一個海帶雌配子體特異性分子標記fsml-1488的染色體定位的製作方法

2023-09-20 17:11:00

專利名稱：一個海帶雌配子體特異性分子標記fsml-1488的染色體定位的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說，是有關海帶雌配子體一個特異性FSML-1488(female-specific marker of Laminaria japonica Areschノ分ナ不不I己仕染色體上白勺定n。
背景技術：
悔荀1ySaccharinajaponica (Areschoug) C. E. Lane, C. Mayes, Druehl et G.ff. Saunders, comb. nov. ^^{Laminaria japonica Aresch.)隸偶揭藻| J (Phaeophyta)、海帶目(Laminariales)，是我國海水養殖業中重要的經濟海藻之一。海帶生活史具有明顯的異型世代交替。孢子體(即人們通常所食用的主要部分)成熟時，帶片上單室孢子囊的孢子母細胞經過減數分裂及多次分裂，產生32個單倍性側生雙鞭毛的同型遊動孢子；它們在釋放後不久附著於基質上，當生長環境適宜吋，分別發育成雌、雄配子體，且性別比為I: I (Schreiber, 1930)。這個性別比結果預示著海帶可能存在著類似高等植物単性花那樣的性別決定系統。Evans (1963, 1965)對掌狀海帶(Z.)等幾物種進行染色體研究,在雌配子體中發現兩個較小和一個較大的染色體，並推測那個較大的染色體可能是它們的性染色體。另外，大量単性生殖的實驗結果(戴繼勳和方宗熙，1976 ;方宗熙等，1978 ；Motomura,1991 ;戴繼勵等，1992 ；Lewis et al. , 1993)證實,海帶雌配子體經無融合單性生埴產生的孢子體能形成孢子囊和遊動孢子，且這些遊動孢子能正常發育均成為雌配子體，說明海帶普遍存在著「孤雌生殖」現象。根據這些研究結果，方宗熙等(1978)推測海帶存在類似X/Y性別決定系統，其中二倍性的孢子體為XY型，而單倍性的雌、雄配子體分別為X型和Y型。但遺憾的是，戴繼勳和方宗熙(1977)、Yabu & Yasui (1991)以及劉宇等(2012)在利用細胞學方法觀察海帶染色體時，雖證實海帶染色體小且雌配子體(大小在O. 78-2. 61 μ m之間)稍微大雄配子體(大小在O. 57-2. 17 μ m之間)，它們多呈短杆狀或點狀，但這些報導都顯示在雌配子體中均沒有發現到顯著的大型性染色體。據此可以推測，海帶可能存在性染色體，但它與常染色體在形態上沒有明顯的差異。分子標記已廣泛應用於高等植物的性別鑑定(Jiang & Sink, 1997; Gunter etal. , 2003a; 2003b; Stehlik & Blattner, 2004; Xu et al. , 2004; Yakubov et al.,2005; Chaves-Bedoya & Nunez, 2007; Li et al. , 2010; Samantaray et al. , 2010)。但至今鮮有藻類性別相關分子標記的報導。Sim et al. (2007)認為隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技術可用於弓長氏'江萬changii)雌、雄株及孢子體的鑑定。Martinez et al. (1999)利用RAPD技術從細江蘺((Jraci/ariagracilis)中分別獲得I個雌性相關PCR標記和2個雄性相關分子標記。最近，通過微衛星引物篩選，Shan & Pang (2010)從裙帶菜(fet/aria pinnatifida)キ敬篇一個與雌配子體相關的分子標記。本課題組所根據地錢polymorpha L. )Y染色體特異序列(GenBank登錄號ΑΒ069714)設計引物，從海帶雌配子體中擴增出一條差異片段，並在國際上率先將該片段成功轉化為ー個命名為FRML-494的SCAR標記(Liu et al.，2009);但這些性別相關分子標記能否特異地定位於染色體上，將直接影響到這些標記在海帶無性繁殖系育苗與育種方面有關雌、雄配子體的鑑定以及在海帶配子體性別分化、性別染色體等基礎理論的深入研究。突光原位雜交(fluorescencein situ hybridization,FISH)技術是建立在原位雜交(i/ situ hybridization)技術的原理與操作方法基礎上(Gall and Pardue, 1969;John et al. , 1969)，首先在哺乳動物的研究中被開發出來(Pinkel ei a人，1986)，它是利用螢光物質標記好的DNA或RNA探針與細胞染色體的核酸進行雜交,檢測後者在細胞內的存在及其數量和結構改變的方法。自從Le et a人(1989)及Schwarzacher et al. (1989) 在植物中成功應用FISH技術後，這種功能強大的手段已廣泛運用於高等植物基因組分析中(參見綜述 Lavania, 1998; Jiang & Gill, 2006; Schwarzacher & Heslop-Harrison,2011)，因為它能夠使目標DNA序列無論在有絲分裂還是在減數分裂的染色體上，都能進行物理繪圖。因而可用於高等植物性別相關基因或DNA標記的定位(Ueda & Tanaka，1995;Mariotti et al. , 2009)及性染色體的鑑定(Shibata et al. , 1999; 2000 ;Hobza etal. , 2004; Lan et al. , 2006)等研究。但FISH技術至今還沒有用於目標DNA序列在藻類染色體上的定位。中國專利文獻CN101280339B公開了ー個能辨別海帶雌配子體的SCAR分子標記，可以對海帶配子體性別進行快速有效的鑑定，也可對單性海帶孢子體親本來源及其後代的性別進行鑑定。中國專利文獻CN101280340B公開了能辨別海帶雌、雄配子體的特異分子標記，可以對海帶配子體性別、単性生殖海帶孢子體親本來源及其後代性別進行鑑定，也可以在細胞核分子水平上對海帶性別分化進行研究。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一個海帶雌配子體特異性分子標記FSML-1488的染色體定位方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是一個海帶雌配子體特異性分子標記FSML-1488的染色體定位方法，包括以下步驟
Cl)帶有目標片段FSML-1488質粒DNA的製備通過CTAB法提取海帶配子體DNA後，利用PCR技術擴增到長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488的片段，然後TA克隆後轉化至大腸桿菌中，最後提取質粒獲得目標片段質粒DNA，所述的目標片段FSML-1488的序列為 SEQ ID NO. 5 ；
(2)海帶配子體染色體的製備利用混合酶液，即纖維素酶、果膠酶、離析酶及鮑魚酶，處理海帶配子體細胞，以DAPI染色，獲得分裂相比較好的高質量染色體；
(3)探針的製備對提取的質粒獲得目標片段FSML-1488質粒DNA利用切ロ平法進行緑色生物素標記探針；
(4)螢光原位雜交按照螢光原位雜交的常規方法進行雌配子體特異性FSML-1488分子標記的染色體定位。所述的步驟(2)中的混合酶液為纖維素酶、果膠酶、離析酶和鮑魚酶的混合酶液，其中纖維素酶、果膠酶、離析酶和鮑魚酶的比例為2:1:1:1. 5,混合酶液的濃度為10 mg/mL。
所述的用於擴增海帶雌配子體基因組DNA的引物對的序列正向引物SEQ IDNO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4。本發明優點在幹
本發明利用各種工具酶，如離析酶、鮑魚酶、纖維素酶、果膠酶等的優化配合以獲得海帶孢子體和配子體原生質體的基礎上，製備高質量的染色體，突破FISH技術在藻類學研究中的技術「瓶頸」，成功地將ー個長為1488 bp的海帶雌配子體特異性FSML-1488分子標記定位在染色體上。


圖I.海帶雌配子體ISSR差異分子標記的電泳圖 譜。1-5泳道不同個體的雄配子體；6-10泳道不同個體的雌配子體；11泳道空白對照；12泳道GeneRuler 100 bp DNAMarker Plus。圖2.海帶雌配子體FSML-1488分子標記的電泳圖譜。1_10泳道不同個體的雄配子體；12-21泳道不同個體的雌配子體；22泳道空白對照；11和23泳道D2000的DNA標準。圖3.海帶配子體DNA酶切電泳圖譜(左)及Southern雜交圖譜(右)。Ml D2000的DNA標準；M2 :1 kb的DNA標準；I 和I早是使用Pstl酶切的基因組DNA ；2 和2早是使用沿ο I和Afoi I雙酶切的基因組DNA。圖4Α.長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488分子標記在海帶雌配子體中期核上的原位雜交圖譜，染色體用DAPI負染。箭號所指為綠色雜交信號。圖4B.長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488分子標記在海帶雌配子體間期核上的原位雜交圖譜，間期核用DAPI負染。緑色區域為雜交信號。圖4C.長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488分子標記在海帶雄配子體中期核上的原位雜交圖譜，染色體用DAPI負染。圖4D.長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488分子標記在海帶雄配子體間期核上的原位雜交圖譜，間期核用DAPI負染。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例I特異性分子標記FSML-1488的提取和鑑定 I)取鮮重為O. I g的海帶配子體無性繁殖系。2)在液氮中輕輕地將配子體無性繁殖系研磨成粉末後，立即轉移入預熱的O. 6 mLCTAB提取緩衝液中，該緩衝液含有重量體積比為3%的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)、I. 4M NaCl,20 mM EDTAUO mM pH為7. 8的Tris-HCl和重量體積比為2%的巰基こ醇，於渦旋混勻儀上混勻I min。3) 65°C溫浴30 60 min,姆10 min顛倒搖動I次。4)加入等體積的體積比為24:1的氯仿異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻3-5 min,至出現乳化層為止。5)室溫下12 000 rpm (轉/分鐘)離心10 min,上清液轉移到另ー滅菌的離心管中。6)向離心管中加入2/3體積_20°C預冷的異丙醇，顛倒混勻，至出現沉澱為止。7)-20°C下放置15 min左右後,8 000 rpm離心10 min。沉澱於70%こ醇洗漆並在無菌操作臺中通風乾燥後，溶解於200 μ L滅菌的CldH2O中。8)待完全溶解後加入1/3體積的7. 5 M的醋酸銨和2倍體積_20°C預冷的無水こ醇。顛倒混勻，至出現沉澱為止。9)-20°C下放置15 min以上，12 000 rpm離心10 min後，再用70%的こ醇洗滌沉澱。最後將沉澱溶解於4(Γ100 μ L左右的滅菌ddH20，-20°c保存備用。10)從加拿大British Columbia大學購置的引物中，選擇10條引物，通過優化PCR反應條件，最後確定反應程序為先進行ー輪94°C變性3 min ;接著45個循環包括94°C變性 45s、50 54°C退火 I. 5 min，72°C延伸 Imin ;最後在 72°C下延伸 10 min。25 μ L 的 PCR 反應體系2· 5 μ L 10XPCR緩衝液[50 mM KCl，10 mM Tris-Cl (pH 8. 3)，I. 5 2. 5 mM Mg2+，100 μ M dNTP], O. 2 μ M ISSR 引物，L I 單位 Taq DNA 聚合酶，30 ngDNA 模板。PCR 產物用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化こ錠染色，凝膠成像系統進行觀察和拍照。在10對引物中，發現引物UBC809 (SEQ ID NO. I)可以自雌配子體中擴增出一條大小在1500 bp左右的差異條帶(圖I)。11)使用北京艾德萊公司的DNA膠回收試劑盒，參照商家實驗步驟說明操作。將海帶雌、雄配子體基因組DNA擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，使雌、雄差異片段與其他擴增條帶儘可能分開，然後用乾淨的刀片割下差異條帶，放入2.0 mL離心管中。12)每100 mg凝膠加入500 μ L溶膠緩衝液，55°C溫浴10 min,使凝膠徹底融化。13)將融化的液體倒入吸附柱中，靜置I min，12000 rpm離心30 S，棄收集管中液體。14)加入700 μ L漂洗液，12000 rpm室溫離心30 S。棄收集管液體。重複此步一次。15)倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管中，12 000 rpm室溫離心2min。16)將吸附柱柱放入一個新的I. 5 mL的離心管中，超淨工作檯風乾吸附柱EC。17)向吸附柱膜中央加40 μ L洗脫液，室溫放置2 min, 12 000 rpm室溫離心2min,離心管中的液體即為回收的DNA片斷，保存於_20°C備用。18)在微量離心管中加入I μ L pMD19_T質粒載體，O. Γθ. 3 pmol待插入DNA片段，再加ddH20至5 μし19)加入5 μ L的連接混合液，16°C反應過夜。20)將上述10 μ L反應液加入至100 μ L的大腸桿菌JM109感受態細胞中，輕輕搖動離心管2 3次，充分混勻。冰中放置30 min。21)冰浴後將離心管轉入42°C水浴90 S，立即冰浴Γ5 min。22)加入890 μ L的LB液體培養基，37°C下150 rpm的速度振蕩培養60 min。(每升LB液體培養基含10 g胰蛋白腖，5 g酵母提取物，10 g NaCl，最後用5 M的NaOH調節PH到7. O後，用蒸餾水定容至一升，滅菌即可)。23)取O. I mL含有連接產物的菌液塗布於LB瓊脂平板培養基上培養，37°C培養過、夜，形成單菌落。LB瓊脂平板製備在每100 mL LB液體培養基中加4 g瓊脂粉，待滅菌的瓊脂培養基冷卻到50°C左右時加入4 mg的5-溴-4-氯-3-卩引哚-β -半乳糖苷(Χ-Gal)、
2.4 mg的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和10 mg的氨節青黴素(Amp+),製作成X_Gal、IPTG、Amp+平板培養基，搖勻後倒平板。24)挑選LB固體培養基上白色菌落，接種到2 mL的含氨苄青黴素的LB液體培養基中。25) 37で下200 rpm的速度震蕩培養過夜。26)取I μ L菌液作為模板DNA，進行PCR反應。25 μ L反應體系含12. 5 μ L天根2XTaq PCR MasterMix [O. I 單位Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.3),100 mM KC1,3 mM MgCl2], 10 μΜ 的上下遊引物各 0.5 μ L, I μ L 菌液模板 DNA。 擴增程序包括94°C預變性3 min，緊接著按照94°C變性45 s、52°C退火45 s、72°C延伸I. 5min的程序進行30個循環，最後72°C延伸10 min。PCR反應結束後，取產物6 μ L在I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳。27)將含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司進行測序。28)根據測序結果SEQ ID NO. 2，將正向引物向3』 -端及反向引物向5』 -端分別延長至32和29個鹼基，獲得FSML-1488特異引物的序列正向引物SEQ ID N0.3和反向引物 SEQ ID NO. 4。29)對海帶雌、雄配子體基因組DNA進行PCR擴增。25 μ L反應體系含12. 5 μ L天根 2 X Taq PCR MasterMix [O. I 單位 Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.3),100 mM KC1,3 mM MgCl2], 10 μ M的上、下遊引物各(λ 5 μ L, I μ L菌液模板DNA。擴增程序包括94°C預變性3 min，緊接著按照94°C變性45 s、65°C退火45 s、72°C延伸I. 5min的程序進行30個循環，最後72°C延伸10 min。擴增結果在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統進行觀察與拍照。30)按照11)-27)步驟進行DNA膠回收、連接轉化、白色菌落篩選、插入片段的確認等，最後將含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司進行測序，獲得能鑑定海帶雌配子體的ー個FSML-1488分子標記，序列參見SEQ ID NO. 5。31) Southern雜交證實FSML-1488分子標記的特異性結果如圖3所示。具體Southern雜交步驟如下
I)按照Thermo公司的North2South雜交試劑盒操作說明書標記探針將 20 μ L 生物素標記的 N4-dCTP (Biotin-dUTP)與 80 yL 的 5XdNTP mix (I mMdATP, I mM dTTP, I mM dGTP, I mM dCTP)充分混合備用。①將100 ng目的片段的PCR純化產物於離心管中稀釋至24 μ L，作為模板DNA;
②加10μ L Heptanucleotide mix引物於上述離心管中，煮沸5 min以變性,然後迅速在冰水混合物放置5 min以退火；
③加10 μ L N4-dCTP 與 5 X dNTP mix(l mM dATP, I mM dTTP, I mM dGTP, I mM dCTP)混合物，5 μ L反應緩衝液，I μ L Klenow酶(10U/ μ L)混合；
④37°C溫育 60min ；
⑤加2 μ L 的 EDTA 液(500 nM, pH 8. 0)使 Klenow 酶失活。II)基因組DNA酶切將提取純化的海帶配子體基因組DNA，選擇分子標記內沒有限制性內切酶位點的內切酶進行酶切。本研究經預實驗後確定使用ー組單酶切及一組由辦ol和#oil組成的雙酶切。III)轉膜
①基因組DNA酶切後電泳，觀察並照相，記下彌散DNA的區域；
②將凝膠置於O.2 M的HCl中處理10 min ；
③棄去HCl溶液，使用去離子水漂洗2次，隨後將凝膠浸泡於20mL體積的變性液(O. 5M NaOH, I. 5 M NaCl)中，30 min後再將凝膠於中和液浸泡30 min ；
④取ー瓷盤，加入轉移液(20XSSC含175.3 g NaCl、88. 2 g檸檬酸鈉、800 mL水、調PH 7、定容至I L)，上置ー塊玻璃板作為平臺，玻璃板表面鋪ー層濾紙，濾紙的兩邊浸沒在轉移液中，驅出玻璃板和濾紙間的氣泡；
⑤根據膠的大小裁剪大小ー樣的濾紙2張先在轉移液中浸沒5min，然後鋪在玻璃板上，將凝膠放到濾紙上，再在凝膠上放置尼龍膜(和膠ー樣大小並預先在去離子水中浸沒10min，後在轉移液中浸沒5 min)，尼龍膜上再放入2層濾紙並驅趕氣泡；
⑥在濾紙上放置15cm高的吸水紙，使用玻璃板壓平，並在玻璃板上放置O. 5 kg的重物。轉膜10 h，期間每間隔2 h更換新的吸水紙；
⑦轉膜完畢，移去吸水紙，將膜放在6XSSC溶液中浸泡5min，用濾紙吸乾液體，放在新的濾紙上，80°C烤膜45 min。IV)雜交
①預雜交將轉好的膜置於雜交管中，點樣面朝上，加雜交液(至少O.I mL/cm2)並確保膜可被雜交液均勻覆蓋，80 rpm室溫下預雜交30 min ；
②熱變性探針煮沸探針10min使其變性，然後迅速置於冰水混合物中退火10 min；
③雜交在雜交液中加入已經變性的DNA探針，使其濃度達到30ng/mL，充分混勻，80rpm, 55 °C雜交過夜。V)嚴謹洗膜
①預先將冷藏的N0rth2S0Uth雜交嚴謹洗膜液緩慢升溫至室溫，加入等體積的去離子水；
②將膜轉移到新的雜交管中使用①步驟的嚴謹洗膜液洗膜3次，毎次用20mL洗膜液洗膜15 min。VI)化學發光法檢測雜交信號
預先將冷藏的封閉液、4X漂洗緩衝液及底物平衡液緩慢升溫至室溫，並配置IX漂洗緩衝液。①封閉棄嚴謹洗膜液，加入15 mL封閉液，42°C振蕩洗膜封閉15 min ；
②配置1:300(66. 7 μ L穩定的親和素標記的HRP加入到20 mL的封閉液中)的抗體稀釋液；
③抗體孵育棄封閉液，加入抗體稀釋液。室溫輕輕振蕩15min ；
④洗膜用20mL的IX漂洗緩衝液淋洗膜，再用20 mL的IX漂洗緩衝液室溫振蕩 輕柔漂洗膜4次，毎次5 min；
⑤平衡將雜交膜移入新的培養皿中，使用30mL的底物平衡液輕輕振蕩5 min ；⑥底物工作液的配置(暗室裡面操作)I:I等體積混合North2South Luminol/Enhanser溶液和N0rth2S0uth 過氧化物酶穩定溶液作為底物發光工作液；
⑦將溼潤的膜放入新的培養皿中，加入⑥步驟的底物工作液(暗室中操作)5min，確保工作液淹沒雜交膜；
⑧將膜從培養皿中取出，濾紙吸乾膜表面液體。用保鮮膜包好雜交膜；
⑨把包好的雜交膜放在暗盒裡，放入柯達X光膠片，曝光2min，(暗室操作)；
⑩從暗盒取出柯達X光片，進行顯影和定影。X光片的條帶結果如圖3所示。
實施例2特異性分子標記FSML-1488的染色體定位
海帶雌配子體特異性分子標記FSML-1488的染色體定位的步驟包括
(I)帶有目標片段(SEQ ID NO. 5)質粒DNA的製備
通過CTAB法提取海帶配子體DNA後，利用PCR技術擴增到長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488的片段，然後TA克隆後轉化至大腸桿菌中，最後提取質粒獲得目標片段(SEQ ID NO. 5)質粒 DNA。(2)海帶配子體染色體的製備
利用纖維素酶、果膠酶、離析酶及鮑魚酶並優化組合以處理海帶配子體細胞，以DAPI染色，獲得分裂相比較好的高質量染色體。(3)探針的製備
對提取的質粒獲得目標片段(SEQ ID NO. 5)質粒DNA利用切ロ平法進行綠色生物素標記探針。(4)螢光原位雜交
按照螢光原位雜交的常規方法進行雌配子體特異性FSML-1488分子標記的染色體定位。帶有目標片段(SEQ ID NO. 5)質粒DNA的製備
I.I海帶配子體DNA的提取
I)取鮮重為O. I g的海帶配子體無性繁殖系。2)在液氮中輕輕地將配子體無性繁殖系研磨成粉末後，立即轉移入預熱的O. 6 mLCTAB提取緩衝液中。該緩衝液含有重量體積比為3%的CTAB、I. 4 M NaCl,20 mM EDTAUOmM的Tris-HCl (pH 7. 8)和重量體積比為2%的巰基こ醇。於渦旋混勻儀上混勻I min。3) 65°C溫浴 45 min,姆 10 min 顛倒搖動 I 次。4)加入等體積的體積比為24:1的氯仿異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻3-5 min,至出現乳化層為止。5)室溫下12 000 rpm離心10 min,上清液轉移到另ー滅菌的離心管中。6)向離心管中加入2/3體積_20°C預冷的異丙醇，顛倒混勻，至出現沉澱為止。7)-20°C下放置15 min左右後,8 000 rpm離心10 min。沉澱於70%こ醇洗漆並在無菌操作臺中通風乾燥後，溶解於200 μ L滅菌的CldH2O中。8)待完全溶解後加入1/3體積的7. 5 M的醋酸銨和2倍體積_20°C預冷的無水こ醇。顛倒混勻，至出現沉澱為止。9)-20°C下放置15 min以上，12 000 rpm離心10 min後，再用70%的こ醇洗滌沉澱。最後將沉澱溶解於4(Γ100 μ L左右的滅菌ddH20，-20°c保存備用。
目標片段的PCR擴增
使用一對正向引物和反向引物(正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4)，對海帶配子體基因組DNA進行PCR擴增。25 μ L反應體系含12. 5 μ L天根2 Taq PCR MasterMix[O. I 單位 Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM KC1，3mM MgCl2], 10 μ M的上、下遊引物各0.5 μ L, I μ L菌液模板DNA。擴增程序包括94°C預變性3 min，緊接著按照94°C變性45 s、65°C退火45 S、72°C延伸I. 5 min的程序進行30個循環，最後72°C延伸10 min。擴增結果在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統進行觀察與拍照。克隆及大腸桿菌轉化
使用北京艾德萊公司的DNA膠回收試劑盒，參照商家實驗步驟說明操作。將海帶雌、雄配子體基因組DNA擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，使雌、雄差異片段與其他擴增條帶儘可能分開，然後用乾淨的刀片割下差異條帶，放入2. O mL離心管中。 I)每100 mg凝膠加入500 μ L溶膠緩衝液，55°C溫浴10 min,使凝膠徹底融化。2)將融化的液體倒入吸附柱中，靜置I min，12 000 rpm離心30 S，棄收集管中液體。3)加入700 μ L漂洗液，12 000 rpm室溫離心30 S。棄收集管液體。重複此步一次。4)倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管中，12 000 rpm室溫離心2min。5)將吸附柱柱放入一個新的I. 5 mL的離心管中，超淨工作檯風乾吸附柱EC。6)向吸附柱膜中央加40 μ L洗脫液,室溫放置2 min, 12 000 rpm室溫離心2 min,離心管中的液體即為回收的DNA片斷，保存於-20°C備用。7)在微量離心管中加入I μ L pMD19-T質粒載體，O. 1-0. 3 pmol待插入DNA片段，再加ddH20至5 μし8)加入5 μ L的連接混合液，16°C反應過夜。9)將上述10 μ L反應液加入至100 μ L的大腸桿菌JM109感受態細胞中，輕輕搖動離心管2-3次，充分混勻。冰中放置30 min。10)冰浴後將離心管轉入42°C水浴90 S，立即冰浴3_5 min。11)加入890 μ L的LB液體培養基，37°C下150 rpm的速度振蕩培養60 min。(每升LB液體培養基含10 g胰蛋白腖，5 g酵母提取物，10 g NaCl，最後用5 M的NaOH調節pH到7. O後,用蒸懼水定容至I L,滅菌即可)
12)取O. I mL含有連接產物的菌液塗布於LB瓊脂平板培養基上培養，37°C培養過夜，形成單菌落。LB瓊脂平板製備在每100 mL LB液體培養基中加4 g瓊脂粉，待滅菌的瓊脂培養基冷卻到50°C左右時加入4 mg的5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷(Χ-Gal )、2. 4 mg的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)和10 mg的氨苄青黴素(Amp+)，製作成X-Gal、IPTG、Amp+平板培養基，搖勻後倒平板。13)挑選LB固體培養基上白色菌落，接種到2 mL的含氨苄青黴素的LB液體培養基中。14) 37°C下200 rpm的速度震蕩培養過夜。
15)取I μ L菌液作為模板DNA，進行PCR反應。25 μ L反應體系含12. 5 μ L天根 2 Taq PCR MasterMix [O. I U Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.3),100 mM KC1,3 mM MgCl2], 10 μΜ 的上下遊引物各 0.5 μ L, I μ L 菌液模板 DNA。擴增程序包括94°C預變性3 min，緊接著按照94°C變性45 s、52°C退火45 s、72°C延伸I. 5min的程序進行30個循環，最後72°C延伸10 min。PCR反應結束後，取產物6 μ L在I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳。16)將含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司進行測序。質粒的提取
使用北京艾德萊公司的質粒提取試劑盒，按照其操作步驟說明進行質粒提取。I)接種100 μ L含有目的片段的菌液到5 mL的含氨苄青黴素的LB液體培養基 中，過夜培養，提取質粒。2)取5 mL的菌液，離心棄上清。3)用250 μ L的溶液pi重懸浮菌液體。3)加入350 μ L的溶液ρ2溫和翻轉3次，室溫放置4 min。4)加入350 μ L的p3，立刻溫和翻轉5次，冰山靜置4 min, 13 000 rpm離心10min,小心取上清。5)將上ー步的上清小心移入吸附柱(吸附柱要放入收集管中)，13 000 rpm, 30 S，
棄收集管中液體。6)加入700 μ L漂洗液WB，12000 rpm，30 S，棄收集管中廢液。7)再次加入500 μ L的漂洗液WB，12000 rpm離心30 S。8)棄收集管中廢液，吸附柱放入收集管中離心2 min。9)棄收集管，把吸附柱放入新的離心管中，超淨工作檯中吹5 min揮髮漂洗液中的こ醇。10)向吸附柱中央的吸附膜上加入60 μ L的洗脫液。海帶配子體染色體的製備
取適量培養狀態良好的海帶配子體離心去除多餘水分，用滅菌海水清洗2-3次，準備待用。加入O. 02%的秋水仙素振蕩搖勻，4°C處理6-12 h，離心得配子體沉澱。加入卡諾固定液(冰醋酸こ醇=1:3)振蕩搖勻之後，4°C處理24 h以上。蒸餾水清洗固定後的產物
3-5次，每次2 min，離心取沉澱藻體，放入2 mL離心管並加入適量混合酶液(纖維素酶果膠酶離析酶鮑魚酶=2:1:1: L 5 (10 mg/mL))，在37°C搖床上於200 r/min酶解18 h。用70%的こ醇終止酶解反應並用蒸餾水清洗酶解產物3-4次以去除こ醇，加入適量4°C保存的冰醋酸，振蕩混勻，觀察酶解產物是否均勻，取少量酶解產物滴片，自然晾乾。取攜帶有染色體的自然晾乾載玻片，在相差顯微鏡下進行鏡檢。然後選取具有分散較好的染色體分裂相，加入 15 μ L DAPI (Vector Laboratories, USA)以染色，15 min 後，在 Olympus BX61螢光顯微鏡(日本)下觀察，拍照並進行放大、測量，以計算雌、雄配子體染色體的相對長度。探針的製備
利用切 ロ平移試劑盒(ADVANCE Nick Translation Kit, Sigma-Aldrich)用 ChromaTide Alexa Fluor 488-5-dUTP (綠色生物素標記)(Invitrogen, USA)標記探針。進行突光原位雜交的探針整個過程都要求在冰上進行。以免酶等其他試劑因為溫度變化失活或者起不到較好的效果。Nick Translation (質粒 DNA 200 ng/μ L)10 μ L IOXNick Translation Buffer2 μ L Labeled dNTP (I mM)0. 5 μ L Non-Iabeled dNTP (2 mM each mixed)2 μ L
DNA Polymerase I (10 U/μ L)4 μ L
DNase I (100 mU/μ L)0.4 μ L
總體積20 μ L
將以上試劑加入I. 5 mL eppendorf管混勻，放入金屬浴，15°C恆溫2 h。之後加入140μ L ssDNA (Sigma-Aldrich, USA),400 μ L 的 90% こ醇-10% こ酸的混合液，_20°C過夜。 4°C下13 000 rpm離心30 min,除去上清,70%こ醇洗漆。無光,風乾。風乾後用20 μ L2XSSC[(含 17. 53 g NaCl、8. 82 g 檸檬酸鈉、800 mL 水、調 pH 7、定容至 I L)，1XTE (10mM Tris-HCl, I mM EDTA, pH 8.0)]溶液溶解，-20°C存貯。螢光原位雜交
I)利用螢光顯微鏡觀察分裂相比較好海帶配子體染色體，取出沒有DAPI染色過的若干張片子標記注釋，將雌、雄配子體分開。2)在紫外交聯儀下進行紫外交聯，2次。3)將8 μ L的雜交液[I. 5 μ L+6. 5 μ L (2XSSC, I X TE)]滴在染色體分裂相上。4)蓋上塑料蓋玻片，100°C，熱變性DNA 5 min。5)將加熱後的雜交片擺放到塑料收納盒裡，放進55°C恆溫培養箱過夜雜交。6)雜交好的片子用2XSSC洗脫液將蓋玻片洗脫棹。黑暗中風乾。7)在染色體雜交區域滴加15 μ L DAPI染色液，5 min後進行螢光顯微鏡鏡檢。請參照附圖4，圖4A是長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488分子標記在海帶雌配子體中期核上的原位雜交圖譜，染色體用DAPI負染。箭號所指為綠色雜交信號。圖4B是長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488分子標記在海帶雌配子體間期核上的原位雜交圖譜，間期核用DAPI負染。緑色區域為雜交信號。圖4C是長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488分子標記在海帶雄配子體中期核上的原位雜交圖譜，染色體用DAPI負染。圖4D是長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488分子標記在海帶雄配子體間期核上的原位雜交圖譜，間期核用DAPI負染。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一個海帶雌配子體特異性分子標記FSML-1488的染色體定位方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)帶有目標片段FSML-1488質粒DNA的製備通過CTAB法提取海帶配子體DNA後，利用PCR技術擴增到長為1488 bp的雌配子體特異性FSML-1488的片段，然後TA克隆後轉化至大腸桿菌中，最後提取質粒獲得目標片段質粒DNA，所述的目標片段FSML-1488的序列為 SEQ ID NO. 5 ； (2)海帶配子體染色體的製備利用混合酶液，即纖維素酶、果膠酶、離析酶及鮑魚酶，處理海帶配子體細胞，以DAPI染色，獲得分裂相比較好的高質量染色體； (3)探針的製備對提取的質粒獲得目標片段FSML-1488質粒DNA利用切口平法進行綠色生物素標記探針； (4)螢光原位雜交按照螢光原位雜交的常規方法進行雌配子體特異性FSML-1488分子標記的染色體定位。
2.根據權利要求I所述的FSML-1488的染色體定位方法，其特徵在於，所述的步驟(2)中的混合酶液為纖維素酶、果膠酶、離析酶和鮑魚酶的混合酶液，其中纖維素酶、果膠酶、離析酶和鮑魚酶的比例為2:1:1:1. 5，混合酶液的濃度為10 mg/mL。
3.根據權利要求I所述的FSML-1488的染色體定位方法，其特徵在於，所述的用於擴增海帶雌配子體基因組DNA的引物對的序列正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ IDNO. 4。
全文摘要
本發明涉及一個海帶雌配子體特異性分子標記FSML-1488的染色體定位方法，包括以下步驟(1)帶有目標片段FSML-1488質粒DNA的製備；(2)海帶配子體染色體的製備；(3)探針的製備；(4)螢光原位雜交。本發明優點在於本發明利用各種工具酶，如離析酶、鮑魚酶、纖維素酶、果膠酶等的優化配合以獲得海帶孢子體和配子體原生質體的基礎上，製備高質量的染色體，突破FISH技術在藻類學研究中的技術「瓶頸」，成功地將一個長為1488bp的海帶雌配子體特異性FSML-1488分子標記定位在染色體上。
文檔編號C12Q1/68GK102660648SQ201210146700
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者劉宇, 周志剛, 畢燕會, 谷俊剛 申請人:上海海洋大學