通過在多個單體與特異性結合單體的粘合體的重複鏈的複合物中增加鍵橋的產量以生產...的製作方法

2023-08-13 22:22:36

專利名稱：通過在多個單體與特異性結合單體的粘合體的重複鏈的複合物中增加鍵橋的產量以生產 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及從基於增加產量的單體中製備二聚體和多聚體的方法。為了達到此目的，通過使用特異性結合單體的親和域的重複鏈來生產重複鏈-多個單體複合物，並利用複合物中單體之間很容易形成單體間鍵橋的事實來生產多聚體。即，本發明涉及，通過使用重複鏈作為骨架以最大化地形成重複鏈-多個單體複合物，以及通過在形成的重複鏈-多個單體複合物中的單體之間增加單體間二硫鍵橋的形成，以製造大量二聚物和多聚體的方法。
背景技術：
抗體毒素是通過將毒素添加到特異性結合癌細胞的抗體而產生的(Pastan I.等，醫學年度評論(Annu Rev Med.) 58 (2007) 221-237)。 單克隆抗體(MAb)、B3結合在結腸、胃、卵巢、乳房或肺癌的表面上過度表達的糖類抗原(LeY) (L. H. Pai等，美國科學院院刊(Proc Natl Acad Sci U SA) 88 (1991) 3358-3362 ;I. Pastan 等，癌症研究(Cancer Res.) 51 (1991) 3781-3787)。PE38是假單胞菌屬外毒素(PE)的一種衍生物(J. Hwang等，細胞(Cell). 48 (1987) 129-136 ；V. K. Chaudhary 等，生物化學雜誌(J Biol Chem) 265 (1990) 16306-16310)。Fab, 一種具有抗體的抗原結合部分的片段，包括Fd鏈(VH和CHl)和輕鏈(VL和CL)。Fab抗體毒素也包括Fd鏈(VH和CHl)和輕鏈(VL和CL)。Fab-毒素與單鏈Fv(scFv)-毒素相比具有兩個優勢。第一，Fab-毒素的產量比scFv-毒素高10倍(J. Buchner 等，生物技術(Biotechnology) (NY). 9 (1991) 157-162 ；J. Buchner 等，生物技術(Biotechnology) 10 (1992) 682-685)。第二，Fab-毒素的穩定性在小鼠血眾中得到改善(M. Choe 等，癌症研究(Cancer Res.) 54 (1994) 3460-3467)。據報導由單體間二硫鍵橋形成的二價Fab-毒素二聚體比單價scFv-毒素具有更高的細胞毒性(S. H. Choi等，韓國化學學會公報(Bull. Kor. Chem.Soc.) 22 (2001) 1361-1365 ；J. H. Park 等，分子細胞(Mol Cells) 12 (2001) 398-402 ；M. H. Yoo等，微生物學與生物技術雜誌(Microbiol. Biotechnol.) 16(2006) 1097-1103)。二硫化二聚體由兩個Fab-毒素單體的單體內不配對(counterpartless)半胱氨酸(cys)殘基的二硫鍵來形成。單體內不配對半胱氨酸殘基位於Fab-毒素單體的Fab域和PE38之間。預期二聚體(二價的)抗體-毒素比單體(單價的)抗體-毒素具有更大的優勢。例如，其具有更高的活動性，因為二聚體的兩個抗原結合域提高了結合強度。而且，因為兩個毒素域同時被二價二聚體的抗體毒素轉移到靶細胞，有可能二價二聚體的抗體毒素可以用比單價單體的抗體毒素更高的細胞毒性殺滅祀細胞。並且，Fab-毒素具有比scFv-毒素更高的穩定性，後者經常用於生產重組抗體-毒素(D. Rothlisberger等，分子生物學雜誌(J Mol Biol)347 (2005)773-789)。[B3 (Fab)-ext_PE38]2，B3 (Fab) _ext_PE38 單體的二硫鍵，可以通過將單克隆抗體B3的Fab域和假單胞菌屬外毒素A的衍生物PE38進行融合來形成(KR10-0566091)，而且據報導，當在CRL-1739胃癌培養細胞系上檢測時，[B3 (Fab)-ext-PE38]2具有比B3 (Fab)-ext-PE38高11倍的細胞毒性(J. H. Park等.分子細胞(MolCells) 12(2001)398-402)。通常，二硫鍵連接的二聚體在重摺疊後純化(S.H.Choi等，韓國化學學會公報(Bull. Kor. Chem. Soc. )22(2001) 1361-1365 J. H. Park 等，分子細胞(MolCells) 12 (2001) 398-402 ；M. H. Yoo 等，微生物學與生物技術雜誌(J. Microbiol.Biotechnol.) 16(2006) 1097-1103)。在以前的報導中，二硫鍵連接的二聚體的重摺疊過程得到約0. 0149T0. 25%的產量。在重摺疊過程中，這些二硫化二聚體通過位於兩個單體的抗體-毒素的Fab域和PE38之間的單體內不配對半胱氨酸殘基的隨機接近而形成。儘管二硫鍵二聚體的產量通過重摺疊過程的改進得到提高，但考慮到Fab-毒素的產量，二聚體的產量非常低，在重摺疊過程期間主要生產的分子達到近10%。由於抗體毒素單體不具有在互相之間自身結合的親和力，鍵橋連接的二聚體通過在重摺疊過程期間抗體-毒素單體的單體內不配對半胱氨酸殘基之間的隨機碰撞而產生。即，單體內不配對半胱氨酸殘基之間碰 撞頻率低導致在重摺疊過程期間，在單體的接近的半胱氨酸殘基之間形成單體間二硫鍵橋的效率不高，因此在重摺疊過程期間產生的二聚體的產量非常低。因此，發明人嘗試了各種方法以生產二硫鍵連接的二聚體，其包括用於通過氧化-氧化、氧化-還原的再循環和化學交聯劑由抗體-毒素單體生產二硫鍵二聚體的方法，但是使用這些方法，二聚體的產量沒有改善。因此，在尋找能生產更多[B3 (Fab) -ext_PE38]2，即其中單體B3 (Fab) -ext_PE38為二硫鍵連接的二聚體的方法時，發明人構建了重複鏈，該重複鏈為重組蛋白，其中鏈球菌蛋白G的Fab結合域重複兩次以上，同時以該鏈為骨架，生產了 Fab-毒素多聚體複合物，該複合物上同時結合有多個單體抗體-毒素。在以前的研究中，據報導蛋白G的第三域(域III)能夠結合IgG的Fab片段，而且Fab片段的CHl域對於蛋白G的域具有高的結合親和力(J.P.等，自然(Nature) 359 (1992) 752-754)。當與重摺疊過程比較時，本發明的重複鏈具有如下優勢單體抗體-毒素顯示出對重複鏈的域的高結合親和力。在這方面，單體抗體-毒素的局部濃度在由重複鏈產生的重複鏈-多個單體複合物中很高。提高的局部濃度帶來每個單體抗體-毒素的單體內不配對半胱氨酸殘基中的高碰撞頻率且加速了單體之間二硫鍵形成。因此，有可能生產大量的單體間二硫鍵橋連接的二聚體。本發明重複鏈類似作用的典型實例為通過酶反應動力學中的鄰近效應使酶反應速率提高(NicholasC. Price 和 Lewis Stevens,酶學基礎(Fundamentals of Enzymology),第三版.牛津大學出版社)。結果，發明人通過將重複鏈與單體抗體-毒素簡單混合能夠容易地製備抗體-毒素多聚體複合物，並證實通過複合物中單體抗體-毒素的單體內不配對半胱氨酸殘基的氧化和還原更替反應，以加速在Fab域和PE38之間的半胱氨酸殘基的二硫鍵形成來生產大量的[B3 (Fab) -ext-PE38]2,從而完成本發明。

發明內容
本發明旨在提供由單體之間具有單體間鍵橋的單體大量生產多聚體的方法，使用單體-特異性親和域的重複鏈為骨架以連接單體並以重複鏈-多個單體複合物的形式大量生產多聚體複合物，並且在重複鏈-多個單體複合物中的單體之間形成單體間橋鍵，且與生產單體間橋鍵連接的多聚體的低產量常用方法相比，本發明通過每個單體中的單體內不配對半胱氨酸殘基之間提高的碰撞頻率，以及隨後單體之間的單體間二硫鍵橋的有利形成，提供了較高的和最大化的多聚體的生產方法。為了實現上述目的，本發明提供生產單體間鍵橋連接的多聚體的方法，其包括以下步驟I)製備特異性結合單體的親和域的重複鏈；2)通過將步驟I)的重複鏈與單體混合製備重複鏈與單體的重複鏈/多個單體複合物；和3)分離多聚體，所述多聚體中單體間的鍵橋形成於步驟2)的重複鏈/多個單體複合物中的單體之間。
在二聚體形成的該方法的一個實施方案中，其中抗體-毒素單體通過二硫鍵橋連接，抗體-毒素單體的單體間二硫鍵橋二聚體的產量增加至通常報導的重摺疊方法的產量的約208倍，因此二聚體的形成產量得到很大提高。本發明生產的二聚體比以前報導的單體抗體-毒素具有更高的抗原結合強度、更高的細胞毒性和更高的穩定性，並且具體地顯示出比胃癌細胞系高約11倍的細胞毒性。因此，二聚體的大量生產可以有效地用於癌症治療藥劑的開發。


圖I示出生產具有本發明鍵橋的多聚體的方法的示意圖；圖2示出試驗結果，其中本發明的純化蛋白使用SDS-聚丙烯醯胺凝膠確定，其中圖2A示出試驗結果，其中蛋白G的重組重複鏈蛋白與SDS-樣品緩衝液混合，混合物在還原的16%SDS-聚丙烯醯胺凝膠中進行分析，其中編號1-7的泳道分別為TRf TR7 ;和圖2B示出根據本發明生產的B3 (Fab)-ext_PE38 (單體)和[B3 (Fab) -ext-PE38]2( 二聚體)抗體-毒素分子的分析結果，在非還原的8%SDS_聚丙烯醯胺凝膠中，其中每個箭頭從頂端開始依次表示[B3 (Fab) -ext_PE38]2、B3 (Fab) _ext_PE38和B3 (Fd) -ext-PE38 (由於(H6-B3 (L)具有很小的分子量(即約25kDa)，因此在圖中無法看到);和圖3示出通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠，對在B3 (Fab) _ext_PE38和TRl TR7蛋白的複合物中形成的[B3 (Fab)-ext-PE38]2進行分析的結果，其中圖3A示出完成以下步驟後得到的結果將蛋白複合物樣品(每份IOg)結合到金屬螯合的瓊脂糖珠(泳道I);在室溫下使用40mM 2-巰基乙醇還原樣品30分鐘(泳道2);在37°〇使用5mM氧化的穀胱甘肽型的GSSG氧化蛋白複合物2小時(泳道3);用非還原的8%SDS-聚丙烯醯胺凝膠分離1/2的樣品，其中從頂端開始每個閉合箭頭表示[B3 (Fab) -ext-PE38]2、B3 (Fab) _ext_PE38 和 B3 (Fd) _ext_PE38，開放箭頭表示來源於複合物的TR蛋白；和圖3B示出用還原的12%SDS_聚丙烯醯胺凝膠分離其餘1/2樣品的結果，其中兩個箭頭表示B3(Fd)-eXt-PE38(頂部)和H6-B3(L)(底部)。箭頭的頭指示來源於複合物的TR蛋白(由於TRl蛋白(分子量為8kDa)太小而無法在圖中顯示出來)。
具體實施例方式下面通過參考附圖對本發明的優選實施方案進行詳細的描述，將會更加清楚地理解本發明的特點和優勢。首先注意的是，基於發明人可以適當地定義術語的概念，從而最好地說明其發明的這一原則，此處所使用的術語和單詞應理解為對應於本發明技術主旨的含義或概念。而且，應理解與本發明相關的熟知的功能和結構的詳細描述將被省略，從而不會不必要地模糊本發明的重點。下面詳細描述本發明。本發明的目的是生產大量的由單體間鍵橋形成的多聚體，以及提供提高鍵橋連接的多聚體產量的方法，其通過使用特異性結合單體的親和域的重複鏈為骨架，並產生重複鏈與單體的複合物，從而增加複合物鏈上單體的局部濃度，增加單體之間的碰撞頻率並促進單體間鍵橋的形成。 儘管鍵橋連接的多聚體通過單體間的鍵橋連接多個單體而產生，但是所產生的鍵橋連接的多聚體的量取決於鍵橋如何有效地形成。對於體內使用的物質，用於形成多聚體的橋鍵優選為共價鍵，以使得多聚體不分解為單體並且保持多聚體在體內的穩定性。為了形成共價鍵橋，需要在形成化學官能團的橋鍵之間接觸。然而，蛋白中化學官能團的尺寸與蛋白大分子的總體尺寸相比非常小。因此，當大分子在反應溶液中自由移動時，小化學官能團互相接觸的可能性很低且多聚體的大量形成幾乎是不可能的，除非存在能大大增加官能團接觸的方法。為了增加單體之間鍵橋的形成，本發明製備特異性結合單體的親和域的重複鏈並將多個單體與重複鏈結合，使單體之間的距離在幾納米之內，或者數十納米或數百納米之內，其為分子尺寸的規模。因此，單體不能在溶液中自由移動。即，單體被固定在有限的空間並通過在分子尺寸的空間內移動而互相接觸。在這種條件下，在多個單體結合其上的每個重複鏈上單體的局部濃度非常高。因此，結合的單體之間的接觸頻率顯著增加，並且能夠形成鍵橋的化學官能團之間的接觸也增加。因此，多聚體的形成顯著增加。本發明的目的不僅包括連接蛋白的二硫共價鍵橋，而且包括連接有機化合物單體、生物分子或蛋白或任何其它蛋白的包括醯胺鍵、酯鍵、糖苷鍵或醚鍵的共價鍵。共價鍵橋可以是最優選的鍵橋以增加多聚體穩定性，但不限於此。即，當用鍵橋如離子鍵形成多聚體時，仍可以使用本發明的概念。另外，當通過在單體之間插入連接鏈，從而在單體之間形成橋，從而產生單體-連接鏈-單體結構而形成多聚體時，本發明的概念可用於改進單體的形成效率(Greg T. Hermanson,生物共軛技術(Bioconjugate Techniques),學院出版社公司，1995;Wong S. S.,蛋白共輒和交聯化學(Chemistry of Protein Conjugation andCross-Linking). CRC 出版社公司,1991)。更具體地，本發明的方法可優選地包括下面的步驟，但不限於此I)製備特異性結合單體的親和域的重複鏈；2)通過將步驟I)的重複鏈與單體混合製備重複鏈和單體的重複鏈/多個單體複合物；和3)分離多聚體，所述多聚體中鍵橋形成於步驟2)的重複鏈/多個單體複合物中的單體之間，但不限於此。根據所述方法，單體和步驟I)的特異性結合單體的親和域可優選地來源於蛋白，但不限於此。即，在其之間具有特異性結合親和力的所有種類的分子都可以用作單體和親和域。例如，蛋白和對其具有特異性結合親和力的小的有機化合物可以用作根據本發明方法的單體和親和域。根據上文所解釋的方法，製備特異性結合單體的親和域的重複鏈(步驟I)可包括製備親和域的重複鏈，其同在鏈上而具有不同的結合親和力。因此，可以製備異-二聚體和異-多聚體，其中不同單體被特異性結合至不同的親和域。
根據上文所解釋的方法，在步驟I)中，蛋白單體和其上的具有特異性結合單體的親和力的蛋白域可優選地來源於蛋白的天然形式，但不限於此。即，如果重組單體對配對物具有特異性結合的親和力，則所述單體可用於生產根據本發明方法的具有鍵橋的多聚體。編碼蛋白的基因信息的DNA片段可優選地通過使用正向和反向引物對，由染色體DNA或由表達蛋白的有機體mRNA進行PCR克隆來製備，但不限於此。根據上文所解釋的方法，步驟3)中的鍵橋不僅可包括連接蛋白的二硫共價鍵橋，而且包括連接有機化合物單體、生物分子或蛋白的包括醯胺鍵、酯鍵、糖苷鍵或醚鍵的共價鍵。然而，這並不局限於此，並且多聚體可以由離子鍵形成。根據上文所解釋的方法，步驟I)中的重複鏈可以通過包括下面步驟的方法製備，但不限於此I)通過重複克隆DNA片段製備具有重複的結合親和力蛋白域的構建體(construct),所述DNA片段在表達載體中編碼親和域和與親和域連接的連接子(linker)；2)通過用步驟I)的構建體轉化宿主細胞製備轉化體；和3)培養步驟2)的轉化體，採用層析法分離和純化所表達的重複鏈蛋白，但不限於此。所述構建體可以優選地具有其中親和域在重複鏈中重複3次以上的結構，但不限於此。關於所述構建體，親和域可以由連接子連接，並且GGGGS可以用作G4S連接子，但不限於此。連接子可以延伸至,例如GGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS，但不限於此。G4S連接子具有非常靈活的結構(R. Arai等，Protein Eng 14(2001)529-532)。根據本發明，通過用NdeI和EcoRI切割編碼親和域和連接子的DNA片段，並在用相同酶切割的PCWl的載體部分上克隆該片段來製備質粒pTRl。用NdeI和BspEI再次切割編碼親和域和pTRl的G4S連接子的DNA片段，以製備編碼親和域和作為其連接子的一個G4S的DNA片段的226bp的DNA片段；通過將製備的片段克隆到大的載體片段上而製備質粒PTR2，所述大的載體片段是通過用NdeI和AgeI切割質粒pTRl而獲得的。重複7次上述克隆方法，從而製備質粒pTR7，其中pTR7具有親和域被重複7次的構建體(見表I)。在轉化大腸桿菌(E. coli)BL21 (DE3)後蛋白被過度表達，使用螯合瓊脂糖凝膠快速流動層析和尺寸-排阻層析進行分離和純化。根據所述方法，步驟2)的單體具有特異性結合親和域的結合序列(B)。關於步驟2)的重複鏈-多個單體複合物的形成，有可能製備由不同單體製成的異二聚體和異多聚體，每個不同單體通過使用具有不同結合特異性的親和域的重複鏈，而特異性結合每個不同的親和域。根據所述方法，優選地，單體間不配對半胱氨酸對於從步驟2)的多個單體的複合物製備二硫鍵橋多聚體是必需的，但不限於此。即，不同種類的化學交聯劑可以用於單體之間的鍵橋，以及不配對半胱氨酸之間的二硫鍵橋。如果單體具有任何用於鍵橋的不配對半胱氨酸，優選地，其中包括一個不配對半胱氨酸，但不限於此。根據所述方法，步驟2)的單體可以用於通過使用擴展序列(Ext)將單體與功能性蛋白連接來製備新的種類的單體。根據所述方法，功能性蛋白可包括所有生物化合物，如酶、毒素(功能性的)蛋白或病毒、具有藥物活性的藥物化合物、官能團如脂質體、生物傳感器或前體藥物。擴展序列(Ext)連接單體和功能性蛋白，以融合單體和功能性蛋白，且擴展序列(Ext)可包括不配對半胱氨酸，但不限於此。不配對半胱氨酸在兩個單體之間被氧化並形成二硫鍵橋；因此，形成了二聚體。而且，擴展序列(Ext)包括二硫鍵橋二聚體形成的最後一 個不配對半胱氨酸與異官能團(F)之間的柔性胺基酸序列(Fix)。優選地，柔性序列(Fix)由包括不是大體積胺基酸的GASQEND胺基酸(即甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、天冬醯胺和天冬氨酸)的序列組成，但不限於此。根據所述方法，優選地，步驟2)的混合通過與單體混合併在3飛。C孵育過夜且在35 40°C孵育f 2小時來實施。更優選地通過在4°C孵育過夜且在37°C孵育I小時來實施，但不限於此。根據所述方法，步驟3)的複合物的固定優選地通過將結合重複鏈的單體的蛋白複合物固定在金屬螯合瓊脂糖珠上來實施，但不限於此。當蛋白複合物固定在所述珠上時，其優選地在10°c實施I小時，但不限於此。根據所述方法，關於鍵橋的形成，鍵橋-異多聚體可以通過在異-多個單體的複合物中的不同單體之間形成鍵橋來製備，所述異-多個單體的複合物由具有不同結合特異性的親和域的重複鏈形成。根據所述方法，步驟3)的鍵橋可以通過採用各種現有方法形成(GregT. Hermanson,生物共輒技術(Bioconjugate Techniques).學院出版社公司，1995;WongS. S.,蛋白共輒和交聯化學(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking),CRC出版社公司，1991)。如果使用二硫鍵橋，不配對半胱氨酸的官能團首先被還原。該還原優選地通過將蛋白複合物添加到含有2-巰基乙醇的還原緩衝溶液中來實施，但不限於此。即，對於所述還原，用於單體的半胱氨酸殘基完全還原的2-巰基乙醇的添加量優選為2(T40mM，但不限於此。根據所述方法，如果使用二硫鍵橋來形成步驟3)的鍵橋，則具有二硫鍵橋的多聚體通過每個單體的還原的半胱氨酸殘基的氧化來產生。單體之間的氧化優選地通過將還原的蛋白複合物添加到含有穀胱苷肽氧化型(GSSG)氧化緩衝溶液中來實施，但不限於此。在本發明中，蛋白複合物的還原優選地通過在室溫下添加其中加入了 2-巰基乙醇的Tris-HCl (pH8. 2)來實施，但不限於此。還原的蛋白複合物優選地用含有MOPS(pH6. 5)的緩衝溶液洗滌，但不限於此。用Tris-HCl (pH8. 2)再洗滌複合物3次；加入含有GSSG和Tris-HCl (pH8. 2)的氧化緩衝溶液，用於氧化；將其在37°C下孵育2小時。根據所述方法，孵育的溫度和時間優選地分別為37°C和2小時，但不限於此。
根據所述方法，優選地，採用SDS-PAGE (SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析步驟3)的鍵橋多聚體，但不限於此。通常用於蛋白分離和純化的所有方法都可以使用。根據所述方法，步驟3)的多聚體優選為二聚體，其中單體通過二硫鍵連接，但不限於此。單體可以是以「結合域(B)-擴展序列(Ext)-功能性蛋白(F) 」形式的融合蛋白分子。如果擴展序列包括不配對半胱氨酸，則在兩個結合域(B)-擴展序列(Ext)-功能性蛋白(F)分子的不配對半胱氨酸之間形成二硫鍵橋；因此，二聚體以[結合域(B)-擴展序列(Ext)-功能性蛋白(F)]2的形式形成。為了完成本發明，發明人使用具有作為單體靶結合域⑶的抗體的Fab蛋白片段的抗體-毒素，作為「結合域(B)-擴展序列(Ext)-功能性蛋白(F) 」形式的單體和鏈球菌蛋白G的Fab結合域，該結合域作為與抗體-毒素的Fab域具有特異性結合親和力的親和域。含有抗體Fab片段作為其部分的所有種類的抗體分子(抗體衍生的分子單體)都可以用作單體以及抗體-毒素形式的單體。為了最大化地形成具有單體間二硫鍵橋的二聚體([抗體 衍生的分子單體]2)，製備重組重複鏈蛋白，其中鏈球菌蛋白G的Fab結合域重複2次以上，並且所製備的蛋白用作製備[抗體衍生的分子單體]2的骨架。更具體地，將重複鏈和抗體衍生的分子單體蛋白混合，以製備重組重複鏈-抗體衍生的分子單體的複合物，其中很多抗體單體結合到具有非共價鍵的一個重組鏈蛋白上，且抗體單體的半胱氨酸殘基經還原和氧化，以形成半胱氨酸殘基的二硫鍵，其位於Fab片段和抗體衍生的分子單體的毒素之間，因此製備了 [抗體衍生的分子單體]2。為了比較基於本發明和基於以前的重摺疊方法的[抗體衍生的分子單體]2的形成水平，本發明的發明人採用SDS-PAGE並通過測量SDS-PAGE帶的密度，分析了 [抗體衍生的分子單體]2的產量，結果是基於本發明的[抗體衍生分子單體]2的產量明顯高於所報導的基於重摺疊方法實施的產量。即，[抗體衍生的分子單體]2的產量範圍為結合重組重複鏈蛋白的全部抗體衍生的分子單體的36%-52%，其中鏈球菌蛋白G的Fab結合域重複2次以上。因此，可確定該產量範圍比現有重摺疊方法所報導的產量高約144-208倍。因此，可確定來源於結合的抗體衍生的分子單體的二硫鍵橋二聚體可以使用蛋白G的Fab結合域的重複鏈來形成，而且重複鏈的使用大幅度增加了 [抗體衍生的分子單體]2的形成。通過使用蛋白G的Fab結合域的重複鏈和其與抗體分子單體的結合特異性，簡單的還原和氧化能夠產生大量的[抗體衍生的分子單體]2。另外，本發明提供了編碼特異性結合單體的親和域的重組重複鏈蛋白表達的基因構建體。本發明製備了編碼蛋白G的域III (Fab結合域)的重組重複鏈蛋白的基因構建體。重組重複鏈蛋白優選地包括在兩個Fab結合域之間的一個連接子，G4S (GGGGS)，但不限於此。重組重複鏈蛋白優選地具有其中蛋白G的域III (Fab結合域)重複3_7次的結構，但不限於此。而且，本發明提供了包括基因構建體的表達載體。表達載體優選地連接到期望的特定核酸序列的基因上，所述核酸序列具有用於控制基因向mRNA轉錄和翻譯為蛋白的信息，以提供所期望的蛋白的良好表達並增加蛋白形成的可能性。
而且，本發明提供了由宿主細胞中的表達載體產生的轉化體。將表達載體誘導進入宿主細胞是通過適合的方法之ー實施的，其包括轉化、轉染、結合(conjugation)、原生質體融合、電穿孔、磷酸I丐沉澱或直接微注射。宿主細胞可以是原核或真核細胞。優選真核細胞。真核細胞是哺乳動物的細胞，如CHO細胞。這些細胞優選為在正確位置提供正確摺疊的細胞或者為在產生蛋白後包括糖基化的轉化蛋白分子的細胞，但不限於此。本發明證實了使用重組重複鏈蛋白作為骨架，[抗體衍生的分子単體]2能夠由抗體衍生的分子單體大量生產，其中鏈球菌蛋白G的Fab結合域在重組重複鏈蛋白中重複3-7次。因此，具有特異性結合親和力的親和域的重複鏈可以用於改進單體之間ニ聚體和多聚體的形成。而且，編碼這些重複鏈的基因構建體、包括基因構建體的表達載體和用表達載體轉化的轉化體對於抗體衍生的分子単體之間的鍵橋多聚體的大量形成是非常有用的。 [參考文獻]I. Pastan I.等，醫學年度評論(Annu Rev Med. ) 58 (2007) 221-2372. L. H. Pai 等，美國科學院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A) 88 (1991) 3358-33623. Pastan I.等，癌症研究(Cancer Res. ) 51 (1991) 3781-37874. J. Hwang 等，細胞(Cell) 48 (1987) 129-1365. V. K. Chaudhary 等，生物化學雜誌(J Biol Chem) 265 (1990) 16306-163106. J. Buchner 等，生物技術(Biotechnology) (N Y). 9 (1991) 157-1627. J. Buchner 等，生物技術(Biotechnology) 10 (1992) 682-6858. M. Choe 等，癌症研究(Cancer Res. ) 54 (1994) 3460-34679. S. H. Choi 等，韓國化學學會公報(Bull. Kor. Chem. Soc.) 22 (2001) 1361-136510. J. H. Park 等，分子細胞(Mol Cells) 12 (2001) 398-40211. M. H. Yoo等，微生物學與生物技術雜誌(J. Microbiol.Biotechnol.) 16(2006) 1097-1103I2. D. Rothlisberger 等，分子生物學雜誌(J Mol Biol) 347 (2005) 773-78913.韓國專利 No. 10-056609114. Nicholas C. Price 和 Lewis Stevens.酶學基礎(Fundamentals ofEnzymology),第3版.牛津大學出版社15. R. Arai 等，Protein Eng 14 (2001) 529-53216. Wong S. S.,蛋白共輒和交聯化學(Chemistry of Protein Conjugation andCross-Linking) CRC 出版社公司 1991.17. Greg T. Hermanson,生物共輒技術(Bioconjugate Techniques).學院出版社公司199518. T. Brody 等，分析生物化學(Anal Biochem) 247 (1997) 247-25619. Nienhaus, G. Ulrich.蛋白-配位體的相互作用方法和應用(Prote in-ligandinteractions:methods and applicationsノHumana Press, 200520. Farah, R. A 等，Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 8, 321-356，199821. Trail1P. A.等，科學(Science) 261，212-215，1993
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權利要求
1.一種生產具有鍵橋的多聚體的方法，所述方法包括以下步驟 1)製備親和域的重複鏈，所述親和域對單體具有特異性結合親和力； 2)通過將步驟I)的所述重複鏈和所述單體混合來製備重複鏈/多個單體複合物；和 3)分離多聚體，所述多聚體中鍵橋形成於步驟2)的所述重複鏈/多個單體複合物中的所述單體之間。
2.如權利要求I所述的方法，包括從特異性結合單體的親和域的重複鏈中分離多聚體的步驟，所述多聚體中鍵橋形成於多個結合在重複鏈上的單體之間。
3.如權利要求I或2所述的方法，其中，如果所述單體為蛋白，則將重組重複鏈蛋白與所述單體混合，其中所述重組重複鏈蛋白中特異性結合單體的親和域蛋白是重複連接的，以及分離多聚體，其中所述多聚體中鍵橋形成於所述複合物中的單體之間，所述複合物中所述重複鏈與多個單體相連接。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述重複鏈為重複連接的域III的重組重複鏈蛋白，所述域III為蛋白G的Fab結合域。
5.如權利要求I所述的方法，其中所述單體包含抗體、配體、受體或其片段，或其重組體、或其衍生物、或與生物化學官能團的融合體。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述單體為Fab片段或含有Fab片段。
7.如權利要求5所述的方法，其中所述生物化學官能團包括生物化合物，所述生物化合物包括酶、毒素蛋白或病毒，或具有藥物活性的藥物化合物，或包括脂質體、生物傳感器或前體藥物的官能團。
8.如權利要求I所述的方法，其中所述多聚體至少為二聚體。
全文摘要
本發明涉及生產多聚體的方法，在多聚體中多個單體通過鍵橋連接，該方法通過製備含有重複連接的特異性結合單體的粘合體的重複鏈，以及通過使用上述物質產生重複鏈/多個單體複合物(該複合物由重複鏈和多個單體產生)，從而有助於複合物中單體之間鍵橋的形成。更具體地，本發明涉及生產多聚體的方法，在多聚體中多個單體通過鍵橋連接，該方法通過製備由重複連接的特異性結合蛋白單體的粘合蛋白產生的重複鏈重組蛋白，以及通過使用上述物質產生重複鏈/多個單體複合物(該複合物由重複鏈和多個單體產生)，從而有助於複合物中單體之間鍵橋的形成。更具體地，本發明涉及生產多聚體的方法，在多聚體中多個單體通過二硫鍵橋連接，該方法通過製備由重複連接的特異性結合蛋白單體的粘合蛋白產生的重複鏈重組蛋白，以及通過使用上述物質產生重複鏈/多個單體複合物(該複合物由重複鏈和多個單體產生)，從而有助於複合物中單體之間二硫鍵橋的形成。更具體地，本發明涉及生產二聚體和多聚體的方法，在二聚體和多聚體中多個單體通過二硫鍵橋連接，該方法通過使用含有由鏈球菌蛋白G的域Ⅲ(Fab結合域)的重複連接產生的重組重複鏈蛋白的骨架，由抗體蛋白的單體產生重複鏈及其多個單體複合物，從而有助於複合物中單體之間二硫鍵橋的形成。本發明的方法可有利地用於大量生產二硫鍵橋二聚體，因為與現有技術中已知的重摺疊方法相比，其在二硫鍵橋二聚體產量方面提供了高達200倍的改進。
文檔編號C07K1/14GK102770438SQ200980163448
公開日2012年11月7日 申請日期2009年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者元哉善, 崔武鉉, 李鎔粲 申請人:崔武鉉