抗睪丸bvdv感染的疫苗接種方法

2023-05-15 09:01:11 2

專利名稱：抗睪丸bvdv感染的疫苗接種方法
技術領域：
本發明涉及通過使易感性雄性動物對感染免疫來預防由牛病毒性腹瀉病毒引起的睪丸感染的方法。
背景技術：
牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是牛及其它易感性動物具有經濟意義的病原，其能夠排入持久且急性感染的公牛及其它易感性雄性動物的精液。此種病原造成易感性動物的胃腸道疾病、呼吸道疾病及生殖疾病。
雖然因BVDV的高度病原性菌株所引發的胃腸道疾病及呼吸道疾病在臨床上較為劇烈，但因BVDV所引發的生殖方面的損失於經濟上更為顯著。BVDV傳播的參考文獻已經確立公牛精液中的病毒可感染易感性的、授精的母牛，造成受孕率的降低、胎牛早期死亡、流產、及生下持續性感染BVDV的小牛。1-3持續性感染的公牛大部分必然感染易感性的、授精的母牛，原因在於公牛精液中含高濃度病毒(107.6細胞培養感染劑量(50％)/mL)(CCID50/mL)。3比較上，急性感染的免疫活性公牛的感染睪丸在精液中排出較低濃度病毒(5至75CCID50/mL)，但也能夠傳播BVDV。4一項調查研究提出，在精液中25至50CCID50/mL的病毒可感染5％授精的小母牛，並且隨後由被感染的小母牛水平傳播BVDV給懷孕母牛群，結果導致其胚胎的持續感染。5兩組調查人員也報導後青春期公牛的急性感染能夠造成睪丸的持續BVDV感染。6，7一獨特病例出現在紐西蘭人工授精站所養殖的血清陽性非病毒血症(nonviremic)公牛。該頭公牛於試圖由血液中分離BVDV呈陰性反應後被納入人工授精中心。儘管存在有抗BVDV中和抗體，該公牛仍然持續在精液中排出低濃度(2×103CCID50/mL)病毒，且在被處死前持續11個月。急性感染來源未明。通過對該公牛的屍體剖檢，只由公牛睪丸中分離出病毒。6此公牛精液中的病毒導致三頭接受授精的血清陰性小母牛中的一頭出現感染和隨後的血清轉變。8第二個人工誘生感染的案例中，3頭非病毒血症的後青春期公牛中的2頭的精液通過逆轉錄套式聚合酶鏈反應(RT-nPCR)檢測到BVDV長達7個月時間，但無法通過標準組織培養方法分離出病毒。初次暴露後5個月收集的血清於靜脈注射一頭血清陰性小牛後造成小牛的BVDV感染。暴露當天收集的血清以及暴露後7個月收集的血清對另外兩頭血清陰性小牛並未造成感染。7兩項研究皆發現，急性感染的公牛可排出BVDV精液，該精液具有可接受的精子濃度、活力及形態。4，5另一項研究發現急性感染的公牛精子活力降低，頭帶缺損增加，精子頭部小，以及近端小滴(proximaldroplet)。9雖然通過自然育種的傳播力以及對公牛生育力的影響的細節上未確立，但顯然由於BVDV傳播給母牛造成的生殖損失，使易感性雄性動物睪丸感染具有顯著的經濟衝擊。
由於已知睪丸為免疫阻隔，因此睪丸的病毒感染造成透過免疫接種進行的治療或預防上的重大挑戰。出乎意外地，發明人顯示免疫接菌株控制易感性動物的BVDV睪丸感染的有效手段。
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9.Paton DJ，Goodey R，Brockman S，et al.Evaluation of the quality andvirological status of semen from bulls acutely infected with BVDV.Veterinary Record 1989；12463-64.

發明內容
本發明包括一種在易感性雄性動物中預防或治療睪丸BVDV感染的方法，該發明包括對所述動物施用有效量的疫苗，所述疫苗選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本發明也包括一種選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗的疫苗，其用作預防易感性雄性動物睪丸BVDV感染的藥物。
本發明進一步包括一種疫苗在製備用於在雄性動物中預防睪丸BVDV感染的藥物中的應用，所述疫苗選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本發明進一步包括一種預防易感性雄性動物中睪丸BVDV感染的方法，該方法包括識別具有較高BVDV睪丸感染風險的動物；以及對該動物施用有效量的疫苗，該疫苗選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本發明也包括一種用作在對BVDV睪丸感染高度易感性的雄性動物中預防睪丸BVDV感染的藥物的疫苗，所述疫苗選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本發明進一步包括一種疫苗在製備用於在對BVDV睪丸感染高度易感性的雄性動物中預防睪丸BVDV感染的藥物中的應用，所述疫苗選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
本發明也包括一種製品，其包括含有BVDV疫苗的一個或多個容器，該疫苗選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗；以及將該BVDV疫苗用於預防易感性雄性動物的睪丸BVDV感染的說明書。
易感性雄性動物包括公牛、公羊及公豬。較佳具體方式中的動物為公牛。
疫苗及製品可以同時包括第1型BVDV改性活疫苗及第2型BVDV改性活疫苗。
疫苗可得自致細胞病變的病毒或非致細胞病變的病毒。
可選擇地，本發明的疫苗及製品可包括至少一種附加抗原，該抗原選自牛皰疹病毒(BHV-1)；副流行性感冒病毒第3型(PIV3)；牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)；犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、流行性傷寒鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno)、出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemmorrhagia)、問號形巴姆那鉤端螺旋體(Leptospira interrogans pomona)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦鉤端螺旋體(Leptospira bratislava)、胚胎彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏桿菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝桿菌(Mycobacterium dispar)。
在優選的實施方式中，本發明的疫苗及製品可包括至少一種選自牛皰疹病毒(BHV-1)、副流行性感冒病毒第3型(PIV3)、和牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)的附加抗原。


圖1-第2型BVDV激發後睪丸活體剖檢樣品的BVDV陽性百分比。圖例VI＝病毒分離，PCR＝聚合酶鏈反應，IHC＝免疫組織化學a，b有不同小寫字母上標的百分比的差異顯著(P≤0.05)。
具體實施例方式
本發明提供一種對易感性雄性動物治療或預防受BVDV病毒的睪丸感染及其所導致的排放BVDV病毒於精液中的方法。本發明的方法有效預防或減少因第1型BVDV及第2型BVDV引發感染所造成的睪丸感染。
定義與縮寫「牛病毒性腹瀉病毒」(「BVDV」)是一種屬於黃病毒科Flaviviridae)及瘟病毒屬(Pestivirus)的小型正義單股RNA病毒。基於感染易感性細胞單層時體外是否存在可見的細胞致病效應，說明有兩生物型BVDV，即細胞致病型(CP)及非細胞致病型(NC)。非細胞致病生物型可由大部分田野爆發(field outbreak)感染病例分離出。牛病毒性腹瀉病毒菌株可基於病毒RNA內部的實質差異，被分類為兩種(即基因型)，第1型及第2型。
術語「易感性動物」表示對BVDV感染易感的任何動物，例如牛、羊、及豬。
屬於「易感性雄性動物」表示任何對BVDV睪丸感染易感的雄性動物，例如雄性牛、羊、及豬。未經去勢的雄牛稱作「公牛」。未經去勢的雄羊稱作「公羊」。未經去勢的雄豬稱作「公豬」。
就睪丸感染而言的術語「預防」或「控制」表示減少或去除易感性雄性動物睪丸受毒性第1型BVDV及第2型BVDV感染的風險；改善或減輕感染症狀，或加速感染的復原。如果通過睪丸活體剖檢或精液中存在的病毒評估病毒或細菌負載減少，則該免疫接種被視為治療性。
術語「感染」可表示急性或持續性感染BVDV。
「急性」或「短暫」BVDV感染出現於免疫活性易感性動物暴露於BVDV的細胞致病菌株或非細胞致病菌株。雖然以亞臨床感染最為常見，但可觀察得例如抑鬱、缺乏食慾、口腔糜爛和潰瘍、腹瀉及死亡等症狀。受到急性感染的免疫活性動物可傳播病毒給易感性動物，但傳播力遠低於持續性感染動物的效力。
急性睪丸感染表示由於短暫系統性感染，易感性雄性動物的睪丸出現急性感染或短暫感染。若干報告指出急性感染的公牛能夠排出精液中病毒，而該精液具有可接受的精子濃度、活力及形態。但於其它報告中，作者觀察到與急性感染一致的精子活力降低，頭帶缺損增加，精子頭部小，以及近端小滴。
持續性感染BVDV出現於在妊娠大約125日發展出免疫活性之前，易感性動物感染BVDV非細胞致病菌株。持續性感染動物對感染其的菌株發展出免疫耐受性，其作為病原儲存場所，並且一般會終生排出大量病毒於尿液、糞便、精液、唾液、淚液及鼻粘液中。
持續性睪丸感染表示由於急性或持續性的系統性感染，易感性雄性動物的睪丸的持續性感染。
本發明使用的疫苗本發明使用的疫苗包括第1型BVDV和/或第2型BVDV以及獸醫上可接受的載體。
傳統上病毒疫苗分成兩類活疫苗含有已經經過處理或生長而使病毒較不具有病原性(減毒)的活病毒，以及含有殺死的(滅活)病毒粒子的疫苗。就BVDV而言，病毒本身可為致細胞病變的或非致細胞病變的。牛病毒性腹瀉病毒菌株也可以基於病毒RNA內部的實質差異，分為兩種(即基因型)，第1型及第2型。如此，原則上可能存在八大類BVDV疫苗，但大部分商用疫苗是基於致細胞病變的病毒。
目前市售BVDV疫苗是經過化學方式滅活的病毒(McClurkin等人，Arch.Virol.58119(1978)；Fernelius等人，Am.J.Vet.Res.331421-1431(1972)；及Kolar等人，Am.J.Vet.Res.331415-1420(1972))。此等疫苗一般需要施用多劑來達成初步免疫接種，提供短時間的免疫力，且無法保護胚胎的傳染(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract.11615-625(1995))。對於羊，曾經報告基於經純化的E2蛋白質的亞單位疫苗(Bruschke等人，Vaccine 151940-1945(1997))。不幸地是，似乎只有一種疫苗可保護胚胎不受感染，此項保護僅限於同源病毒中的一種菌株。
此外，曾經使用已經減毒的BVD病毒來製造改性活病毒(MLV)疫苗，該BVD病毒的減毒通過於牛細胞或豬細胞重複繼代培養來進行的(Coggins等人，Comell Vet.51539(1961)及Phillips等人，Am.J.Vet Res，36135(1975))，或以化學方式誘生造成病毒的溫度易感性表現型的突變來進行(Lobmann等人，Am.J.Vet.Res.452498(1984)；及Lobmann等人，Am.J.Vet.Res，47557-561(1986))。單一劑MLV疫苗證實可充分提供免疫力，且接受疫苗接種的牛隻的免疫力持續時間長達數年(Coria等人，Can.J.Con.Med.42239(1978))。此外，對以MLV型疫苗免疫接種的小牛也報導可產生交叉保護效果(Martin等人，In Proceedings of the Conference Res.Workers』Anim.Dis.，75183(1994))。但有關此等疫苗使用的安全性考慮，例如可能於胚胎傳播病毒，造成重大問題(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food.Anim.Pract.，11615-625(1995))。
在優選的實施方式中，第1型BVDV成分是改性活致細胞病變的病毒(cpBVD-1菌株NADL-國家動物疾病中心，美國農業部，Ames，Iowa，ATCC VR-534)。在另一優選的實施方式中，第2型BVDV成分為改性活致細胞病變的病毒(cp BVD-2菌株53637，ATCC No.PTA-4859)。如共同審查中的美國專利申請第60/490,834號，申請日2003年7月29日所述，二分離物皆含有NS2-3區的插入物。經過減毒的cp BVDV-1含有編碼核苷酸位置#4993(NADL序列編號)的胸腺嘧啶核苷的3』端序列的Bos taurus DnaJ1，該胸腺嘧啶核苷是於胺基酸位置1536的甘氨酸殘基的編碼密碼子的第三核苷酸。減毒cp BVDV-2含有編碼同一個染色體組位置序列的Bos Taurus DnaJ1的插入物。在另一優選的實施方式中，改性活抗原經過乾燥、凍幹、或玻璃化。
在一個實施方式中，本發明的疫苗組合物包括有效量的一種或多種前述BVD病毒，優選為cpBVD-1菌株NADL(cpBDV-1菌株NADL—國家動物疾病中心，美國農業部，Ames，Iowa，ATCC VR-534)；cpBVD-2菌株53637(ATCC No.PTA-4856)、IBRV菌株C-13(CutterLaboratories)；PIV3菌株Reisinger(Univ.Nebraska)；BRSV菌株375(Veterinary Medical Research Institute，Ames，Iowa)。純化後的BVD病毒可直接用於疫苗組合物，或優選地，BVD病毒可進一步於體外通過一連串的繼代培養而改性。典型地，疫苗含有約1×102至約1×1010噬斑形成單位或TCID50單位病毒，含有獸醫上可接受的載體以及可選地輔劑，體積為約0.1毫升至5毫升，且優選約2毫升。疫苗組合物中可有效提供保護效果的病毒的精確數量可由熟練的獸醫師判定。適合用於疫苗組合物的獸醫上可接受的載體可為後文說明的任一種載體。
典型地，疫苗含有約1×102至約1×1010噬斑或群落生成單位病毒，含有獸醫上可接受的載體以及輔劑，體積為約0.1毫升至5毫升，且優選約2毫升。疫苗組合物中可有效提供保護效果的病毒的精確數量可由熟練的獸醫師判定。適合用於疫苗組合物的獸醫上可接受的載體可為後文說明的任一種載體。典型給藥途徑為肌肉注射或皮下注射約0.1毫升至約5毫升疫苗。本發明的疫苗組合物也包括其它活性成分，例如其它抗BVDV的疫苗組合物，例如W95/12682、WO99/55366、美國專利第6,060,457號、美國專利第6,015,795號、美國專利第6,001,613號及美國專利第5,593,873號。
疫苗接種可通過單次接種或多次接種達成。若需要，可由接種的動物收集血清，並測試是否存在BVD病毒抗體。在本發明的另一實施方式中，疫苗組合物用來處理BVDV睪丸感染。因此，本發明提供控制或預防動物體因第1型或第2型BVD病毒、或第1型與第2型病毒的組合所引起的感染的方法，該方法通過將有效量的本發明的BVDV病毒為動物給藥。在另一實施方式中，本發明的疫苗組合物可有效改善獸群生育力，並減少易感性雄性動物的睪丸感染風險。
在實施本發明方法時，本發明的疫苗組合物優選經肌肉或皮下途徑施予牛隻，但其它給藥途徑也可使用，例如經口、經鼻內(例如噴霧劑或其它無針給藥)、淋巴結內、皮內、腹膜內、直腸或陰道給藥、或通過組合途徑給藥。優選動物頸區的肌肉給藥。可能需要追加接種，且可調整劑量，從而提供優化的免疫接種。
「免疫原性」表示BVD病毒能夠於動物中激發抗第1型或第2型BVD病毒或同時抗第1型與第2型BVD病毒的免疫反應。該免疫反應可以是主要由胞毒性T細胞媒介的細胞免疫反應，或主要由輔助T細胞媒介的體液免疫反應，其又反過來活化B細胞從而導致抗體的製造。
根據本發明，病毒優選在用於免疫原性組合物之前通過細胞培養中的一系列繼代培養而減毒。改性方法是本領域技術人員所公知的。
本發明方法使用的疫苗組合物也可包括其它活性成分，例如其它抗BVDV的免疫原性組合物，例如在共同審查中的專利申請第08/107,908、WO 95/12682、WO 99/55366、美國專利第6,060,457號、美國專利第6,015,795號、美國專利第6,001,613號及美國專利第5,593,873號。
此外，本發明的目的可通過施用BVDV第1型和/或第2型以外的其它抗原(「組合疫苗」)來實現，此等抗原包括但不限於BRSV、BHV-1、PTV2、犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、流行性傷寒鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemmorrhagia)、問號形巴姆那鉤端螺旋體(Leptospira interrogans pomona)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦鉤端螺旋體(Leptospira bratislava)、胚胎彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏桿菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝桿菌(Mycobacterium dispar)。在一些優選的實施方式中，組合疫苗來源於Bovi-ShieldGOLDTMIBR-BVD、Bovi-ShieldGOLDTM3、Bovi-ShieldGOLDTM5、Bovi-ShieldGOLDTMIBR-BVD-BRSV-LP、Bovi-ShieldGOLDTMFP 5L5、Bovi-ShieldGOLDTMFP 5VL5或PreguardGOLD FP 10(Pfizer，Inc.)。
此外，本發明方法採用的免疫原性組合物及疫苗組合物可包括一種或多種獸醫上可接受的載體。如本文所使用的，「獸醫上可接受的載體」包括任一種及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、輔劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑等。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖等。穩定劑包括白蛋白等。輔劑包括但不限於RIBI輔劑系統(Ribi Inc.)、礬土、氫氧化鋁凝膠、膽固醇、水包油型乳液、油包水型乳液，例如Freund’s完全輔劑及不完全輔劑、Block共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、AMPHIGEN輔劑、皂苷、Quil A、QS-2J(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)或其它皂苷部分、一磷醯基脂質A、Avridine脂質-胺輔劑、得自大腸桿菌的熱不穩定性腸毒素(重組或其它)、霍亂毒素、或胞壁醯基二肽等。疫苗組合物可進一步包括一種或多種其它免疫調節劑，例如介白細胞間介素、幹擾素、或其它細胞因子。本發明方法採用的疫苗組合物也可包括艮他黴素(Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate)。雖然本發明的上下文中有用的輔劑及添加劑的數量及濃度可以方便地由技術人員測定，但本發明要涵蓋在2毫升劑量的疫苗組合物中包括約50ug至約2000ug輔劑的組合物，且優選約500ug/2毫升劑量疫苗組合物。在另一優選的實施方式中，本發明涵蓋的疫苗組合物包括約1ug/ml至約60ug/ml抗生素，並且優選小於約30ug/ml抗生素。
本發明方法採用的疫苗組合物可以依據給藥途徑製作為各種形式。例如疫苗組合物可製作成適合注射用的無菌水性溶液或分散液，或使用凍幹技術製造為凍幹劑型。凍幹疫苗組合物一般維持於約4℃，且可於含有或不含有輔劑的穩定性溶液(例如鹽水和/或HEPES)中重新調製。
本發明的疫苗組合物可施予動物體來誘生對第1型或第2型BVD病毒、或對第1型及第2型BVD病毒的免疫反應。如此，本發明的另一個實施方式提供刺激抗第1型或第2型BVD病毒、或抗第1型與第2型BVD病毒的組合的免疫反應的方法，該方法通過對動物體施用有效量的如本發明前面所述的免疫原性組合物。「動物體」表示包括任一種對BVDV感染易感性的動物，諸如牛、羊、及豬。
根據本發明的方法，施予動物體的優選免疫原性組合物包括BVDV cpNADL病毒和/或BVDV cp53637病毒。含有BVDV病毒的免疫原性組合物，特別是在培養中通過一系列繼代培養而改性的，優選透過肌肉或皮下途徑施予牛，但也可使用其它給藥途徑，例如通過經口、經鼻內、經淋巴結內、經皮內、經腹膜內、經直腸或經陰道給藥、或通過各種途徑的組合給藥。
免疫接種方案可使用本領域公知的程序優化。可對動物施用單一劑量，或可間隔兩周至十周接種兩次或多次。依據動物年齡，可再度施用免疫原性或疫苗組合物。例如，本發明涵蓋於六月齡之前對健康牛隻免疫接種，而於六月齡之時再度免疫接種。在另一實施例中，本發明涵蓋於育種前約5周(或於加至牛群前5周)對育種前的牛免疫接種，並且可選地於育種前約2周或於妊娠期間再度免疫接種來保護胚胎不受BVDV第1型及第2型感染。單劑本發明組成物也可於第一劑後約3至4周施用。使用單劑組合疫苗半年再度接種疫苗，預期也可預防BVDV胚胎感染。
在牛隻中誘生免疫反應的程度及本質可使用多項技術評估。例如可由免疫接種動物收集血清，測試是否存在有BVDV病毒的特異性抗體，例如通過傳統的病毒中和化驗。
術語「有效量」表示對給藥動物足夠引起免疫反應的組合疫苗的量。免疫反應可不受限制地包括誘生細胞免疫力及/或體液免疫力。疫苗的治療有效量可依據使用的特殊病毒、牛隻情況和/或感染程度而改變，治療有效量可由獸醫師決定。
滅活(部分或全細胞)和改性活疫苗用於本發明方法的滅活或改性活疫苗可使用本領域公知的多種方法製備。
例如，BVDV分離物可使用已知技術直接從感染母牛的子宮得到。
BVDV分離物可使用多種已知方法減毒，例如包括一系列繼代培養。除了改性活病毒分離物外，本發明的方法採用的疫苗產品也可包括適量的一種或多種常用輔劑。適當輔劑可不受限制地包括礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質，例如溶血卵磷脂；糖苷，例如皂苷衍生物，如Quil A or GPI-0100；Pluronic多聚醇；聚陰離子類；非離子性嵌段聚合物，例如Pluronic F-127(B.A.S.F.，USA)；肽礦物油，如Montanide ISA-50(Seppic，Paris，France)、聚羰乙烯、Amphigen、Amphigen Mark II(Hydronics，USA)、Alhydrogel、油乳液，例如BayolF/Arlacel A之類的礦物油和水的乳液、或植物油、水及卵磷脂之類的乳化劑的乳液；礬土；牛細胞因子；膽固醇及輔劑組合。在優選的實施方式中，含皂苷的水包油型乳液通常經過微流體化。
用於本發明方法的特別優選的BVDV第1型及第2型源為Bovi-ShieldGOLDTM系疫苗產品(PFIZER INC.)，其含有BVDV菌株NADL(得自國家動物疾病中心(NADC)，USDA，Ames，IA)及BVDV第2型菌株cp BVDV菌株53637(Univ.Guelph，Guelph，Ont.)(ATCC No.PTA-4859)。
優選地，菌株NADL及53637為改性活菌株。根據本發明，本發明的菌株可以用市售輔劑輔助，優選為Quil A-Cholesterol-Amphigen(Hydronics，USA)。本發明的免疫原性和疫苗組合物的優選劑量為約2.0毫升。本發明方法採用的組合物中可包括防腐劑。本發明涵蓋的防腐劑包括艮他黴素及硫柳汞。也可添加載體，優選為PBS。改性活疫苗的製備，例如通過繼代培養將有毒菌株減毒，是本領域已知的。
改性活BVDV分離物也可結合下列細菌及病毒，包括但不限於牛皰疹病毒第1型(BHV-1)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、副流行性感冒病毒(PIV3)、犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、流行性傷寒鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemmorrhagia)、問號形巴姆那鉤端螺旋體(Leptospira interrogans pomona)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦鉤端螺旋體(Leptospira bratislava)、胚胎彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏桿菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝桿菌(Mycobacterium dispar)。
給藥劑量和方式根據本發明，將有效量的BVDV或組合疫苗施予易感性雄性動物，提供與第1型及第2型BVDV有關的抗睪丸感染的有效免疫。在一個實施方式中，疫苗分兩劑，間隔約3至4周施予小牛。例如，初次給藥是在動物約1月齡至約3月齡。第二次給藥是在初次施用組合疫苗後的約1周至約4周。
在另一優選實施方式中，給藥是在動物育種前或進入人工授精設施前約4至5周進行。隨後各劑疫苗的施用優選以每年一劑的基準進行。在另一優選的實施方式中，約6月齡之前接受疫苗接種的動物須於6月齡之後再度摟種疫苗。隨後各劑疫苗的給藥優選以每年一劑為基準進行，但預期每兩年及每半年施用隨後各劑疫苗也包括在本發明的範圍中。
有效疫苗劑量依據疫苗成分及給藥計劃決定。典型地，當改性活BVDV製劑用於疫苗時，當一次施予易感性雄性動物時，該疫苗含有每劑約102至約1010TCID50單位的BVDV，並且優選每劑約104至約107TCID50單位的第1型BVDV及第2型BVDV。優選地，對易感性動物一次給藥時，可提供有效免疫力的疫苗含有約104至107TCID50單位/劑量第1型BVDV和第2型BVDV，並且優選約105TCID50單位/劑量。隨後各劑疫苗的給藥優選以每年一次為基準進行。約6月齡之前接種疫苗的動物應在6月齡之後再度接種疫苗。隨後各劑疫苗的給藥優選以每年一次為基準進行。
根據本發明，當施用優選產品Bovi-ShieldGOLDTM 5(Pfizer，Inc.)時，該產品優選以一次約0.1毫升至約5.0毫升的量給藥，更優選約1.5毫升至約2.5毫升，進一步優選約2毫升。隨後各劑疫苗的給藥優選以每年一次為基準進行。約6月齡之前接種疫苗的動物應在6月齡之後再度接種疫苗。隨後各劑疫苗的給藥優選以每年一次為基準進行。
根據本發明，給藥可通過已知途徑達成，包括經口、經鼻內、局部、經皮、及經腸道外(例如靜脈、腹膜內、皮內、皮下或肌肉)。優選的給藥途徑為肌肉或皮下給藥。
本發明也涵蓋單一施用初次劑量，接著為每年再度接種疫苗，而免除每年再度接種之前對小牛施用額外劑量疫苗而產生和/或維持抗感染的免疫力的必要性。
根據本發明施用的疫苗可包括其它成分，例如輔劑(例如礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質，例如膽固醇、溶血卵磷脂；糖苷，例如皂苷衍生物，如Quil A、QS-21或GPI-0100；Pluronic多聚醇；聚陰離子；非離子性嵌段聚合物，例如Pluronic F-127；肽；礦物油，例如Montanide ISA-50、聚羰乙烯、Amphigen、Alhydrogel、油乳液，例如礦物油，如BayolF/Arlacel A和水、或植物油、水及卵磷脂之類的乳化劑的乳液；礬土；牛細胞因子；及輔劑組合。
根據本發明，將有效量的疫苗施予約3月齡的易感性雄性動物，可提供抗睪丸感染的有效免疫力。
在優選的實施方式中，疫苗經肌肉給藥。在另一優選的實施方式中，疫苗經皮下給藥。此外，優選疫苗劑量包括約1毫升至約7毫升，優選約2毫升，每毫升含有約102至約1010TCID50單位/每劑病毒。組合疫苗優選施予動物兩次；一次於約1月齡至約3月齡，一次於約5周至3周後。本發明也涵蓋每年重新疫苗接種單劑。
有較高BVDV感染風險的動物的識別本發明進一步包括一種在對BVDV感染易感性的雄性動物中預防睪丸BVDV感染的方法，包括a)識別具有較高BVDV睪丸感染風險的動物；以及b)對該動物施用有效量的疫苗，該疫苗選自第1型BVDV死疫苗、第2型BVDV死疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
為了識別有較高BVDV感染風險的動物，熟練的技術人員了解當BVDV感染被導入先前未感染的獸群時，或易感性動物接觸另一患有BVDV感染的易感性動物時，動物有較高感染風險。BVDV是以糞-口方式在動物間傳播的。激發有症狀的感染所需的病毒負載與BVD病毒的型別和種系有關，且與病毒於獸群間傳播的速度有關。感染動物可以由症狀識別。常見BVDV感染的表徵包括流產發作(abortionstorm)、不孕症、不規則發熱周期、胚胎早期死亡、胎兒乾屍化、免疫抑制、痢疾、血小板減少及腦部發育不全。出現疾病症狀之前通常先有白血球減少，至今為止的試驗都致力於識別此種效應。
血清學研究顯示有高百分比BVDV感染的牛，包括被視為持久性感染(PI)的，維持臨床上無徵狀。因此，識別感染動物的優選方法是檢測是否存在病毒本身，而非仰賴於疾病的徵狀。已經發展出數種不同試驗方法來檢測BVDV，和/或檢測BVDV感染動物。此等試驗方法包括逆轉錄聚合酶鏈反應、酶聯免疫測定法(ELISA)、標準病毒分離技術、及免疫組織化學(Haines等人，「MonoclonalAntibody-Based Immunohistochemical Detection of Bovine Viral DiarrheaVirus in Formalin-Fixed，Paraffin-Embedded Tissues，」Vet.Pathol.，2927-32(1992))。
PCR及病毒分離技術由於其特有的靈敏度，因此皆可檢測極低濃度的BVDV。例如耳刻痕活體剖檢樣本(ear notch biopsy sample)的組織樣本的免疫組織化學，也是檢測持久性感染動物的有效技術。ELISA技術雖然略微不敏感，但適合作為檢測動物BVDV感染的無限診斷工具，因ELISA技術價廉，可於短時間內獲得結果，且無需高度熟練的技術人員和高度特殊的實驗室設備。
檢測BVDV感染的ELISA方法在參考文獻中描述。參見Huchzermeier等人的美國專利第6,174,667號及WO99/15900和美國專利申請第20030143573號，並與其它方法比較，「Comparison of anAntigen Capture Enzyme-Linked Assay with Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction and Cell Culture Immunoperoxidase Tests forthe Diagnosis of Ruminant Pestivirus Infections，」Vet.Microbiol.，4375-84(1995))。
通過下列實施例進一步舉例說明本發明，但不被限制於以下實施例。
實施例1睪丸的保護研究綜述使用第1型BVDV及第2型BVDV調製的Bovi-ShieldGOLDTM5疫苗系，於2003年11月引進給牛飼養產業，來獲得疫苗接種提供的對第2型BVDV的最佳胚胎保護程度。此處的報告是獲得許可執照前期的功效研究結果，起評估青春期前期使用Bovi-ShieldGOLDTM5疫苗接種是否可有效預防嚴重的第2型BVDV激發的睪丸感染10，且與安慰劑(Bovi-ShieldIBR-PI3-BRSV)作比較。
全部納入較廣泛的第2型BVDV激發研究的小公牛(n＝17)接受進一步評比，來判定疫苗接種Bovi-Shield GOLDTM5是否可有效預防BVDV的睪丸感染。初期調查研究的小牛皆為3月齡至4月齡斷初乳的小牛(雄性及雌性)。使用含有最低免疫劑量(最低免疫劑量是在疫苗許可執照核發之前確立的，且反應比終產物中存在的抗原病毒更低量。最低免疫劑量的測定有助於確保產品以釋放濃度使用時，一致性地刺激足夠對抗疾病的保護)的第1型BVDV及第2型BVDV二者的配製物免疫接種後28日，全部接種疫苗的小牛及接受安慰劑的對照組小牛經鼻內以非致細胞病變的第2型BVDV菌株24515激發。菌株24515分離自加拿大一次嚴重的BVD暴發感染，殺死感染牛群超過40％。激發後，全部10頭對照組小牛皆嚴重發病，發病特徵為長時間的病毒血症(9至14日)，發燒4至9日達到105.6至107.2，白血球減少(1至9日)，血小板減少(＜100,000每μL)，發病(4至9日)，及高死亡率(10頭對照中7頭死亡(70％))。相反地，免疫接種組的小牛隻有1頭出現病毒血症，6頭髮燒1或2日，1頭的白血球減少經歷1日，皆未出現血小板減少，且無死亡。整體而言，20頭接受疫苗接種的小牛中18頭於整個研究期間維持健康，只有2頭於第1日顯示抑鬱。此二項觀察皆未關聯先前或目前的病毒血症、發燒、白血球減少或血小板減少。11BVDV睪丸感染的評估是始於激發後約2周。如表1所示，睪丸樣本是對2頭安慰劑對照組小牛於研究的第41日由屍體剖檢收集，而其餘5頭對照組小牛以及Bovi-ShieldGOLDTM5疫苗接種小牛於第42日由活體剖檢取得睪丸樣本。第二樣本也是得自10頭Bovi-ShieldGOLDTM5疫苗接種組中的7頭，其於第56日仍然可取得樣本。全部樣本皆使用組織培養分離法、核酸放大法(RT-nPCR)、及免疫組織化學試驗法來檢測BVDV。收集及檢測睪丸樣本的工作人員未知處理組別的分配。

*分離物24515從the University of Guelph，Guelph，Ontario，Canada獲得。
7頭接種安慰劑的小公牛中的兩頭在第41日剖檢取樣，其它5頭小公牛在第42日取樣。
全部10頭小公牛在第42日取樣，第2份樣品在第56日從7頭小牛中取樣。
病毒分離和PCR化驗在the Auburn University VeterinaryPathobiology和Clinical Sciences Laboratory進行，免疫組織化學分析在the University of Nebraska-Lincoln Veterinary Diagnostic Center進行。數據由Pfizer Animal Health，Veterinary Medicine and Research，Biometrics，Technology and Quality的代表以分類程序進行分析(SAS/STATSoftware Changes and Enhancements through Release 6.12，SAS Institute，Cary，NC，或SAS/STAT User’s Guide Version 8和SAS Procedures GuideVersion 8)。使用Fisher’s Exact Test比較每個治療組中具有至少一個BVDV陽性測試結果的動物的比例。適當地計算描述統計。
結果表2和圖1總結了治療組在睪丸組織剖檢樣本中BVDV檢測的百分比。7個得自接種安慰劑和激發的公牛的睪丸樣本中的6個(85.7％)檢測到BVDV核酸或抗原。相反地，在得自激發並接種Bovi-ShieldGOLDTM的小公牛的睪丸樣本中沒有檢測到BVDV核酸或抗原(0％)，由顯著差異(P≤0.05)。

VI＝病毒分離，PCR＝聚合酶鏈反應，IHC＝免疫組織化學a，b欄內有不同小寫字母上標的百分比的差異顯著(P≤0.05)。
結論與討論研究結果證明了接種Bovi-ShieldGOLDTM5的小牛的安全性和功效。用最小免疫劑量的第1型和第2型BVDV配製疫苗不僅沒引起睪丸感染，而且有效地保護青春期前的小公牛免受第2型BVDV嚴重激發後的睪丸感染。
在青春期前的公牛中使用Bovi-ShieldGOLDTM5在母牛-小牛和牛乳操作中可以是BVD控制程序的重要組成。及時的疫苗接種能夠有助於保護小公牛免受急性感染，急性感染與暫時和持久的睪丸感染以及隨後的精液中BVDV傳播給易感性母牛有關。此外，為防止青春期後BVDV感染而對青春期前公牛接種疫苗可有助於保持精液質量，其在急性BVDV感染之後的首60日顯示可被影響(降低活力和形態異常)。9儘管這裡的結果證明用第2型BVDV激發後的成功保護，可以預測到用第1型BVDV激發後將觀察到相似的結果。
實施例2對第1型BVDV激發的睪丸保護—研究綜述進行研究來評估Bovi-ShieldGOLDTM5在面對嚴重第1型BVDV激發時預防睪丸感染的功效。本研究設計為一般隨機區組設計(blockdesign)，具有單向處理結構。全部研究室人員皆未知處理信息。
45頭青春期附近的完好肉用小公牛分配進行研究。小公牛為9月齡至15月齡。全部動物皆為BVD病毒第1型及第2型血清陰性，血清中BVD病毒分離物陰性，及血清逆轉錄套式聚合酶鏈反應(RT-nPCR)陰性。於第42日，安慰劑組(n＝23)及試驗組(n＝22)中的小公牛的最小均方體重分別為625.7±30.94lbs和613.5±35.96lbs。動物接種安慰劑(Bovi-ShieldIBR-PI3-BRSV)或Bovi-ShieldGOLDTM5(IBR-BVDV1-BVDV2-PI3-BRSV)。
使用含最小免疫劑量的製劑疫苗接種後第28日，全部疫苗接種小牛及安慰劑對照組小牛皆經鼻內接受Auburn University分離的非致細胞病變第1a型BVDV病毒菌株SD-1激發。鼻內激發以如下反式進行，將塑膠袋置於公牛鼻孔使其強力呼吸30秒，然後滲入5毫升生長於MEM的病毒，該MEM含有Earle’s鹽且補充10％(vol/vol)馬血清碳酸氫鈉(0.75mg/mL)、L-穀氨醯胺(0.29mg/mL)及抗生素(100單位青黴素G，100μg鏈黴素及0.25μg兩性黴素B/mL)。通過病毒分離及RT-nPCR測得馬血清不含BVD病毒。
BVDV睪丸感染的評估是於第42日及93日進行的。基本研究設計摘在下表3中描述。

激發後，檢測兩組動物的血清是否存在有病毒。乳血清病毒分離物所檢測的，安慰劑組的18頭小牛於第34日皆為病毒血症。這18頭中的9頭於第35日也有病毒血症。Bovi-ShieldGOLDTM5組只有5頭小牛在第34日為病毒血症。任何研究日任一治療組的小牛在其它病毒分離檢測中都不呈陽性反應。
RT-nPCR檢測也用於測定小牛是否患有病毒血症。安慰劑組於第34、35、36及37日分別有3、9、12及6頭小牛有陽性結果。而對Bovi-ShieldGOLDTM5組，於第34、35、36及37日分別有1、1、2及1頭小牛呈陽性結果。任何研究日任一治療組的小牛皆在其它血清RT-nPCR檢測中都不呈陽性反應。
對兩組測量最小均方直腸溫度。只有第36日的平均(安慰劑組為104，Bovi-Shield GOLD 5組為102.9)有顯著差異(P≤0.05)。
睪丸保護結果第93日進行睪丸活體剖檢樣本的測試結果顯示於表4中。得自安慰劑組23頭小牛的樣本中有6頭(26.1％)於RT-nPCR檢測中呈陽性，而Bovi-ShieldGOLDTM5組全部22頭小牛的樣本皆為陰性。安慰劑組及Bovi-ShieldGOLDTM5組的活體剖檢樣本的病毒分離檢測皆為陰性。來自安慰劑組23頭小牛中的5頭(21.7％)和來自Bovi-ShieldGOLDTM5組22頭小牛中的0頭的活體剖檢樣本在IHC檢測中為陽性。
治療組中的所以血清樣本小牛在第42日於RT-nPCR檢測BVD病毒中呈陰性(表4)。在第93日，安慰劑組23頭小牛中的10頭(43.5％)在RT-nPCR檢測中呈陽性，但Boyi-ShieldGOLDTM5組中的全部22頭小牛皆呈陰性。在第42日或第93日，沒有從任何治療組的任何血清樣本中分離出病毒(表4)。
安慰劑組23頭小牛中的10頭在至少一種測試中呈陽性。這十頭小牛中的四頭僅對一種測試(第93日的血清RT-PCR)呈陽性。一頭小牛對兩種測試(第93日的睪丸活體剖檢RT-nPCR和血清RT-nPCR)呈陽性。五頭小牛對三種測試(第93日的睪丸活體剖檢RT-nPCR、血清RT-nPCR和活體剖檢IHC)呈陽性。

VI＝病毒分離，PCR＝聚合酶鏈反應，IHC＝免疫組織化學a，b欄內有不同小寫字母上標的百分比的差異顯著(P≤0.0002)。
第93日睪丸活體剖檢樣本第42日血清樣本*第93日血清樣本對每個動物，檢測在任何時間點血清或睪丸活體剖檢中是否存在BVD病毒，根據治療組來進行總結，並使用實施例1中的Fisher’s Exact檢測來分析。
結論在本研究中，用Bovi-ShieldGOLDTM5進行疫苗接種的小公牛預防第1型BVD病毒的持久睪丸感染和隨後的將病毒排入精液。安慰劑與疫苗接種動物之間的對比在雙尾Fisher’s Exact Test中的至少一個陽性測試中是顯著的(P＝0.0002)。
以上引用的全部專利、專利申請、和出版物都完整地引入本文以供參考，相當於它們都在本文中不矛盾地提供。
本發明不限制於具體實施方式
中描述的範圍，這些具體實施方式
僅是本發明單個方面的單個例證。功能上等價的成分和方法在本發明的範圍中。事實上，除了本文所描述和顯示的以外，本發明的各種修改對於閱讀了前述說明書的本領域技術人員來說將是顯而易見的。這些修改是要包括在所附權利要求的範圍中的。
權利要求
1.一種在易感性雄性動物中預防睪丸BVDV感染的方法，包括對所述動物施用有效量的疫苗，所述疫苗選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述動物選自公牛、公羊及公豬。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述動物為公牛。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗包括第1型BVDV改性活疫苗及第2型BVDV改性活疫苗。
5.如權利要求4所述的方法，其中至少一種BVDV改性活疫苗來自致細胞病變的病毒。
6.如權利要求4所述的方法，其中至少一種BVDV改性活疫苗來自非致細胞病變的病毒。
7.如權利要求4所述的方法，其中兩種BVDV改性活疫苗均來自致細胞病變的病毒。
8.如權利要求1-7中任何一項所述的方法，其中所述疫苗包括至少一種附加抗原，所述抗原選自牛皰疹病毒(BHV-1)；副流行性感冒病毒第3型(PIV3)；牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)；犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、流行性傷寒鉤端螺旋體(Leptospiragrippotyphosa)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospira borgpeterseniihardio-prajitno)、出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospiraicterohaemmorrhagia)、問號形巴姆那鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans pomona)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospiraborgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦鉤端螺旋體(Leptospirabratislava)、胚胎彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏桿菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝桿菌(Mycobacterium dispar)。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述附加抗原包括牛皰疹病毒(BHV-1)、副流行性感冒病毒第3型(PIV3)、及牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)。
10.一種疫苗在製備用於在對BVDV睪丸感染高度易感性的雄性動物中預防睪丸BVDV感染的藥物中的應用，所述疫苗選自滅活第1型BVDV疫苗、滅活第2型BVDV疫苗、第1型BVDV改性活疫苗、及第2型BVDV改性活疫苗。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述動物選自公牛、公羊及公豬。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述動物為公牛。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述疫苗包括第1型BVDV改性活疫苗及第2型BVDV改性活疫苗。
14.如權利要求13所述的方法，其中至少一種BVDV改性活疫苗來自致細胞病變的病毒。
15.如權利要求13所述的方法，其中至少一種BVDV改性活疫苗來自非致細胞病變的病毒。
16.如權利要求13所述的方法，其中兩種BVDV改性活疫苗均來自致細胞病變的病毒。
17.如權利要求10-16中任何一項所述的方法，其中所述疫苗包括至少一種附加抗原，所述抗原選自牛皰疹病毒(BHV-1)；副流行性感冒病毒第3型(PIV3)；牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)；犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、流行性傷寒鉤端螺旋體(Leptospiragrippotyphosa)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospira borgpeterseniihardio-prajitno)、出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospiraicterohaemmorrhagia)、問號形巴姆那鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans pomona)、伯格彼德西奈鉤端螺旋體(Leptospiraborgpetersenii hardjo-bovis)、伯拉第斯拉瓦鉤端螺旋體(Leptospirabratislava)、胚胎彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、溶血巴氏桿菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、出血敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)及迪斯伯分枝桿菌(Mycobacterium dispar)。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述附加抗原包括牛皰疹病毒(BHV-1)、副流行性感冒病毒第3型(PIV3)、及牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)。
全文摘要
本發明涉及通過使易感性雄性動物對感染免疫來預防由牛病毒性腹瀉病毒引起的睪丸感染的方法。
文檔編號A61K39/295GK1929859SQ200580008271
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月4日 優先權日2004年3月17日
發明者M·A·埃爾斯沃思, C·M·塔克 申請人:法瑪西雅厄普約翰有限責任公司