分使用，可以有或沒有可降解的連接子。這些化合物預計能改善在存在或 不存在血清的情 況下本發明的核酸分子向來自不同組織的多種細胞類型的遞送和/或定位(見Sullenger 和Cech，U. S. Pat. No. 5，854，038)。本文描述的分子的綴合物可通過可生物降解的連接子 (例如可生物降解的核酸連接子分子)與生物活性分子連結。最優地，外源遞送的治療性核酸分子(例如SiRNA分子)在細胞中穩定，直到RNA 的反轉錄被調節足夠長到能降低RNA轉錄本的水平。核酸分子能抗核酸酶，以作為有效的 細胞內治療劑發揮功能。本發明和本領域中描述的對核酸分子化學合成的改進拓展了通過 引入核苷酸修飾來修飾核酸分子以增強其核酸酶穩定性的能力(如上文所述)。在又一實施方式中，本發明提供了具有化學修飾的SiRNA分子，其能保持或增強 RNAi中涉及的蛋白質的酶促活性。此類核酸通常還比未經修飾的核酸對核苷酸更有抗性。 因此，體外和/或體內活性不應被顯著降低。使用本發明的基於核酸的分子將通過提供組合療法(例如，靶向不同基因的多種 siRNA分子；與已知小分子調節劑偶聯的核酸分子；或者用分子(包括不同基序和/或其它 化學或生物分子)的組合的間歇療法)的可能性而獲得更好的對疾病進程的治療。用siRNA 分子治療受試者還包括不同類型的核酸分子的組合，它們例如酶促性核酸分子(核酶)、異 型酶、反義、2，5-A寡腺苷酸、誘餌和適配體。在另一方面，本發明的siRNA分子包含一種或多種5』和/或3』 -帽結構，例如，僅 在正義siRNA鏈上、僅在反義siRNA鏈上，或者在兩條siRNA鏈上。IV.核酸分子的遞送可對核酸分子(例如siRNA分子)加以改造，使得其適合單獨或與其它治療組 合，用於調節、改善或治療例如本文所述的多種疾病和病況，例如增殖性疾病和病況和/或癌症，包括乳腺癌，頭頸癌(包括多種淋巴瘤，例如，套細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤)、 腺瘤、鱗狀細胞癌、喉癌、視網膜癌、食道癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、子宮癌、黑素瘤、結直腸 癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、成膠質細胞瘤、肺癌(包括非小細胞肺癌)、胰腺癌、宮頸癌、頭 頸癌、皮膚癌、鼻咽癌、脂肪瘤、上皮癌、腎細胞癌、膽囊腺癌、腮腺癌、子宮內膜瘤、抗多種藥 物的癌；和增殖性疾病和病況，例如，與腫瘤血管新生相關的新血管形成，眼部疾病(例如 黃斑變性(例如溼/幹AMD)、角膜新血管形成、糖尿病性視網膜病變、新生血管性青光眼、近 視性變性)和其它增殖性疾病和病況，例如再狹窄和多囊腎病以及與細胞或組織中的靶蛋 白(例如VEGF和/或VEGFr)水平相關或將應答於其的任何其它疾病或病況。例如，siRNA 分子可包含用於施用給受試者的遞送載體(包括脂質體)、載體和稀釋劑及其鹽，和/或其 可以存在於可藥用製劑中。用於遞送核酸分子的方法被描述於Akhtar等人，1992，Trends Cell Bio. ,2,139 ；Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics 編輯，Akhtar，1995，Maurer 等人，1999，Mol. Membr. Biol.，16，129 140 ；Hofland 和 Huang, 1999，Handb. Exp. Pharmacol.，137，165192 和 Lee 等人，2000，ACS Symp. Ser.，752，184 192中，所有這些文獻都通過引用併入本文。Beigelman等人，U. S. Pat. No. 6，395，713和 Sullivan等人，PCT WO 94/02595還描述了用於遞送核酸分子的一般性方法。這些方案可 用於遞送幾乎任何核酸分子。可通過本領域技術人員已知的多種方法來將核酸分子施用給 細胞，所述方法包括但不限於包埋於脂質體中，通過離子電滲療法(見例如WO 03/043689 和WO 03/030989)或通過併入進其它載體，例如可生物降解的聚合物、水凝膠、環糊精(見 例如 Gonzalez 等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068 1074 ；Wang 等人，國際 PCT 公 開Nos. WO 03/47518和WO 03/46185)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA微球體(見 例如U. S. Pat. No. 6，44 7，796和U. S.專利申請公開No. U. S. 2002130430)、可生物降解的 納米膠囊和生物黏附性微球體，或通過蛋白質性載體(0' Hare和Normand，國際PCT公開 No. WO 00/53722)。在另一實施方式中，本發明的核酸分子還可與聚乙烯亞胺及其衍生物 (例如，聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙醯半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亞胺-聚乙二 醇-三-N-乙醯半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物)一起配製或複合。或者，可通過直接 注射或使用輸注泵來局部遞送核酸/載體組合。 用於增加體內寡核苷酸施用進脊椎動物的效率的其它方法包括使用化學試劑或 物理操作。此類化學試劑包括聚合物(Mumper，R. J.，等人，Pharm. Res. 13 701-709 (1996)； Mumper R. J.,等人，J. Cont. Rel. 52 191-203 (1998) ；Anwer, K.,等人，Pharm. Res, 16 889-895(1999) ；Boussif 0·，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301 (1995); Orson F. Μ.,等人，J. Immunol. 164 :6313_6321 (2000) ；Turunen Μ. P.,等人，Gene Ther. 6 6-11(1999) ；Shi N. Y.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :7567_7572 (2000) ；Rozema, D. B. PNAS early edition July 24,1-6(2007) ；Thomas, Μ.等 K Expet opin.Biol Ther. 5 :495_505 (2005) ；Howard, K. Α·等人 Mol. Ther. 14 :476_484 (2006) ；Leong K. W.， 等 K, J. Controlled Release 53 183-193 (1998) ；Baranov A.,等 K, Gene Ther. 6 1406-1414(1999) ；Lunsford L.，等人，J. Drug Targeting 8 39-50(2000) ；Bertling W. Μ.,等人，Biotechnol. App 1. Biochem. 13 :390_405 (1991) ；Heldel J. D.，PNAS. 104 5715-5721 (2007) ；Schiffelers, R. M.等人 Nucleic Acids Res. 32 :el49 (2004) ；Davis, Μ. Ε.等人 Curr. Med. Chem. 11 179-197 (2004))、去垢劑(Freeman D. J.和 Niven R. W.,Pharm. Res. 13 202-209 (1996) ；Raczka Ε.，等人 Gene Ther. 5 1333-1339(1998))、可協助 寡核苷酸進入細胞脂雙層的陽離子或非陽離子性脂類(Liu Y.，等人，Nat. Biotechnol. 15 167-173(1997) ；Eastman S. J.，等人 Hum. Gene Ther. 8 :313_322 (1997) ；Simoes, S.，等 A, Biochim. Biophys. Acta Biomembranes 1463 459-469 (2000) ；Thierry, A. R. , φ A, Gene Ther. 4 226-237 (1997) ；Floch V. , ^ABiochim. Biophys. ActaBiomembranes 1464 95-103(2000) ；Egilmez N. K.,等人 Biochem. Biophys. Res. Commun. 221 169-173 (1996)； Santel A. , Gene Ther. 13 1360-1370 (2006) ；Li, W. Pharm. Res. 24 438-449 (2007), Pirollo, K. F. Cancer Res. 67 (7) 2938-2943 (2007) ；Cardoso, A. L. C. J. Gene Med. 9 170-183(2007) ；Zimmermann，Τ. S.等人 Nature 441 :111_114(2006) ；Chein, P. Y 等人 Cancer Gene Ther. 2 321-328) ；Landen, C. N.等 A Cancer Res. 65 6910-6918(2005)； Morrissey, D. V.等人 Nat Biotechno. 23 1002-1007 (2005))、蛋白質和肽(Ryter J. M.， The EMBO Journal 17 7505-7515 (1998) ；Kumar, P.等人 Nature 448:39-43(2007); Deshayes, S.等人 Biochimica Acta, 1667 141-147 (2004) ；Morris, Μ. C.等人 Nucleic acidsResearch 25 :2730_2736 (1997) ；Simeoni, F.等人 Nucleic acids Research31 2717-2724(2003) ；US patent 5，264，618 和 5，334，761)。其它方法包括使用空細 菌包膜(MacDiarmid J. A.等人 Cancer Cell 11:431-445(2007))，以電的方式開啟 肌肉細胞孔以允許更多寡核苷酸進入細胞的電穿孔(Aihara，H.和Miyazaki，J.， Nature Biotechnol. 16 867-870 (1998) ；Mir, L. Μ.,等人，C R Acad Sci. III 321 893-899 (1998)，Mir, L. Μ.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci，USA 96 :4262_4267 (1999)； Mathiesen, I. ， Gene Ther. 6 508-514 (1999) ；Rizzuto, G. ， ·入，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6417-6422(1999) ；Schiffelers, R. Μ.等人 Arthritis and Rheumatism 52: 1314-1318(2005) ；Golzio, Μ.等人 Gene Ther. 12 246-251 (2005))；使用血管內壓或水力 遞送(Budker, V.，等人，Gene Ther. 5 :272_276 (1998) ；McCaffrey, A. P.等人 Nature 418 28-39(2002))。在一種實施方式中，本發明的SiRNA分子被設計或配製為能特異性靶向內皮細胞 或腫瘤細胞。例如，可利用多種製劑和綴合物來特異性靶向內皮細胞或腫瘤細胞，它們包括 PEI-PEG-葉酸酯、PEI-PEG-RGD、PEI-PEG-生物素、PEI-PEG-膽固醇和本領域已知能特異性 靶向內皮細胞和/或腫瘤細胞的其它綴合物。在一種實施方式中，用於治療眼部病況(例如黃斑變性、糖尿病性視網膜病變等) 的化合物、分子或組合物眼內或通過眼內手段施用給受試者。在另一實施方式中，用於治療 眼部病況(例如黃斑變性、糖尿病性視網膜病變等)的化合物、分子或組合物眼周或通過眼 周手段施用給受試者(見例如Ahlheim等人，國際PCT公開No. WO 03/24420)。在一種實 施方式中，siRNA分子和/或其製劑或組合物眼內或通過眼內手段施用給受試者。在另一 實施方式中，siRNA分子和/或其製劑或組合物眼周或通過眼周手段施用給受試者。眼周 施用通常提供了侵入性較少的途徑，來向受試者施用siRNA分子及其製劑或組合物(見例 如Ahlheim等人，國際PCT公開No. WO 03/24420)。使用眼周施用還使得視網膜脫落的風險 最小化，這允許更頻繁地給劑量或施用，提供了用於黃斑變性和其它眼部病況的臨床相關 的施用途徑，還提供了使用存貯體(reservoirs)(例如植入體、泵或其它設備)來遞送藥物 的可能性。在一種實施方式中，本發明的siRNA化合物和組合物單獨或與本文其它化合物和/或療法組合，局部施用，例如通過眼內或眼周手段，例如注射、離子電滲療法(見例如WO 03/043689和W003/030989)，或者通過植入體，大約每1_50周施用一次(例如大約每1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 周)。在一種實施 方式中，本發明的siRNA化合物和組合物單獨或與本文描述的和/或本領域已知的其它化 合物和/或療法組合，全身性施用(例如通過靜脈內、皮下、肌內、輸注、泵、植入體等)，大約 每 1-50 周施用一次(例如大約每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49 或 50 周)。
在一種實施方式中，本發明的核酸分子施用至CNS。實驗已證實神經元能有效體 內吸收核酸。作為將核酸局部施用到神經細胞的一個例子，Sommer等人，1998，Antisense Nuc. Acid Drug Dev.，8，75描述了這樣的研究，其中，通過向腦中顯微注射，將15元的硫 代磷酸酯反義核酸分子(針對c-fos)施用給大鼠。注射後30分鐘，神經元排他性地吸收 了經四甲基若丹明-異硫氰酸酯(TRITC)或異硫氰酸螢光素(FITC)標記的反義分子。在 這些細胞中觀察到了擴散的胞質染色和核染色。作為核酸全身性施用到神經細胞的例子， Epa 等人，2000，Antisense Nuc. Acid Drug Dev.，10，469 描述了一種體內小鼠研究，其中， β -環糊精_金剛烷_寡核苷酸綴合物被用於靶向神經元型分化的PC12細胞中的ρ75神 經營養因子受體。2周時程的IP施用後，在背根神經節(DRG)細胞中觀察到了 ρ75神經營 養因子受體反義的明顯吸收。此外，在DRG神經元中觀察到了 ρ75的顯著且持續的下調。 Broaddus 等人，1998，J. Neurosurg.，88(4)，734 ；Karle 等人，1997，Eur. J. Pharmocol.， 340(2/3)，153 ；Bannai 等人，1998，Brain Research, 784 (1, 2), 304 ；Rajakumar 等人，1997， Synapse,26(3)，199 ；ffu-pong 等人，1999，BioPharm,12(1)，32 ；Bannai 等人，1998，Brain Res. Protoc. ,3(1) ,83 ；Simantov 等人，1996，Neuroscience, 74 (1), 39 中描述了用於核酸 靶向神經元的其它手段。可使用的CNS遞送的傳統手段包括但不限於，鞘內和腦室內施用， 導管和泵的植入，在受傷或損傷位點直接注射或灌注，注射進腦動脈系統或者通過化學或 滲透開啟血腦屏障。其它手段可包括使用多種運送和載體系統，例如通過使用綴合物和可 生物降解的聚合物。另外，基因治療手段，例如Kaplitt等人，U. S. Pat. No. 6, 180，613和 Davidson, W004/013280中描述的那些，可用於在CNS中表達核酸分子。在一種實施方式中，本發明的核酸分子通過肺部遞送來施用，例如通過吸入氣溶 膠或噴霧乾燥製劑(通過吸入設備或噴霧器施用)，使得核酸分子被快速局部吸收進相關 肺組織中。可通過磨碎乾燥或凍幹的核酸組合物，然後使微粒化的組合物經過例如400目 篩，以破碎或分離出大的團塊，來製備含有可被呼吸的微粒化核酸組合物的乾燥顆粒的固 體顆粒組合物。包含本發明核酸組合物的固體顆粒組合物任選可含有分散劑(其作用於協 助氣溶膠形成)以及其它治療性化合物。合適的分散劑是乳糖，其可與核酸化合物以任何 合適的比例(例如重量比1比1)摻合。可通過任何合適的手段來製備包含本發明核酸組 合物的液體顆粒的氣溶膠，例如使用噴霧器(見例如U. S. Pat. No. 4，501，729)。噴霧器是 可商業獲得的設備，其通過窄液體流動孔(venturi orifice)加速壓縮氣體(典型地是空 氣或氧氣)或通過超聲波振蕩，將活性成分的溶液或懸浮液轉化為治療性氣溶膠霧。用於 噴霧器中的合適製劑包括以可至多為製劑40% w/w但優選小於20% w/w的量的處於液體載體中的活性成分。載體典型地是水或稀釋水性醇溶液，其優選通過加入例如氯化鈉或其 它合適的鹽被製造為與體液等滲。任選的添加劑包括防腐劑(如果製劑沒有被無菌製備 的話)(例如，對羥基苯甲酸甲酯)、抗氧化劑、矯味劑、揮髮油、緩衝劑和乳化劑以及其它制 劑表面活性劑。可用任何固體顆粒氣溶膠發生器，類似地生產包含活性組合物和表面活性 劑的固體顆粒的氣溶膠。用於將固體顆粒治療劑遞送給受試者的氣溶膠發生器以適於人類 施用的速率，產生可被呼吸的顆粒(如上文所解釋的)，以及產生含有預先計量的劑量的治 療組合物的氣溶膠體積。固體顆粒氣溶膠發生器的一種闡述性類型是吹入器。用於通過吹 入法施用的合適製劑包括經精細粉碎的粉末，其可通過吹入器遞送。吹入器中的粉末(例 如其預先計量的、能有效進行本文所述治療的劑量)被包含在膠囊或藥筒(典型地由明膠 或塑料製成)中，在吸入時該膠囊或藥筒原位刺穿或打開，通過空氣牽引經過設備或者通 過人工操作的泵來遞送粉末。用於吹入器中的粉末僅由活性成分構成，或者由包含活性成 分、合適的粉末稀釋劑(例如乳糖)和合適的表面活性劑的粉末摻合物構成。活性成分典 型地佔到製劑的0. 1至lOOw/w。第二種類型的闡述性氣溶膠發生器包含帶計量型劑量吸 入器。帶計量型劑量吸入器是加壓氣溶膠分散器，其典型地含有處於液化推進劑中的活性 成分的懸浮液或溶液製劑。在使用期間，這些設備通過適合遞送經計量的體積的閥，將製劑 釋放以產生含活性成分的精細顆粒噴霧。合適的推進劑包括某些含氯氟烴化合物，例如，二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。製劑可額外含有一種或多種共溶劑 (例如，乙醇)、乳化劑和其它製劑表面活性劑(例如油酸或山梨聚糖三油酸酯)、抗氧化劑 和合適的矯味劑。用於肺部遞送的其它方法被描述於例如U. S.專利申請No. 20040037780 和 U. S. Pat. Nos. 6，592，904,6, 582，728,6, 565，885 中。在一種實施方式中，本發明的SiRNA分子以離子電滲療法施用，例如施用到特定 的器官或區室(例如，眼、眼底、心臟、肝、腎、膀胱、前列腺、腫瘤、CNS等)中。關於離子電 滲療法遞送的非限制性例子被描述於例如WO 03/043689和WO 03/030989中，它們通過引 用整體併入本文。在一種實施方式中，本發明的SiRNA分子與膜破壞試劑(例如U. S.專利申請公開 No. 20010007666中描述的那些，該文獻包括附圖在內通過引用整體併入本文)複合。在另 一實施方式中，一種或多種膜破壞試劑和siRNA分子還與陽離子脂類或助手(helper)脂類 分子(例如U. S. Pat. No. 6，235，310中描述的那些，該文獻包括附圖在內通過引用整體併入 本文)複合。因此，本發明涉及包含處於可藥用載體(例如穩定劑、緩衝液等)中本發明的一種 或多種核酸的藥物組合物。可通過任何標準手段，在有或沒有穩定劑、緩衝液等的情況下， 將本發明的寡核苷酸(例如RNA、DNA或蛋白質)形成藥物組合物以施用和導入受試者。當 想要使用脂質體遞送機制時，可遵循標準的脂質體形成方案。本發明的組合物還可被配製 和用作為片劑、膠囊或酏劑(用於口服施用)、栓劑(用於直腸施用)、無菌溶液/懸浮液 (用於可注射施用)和本領域已知的其它組合物。本發明還包括所描述化合物的可藥用製劑。這些製劑包括上述化合物的鹽(例如酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、乙酸和苯磺酸鹽)。藥物組合物或製劑指適於施用(例如全身性施用)進細胞或受試者(包括例如 人)的形式的組合物或製劑。合適的形式部分取決於用途或進入途徑，例如口服、透皮或通過注射。此類形式不應阻礙組合物或製劑到達靶細胞(即，想要將帶負電荷的核酸遞送至 的細胞)。例如，注射進血流的藥物組合物應當是可溶的。其它因素是本領域已知的，包括 考慮到阻礙組合物或製劑發揮其作用的毒性和形式。「全身性施用」表示在血流中的藥物體內全身性吸收或積累接著在全身中分布。導 致全身性吸收的施用途徑包括但不限於靜脈內、皮下、腹膜內、吸入、口服、肺內和肌內。這 些施用途徑中的每種都將本發明的siRNA分子暴露給可達到的疾病組織。藥物進入循環的 速率已顯示為分子量或分子大小的函數。使用包含本發明化合物的脂質體或其它藥物載體 有望將藥物定位於某些組織類型(例如網狀內皮系統(RES)的組織)中。可協助將藥物與 細胞(例如淋巴細胞和巨噬細胞)表面聯結的脂質體製劑也是有用的。該手段可通過利用 巨噬細胞和淋巴細胞對異常細胞的免疫識別的特異性，來增強藥物向靶細胞的遞送。「可藥用製劑」表示這樣的組合物或製劑，其允許本發明的核酸分子以最適於其期待活性的方式在體內位置處有效分布。適用於與本發明的核酸分子一起配製的試劑的非 限制性例子包括P-糖蛋白抑制劑(例如Pluronic P85)；可生物降解的聚合物，例如聚 (DL-乙丙交酯)(poly(DL-lactide-coglycolide))微球體，用於緩釋遞送(Emerich，DF 等 人，1999，Cell Transplant,8,47 58)；以及經裝載的納米顆粒，例如聚氰基丙烯酸丁酯制 造的那些。用於本發明的核酸分子的遞送策略的其它非限制性例子包括Boado等人，1998， J. Pharm. Sci.，87，1308 1315 ；Tyler 等人，1999，FEBSLett.，421，280 284 ；Pardridge 等 人，1995，PNAS USA. ,92,5592 5596 ；Boado,1995, Adv. Drug Delivery Rev. ,15,73 107 ； Aldrian-Herrada等人，1998，Nucleic Acids Res. ,26,4910 4916和 Tyler等人，1999，PNAS USA.，96，7053 7058中描述的材料。本發明還涉及使用包含經表面修飾的脂質體的組合物，所述脂質體含有聚(乙二 醇)脂類(經PEG修飾的或長循環脂質體或隱形脂質體(stealthliposomes))。這些制 劑提供了增加藥物在靶組織中積累的方法。這類藥物載體能抵抗單核吞噬細胞系統(MPS 或RES)的調理作用和清除，由此能夠在血液循環中保持更長的時間，以及增強包入膠囊的 藥物的組織暴露(Lasic 等人 Chem. Rev. 1995，95，2601 2627 ；Ishiwata 等人，Chem. Pharm. Bull. 1995,43,1005 1011)。此類脂質體已顯示能在腫瘤中選擇性積累，這大概是通過新 形成血管的靶組織的外滲和捕獲導致的(Lasic等人，Science 1995，267，1275 1276 ；Oku 等人，1995，Biochim. Biophys. Acta, 1238，8690)。這些長循環脂質體能增強DNA和RNA的 藥物代謝動力學和藥物動力學，特別是較之已知能在MPS的組織中積累的傳統陽離子脂質 體而言(Liu 等人，J. Biol. Chem. 1995,42, 24864 24870 ;Choi 等人，國際 PCT 公開 No. WO 96/10391 ；Ansell 等人，國際 PCT 公開 No. W096/10390 ；Holland 等人，國際 PCT 公開 No. WO 96/10392)。長循環脂質體還可以比陽離子脂質體更好的程度，保護藥物抵擋核酸酶降解， 這基於其避免在具代謝侵略性的MPS組織(例如肝和脾)中積累的能力。本發明還包括製備用來貯藏或施用的組合物，其中包括藥物有效量的想要的化合 物，其處於可藥用載體或稀釋劑中。對於治療用途而言可接受的載體或稀釋劑是製藥領 域已知白勺，其被描述於例如 Remington' sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Germaro編輯，1985)中，該文獻通過引用併入本文。例如，可提供防腐劑、穩定劑、 染料和矯味劑。它們包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸的酯。此外，可使用抗氧化劑和 懸浮劑。
藥物有效劑量是對疾病狀態加以預防、抑制其發生或治療(將症狀減輕至一定程 度，優選所有症狀)所需的劑量。藥物有效劑量取決於疾病類型、所使用的組合物、施用途 徑、被治療的哺乳動物的類型、考慮的特定哺乳動物的身體特徵、同時進行的治療以及醫藥 領域技術人員將認識到的其它因素。通常，施用的活性成分的量在0. lmg/kg體重/天至 100mg/kg體重/天之間，這取決於帶負電荷的聚合物的效力。本發明的核酸分子及其製劑可以以含有傳統非毒性可藥用載體、佐劑和/或載體 的劑量單位製劑的形式，口服、局部、胃腸道外、通過吸入或噴霧或直腸施用。術語胃腸道外 在本文中使用時包括經皮、皮下、血管內(例如靜脈內)、肌內或鞘內注射或輸注技術等。此 夕卜，本發明提供了包含本發明的核酸分子和可藥用載體的藥物製劑。本發明的一種或多種 核酸分子可與一種或多種非毒性可藥用載體和/或稀釋劑和/或佐劑以及如果需要的話其 它活性成分聯合存在。含有本發明核酸分子的藥物組合物可以是適於口服使用的形式，例 如作為片劑、糖錠(troches)、錠劑(lozenges)、水性或油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳 液、硬或軟膠囊或糖漿或酏劑。可按照本領域已知用於生產藥物組合物的任何方法，來製備意欲口服使用的組合 物，此類組合物可含有一種或多種增甜劑、矯味劑、著色劑或防腐劑，以提供藥學上精巧可 口的製劑。片劑含有與適用於生產片劑的非毒性可藥用賦形劑混合的活性成分。這些賦形 劑可以是，例如，惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒和崩解劑， 例如，玉米澱粉或褐藻酸；結合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；以及潤滑劑，例如硬脂酸 鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是不經包覆的，或可通過已知技術對其進行包覆。在一些情況 下，可通過已知技術製備此類包覆，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，由此在較長時間內持 續提供作用。例如，可使用時間延遲性材料，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。用於口服使用的製劑還可呈現為硬明膠膠囊(其中活性成分與惰性固體稀釋劑 (例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合)或軟明膠膠囊(其中，活性成分與水或油介質(例 如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合)。水性懸浮液含有與適用於生產水性懸浮液的賦形劑混合的活性材料。此類賦形 劑是懸浮劑，例如，羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯 烷酮、黃蓍膠和阿拉伯膠；分散劑或溼潤劑可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或氧化烯 與脂肪酸的縮合產物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者氧化乙烯與長鏈脂肪醇的縮合產物，例 如十七乙烯氧鯨蠟醇(h印tadecaethyleneoxycetanol)，或氧化乙烯與源於脂肪酸和己糖 醇的部分酯的縮合產物，例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或氧化乙烯與源於脂肪酸和脫 水己糖醇(hexitol anhydrides)的部分酯的縮合產物，例如聚乙烯去水山梨糖醇單油酸 酯。水性懸浮液還可含有一種或多種防腐劑(例如，對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正 丙酯)、一種或多種著色劑、一種或多種矯味劑以及一種或多種增甜劑(例如蔗糖或糖精)。可通過將活性成分懸浮於植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰油)或礦物油 (例如液體石蠟)中，來配製油性懸浮液。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨 蠟醇。可加入增甜劑和矯味劑，以提供可口的口服製劑。可通過加入抗氧化劑(例如抗壞 血酸)來防腐這些組合物。適用於通過加水來製備水性懸浮液的可分散粉末和顆粒將活性成分提供於與分 散劑或溼潤劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的混合物中。合適的分散劑或溼潤劑或懸浮劑的例子是上文已經給出的那些。也可存在其它賦形劑，例如增甜劑、矯味劑或著色劑。本發明的藥物組合物還可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油或礦物油或 它們的混合物。合適的乳化劑可以是天然存在的膠，例如阿拉伯膠或黃蓍膠，天然存在的磷 月旨，例如大豆、卵磷脂，以及源於脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或部分酯，例如去水山梨糖醇單 油酸酯，以及所述部分酯與環氧乙烷的縮合產物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯。乳 液還可含有增甜和矯味劑。可用增甜劑(例如甘油、丙二醇、山梨糖、葡萄糖或蔗糖)來配製糖漿和酏劑。此 類製劑還可含有緩和劑、防腐劑和矯味劑和著色劑。藥物組合物可以是無菌可注射的水性 或油質懸浮液的形式。可使用那些合適的分散劑或溼潤劑以及懸浮劑(上文已提到)，根據 本領域的已知內容，來配製該懸浮液。無菌可注射製劑還可以是非毒性腸胃外可接受的稀 釋劑或溶劑的無菌可注射溶液或懸浮液，例如作為1，3_ 丁二醇的溶液。可使用的可接受載 體和溶劑包括水、Ringer』 s溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的非揮髮油傳統上也可用 作為溶劑或懸浮介質。就此目的而言，可使用任何溫和的非揮髮油，包括合成的甘油單酯或 甘油二酯。此外，脂肪酸，例如油酸，可用於製備可注射製劑。本發明的核酸分子還可以以栓劑的形式施用，例如用於直腸施用藥物。可通過將 藥物與合適的無刺激性賦形劑(其普通溫度下是固體但是在直腸溫度下是液體，因此可在 直腸中溶化以釋放藥物)混合，來製備這些組合物。此類材料包括可可脂和聚乙二醇。本發明的核酸分子可在無菌介質中腸胃外施用。取決於所使用的載體和濃度，藥 物可懸浮或溶解於載體中。有利地，可將佐劑(例如局部麻醉劑)、防腐劑和緩衝劑溶於載 體中。每天每千克體重大約0. Img至大約140mg的數量級上的劑量水平可用於治療上文 指出的病況(每天每受試者大約0. 5mg至大約7g)。可與載體材料組合以生產單一劑量形 式的活性成分的量根據接受治療的宿主和特定施用模式而變化。劑量單位形式通常含有大 約Img至大約500mg的活性成分。應當理解，用於任何特定受試者的特定劑量水平取決於多種因素，這包括所使用 的特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康情況、性別、膳食、施用時間、施用途徑、排洩率、 藥物組合和接受治療的特定疾病的嚴重程度。為施用給非人動物，還可將組合物加入到動物飼料或飲用水中。配製動物飼料和 飲用水組合物，以令動物隨其膳食攝入治療合適量的組合物，這可能是方便的。將組合物制 備為用於加入進飼料或飲用水的預混合物，也可能是方便的。本發明的核酸分子還可與其它治療性化合物組合施用給受試者，以增加總體治療 效果。使用多種化合物來治療適應症可增加有益作用同時降低副作用的存在。在一種實施方式中，本發明包含適用於將本發明的核酸分子施用給特定細胞類 型的組合物。例如，脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPr) (Wu和Wu, 1987，J. Biol. Chem. 262,4429 4432)是肝細胞特有的，其結合帶支鏈的半乳糖末端糖蛋白，例如，脫唾液酸血清類粘蛋 白(ASOR)。在另一例子中，葉酸受體在很多癌細胞中過量表達。此類糖蛋白、合成的糖 綴合物或者葉酸與受體的結合以強烈依賴寡糖鏈分支程度的親和性進行，例如，三枝結構 (triatennary structures)就以 t匕二枝(biatenarry)或單枝(monoatennary)鏈更高白勺 親和性結合(Baenziger 和 Fiete，1980，Cell，22，611 620 ;Connolly 等人，1982，J.Biol.Chem. ,257,939 945)。Lee 和 Lee，1987，Glycoconjugate J. ,4,317 328 通過使用 N-乙 醯-D-半乳糖胺作為碳水化合物基元(其較之半乳糖有更高的受體親和性)，獲得了這種 高特異性。針對甘露糖基結尾的糖蛋白或糖綴合物，也報導了這種「簇效應」(Ponpipom等 人，1981，J. Med. Chem. ,24,1388 1395)。使用基於半乳糖、半乳糖胺或葉酸的綴合物來將 外來化合物運送通過細胞膜，可提供靶向遞送手段，以例如治療肝病、肝癌或其它癌症。使 用生物綴合物也可降低治療所需的治療性化合物的需要劑量。此外，可通過使用本發明 的核酸生物綴合物，來調節治療的生物利用率、藥物動力學和藥物代謝動力學參數。此類 生物綴合物的非限制性例子被描述於2001年8月13日提交的Vargeese等人，U. S. Ser. No. 10/201，394 和 2002 年 5 月 17 日提交的 Matulic-Adamic 等人，U. S. Ser. No. 10/151，116 中。在一種實施方式中，本發明的核酸分子與納米顆粒(例如B肝病毒S、M或L包膜蛋白 (見例如 Yamado 等人，2003，Nature Biotechnology, 21,885))複合或共價連結。在一種 實施方式中，本發明的核酸分子特異遞送至人腫瘤細胞，特別是非凋亡性人腫瘤細胞，其包 括，例如，T-細胞、肝細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、黑素瘤細胞、腸上皮細胞、前列腺細胞、 睪丸細胞、非小細胞肺癌、小細胞肺癌等。
或者，本發明的某些SiRNA分子可在細胞中從真核啟動子啟動表達(例如， Izant 禾口 Weintraub，1985， Science,229, 345 ；McGarry 禾口 Lindquist，1986，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 83，399 ;Scanlon 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，10591 5 ； Kashani-Sabet 等人，1992，Antisense Res. Dev. ,2,3 15 ；Dropulic 等人，1992，J. Virol.， 66，143241 ；Weerasinghe 等人，1991，J. Virol.，65，55314 ；Ojwang 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,10802 6 ;Chen 等人，1992，Nucleic Acids Res. ,20,4581 9 ;Sarver 等 人，1990Science，247，1222 1225 ;Thompson 等人，1995，Nucleic Acids Res.,23,2259 ； Good等人，1997，Gene Therapy，4，45)。本領域技術人員知道，任何核酸都可從合適的 DNA/RNA載體表達於真核細胞中。可通過酶促性核酸將其從初級轉錄本釋放，來增加此類 核酸的活性(Draper 等人，PCT W093/23569 和 Sullivan 等人，PCT WO 94/02595 ；Ohkawa 等人，1992，NucleicAcids Symp. Ser. ,27,15 6 ;Taira 等人，1991，Nucleic Acids Res., 19，512530 ;Ventura 等人，1993，Nucleic Acids Res. ,21,3249 55 ;Chowrira 等人，1994， J. Biol. Chem，269，25856)。在本發明的另一方面，本發明的RNA分子可從插入進DNA或RNA載體的轉錄單 元表達(見例如Couture等人，1996，TIG.，12，510)。重組載體可以是DNA質粒或病毒載 體。可基於但不限於腺相關病毒、逆病毒、腺病毒或α病毒，來構建表達siRNA的病毒載 體。在另一實施方式中，可使用基於pol III的構建體，來表達本發明的核酸分子(見例如 Thompson, U. S. Pas. Nos. 5，902, 880 和 6，146，886)。可按照上文遞送能表達 siRNA 分子的 重組載體，它們可在靶細胞中持久保持。或者，可使用病毒載體，提供核酸分子的瞬時表達。 如果必要的話，此類載體可重複施用。一旦表達，siRNA分子即與靶mRNA發生相互作用，產 生RNAi應答。表達siRNA分子的載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈內或肌內施用， 通過向從受試者中外植的靶細胞施用接著再引入進受試者，或者通過能允許引入目標靶細 胞的任何其它手段來進行(綜述參見Couture等人，1996，TIG.，12，510)。在一個方面，本發明涉及包含編碼本發明的至少一種siRNA分子的核酸序列的表 達載體。所述表達載體可編碼siRNA雙鏈體的一條或兩條鏈，或者單條自身互補的鏈，其自身雜交成siRNA雙鏈體。編碼本發明的siRNA分子的核酸序列可以以能允許siRNA分子表達的方式有效地相連(見例如 Paul 等人，2002，Nature Biotechnology, 19, 505 ；Miyagishi 禾口 Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497 ;Lee 等人，2002，Nature Biotechnology, 19，500 和 Novina 等人，2002，Nature Medicine，進一步的在線公開 doi :10· 1038/nm725)。在另一個方面，本發明涉及表達載體，其包含a)轉錄起始區域(例如真核pol I、 II或III起始區域)；b)轉錄終止區域(例如真核pol I、II或III終止區域)和C)編碼 制少一條本發明siRNA分子的核酸序列，其中所述序列與所述起始區域和所述終止區域以 允許表達和/或遞送siRNA分子的方式有效相連。載體可任選包括與本發明siRNA編碼序 列的5』側或3』側有效相連的蛋白質的開放讀碼框(ORF)；和/或內含子(居間序列)。可由用於真核RNA聚合酶I (pol 1)、1 嫩聚合酶11( 01 II)或RNA聚合酶III (pol III)的啟動子，來驅動SiRNA分子序列的轉錄。來自pol II或pol III啟動子的轉錄本 在所有細胞中以高水平表達；給定的pol II啟動子在給定的細胞類型中的水平取決於附 近存在的基因調控序列(增強子、沉默子等)的性質。如果原核RNA聚合酶在合適的細胞 中能表達的話，還可使用原核RNA聚合酶啟動子(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87,6743 7 ;Gao 和 Huang 1993，Nucleic Acids Res. ,21,2867 72 ；Lieber 等人，1993，Methods Enzymol. ,217,47 66 ;Zhou 等人，1990，Mol. Cell. Biol.，10，4529 37)。若干研究者發現，從此類啟動子表達的核酸分子可在哺乳動物細胞中發揮功能(例 如 Kashani-Sabet 等人，1992，Antisense Res. Dev. ,2,315 ；Ojwang 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,10802 6 ;Chen 等人，1992，Nucleic Acids Res. ,20,4581 9 ;Yu 等人， 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,6340 4 ;L' Huillier 等人，1992，EMBO J, 11,4411 8 ； Lisziewicz 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，90,8000 4 ；Thompson 等人，1995， Nucleic Acids Res. ,23,2259 ；Sullenger & Cech，1993，Science, 262，1566)。更具體地，可 使用轉錄單元，例如源於編碼U6小核(snRNA)、轉運RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的 那些，在細胞中產生高濃度的想要的RNA分子，例如siRNA (上文的Thompson等人；Couture 禾口 Stinchcomb，1996 ；Noonberg 等人，1994，Nucleic Acid Res. ，22，2830 ；Noonberg 等人， U. S. Pat. No. 5，624，803 ；Good 等人，1997, GeneTher. ,4,45 ；BeigeIman 等人，國際 PCT 公開 No. WO 96/18736)。上述siRNA轉錄單元可併入多種載體，用於引入哺乳動物細胞，它們包 括但不限於質粒DNA載體、病毒DNA載體(例如腺病毒或腺相關病毒載體)或病毒RNA載 體(例如逆病毒或α病毒載體)(綜述參見上文的Couture和Stinchcomb，1996)。在另一方面，本發明涉及下述表達載體，其包含以允許下述siRNA分子表達的方 式編碼至少一種本發明的siRNA分子的核酸序列。在一種實施方式中，表達載體包含a)轉 錄起始區域；b)轉錄終止區域；和c)編碼siRNA分子的至少一條鏈的核酸序列，其中所述 序列以允許siRNA分子表達和/或遞送的方式與起始區域和終止區域有效地相連。在另一實施方式中，表達載體包含a)轉錄起始區域；b)轉錄終止區域；C)開放 讀碼框；和d)編碼siRNA分子的至少一條鏈的核酸序列，其中所述序列與開放讀碼框的3』 末端有效地相連，並且其中所述序列以允許siRNA分子表達和/或遞送的方式與起始區域、 開放讀碼框和終止區域有效地相連。在又一實施方式中，表達載體包含a)轉錄起始區域； b)轉錄終止區域；c)內含子；和d)編碼至少一種siRNA分子的核酸序列，其中，所述序列以 允許核酸分子表達和/或遞送的方式與起始區域、內含子和終止區域有效地相連。
在另一實施方式中，表達載體包含a)轉錄起始區域；b)轉錄終止區域；C)內含 子；d)開放讀碼框；和e)編碼siRNA分子的至少一條鏈的核酸序列，其中所述序列所述序 列與開放讀碼框的3』末端有效地相連，並且其中以允許siRNA分子表達和/或遞送的方式 與起始區域、內含子、開放讀碼框和終止區域有效地相連。V.某些試劑盒本發明的教導還提供了涉及來協助本發明方法的試劑盒。試劑盒可用於提升公開 的方法的性能，這通過將實現某些方法所需的兩種或多種組分組裝起來而實現。試劑盒可 含有預先測量的單位量的組分，從而使得最終使用者的測量需求最小化，並且還可包括進 行一種或多種公開的方法的說明書。典型地，對試劑盒的組分加以優化，使得其互相聯合運 行。公開的試劑盒可用於對寡核苷酸(包括小RNA分子和包含脫氧核糖核苷酸的寡核苷 酸)進行鑑定、檢測和/或定量。在某些實施方式中，包含反轉錄引物的試劑盒包含具有 寡核苷酸識別序列的寡核苷酸分子結合部分，所述序列包含位於3』區域與寡核苷酸分子的 區域互補的至少2個核苷酸以及位於5』區域包含至少2個核苷酸的延伸尾；正向引物，其 中所述正向引物包含寡核苷酸分子結合部分，其中包含與寡核苷酸分子的區域相同的至少 2個核苷酸；以及反向引物。在某些實施方式中，此類試劑盒包含第一引物組，其中包括正 向和相應的反向引物。在某些實施方式中，公開的試劑盒還包含第二引物組，其包括但不限 於通用正向引物、通用反向引物或兩者；報導探針；報導基團；反應容器，其包括但不限於 多孔板或微流體設備；底物；緩衝液或緩衝鹽；表面活性劑；或其組合。在某些實施方式中， 公開的試劑盒還可包含第一延伸酶、第二延伸酶和/或第三延伸酶。 實施例試劑使用下述寡聚DNA 反轉錄(RT-)弓| 物5，-GTATCC AGT GCA GGGTCC GGT CGA-3，(SEQ ID NO 1)；正向(FW-)引物5，-GCG TTGAGG TTT GAA ATC-3，(SEQ ID NO: 2)；反向(Rev-)引物:5，-GTA TCCAGT GCA GGG TCC-3，(SEQ ID NO :3)。針對 VEGFR2 的 siRNA 反義序歹Ij :5，-UUG AGG UUU GAA AUC GAC Cx_3，(SEQ ID NO 4) (χ 是 C3-連接子)。TaqMan MicroRNA(Part no. 4346906) > Taqman 2 X Universal PCR Master 混合物(Part no. 4324018)和 MicroAmp Fast 光學 96 孔反應板(Part no. 4366597) 購自 Applied Biosystems0 SYBR GreenI (S7563)從 Invitrogen 獲得。用於兩步RT-PCR的方案在無RNAse的水中將血漿分別稀釋10、100和1000倍(根據經驗建立最佳稀釋)。 在無RNAse的水中，通過對雙鏈siRNA進行系列稀釋，獲得標準曲線。在第一步中，在95°C 對樣品加熱5分鐘，在操作臺上令其冷卻至室溫。隨後，將3μ1樣品與12μ1 RT-緩衝液 混合，緩衝液含有0. 15 μ IlOOmM dNTP、2yl 0. 5 μ M RT-引物、1.5μ1 IOXRT-緩衝液、 1. 0μ IMultiscribe 反轉錄酶 50U/μ 1、0· 19 μ 1 RNAse 抑制劑 20U/μ 1 禾Π 7. 16 μ 1 無 RNAse 的水。將RT混合物施加到96孔MicroAmp板上，在16°C (30分鐘),42°C (30分鐘),85°C (5 分鐘)孵育，然後保持於4°C。在第二步驟中，將3μ1 RT反應物與12 μ 1 PCR緩衝液混合， 緩衝液含有0. 3μ1 IOyMFW引物、0. 3μ 1 10 μ M通用Rev引物、3. 8 μ 1無RNAse的水、 7. 5μ 1 Taqman2XUniversal PCR Master 混合物和 0· 1 μ 1 100XSYBR Green I。用下述參數進行PCR反應1個循環95°C 10分鐘；45個循環95°C 15秒，50°C 1分鐘。數據分析使用系統軟體(7500或7900HT Fast System軟體)分析數據。針對每份樣 品，通過減去無模板對照樣品的Ct-值，來計算Δ Ct-值(Taqman閾值循環)。用公式 EXP(-In(2)* Δ Ct)將ACt值轉化為線性信 號。在EXCEL中繪製標準曲線。示出的值代表 每微升血漿的siRNA濃度(三種稀釋的平均信號以及其相應的標準偏差)。圖1示出了實驗結果，其顯示了使用兩步RT-PCR對血漿中siRNA的定量。用IOmg/ kg siRNA或100mg/kg，經腹膜內(i. ρ)或通過管飼(ρ.ο 經口)來處理小鼠(每組三隻動 物)。施用後數分鐘內獲取血漿(TO)。上面的圖顯示針對VEGFR2檢測的經修飾siRNA的標 準曲線。針對信號強度對siRNA的量繪圖。使用線性回歸計算斜率(0. 9882)、截距(0. 9564) 和R-平方(0.9984)。下面的圖顯示了柱狀圖，其代表在每組一隻小鼠中通過RT-PCR檢測 的每微升血漿的VEGFR2-siRNA的量(fmol)。為進行比較，將每隻動物的血漿(1. 25 μ 1)上 樣到凝膠上，用SYBR GOLD染色。作為參照，還在凝膠上包括進從0. 1到6. 3pmol siRNA範 圍的的稀釋系列。實施例2 使用一步RT-PCR檢測血漿中的siRNA試劑用於檢測針對VEGFR2 的 siRNA 反義序列5，_UUG AGG UUU GMAUC GAC Cx_3，(SEQ ID NO 5) (x是C3-連接子)，使用下述寡聚DNA 反轉錄(RT-)引物5，GTA TCC AGT GCA GGG TCC GGT CGA-3，(SEQ ID NO 6)；正向(Fff-)引物5，-GCG TTG AGG TTT GAAATC-3，(SEQ ID NO 7)；反向(Rev-)引物5，-GTA TCC AGT GCAGGG TCC-3，(SEQ ID NO :8)。TaqMan MicroRNA 反轉錄試劑盒(Part no. 4346906)和 MicroAmpFast 光學 96 孔 反應板(Part no. 4366597)購自 Applied Biosystems0 SYBRGreen I (S7563)和 ROX參照染 料(cat. no 12223-012)從 Invitrogen 獲得。Taq 聚合酶(cat. No 04738225001)從 Roche 獲得。樣品描述將腫瘤培養7天。在第7天，從首次用於實驗的小鼠收集血漿，用載體(小鼠1至 6)、0. 2mg VEGFR2siRNA(小鼠 7 至 12)或 2. Omg VEGFR2siRNA(小鼠 13 至 18)來處理。隨 後,施用VEGFR2siRNA後1小時後分離血漿(小鼠19至24 0. 2mg VEGFR2 siRNA/小鼠25 至30 2. 0mgVEGFR2 siRNA)。第14天，從經載體處理的小鼠(31至36)；經0. 2mgVEGFR2 siRNA處理的小鼠(37至42)和經2. Omg VEGFR2處理的動物(43-48)分離血漿。該數據組 反映了 siRNA施用後24小時的siRNA水平。還在siRNA處理之後1小時收集血漿(小鼠 49 至 54 0. 2mg VEGFR2siRNA/ 小鼠 55 至 60 2. Omg VEGFR2 siRNA)。用於一步RT-PCR的方案在無菌無RNAse的水中將血漿稀釋10倍。製備VEGFR2 siRNA標準，在95°C對樣品 和標準都加熱5分鐘，隨後在冰上冷卻。將5 μ 1樣品與10 μ IRT-PCR緩衝液混合，緩衝液含 有0. 15μ1 IOOmM dNTP、0. 1 μ 1 10 μ M RT-引物、0. 3 μ 1 10 μ M FW-引物、0. 3 μ 1 10 μ M Rev-引物、1·5μ1 10XRT-緩衝液、0· 1 μ 1 100 X SYBR Green Ι、0·03μ1 ROX 參照染料、 0· 5 μ 1 Multiscribe 反轉錄酶(50U/ μ 1)、0· 19 μ 1 RNAse 抑制劑(20U/ μ 1)、0· 15 μ 1 Taq 聚合酶(IU/ μ 1)和6. 68 μ 1無RNAse的水。將PCR混合物施加到96孔MicroAmp板上，隨後在16°C (30分鐘)、42°C (30分鐘)、95°C (10分鐘)孵育，接著進行45個循環95°C (15 秒),500C (1分鐘，獲得數據)，這使用9800Fast熱循環儀(Applied Biosystems)來進行。 使用系統軟體分析數據(7500Fast System軟體)。數據分析在EXCEL中繪製標準曲線，使用線性回歸，獲得式y = ax+b中的a和b的值。使 用該式，將樣品的Ct值轉化為每微升血漿飛克siRNA的值。描述的值代表同一組內所有動 物的平均值以及相應的標準偏差。圖2顯示了使用一步RT-PCR對血漿中siRNAs的定量。通過管飼(p.o 經口)，用 載體或含有0. 2mg或2. Omg針對編碼VEGFR2的mRNA的siRNA的載體，處理小鼠。從首次 用於實驗的小鼠(第7天T0)，處理後1小時(第7天處理後1小時，和第14天處理後 1小時)以及最後一次處理後24小時(第14天處理後24小時)分離血漿。siRNA。使用 標準曲線(上圖)來計算檢測到的血漿中的siRNA的量。柱狀圖代表每組內的平均siRNA 水平及其相應的標準偏差(下圖)。實施例3 使用兩步RT-PCR檢測組織中的siRNA將基於SYBR Green I的檢測與FAM/TAMRA探針的檢測進行比較試劑針對基於SYBR Green I的對siRNA的檢測，使用下述寡聚DNA 反轉錄(RT-)弓丨 物5，-GCG TAT CGA GTG CAG GAT CCA CTT TC-3，(SEQ ID NO 9)；正向(FW-)引物5，_GCG TGT TCT TGT CAT TGA-3，(SEQ ID NO 10)；反向(Rev-)引物5，-GCG TAT CGA GTG CAG G-3，(SEQ ID NO :11)。針對基於FMA/TAMRA的對siRNA的檢測，使用下述寡聚DNA 反轉錄(RT-)引物 5，-GCG TAT CGA GTG CAG GAT CCT GGA AGCAGC MC TTT C_3，(SEQ ID NO 12)；正向(FW-) 引物5，-GCG TGTTCT TGT CAT TGA-3' (SEQ ID NO 13)；反向(Rev-)引物5，-GCGTAT CGA GTG CAG G-3，(SEQ ID NO 14)；探針5，FAM_TGG AAGCAG CM CTT TCA ATG A_3，TAMRA(SEQ ID NO :15)。反義 siRNA 序列 ND9227 :5，-UGU UCU UGU cAU UGA AAG UTsT-3，(SEQ IDNO 16)。反義 siRNA 序列 AD1955 :5，-UCGAAGuACUcAGCGuAAGTsT-3，(SEQ ID NO: 17)。TaqMan MicroRNA 反轉錄試劑盒(Partno. 4346906)和 MicroAmp Fast 光學 96 孔反應板(Part no. 4366597)購自 Applied Biosystems. ROX 參照染料(cat. no 12223-012)從 Invitrogen 獲得，Taq 聚合酶(cat. no 11647679001)從 Roche 獲得。樣品描述大鼠41 和 42 低滲鹽水(IOOmOsmol/kg 水)。大鼠 49 和 50 :10mg/kgsiRNA AD1955，以24小時間隔給兩次劑量，最後一次處理後24小時時進行收穫。大鼠57和58 50mg/kg siRNA AD1955，以24小時間隔給兩次劑量，最後一次處理後24小時時進行收穫。 大鼠65和66 :10mg/kg siRNAND9227,以24小時間隔給兩次劑量，最後一次處理後24小時 時進行收穫。大鼠73和74 :50mg/kg siRNA ND9227,以24小時間隔給兩次劑量，最後一次 處理後24小時時進行收穫。從組織分離siRNA:使用手持Polytron (PT1200，Kinematica AG, Switzerland)，在 TRIZOL (每 IOOmg 組織Iml TRIZ0L)中對經粉碎的冷凍肺組織進行勻漿均質化。在室溫下對勻漿孵育5分鐘，加入氯仿(200μ 1/lml TRIZOL)後，對樣品劇烈振蕩15秒，接著在12000rpm離心15分鐘 (2-80C ) 0將上面的相轉移到新的管中，通過加入2-丙醇(500μ 1/lml TRIZOL)接著在室 溫孵育10分鐘來沉澱RNA。在12000rpm離心10分鐘(2_8°C )後，用Iml冰冷的75% EtOH 洗沉澱，並將其重新懸浮於無RNAse的水中。使用NanoDrop ND-100分光光度計(Witec AG) 測定RNA濃度。為進行RT-PCR的目的，將所有樣品調節至IOng/ μ 1的終RNA濃度。用於兩步RT-PCR的方案
在95 V對RNA樣品(IOng/ μ 1)加熱5分鐘，在冰上冷卻。將5 μ 1樣品與 10 μ 1 RT-緩衝液混合，緩衝液含有0. 15 μ 1 IOOmM dNTP、0. 1 μ 110 μ M RT-引物、1.5μ1 10XRT-緩衝液、0· 5 μ 1 Multiscribe 反轉錄酶 50U/μ 1、0· 19 μ 1 RNAse 抑制劑 20U/μ 1 和7. 56 μ 1無RNAse的水。將RT-混合物施加到96孔MicroAmp板上，在16°C (20分鐘)、 420C (20分鐘)、85°C (5分鐘)孵育，然後保持於4°C。隨後，將5 μ 1 RT-反應物與10 μ 1 PCR 緩衝液混合，緩衝液含有0. 15 μ 1 IOOmM dNTP、0. 3 μ 1 10 μ M Fff-引物、0. 3 μ 110 μ M Rev-引物、0.3μ1 30 μ M FAM/TAMRA 探針、1. 5 μ 1 10XPCR-緩衝液(+MgC12)、0· 03 μ 1 ROX參照染料、0. 12 μ 1 Taq聚合酶(5υ/μ 1)和7. 3 μ 1無RNAse的水。採用基於SYBR Green I的檢測，用0. 1 μ 1 100Χ CYBRGreen I代替FAM/TAMRA探針，相應地調節終體積。 將PCR混合物施加到96孔MicroAmp板上，隨後95°C孵育(5分鐘)，接著進行40個循環 950C (15秒)、58°C (30秒)和72°C (1分鐘，獲取數據)，這使用9800Fast熱循環儀(Applied Biosystems)來進行。使用系統軟體(7500FastSystem軟體)分析數據。數據分析針對每種樣品，通過減去無模板對照樣品的Ct-值，來計算ACt-值(Taqman閾值 循環)。用公式EXP(-In(2)* Δ Ct)將Δ Ct值轉化為相對信號強度。示出的值代表兩次獨 立RT-PCR反應的平均信號及其標準偏差。圖3顯示了對使用SYBR Green I或經FAM/TAMRA標記的探針作為讀出劑對siRNAs ND9227進行基於兩步RT-PCR的檢測的比較。在從用siRNA ND-9227 (10mg/kg ；大鼠65/66， 50mg/kg ；大鼠 73-74)或AD1955 (10mg/kg ；大鼠 49/50，50mg/kg ；大鼠 57-58)處理的大鼠肺 或保持未處理(大鼠41/42)的大鼠肺獲得的50ng總RNA上進行兩步RT-PCR。使用SYBR Green 1(上面的圖)作為信號強度的讀出劑或經FAM/TAMRA標記的探針(下面的圖)，建 立相對表達(通過信號強度反映)。柱狀圖代表兩次獨立的RT-PCR反應的平均值及它們相 應的標準偏差(η = 2，士stdev)。實施例4 使用FAM/TAMRA探針在大鼠肺中定量檢測siRNA試劑使用下述寡聚DNA 反轉錄(RT-)引物5，-GCG TAT CGA GTGCAG GAT CCT GGA AGC AGC AAC TTT C_3，(SEQ ID N0:18)；正向(Fff-)引物5，-GCG TGT TCT TGT CAT TGA-3，(SEQ ID NO 19)；反向(Rev-)引物5，-GCG TAT CGA GTG CAG G_3，(SEQ ID NO 20)；探針5'FAM-TGG AAG CAG CAA CTT TCA ATG A_3，TAMRA(SEQID NO :21)。反義 siRNA 序列 ND9227 :5，-UGU UCU UGU cAU UGA AAGUTsT-3，(SEQ ID NO :22)。TaqMan MicroRNA 反轉錄試劑盒(Part no. 4346906)和 MicroAmp Fast 光學 96 孔反應板(Part no. 4366597) 購自 Applied Biosystems。ROX 參照染料(cat. no :12223_012)從 Invitrogen 獲得，Taq 聚合酶(cat. no 11 647 679 001)從 Roche 獲得。
樣品描述大鼠41 和 42 低滲鹽水(IOOmOsmol/kg 水)。大鼠 49 和 50 :10mg/kgsiRNA AD1955，以24小時間隔給兩次劑量，最後一次處理後24小時時進行收穫。大鼠57和58 50mg/kg siRNA AD1955，以24小時間隔給兩次劑量，最後一次處理後24小時時進行收穫。 大鼠65和66 :10mg/kg siRNAND9227,以24小時間隔給兩次劑量，最後一次處理後24小時 時進行收穫。大鼠73和74 :50mg/kg siRNA ND9227，以24小時間隔給兩次劑量，最後一次 處理後24小時時進行收穫。從組織分離siRNA:使用手持Polytron (PT1200，Kinematica AG, Switzerland)，在 TRIZOL (每 IOOmg 組織Iml TRIZ0L)中對經粉碎的冷凍肺組織進行勻漿同質化。在室溫下對勻漿孵育5分鐘， 加入氯仿(200μ 1/lml TRIZ0L)後，對樣品劇烈振蕩15秒，接著在12000rpm離心15分鐘 (2-80C ) 0將上面的相轉移到新的管中，通過加入2-丙醇(500μ 1/lml TRIZ0L)接著在室 溫孵育10分鐘來沉澱RNA。在12000rpm離心10分鐘(2_8°C )後，用Iml冰冷的75% EtOH 洗沉澱，並將其重新懸浮於無RNAse的水中。使用NanoDrop ND-100分光光度計(Witec AG) 測定RNA濃度。為進行RT-PCR的目的，將所有樣品調節至IOng/ μ 1的終RNA濃度。用於兩步RT-PCR的方案在95 V對RNA樣品(IOng/ μ 1)加熱5分鐘，在冰上冷卻。將5 μ 1樣品與 10 μ 1 RT-緩衝液混合，緩衝液含有0. 15 μ 1 IOOmM dNTP、0. 1 μ 110 μ M RT-引物、1.5μ1 10XRT-緩衝液、0. 5 μ 1 Multiscribe 反轉錄酶 50U/μ 1、0· 19 μ 1 RNAse 抑制劑 20U/μ 1 和7. 56 μ 1無RNAse的水。將RT-混合物施加到96孔MicroAmp板上，在16°C (20分鐘)、 420C (20分鐘)、85°C (5分鐘)孵育，然後保持於4°C。隨後，將5 μ 1 RT-反應物與10 μ 1 PCR 緩衝液混合，緩衝液含有0. 15 μ 1 IOOmM dNTP、0. 3 μ 1 10 μ M Fff-引物、0. 3 μ 110 μ M Rev-引物、0.3μ1 30 μ M FAM/TAMRA 探針、1. 5 μ 1 10XPCR-緩衝液(+MgC12)、0· 03 μ 1 ROX參照染料、0. 12 μ 1 Taq聚合酶(5U/ μ 1)和7. 3 μ 1無RNAse的水。將PCR混合物施 加到96孔MicroAmp板上，隨後95°C孵育(5分鐘)，接著進行40個循環95°C (15秒)和 600C (1分鐘，獲取數據)，這使用9800Fast熱循環儀(Applied Biosystems)來進行。使用 系統軟體(7500Fast System軟體)分析數據。數據分析針對每種樣品，通過減去無模板對照樣品的Ct-值，來計算ACt-值(Taqman閾值 循環)。用公式EXP (-In (2)* Δ Ct)將Δ Ct值轉化為相對信號強度。使用標準曲線計算樣 品中siRNA的量。示出的值代表三次獨立RT-PCR反應的平均信號及其標準偏差。圖4顯示了對大鼠肺中siRNA進行絕對定量的結果。在從用siRNAND-9227 (IOmg/ kg ；大鼠 65/66，50mg/kg ；大鼠 73-74)或 AD1955 (10mg/kg ；大鼠 49/50，50mg/kg ；大鼠 57-58)處理的大鼠肺或保持未處理(大鼠41/42)的大鼠肺獲得的50ng總RNA(下面的圖) 和siRNA ND9227(上面的圖)的系列稀釋液上進行兩步RT-PCR。柱狀圖代表三次獨立的 RT-PCR反應的平均siRNA濃度及它們相應的標準偏差(η = 3，士 stdev)。圖5顯示了使用FAM/TAMRA探針進行siRNA檢測的概括。在反轉錄期間，通過反 轉錄(RT)-引物識別反義RNA，產生單鏈拷貝DNA(cDNA)。隨後，在聚合酶鏈式反應(PCR) 的第一循環中，用cDNA作為正向引物的模板，產生雙鏈DNA分子。在第二 PCR循環中，用該新合成的DNA鏈作為FAM/TAMRA探針和反向引物的停靠位點。不存在模板的情況下，探針是完整的，報導染料與淬滅劑染料的近似性導致報導螢光被抑制。但是，當探針與其靶序列 結合時，DNA聚合酶系統的5』 -3』核酸酶活性在報導和淬滅劑之間切割探針，導致對信號的 檢測。在該過程期間，探針片段被從靶上置換下來，鏈的聚合繼續。封閉探針的3』末端，以 阻礙PCR期間探針的延伸。該過程在每個循環中都發生，其不會干擾產物的指數積累。參考文獻1. Fire, Andrew ；Xu, SiQun ；Montgomery, Mary K. ；Kostas, StevenA.； Driver, Samuel Ε. ；Mello, Craig C. Potent and specific geneticinterference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature(1998) 391 :806-811.2. Elbashir, Sayda M. ；Harborth, Jens ；Lendeckel, Winfried ；Yalcin, Abdullah ；Weber, Klaus ；Tuschl, Thomas. Duplexes of 2l~nucIeotideRNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature(2001)411 :494-498.3. Meister, Gunter ；Tuschl, Thomas. Mechanisms of gene silencingby double-stranded RNA. Nature(2004) 431 :343_349.4. Filipowicz, ffitold. RNAi :The nuts and bolts of the RISCmachine. Cell (2005) 122 17-20.5. Mukherji, Mridul ；Bell, Russell ；Supekova, Lubica ；Wang, Yan ；Orth, Anthony P. ；Batalov, Serge ；Miraglia, Loren ；Huesken, Dieter ；Lange, Joerg；Martin, Christopher ；Sahasrabudhe, Sudhir ；Reinhardt, Mischa ；Natt, Francois ；Hall, Jonathan ；Mickanin, Craig ；Labow, Mark ；Chanda, Sumit K. ；Cho, Charles Y. ；Schultz, Peter G.Genome-widefunctional analysis of human cell—cycle regulators. Proceedings of theNational Academy pf Sciences of the United States of America(2006) 103 14819-14824.上述說明書中提到的所有出版物和專利都通過引用併入本文。對描述的本發明的 方法和系統的多種改動和變化對本領域技術人員來說是明顯的，這不背離本發明的範圍和 宗旨。雖然參照一些特別的優選實施方式對本發明進行了描述，但是應當理解，要求保護的 發明不應被不適當地限制於此類特別的實施方式。事實上，分子生物學、遺傳學或相關領域 的技術人員顯而易見對描述的用於開展本發明的模式的若干改動，它們也意欲包括在所附 權利要求的範圍內。
權利要求
具有改進的靈敏度、在樣品中鑑定或定量寡核苷酸分子的方法，所述方法包括將反轉錄引物與寡核苷酸分子雜交，其中，所述反轉錄引物包含具有寡核苷酸識別序列的寡核苷酸分子結合部分，所述序列包含位於3』區域與所述寡核苷酸分子的區域互補的至少2個核苷酸以及位於5』區域的包含至少2個核苷酸的延伸尾；用第一延伸酶延伸雜交的反轉錄引物，產生反轉錄產物；將正向引物與所述反轉錄產物雜交，其中所述正向引物包含寡核苷酸分子結合部分，所述部分包含與所述寡核苷酸分子的區域相同的至少2個核苷酸；用第二延伸酶延伸雜交的正向引物，產生第一擴增子；將反向引物與所述第一擴增子雜交；用第二延伸酶延伸雜交的反向引物，產生與所述第一擴增子互補的第二擴增子；檢測擴增產物；以及由此對所述寡核苷酸分子進行鑑定或定量。
2.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸分子選自小RNA分子、DNA分子、經修飾的RNA 分子、經修飾的DNA分子、適配體、核酶、誘餌寡核苷酸、免疫刺激性的寡核苷酸構成的組。
3.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸具有包含10-30核苷酸的長度。
4.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸是經化學修飾的。
5.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸是雙鏈的。
6.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸是siRNA。
7.權利要求1的方法，其中所述反轉錄酶引物還包含反向引物序列。
8.權利要求1的方法，其中所述反轉錄酶引物還包含探針序列。
9.權利要求8的方法，其中所述探針序列定位於選自正向引物和反向引物之間或者反 轉錄酶引物內部的位置。
10.權利要求1的方法，其中所述第一引物和第二引物是未經修飾的引物。
11.權利要求1的方法，其中所述第一引物和第二引物是經修飾的引物。
12.權利要求11的方法，其中所述第一引物或第二引物是經修飾的，其中所述修飾包 含使用LNA殘基、肽核酸殘基、經2』 -修飾的RNA殘基、經修飾的核鹼基或其組合。
13.權利要求1的方法，其中所述雜交發生於包含所述反轉錄酶引物、所述反向引物和 所述正向引物的單一反應混合物中。
14.權利要求1的方法，其中所述雜交發生在兩種分別的反應混合物中，其中，所述反 轉錄酶引物存在於第一反應混合物中，其被用於產生反轉錄產物；而所述正向和所述反向 引物存在於第二反應混合物中，其中，來自所述第一反應混合物的所述反轉錄產物在所述 第二反應混合物中被用作為所述正向和反向引物的模板。
15.權利要求1的方法，其中所述反轉錄酶引物的所述寡核苷酸分子結合部分包含與 所述寡核苷酸分子至少90%互補的核苷酸序列。
16.權利要求15的方法，其中所述反轉錄酶引物的所述寡核苷酸分子結合部分包含與 所述寡核苷酸分子互補的大約2-17個核苷酸，其中所述寡核苷酸分子長大約4-19個核苷 酸。
17.權利要求1的方法，其中所述反向引物的所述寡核苷酸分子結合部分包含與所述 寡核苷酸分子的所述區域互補的大約2-30個核苷酸。
18.權利要求1的方法，其中所述正向引物的所述寡核苷酸分子結合部分包含與所述 寡核苷酸分子的所述區域具有相同序列的大約2-30個核苷酸。
19.權利要求1的方法，其中檢測所述擴增產物的步驟包括用第一檢測探針檢測所述第一擴增子，用第二檢測探針檢測所述第二擴增子以及用多種檢測探針檢測所述第一和第 二擴增子兩者。
20.權利要求19的方法，其中所述第一檢測探針是雙鏈DNA嵌入劑。
21.權利要求19的方法，其中所述第一檢測探針是SYBRGreen.
22.權利要求19的方法，其中所述第一和第二檢測探針是信號發射探針，其使用 Watson-Crick鹼基配對與所述寡核苷酸分子結合部分結合。
23.權利要求22的方法，其中所述信號發射探針選自FAM、VIC、JOE、NED、CY5染料、 CY3-染料、經TAMRA標記的探針和MBG探針、蠍探針和分子信標構成的組。
24.權利要求23的方法，其中所述檢測探針包含FAM/TAMRA檢測基團。
25.權利要求1的方法，其中使用信號強度讀出法進行檢測時，對所述寡核苷酸分子進 行定量的所述靈敏度以至少10-100，000倍的因子提高。
26.權利要求1的方法，其中使用信號強度讀出法進行檢測時，對所述寡核苷酸進行定 量的所述靈敏度以至少100-10，000倍的因子提高。
27.權利要求1的方法，其中對所述寡核苷酸進行定量的所述靈敏度被提高到能檢測 濃度範圍為大約1個分子至大約1X10"1個分子的寡核苷酸分子。
28.權利要求1的方法，其中對所述寡核苷酸進行定量的所述靈敏度被提高到能檢測 濃度範圍為大約100個分子至大約1X109個分子的寡核苷酸分子。
29.權利要求1的方法，其中在將所述寡核苷酸分子施用給受試者之後檢測所述寡核 苷酸分子，所述施用通過臨床相關途徑進行，其選自但不限於氣管內、鼻內、腦內、鞘內、結 直腸、口服、肌內、關節內、局部包括陰道、肺遞送、眼內、腹膜內、靜脈內和皮下施用構成的 組。
30.權利要求1的方法，其中用能協助遞送至所述靶細胞和/或協助被所述靶細胞吸收 的藥物載體來配製所述寡核苷酸分子。這選自但不限於中性脂質體、陽離子脂質體或脂復 合體、陽離子聚合物或多聚複合體、中性聚合物、納米顆粒、雙鏈RNA結合蛋白、磷酸鈣、細 胞穿透肽、病毒蛋白和病毒顆粒、抗體和空細菌包膜。
31.權利要求1的方法，其中所述樣品選自流體、組織、細胞和腫瘤構成的組。
全文摘要
本發明提供了用於對核酸寡核苷酸進行檢測和/或定量的方法和組合物。這些方法和組合物可用於在生物樣品中對診斷和/或治療性用的合成靶寡核苷酸，例如適配體、RNAi、siRNA、反義寡核苷酸或核酶，加以檢測和定量。
文檔編號C12Q1/68GK101835903SQ200880112769
公開日2010年9月15日 申請日期2008年8月21日 優先權日2007年8月23日
發明者A·吉爾, F·J-C·納特, I·伯文克 申請人:諾瓦提斯公司