編碼一種癌症新標記的基因的製作方法
2024-01-21 19:01:15
專利名稱：編碼一種癌症新標記的基因的製作方法
編碼一種癌症新標記的基因本申請是申請日為1999年3月11日，申請號為99806169.7，發 明名稱為"編碼一種癌症新標記的基因"的發明專利申請的分案申請。本發明涉及編碼包含一表位即癌相關抗原的蛋白和衍生自該蛋 白的肽的基因，該表位可用作不限於先前定義的癌組織學類別的標記。 抗原肽可用作治療和預防癌症的疫苗，且適合於製備新的、特異性的 單克隆抗體。反義分子在藥用組合物中是有用的，且可用於診斷和治 療。發明背景癌症("癌症是一種惡性胂瘤；"其中"腫瘤"是異常的組織塊， 它不一定為惡性的；"贅生物"是新生長物的一種形式。)是全世界男 性和婦女的主要死因；僅在美國，每年診斷出超過一百萬的新病例， 且每年報導有超過五十萬人死亡(Landis等，1998)。在歷史上，部分地 基於其中發生例如乳癌、結腸癌和肺癌等等的組織，將腫瘤分類並治 療。然而，例如在肺癌中，已充分地認識到這些腫瘤是一組異質性高 的贅生物。在其他組織中出現的腫瘤也是如此。在某種程度上，因為 這異質性，有了用於人類腫瘤的複雜且不一致的分類系統。先前的治 療癌症的嘗試已被兩方面所阻礙，即l)對在特定組織中出現的腫瘤的 任意分類，以及2)通過使用基於這些腫瘤外表怎樣的顯微方法(組織學 分類)。雖然現存的對不同腫瘤類型的分類有一些預測伯、值，但幾乎所 有的分類法不能預告治療的反應性和治癒的可能性或疾病的進程。為 了有效改變癌症患者的生存統計，需要基於這些贅生物的生物學組成 的、改進的分類系統。解決這些問題的一種方法是確定對腫瘤特異性 的分子的位置，優選分子中作為癌細胞標記的抗原。(在本文中，"標 記"定義為能糹皮用於區別癌症組織與正常組織且能一皮用於識別癌症與 其他疾病狀態的任何特性。)於是，標記的存在成為分類的基礎。通常在小鼠中用體細胞雜交技術製備的單克隆抗體(MCA)是探測和區別細胞抗原的有用分子探針，因此有探測癌相關抗原的巨大潛力。 這些抗體結合到特定的抗原上且該結合是可用眾所周知的方法探測 的。當發生結合時，則作出存在特定的抗原的推斷。那些暴露於細胞 表面或在癌塊中發現的癌相關抗原是宿主免疫系統(包括宿主抗體)的分子靶。近來的發現暗示具有4元胂瘤抗體的癌症患者，比沒有建立 這種類型免疫應答的那些患者的情況好些(Livingston等，1994)。因此， 天然的、誘導的或被給予的抗體是有希望的治療手段。非人類的MCA的人源化(將非人類的MCA反應位點穿梭到克隆內和在離體的應用中不喪失它們的特異性結合。在活體內，MCA可用 作成像劑、診斷試劑，並可用於治療(Radosevich等，1988, 1990; Rosen等，1988)。疫苗療法是充分確認的、針對誘發免疫應答而不會暴露於疾病或 病徵的病原體的方法。例如，在宿主中許多疫苗可用於激發對細菌因 子和病毒因子的反應。疫苗中的腫瘤相關抗原(標記)的應用能預防原 發性癌症的發生，並同樣能提供子貞防該疾病復發的方法。基因療法是通過其修飾細胞的遺傳組成來表達所關注基因的方 法。基因療法的形式有多種，包括基因取代、反義抑制療法和替代 物基因表達。發現編碼癌相關抗原的基因，最好發現編碼癌特異性抗 原(標記)的基因，以打開對癌細胞增生進行基因幹涉之門。區分癌組 織和正常組織的癌標記的準確與連貫的使用，不僅具有診斷潛力，而 且對治療和預測也是所希望的；因此，已尋找了這樣的標記。近來的研究已顯示，在有些人的腺癌細胞系中和在原發性肝細胞 癌中，編碼人天冬氨醯P-輕化酶(HAAH)的酶^皮過量表達，因此，該酶 可能是一種標記。已克隆並測序了編碼HAAH的所述基因(Gronke等, 1989, 1990; Wang等，1991; Jia等，1992, 1994; Korioth等，1994; Lavaissiere等，1996)。可是在人的腫瘤中，有關HAAH的表達大體上幾乎是一無知(Lavaissiere等，1996)。該HAAH酶的研究產生自與其牛的相應物的研究(Gronke等, 1989, 1990; Wang等，1991; Jia等，1992)。 牛天冬氨醯(3-羥化酶是細胞 內的糖基化蛋白，定位於粗糙內質網上。已報導該蛋白有三種主要的 分子85千道爾頓的形式和分子量分別為56千道爾頓與52千道爾頓 的兩種活性形式(Lavaissiere等，1996)。使用標準的生化方法，已純化了牛天冬氨醯P-鞋化酶(bAAH)並對 其進行了特徵鑑定(Gronke等，1990; Wang等，1991)。已顯示該酶的活 性與純化的52千道爾頓和56千道爾頓的種類相互關聯。免疫學上， 也觀察到分子量較高的相關形式(85-90千道爾頓)。作為純化的 一部分， 使bAAH結合到ConA瓊脂糖凝膠上，這與該酶被糖基化的結論相一 致。(隨後的關於DNA序列的報告顯示了三個可能的糖基化位點，一 個位點非常接近於已知的活性酶結構域。)在性質上該蛋白的酸性很 強，且不需要去垢劑溶解該活性部分。該酶的活性位點依賴於在生化 分離的牛蛋白(bAAH)的675號位存在組氨酸(Jia等，1994)。已獲得了 HAAH的部分胺基酸序列。用從該胺基酸序列推斷出的 DNA探針(DNA探針是在某些條件下具有能結合到特定的核苷酸序列 上的核普酸序列的分子)篩選了牛cDNA文庫(Jia等，1992)。(一個 cDNA文庫包含編碼基因產物例如相對於基因組DNA的肽的DNA片 段)。在該文庫中的幾個重疊的cDNA序列包含一764個胺基酸的、預 期編碼一 85千道爾頓蛋白的可讀框(ORF)序列。另外兩個可能的起始 密碼子，即編碼開始的位置，也存在於該ORF序列中。 一個核糖體結 合位點位於最靠3，端的起始密碼子之前。具有該序列的克隆的翻譯產 生大約85千道爾頓的蛋白。生產針對人MG-63細胞的細胞膜成分的 抗血清，並用該抗血清免疫篩選從MG-63細胞製備的cDNA文庫。報 道了關於一個克隆的資料，該克隆能編碼一 757個胺基酸的蛋白；通 過序列分析，發現其與bAAH具有強烈的N-末端同源性(Korioth等， 1994)。當將該克隆用於體外翻譯系統(一種用於將mRNA轉譯成蛋白質的正常細胞細胞質的人造混合劑)時，產生56千道爾頓的蛋白。有 人提議這是由於翻譯後的切割。該HAAH酶負責對蛋白的表皮生長因子樣結構域中的特定天冬 氨酸殘基進行修飾。已假定這些淨皮修飾的天冬氨酸殘基使得表皮生長 因子樣結構域變成4丐結合域(Gronke等，1989, 1990; Wang等，1991; Jia 等，1992, 1994; Korioth等，1994; Lavaissiere等，1996)。首先研究了與HAAH相關的酶天冬氨醯P-羥化酶(AHH),因為 它特異性地修飾一組生物學上重要的蛋白中的選定的天冬氨酸殘基或 天冬醯胺殘基，所述重要的蛋白包括依賴維生素K的凝血因子VII、 IX 和X。象C、 S和Z的其他蛋白也有這種修飾(Gronke等，1989, 1990; Wang等,1991; Jia等，1992, 1994; Korioth等，1994; Lavaissiere等, 1996)。已顯示在包含表皮生長因子樣結構域的蛋白中，由HAAH修飾 天冬氨酸殘基和天冬醯胺殘基。(3 -羥基天冬氨酸殘基和p -羥基天冬 醯胺殘基的功能是未知的，可是，已推測對於選定蛋白的表皮生長因 子(EGF)樣結構域中鈣的結合，需要這種修飾。生產針對人肝細胞癌FOCUS細胞的抗體(Lavaissiere等，1990)。 一種MCA與一種在肝細胞癌中高度表達的抗原起反應(Lavaissiere等, 1996);用這種抗體和Xgtll HepG2文庫的免疫篩選導致分離出一不完 全的cDNA，隨後用該cDNA分離一較大的克隆。報導了稱為A549的人腺癌細胞系具有非常高水平的HAAH活性 (Lavaissiere等，1996)。生產針對人腺癌細胞系A549(ATTC保藏號CCL 185)(Radosevich等，1985)的稱為MCA 44-3A6 (美國專利號4,816,402) 的小鼠單克隆抗體。該抗體識別一細胞表面的、非糖基化的抗原蛋白， 該蛋白具有40千道爾頓的、估計的表觀分子量。用A549細月包表達該抗原，且發現該抗原為一好的腺癌標記，即 在組織學檢查時看上去象腺癌的癌頻繁地表達該抗原(Radosevich等, 1990a; Lee等，1985)。 MCA44-3A6是獨一無二的，因為它是第一個具 有這種結合特異性的單克隆抗體。來自 一關於肺癌的國際專題討論會的結果證實了發表的有關MCA 44-3A6的其他相關的研究結果(Stahel, 1994)。稱為MCA44-3A6的抗體具有臨床用途，因為它區別與腺癌相關 的抗原。該抗原在正常組織和月臺兒組織的分布限定於某些腺組織 (Radosevich等，1991)。檢測可以發生在福馬林固定的石蠟包埋的組 織上(Radosevich等，1985, 1988, 1990a, 1990b, Lee等，1985, 1986; Piehl 等，1988; Combs等，1988b， 1988c; Banner等，1985)。該抗體在人肺腫瘤 中具有有限的結合方式(Lee等，1985; Banner等，1985; Radosevich等, 1990a, 1990b)。在一項超過二百位肺癌患者的研究中，發現MCA44-3A6既與全 部試驗的腺癌、許多大細胞癌起反應，又與各種中間神經內分泌性小 細胞肺癌、分化良好的神經內分泌性小細胞癌、類癌瘤而不是間皮瘤 的各個亞組起反應。MCA 44-3A6與鱗狀細胞癌、支氣管肺泡癌或小 細胞癌不反應(Lee等，1985)。 MCA 44-3A6在區別轉移到胸膜的腺癌 和間皮瘤方面是有用的(Lee等，1986)。該抗體在各種腺癌中和在大細 胞癌方面具有選定的反應性(Piehl等，1988; Radosevich等，1990b)。在一項超過40個肺癌病例的、比較細胞學和組織學研究的研究 中，發現MCA44-3A6在細胞學診斷方面是有用的，且與組織學的研 究結果一致(Bamer等，198》。組織學研究的是組織(由細胞構成的)。 細胞學研究的是已從通常稱為組織的組織範圍移出的細胞。從組織移 出的細胞的表現不總是同它們在得到它們的組織中一樣。幸運地是， 由MCA 44-3A6檢測的、在組織中腺癌細胞中表達的抗原，其表現如 同其在從組織中移出的腺癌細胞裡的一樣。這在診斷上是很重要的特 性。用細胞學製備的肺癌細胞塊，以及用存在於來自全身其他部位體 液中的AC,也顯示出相似的相互關係(Lee等，1985; Spagnolo等，1991; Combs等，1988c)。同樣，MCA44-3A6結合到肺癌以外位置的腺癌上。 在原發性損害和轉移性損害中也報導了該抗原的表達(Combs等, 1988a)。也提到了在人的乳房組織中該單克隆抗體在區別癌與良性損害方面的效用(Duda等，1991)。已確定了由MCA44-3A6檢測的該抗原在細胞中的位置。通過用 活細胞放射免疫分析(一種目的為確定抗體與活細胞結合的放射性抗 體試驗)、免疫螢光和活細胞螢光激活細胞分類器(FACS)分析，已顯示 由MCA 44-3A6檢測的該抗原在該細胞的外表面上(Radosevich等, 1985)。使用免疫金電子顯微術和FACS分析的另外研究已表明，這種 抗原是非調節的(當被抗體結合時不被癌細胞內化)，並在原生質膜的 細胞外表面上表達，且不是細胞周期特異性的，即該細胞在它正經歷 著細胞複製的過程和在它還不分裂時， 一直製造著該蛋白(Radosevich 等，1991)。在正常血清或腫瘤病人的血清中沒有發現該抗原，且該抗 原不被陽性細胞系脫落到培養基中(即已知癌細胞起泡脫掉(to bleb off) 它們的部分細胞膜並將其釋放到周圍的液體中)(Radosevich等，1985)。 近來發現在27個一皮隨機試驗的腺癌病人中，有3位有了自然產生的針 對該抗原的抗體。另外，在棵鼠中，用放射性標記的MCA44-3A6確 定了 A549腫瘤生長的位置。阿黴素(douxorubicin)免疫綴合的MCA 44-3A6在體外是有選擇性毒性的(Sinkule等，1991)。測定由MCA44-3A6檢測的抗原的核甘酸序列和胺基酸序列將 增強這種抗原在癌症診斷、治療和預防方面的實用性。發明簡述現在將如在背景中描述的由抗體MCA 44-3A6檢測的抗原稱為 "迷路蛋白(Labyrinthin)"。分離並特徵鑑定其特徵為編碼由MCA 44-3A6檢測的抗原的獨一無二的核芬酸序列的基因(稱為迷路蛋白基 因(/W,/w欲/w)、縮寫為標誌/aZ)表示核酸DNA/RNA的形式， "Lab"標誌是指由/a6 DNA/RNA編碼的蛋白。本文描述的發明用抗體MCA 44-3A6作為克隆編碼Lab的基因的 工具。另外，在由該克隆表達的Lab蛋白上針對MCA 44-3A6的表位(在該抗原上發現的必需的抗體結合位點)鑑定為PTGEPQ (胺基酸的標準 縮寫)。所述表位代表重要的免疫顯性序列，即當將其注射到動物體中 時，所述動物容易產生對這種序列的抗體。本發明的一個方面是以有義(其中從3'端進行到5'端的DNA序列 的正常轉錄，從DNA的有義鏈產生一mRNA鏈；該mRNA互補於該 DNA)表達方式將DNA用於如下方面l)用核苷酸探針標記人類腫 瘤；2)檢測在細胞和組織中的DNA和mRNA表達；3)將細胞轉化 成腺樣細胞的類型；4)在體內產生用於免疫的Lab抗原；5)為了免疫 產生抗體，離體表達Lab;以及6)在體外生產Lab。本發明的另一方面義分子抑制迷路蛋白基因(/^3^7"f/n力)表達(癌)細胞的生長。本發明的一個方面是包括DNA分子的一種載體，所述DNA分子 具有編碼至少一種Lab抗原表位的核苷酸序列和允許在宿主細胞中表 達的合適調節序列。本發明的另一方面是從基因的蛋白編碼區推斷的胺基酸序 列。通過免疫學方法找到該序列的選定區域，以產生不但與來自自然 存在的(癌細胞)產物、化學產生的(合成產生的肽)產物的效應相 一致的 效應，而且產生與克隆的/"6基因的表達產物的效應相一致的效應。本發明的另一方面是使用推斷的Lab的全部胺基酸序列、衍生自 Lab的肽、或化學生產的(合成的)Lab肽、或這些分子的任何組合，供 製備預防人類癌症和/或治療癌症患者的疫苗之用。為了本發明的目 的，"癌症患者，，是在其細胞中有檢測到的Lab抗原的那些人。這些 製劑也可在肺瘤首次發生前用來防止病人患這些腫瘤。針對Lab蛋白或抗原組份或Lab蛋白衍生物的單克隆抗體，對於 檢測Lab和其他的目的是有用的。以與Lab抗原反應的種類以外的種 類製備的單克隆抗體，可用許多分子克隆的方法修飾，使得它們保留 其與迷路蛋白肽的結合，而在人類中又無免疫原性(Sastry等，1989;Sambrook等，1990)。簡言之，通過用非人類的所關注的單克隆抗體結 合位點序列取代克隆的人抗體基因的結合位點序列而達到這一點。這 些"人源化"單克隆抗體在體內、離體和在體外 f皮用作治療劑和診斷 試劑。在癌症診斷分析方面，Lab蛋白或從其衍生的抗原肽的應用是監 視病人血液或其它體液或組織中具有的抗體的存在和抗體量的一種方 法。這種檢測不限於先前明確表示的一類癌或多類癌，而是可用於有 Lab標記抗原的癌細胞。可以用血清轉化的程度來監控治療的效果， 該血清轉化的程度用本領域技術熟練人員已知的技術測定[例如 ELISA (Engrail和Perlmam, 1971)]。用藥用組合物中/a6的反義分子或Lab的抗體的療法是治療其癌 細胞中或癌細胞上有Lab的病人的一種方法。附圖筒述
圖1是/a6基因的核酸序列(SEQ ID NO: 1)。圖2是從基因推斷的Lab的胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)。圖3是/W基因的圖解以及它與HAAH酶是怎樣相關的。發明詳述迷路蛋白基因(X^F7》^w)的分子生物學:為了證明MCA 44-3A6 表位(epitope MCA 44-3A6)由 一 蛋白序列編碼，分離了來自細胞系 A549的高分子量DNA。將該DNA與質粒(pSVneo)共沉澱(通過4丐)， 並用於轉染一種叫做B78H1細胞的小鼠細胞系(Albino等，1985)。這種 小鼠細胞系對於該表位的表達是陰性的，且報導該小鼠細胞系使任何 人DNA序列高頻摻入並表達。如果特定的B78H1細胞處於一種吸收 DNA的狀態，則預期它既吸收了人DNA，又吸收了該質粒DNA。該 質粒DNA使該細胞抗G418(—種標準的毒藥)。因此，如果使對G418 生長抑制劑正常敏感的細胞生長於G418中，則它必須吸收了質粒，並可能也吸收了 一個或更多個A549 DNA序列。在G418選擇後(只選 擇通過吸收/表達pSVneo質粒上的Neo基因而具有抗性從而在G418 中生長的細胞、並因此代表處在同時吸收其他DNA狀態的細胞的一種 方法)，用MCA44-3A6進行免疫選擇，大約在1 x 105個克隆中檢測到 15個。該研究結果與下述結論相一致，即人A549細胞有編碼Lab 的DNA，並具有Lab表達所必需的調節序列。HAAH和迷路蛋白基因a^ wv力甴力)的比較:因為/W的DNA序 列作為本發明的一方面而被測定，所以能比較HAAH和/a6。 HAAH 和的核苷酸序列有某些內部片段的相似性；但在片段的每一邊是 不同的，且與不同的產物相關。這個結論部分基於根據已報導的這兩 個基因DNA序列的分析和同源性。具體地講，該/a6的5'區域與HAAH 沒有同源性。的蛋白編碼區與所提出的HAAH蛋白編碼區的一內 部區段有大約99.6 %的同源性。該3'區域與報導的HAAH序列沒有同 源性。事實上，比較HAAH和迷路蛋白基因(/^ynW/H力)的所有其他資 料是不相同的，例如l)蛋白的分子量，2)細胞定位，3)染色體定位， 4)在正常組織和腫瘤中的組織學呈現，5)RNA印跡的表達，6)免疫學 的研究結果。雖然的蛋白編碼區域與報導的HAAH序列的一內部區域相 同，但HAAH的5'非翻譯區是不同的，且在/W克隆中發現的序列缺 失HAAH的5'翻譯的蛋白編碼區的部分。既根據HAAH，又根據 克隆，能預期所推斷的蛋白在性質上酸性非常強，並因此在SDS凝膠 中電泳不規則。如同所預測的，該Lab蛋白在SDS凝膠中遷移不規則。 在本發明中所克隆並公開的物質與在幾個細胞系中發現的天然蛋白的 遷移相同。編碼由MCA 44-3A6檢測的抗原的正確基因片段(mRNA) 已被克隆的令人信服證據是當製備重組蛋白時，該重組蛋白的行為 就同單獨的生物學起源的該蛋白 一樣(在這種情況下具有表觀分子 量)。由克隆提供的Lab具有來自細胞Lab的特徵。由HAAH編碼的推斷的胺基酸序列，需要使用一能產生85-90千ii道爾頓蛋白的可讀框，且不考慮有數個起始密碼子和其他較短的可讀框。該推斷的HAAH蛋白是(生化上)糖基化的，且l艮道的序列具有糖 基化位點(Korioth等，1994; Lavaisslere等，1996)。相反的，Lab是非糖 基化的，它也沒有預測的糖基化^(立點。該推斷的HAAH的胺基酸序列包含與Lab的胺基酸序列共享的、 預測疏水性非常強的區域。為了成為可溶的，Lab需要強的去垢劑； 而HAAH不需要。在廣泛地用於克隆及研究的同一細胞系(A549) 中，增加的HAAH的表達(根據酶活性測定)暗示這兩種基因產物對 AC表型可能是重要的，且至少A549細胞既產生功能性HAAH，又產細胞生長速率的顯著降低。在NIH-3T3細胞(正常鼠成纖維細胞)中有 義構成物的表達導致顯著的表型變化，產生一種與AC表型一致的 表型。因此，/aZ)表達和正常細胞轉化成癌細胞相關。Lab和HAAH具 有共同的潛在的鈣結合域。cDNA文庫的構建和克隆:用從活潑生長的A549細胞中分離的 mRNA構建一 cDNA人gtl 1噬菌體文庫(Sambrook等，1990)。用EcoRI 接頭將該寡聚(dT)引物的cDNA克隆到EcoRI位點中。該文庫有大約 83 %清亮的(包含一插入片段)噬菌斑和表示最小量為1.46 x 106個獨立 噬菌斑的1.2 x 10"Vml的效價，所述獨立噬菌斑通過聚合酶鏈式反應 而有大小範圍從0.6至5千鹼基的插入片段。由於Lab為一 40千道爾 頓的膜內在蛋白(一內嵌在原生質膜中的蛋白)，因此，估計理論上全 長的、編碼該蛋白且包括一潛在前導序列的mRNA大約為1.1千磁基。 用抗體MCA 44-3A6免疫篩選該文庫，分離到八林獨立起源的噬菌體 原種(來自同一噬菌斑的相同的噬菌體)，通過免疫篩選/分離的反覆循 環，對全部這些噬菌斑進行純化。憑著對這八種分離物的EcoRI消化， 查看到大約2kb的插入片段。分離到最大的插入片段(2A1A1),並將該 EcoRI片段克隆到pGEM-3Z質粒中。序列測定和序列分析:發現稱為2A1A1的DNA片段有一長度為2442個鹼基對的插入片段(圖1)，包舍一5'非翻譯區、 一核糖體結合位 點和一個起始密碼子，能預期該插入片段編碼一 255個胺基酸的蛋白 (圖2)。該3'非翻譯區在其僅包含四個不穩定性序列ATTTA方面是值 得注意的(Xu等，1997)。另外，有發現於mRNA的極3'末端、導致該 mRNA腺苷酸化的序列(Sambrook等，1990)。該/W序列既包含亞適 宜的多聚腺苷酸化位點(ATTAAA)，又包含最適的多聚腺苷酸化位點 (AATAAA)。這些是發現於mRNA的極3'末端、導致該mRNA腺香酸 化的序列。這項研究結果提供了支持已在本文中概括的細胞和生化資 料的分子資料。(該HAAH的克隆有一多聚腺苷酸(poly A)信號，但沒 測定整個3'區的序列。)在Lab胺基酸序列中注意到一鈣結合位點基序(圖2),可是，它沒 有已知的、成為結合位點所需要的鄰近結構序列。在這實例中，有鈣 限制序列(calcium limiting sequence)， ^旦它不在一 已知的使其作為結合 位點的蛋白序列鄰近序列(context)中。注意到和一 EST克隆(稱為 #5501)的同源性，EST克隆僅代表3'非翻譯區的一部分，並獨立地證 實了該部分的序列。也注意到某些內部片段與HAAH的同源性，但該 5'未翻譯的和部分5'翻譯的區域是不同的(58個胺基酸)，以及在中， 3'編碼區的主要部分是缺失的(圖3)。基因組DNA克隆和分析:用代表/W的蛋白編碼區的一PCR片 段作為探針，篩選一從人肺成纖維細胞細胞系WI-38構建的基因組 XFIXII文庫。從大約lxl(^個篩選的噬菌斑裡分離出十個原代噬菌斑。 用這十個中的七個作為靶DNA,用蛋白編碼區的引物建立聚合酶鏈式 反應條件，產生一 765個鹼基對的片段，即所期望的的蛋白編碼 區。通過RNA印跡(用於定性評價mRNA的 一種方法)，僅檢測到 一條表明為2.7千石M的帶。當用MCA44-3A6進行蛋白質印跡(用於 定性確定蛋白的一種方法)試驗時，從該/W克隆產生的重組蛋白的相 對遷移率與由A549細胞產生的Lab蛋白一樣。/W基因和HAAH基因在其編碼的蛋白方面產生不同的結果。根據RNA印跡分析，HAAH始終如一地產生二條帶(2.6和4.3千鹼基)， 這暗示2.6千鹼基帶是由於可變剪接造成的，即該細胞切割並剪接該 mRNA。同樣，如果/W和HAAH是同一基因，則在發現Lab的所有 組織和癌細胞系中應該檢測到HAAH;可是，在細胞系EMT6或QU-DB 的RNA印跡上沒查看到Lab，在這些細胞中也沒有免疫反應性，這表 明在這些細胞裡沒產生Lab mRNA,且不產生Lab蛋白。Lab蛋白在 正常細胞中很少表達，而已才艮道在幾乎每種研究過的組織中，既表達 HAAHmRNA,又表達HAAH蛋白。mRNA分析:用cDNA作為探針的、來自A549細胞系的DNA 片段的RNA印跡分析，鑑定出一大約2.7千鹼基的單一帶。基於所述 cDNA (2442個鹼基對)和大約300個鹼基對的多聚腺苷酸尾，預期了 這一點。小鼠細胞系EMT6和人的大細胞癌細胞系QU-DB的RNA印 跡分析，證實這些細胞不產生的轉錄物。這和在這些細胞中 的表達為陰性的免疫分析相一致。反義cDNA和有義cDNA的表達:質粒(pBK-CMV) (Sambrook等, 1990)可以將有義的或反義的全長cDNA /a6運載到A549和NIH 3T3 細胞中去。反義分子例如可以為與有義分子雜交、阻止該有義分子 表達的該有義分子的互補序列。用MTT分析(Siddique等，1992)來評價 表達反義物的A549細胞的生長速率；注意到生長速率顯著降低。 反義轉染的A549細胞看來有較大程度的接觸抑制。在這些反義轉染 的細胞中，可檢測的Lab量減少。當有義表達發生時，NIH-3T3細胞 從一成纖維細胞樣細胞類型形態(大的、薄紡錘形)轉變成一種大的、 看來好象腺癌的細胞(很圓的、鼓起的)。染色體定位就/W的染色體定位而言,用全長cDNA作為探針， 通過原位雜交(Sambrook等，1990)，暫定為在染色體2ql2-14上；也許 對染色體4和8有一些反應性。使用同 一探針(/aZ)的全長cDNA序列) 和FACS分類的染色體(Lebo等，1985)，也表明在染色體2上染色；在 染色體4上有弱的染色且在染色體8上無著色。基因組克隆的應用在分辨這些資料方面將具有特殊價j直，因為能用比cDNA所容許的雜交條件更高嚴格性的雜交條件，從而減少背景信號。這也是已克隆了正 確的基因且該結果不是由於方法的人為現象的另一個證據。在腫瘤的 基因組DNA中可能有突變，且對於本發明，從腫瘤細胞(A549)克隆了 DNA;所以，可能已克隆了一突變的基因。可是，因為來自正常細胞 的基因組DNA (DNA)產生與本文描述的、所克隆的序列相同的序列， 所以，事實並非如此。因此，從A549細胞克隆到正常的基因。在染 色體4和8上的弱信號與一偽基因或一相關基因是一致的。例如，通 過原位雜交，報導了 HAAH存在於染色體8ql2上，因而在染色體8 上的結果可能反映出HAAH和/fl6的序列同源性。迷路蛋白基因(X^yn"^力)的蛋白分子的特徵鑑定:運用蛋白質印 跡分析(評價抗原的定性分析)的先前的工作已顯示Lab抗原為一在 A549細胞中可^r測的40千道爾頓(根據相對遷移率)的蛋白 (Radosevich等，1985)。該表位看來不受凝集素調節或封閉，並在細胞 表面上選擇性地表達，初步定位到原生質膜上。(Radosevich等，1985, 1991)。 Lab對蛋白酶是敏感的，但是對脂質或碳水化合物改變反應不 敏感(Radosevich等，1985)。 Lab的生化性質與為膜內在蛋白的Lab是 一致的。由於有了從本發明的/W基因推斷的胺基酸序列，因而允許進一 步對Lab蛋白進行特徵鑑定。對Lab的廣泛的計算機分析已識別出一 真核前導序列樣序列和理論上的切割位點、3個十四烷基化序列位點、 一個弱的錨膜域(MAD I)和一個強的錨膜域(MAD II)(圖2)。[(在HAAH 序列中，有58個(理論上的)胺基酸，接著是一同源於Lab蛋白編碼序 列的序列和一另外的、所述/W序列3'端的445個胺基酸。)]當Lab作為融合蛋白在細菌GST融合表達系統 (pGEMEX-2TXAmereham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey, 08854, USA)中表達並經受使用抗體MCA 44-3A6的蛋白質印 跡分析時，所產生的印跡證明表達的j皮切割的融合蛋白具有和A549細胞中檢測到的蛋白一樣的相對遷移率。所推斷的Lab的分子量為 28.8千道爾頓，且在蛋白質印跡上，它具有和由A549細胞表達的類 型相等的相對遷移率(表觀相對遷移率=40千道爾頓)。除了前導序列 和最強的錨膜域(MAD II)外，52個穀氨酸殘基和27個天冬氨酸殘基(合 起來一共79個殘基)幾乎遍及該蛋白而均勻分布(總共255個胺基酸， 無前導序列則為228個)。這些資料使人聯想到Lab在SDS凝膠中不規 則的遷移。不同於A549的細胞系(例如腺癌DU-145, ATCC#HTB-81; ZR-75-1, ATCC #CRL-1504等等)具有一種用分子量和Lab —樣的抗原 檢測到的抗原。當用蛋白質印跡探測Lab時，既沒有記錄到85-90千 道爾頓的分子量種類，也沒有記錄到52和56千道爾頓的分子量種類。用抗體MCA 44-3A6進行表4立作圖和Lab的疫苗可行性:用聚合 酶鏈式反應和GST融合蛋白系統，構建了該蛋白編碼區的亞克隆，並 將MCA 44-3A6的結合通過表位作圖定為至代表Lab的117-122號氨 基酸的六個胺基酸(PTGEPQ) ("P"肽)上。為了確定該表位，將整個編 碼區分成多個小區，設計聚合酶鏈式反應引物來擴增各小區，並克隆 聚合酶鏈式反應的產物，通過用抗體MCA44-3A6的蛋白質印跡分析， 檢驗該聚合酶鏈式反應產物隨後的表達。然後，進一步細分顯示陽性蛋白質印跡結果的DNA片段。製備 出聚合酶鏈式反應產物並將其克隆、表達，通過蛋白質印跡進行檢驗。 以這種方式，既從5，末端，又從3'末端製造構成物，並在每一輪減小 胺基酸數的間隔。這導致顯示出最後一輪與前一輪一個胺基酸的差異 (在兩個方向上)，使得人們能推斷MCA 44-3A6的準確結合位點。這 顯示至少這六個胺基酸暴露到細胞外表面上。為了進一步證明這點， 克隆了僅編碼這六個胺基酸的DNA，且通過蛋白質印跡分析，該融合 蛋白為陽性的。可用MCA44-3A6特異性地檢測合成製備的"P"肽。且 在5隻試驗的小鼠中，該合成肽在5隻鼠中具有為免疫原性。用計算 機輔助分析(GCG程序)(Genetics Computer Group, Madison, WI 53703) 的計算機分析/才莫擬，也預示該表位會是極具免疫原性。16疫苗的製備:疫苗為抗原製劑，它一^皮給予宿主，就導致該宿主 產生對該抗原的抗體。該宿主的反應導致該宿主對該疫苗針對的疾病 是免疫的。因此，疫苗處理預防疾病的臨床表現，而不會暴露宿主於 致病因子。Lab具有優選的癌疫苗的所有特性。該/a6基因被看來象腺 癌的腫瘤頻繁地表達；並被表達在該細胞的外表；在一特定的癌中， 該基因被所有細胞表達；且一直被這些癌細胞表達；並且正常細 胞不常表達該基因。通過運用分子克隆技術的許多方法可生產Lab 蛋白(肽)，並能大量地生產；因而使其成為用作疫苗的實用抗原。在 純化了該Lab蛋白使得它適合於注射到人體中後，經皮內、皮下或通 過其他途徑將其給予個體，以便激發免疫系統產生抗該蛋白(肽)的抗 體。分子模型和計算機輔助分析的GCG程序(Genetics Crystal Group, Madison, WI 53703)的運用，使4尋筌定出 一個分子中略大於一個表位 (蛋白的六至七個胺基酸)的、預期存在於蛋白分子表面的各小部分。 另外，可確定特定序列的疏水性程度或親水性程度以及該序列在動物 中的免疫原性如何(Genetics Crystal Group, Madison, WI 53703)。在確定 哪一些序列符合這些標準後，合成製備這些肽，或用若干標準方法生 產這些肽。然後，，可配製這些肽的一種或更多種以作為疫苗使用， 並如上略述作為疫苗給予宿主。一種疫苗，它包含具有一tt酸序列選自圖1的cDNA編碼的序列、 該cDNA編碼的圖2的序列、肽APPEDNPVED (SEQ ID NO: 6) EEQQEWPDT (SEQ ID NO: 7)、 DGPTGEPQQE (SEQ ID NO: 8)和 EQENPDSSEPV (SEQ ID NO: 9)、以及任何其片段或其組合的一種分子。可以一種特定的疫苗給予宿主一次，或可以給予多次。為了使某 些病人識別一特定的疫苗，也可能必需一佐劑和所述肽一起給予。佐 劑是力口強免疫準備狀態和幫助宿主從沒有可檢測出的血清抗體轉變成 有^f艮高效價的血清抗體的非特異性免疫刺激劑。正是這種高水平(效價) 的抗體有效地保護該宿主，使其不患所述抗體針對的疾病或病徵。功能的研究:對於了解Lab的細胞功能的研究是細胞定位/特徵 鑑定研究的延伸(Siddique等，1992)。著手研究對於細胞外暴露於不 同陽離子(Ca^、 MgW、 OT和Fe"^)反應的Lab水平變化。在A549細 胞中的丄W表達僅受Ca^調節。用測定胞質Ca^的高度專一的螢光 Fura-2/AM Ca"方法(Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402), i正明 了 1)在A549細胞中的內部CaW濃度比在QU-DB細胞中的高一些， 以及2) A549細胞系對不同的外部Ca^水平有反應(Siddique等，1992)。 由於pH能調節細胞內游離Ca—水平，因而外部的pH操作應該導致 Lab表達水平的變化。細胞外pH的變化(在存在正常Ca^濃度的情況 下)導致l)細胞內pH的平行變化，該pH用SNARF-1 AM/FACS測量， (Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402); 2) Lab的轉錄物水平增加 (當通過RNA印跡與GAPDH表達相比時)；以及3) Lab蛋白也增力口(用 蛋白質/狹線印跡分析)。A549細月包的細胞內pH的變化(由於外部變化 引起的)與報導的正常細胞的相應變化是相同的。所增加的的表達 也不是由於細胞的死亡(這一點通過MTT分析測定)(Siddique等， 1992)。另外，重組Lab在不同pH溶液中的溫育不改變免疫反應性。 初步的資料提示當用在減少了的Ca^中生長的A549細胞進行這些 實驗時，則減弱/a6的誘導表達。在細胞樣品中診斷癌細胞的方法用來自 一被試者的生物學樣 品，來確定是否有癌細胞存在於該被試者體中。合適樣品的實例包括 血液和活組織檢查材料。 一種診斷方法是將來自樣品中細胞的DNA, 暴露於一標記的、在嚴格條件下能與該/W基因或其片段雜交的探針， 所述嚴格條件例如6xssc; 0.05 x blotto; 50%甲醯胺；42°C (Sambrook 等，1990)。當然，根據生物學樣品的性質、癌的類型、製備探針的方 法和組織製備的方法，可改變雜交條件以達到最佳靈敏度和特異性。在將該樣品與該探針接觸後，下一步則是確定該探針是否已和來 自該樣品的DNA的核苦酸序列雜交，從該結果推斷基因的存在； 所述存在就可診斷為癌症。另 一種診斷方法是獲得優選標記的單克隆抗體，所述抗體或者是已經存在的抗體，或者是針對本發明各方面抗原肽的新抗體；並將一 樣品與這些標記的單克隆抗體接觸以檢測Lab抗原。這些單克隆抗體 可用於開發檢測Lab抗原的非常專一的分析，並允許以許多不同的形 式進行試驗，從而導致在科學和醫學方面的更廣泛應用。因為本發明描述一種在腫瘤表面表達的、先前沒有報導的新基 因，所以本發明是有用的。該基因不是組織特異的，因此將允許無論 胂瘤出現在任種器官均可檢測腫瘤。同樣地，用該基因生產一種對這 些腫瘤的疫苗，將有非常廣泛的用途。診斷試驗也將有這種廣泛的組 織用途，從而使得可檢測Lab〃W;所述1^1)//^即癌的"泛標記"， 特別是對於先前已經指出的腺癌。引用的文獻Albino, AP, Graf, LH, Kontor, RRS等，DNA介導的人黑素瘤細胞 表面糖蛋白gpl30的轉移通過E玫瑰花試驗鑑定轉染子Mol. Cdl. Biol. 5: 692-697, 1985.Banner BF, Gould VE, Radosevich JA等，單克隆抗體44-3A6在肺 癌細胞診斷和分類方面的應用 Diag. Cytopathol. 1: 300-307, 1985.Brown, DT和Moore, M. 4十對兩種人肺癌細胞系的單克隆抗體 Br. J. Can. 46: 794-801,1980.Combs SG, Hidvegi DF, Ma Y等，胰的多形癌胰的多形腺癌和巨 細胞瘤的聯合組織學特徵的一罕見病例的報告 Diag. Cytopathol. 4: 316-322, 1988a.Combs SG, Radosevich JA, Ma Y等，由單克隆抗體44-3 A6識別 的抗原決定簇在選定的人腺癌和正常人組織中的表達 Tumor Biol. 9: 116-122, 1988b.Combs SG, Radosevich JA,和ST Rosen. 腺癌抗原標記在人體液 中的細胞學表達 Tumor Biol. 9: 116-122, 1988c.Duda RB, August CZ, Radosevich JA,和ST Rosen.單克隆抗體 44-3A6作為鑑別乳癌的一種標記Tumor Biol. 12:254-260, 1992.Engvall, E和Perlmann, P.酶耳關免疫吸附測定(ELISA;): IgG的定量 分析Immunochemistry. 8: 87-874, 1971.Gronke RS, VanDusen W，Garsky VM, JacobsW, Sardana MK, Stern AM和PA Friedman.天冬氨醯p-羥化酶基於人因子IX的第一 生長因子樣域結構的一種合成肽的體外羥基化PANS. 86: 3609-3613, 1989.Gronke RS, Welsch D，VanDusen W，Garsky VM, Sardana MK, Stem AM和PA Friedman.牛肝天冬氨醯(3-羥化酶的部分純化和鑑定J. Biol. Chem. 265: 8558-8565, 1990.Jia S, Van Dusen WJ, Diehl RE, Kohn NE, Dixon RAF, EUiston KO, Stern AM和PA Friedman.牛天冬氨醯(天冬醯氨醯)(3-羥化酶的cDNA克隆與表達J. Biol. Chem. 267: 14322-14327, 1992.Jia S, McGinns K, Van Dusen WJ, Burke CJ, Kuo A, Griffin PR, Sardana MK, Elliston KO, Stem AM和PA Friedman.在大腸桿菌中表 達的牛天冬氨醯(天冬醯氨醯)P-羥化酶的全活性催化域在脊稚動物 中依賴a-酮戊二酸的雙加氧酶一活性位點區域鑑定的特性記述和證據 PANS 91:7227-7231,1994.Korioth F, Gieffers C和J Frey.編碼天冬氨醯(3-羥化酶的人基因的 克隆和鑑定Gene 150: 395-399, 1994.Landis, S.H., Murray, T., Bolden S.禾口 P.A. Wingo. Cancer Statistics, 1998., CA 44: 6-9.Lavaissiere L, Jia S, Mshiyama M, de la Monte S, Stem AM, Wands JR和PA Friedman.在肝細胞癌和膽管癌中人天冬氨醯(天冬醯氨醯)p_ 羥化酶的過量表達J. Clin. Invest. 98: 1313-1323, 1996.Lebo RV, Tolan DR, Bruce BD, Cheng MC和YW Kan.分類的染 色體的斑點印跡分析確定不耐果糖基因的基因座位於染色體9上。 Cytometry. 6: 476-483, 1985.Lee I， Radosevich, JA, Rosen, ST等，用單克隆抗體44-3A6的肺 癌的免疫組織化學Can. Res. 45: 5813-5817, 1985.Lee I, Radosevich, JA, Chelfec G等，惡性間皮瘤用單克隆抗體 44-3A6和624A12和肺腺癌區分的改進的鑑別診斷Amer. J. Path. 123:497-507, 1986.Livingston PO, Wong GYG, Adluri S, Tao Y, Padevan M, Parente R, Hanlon C, Calves MJ, Helling F, Ritter G, Oettgen HF和Old LJ.用GM2 抗體提高AJCC三期黑素瘤病人的生存具有GM2神經節苷脂的佐劑 疫苗的隨機化試驗J. Clin. Oncol., 12: 1036-1044, 1994.Piehl MR, Gould VE, Radosevich, JA等，大細胞肺癌的外分泌亞群 和神經內分泌亞群的免疫組織化學鑑定Path. Res. and Prac. 183: 675-682, 1988.Radosevich, JA, Ma Y, Lee I等，單克隆抗體44-3A6作為發現於具有腺分化的人肺癌的新抗原的探4十Can. Res 45:5805-5812, 1985.Radosevich, JA, Lee I， Gould VE和ST Rosen.用於肺癌的單克隆 抗體分析。載於In vitro diagnosis of human tumors using monoclonal antibodies. Kupchick HZ和N Rose (編輯)Marcel Dekker第101-119頁， 1988.Radosevich, JA, Combs SG和ST Rosen.肺癌鑑別標記的免疫組 織、學分對斤。載於Lung Cancer Differentiation. Lung Biology in Health and disease. L'Enfant C, Bemal S和Baylin S.(編輯).Marcel Dekker, 1990a.Radosevich, JA, Noguchi M, Rosen ST, Y. Shimosato.運用單克隆 抗體44-3A6的人腺癌和肺的支氣管肺泡癌的免疫細胞化學分析 Tumor Biology. 11: 181-188, 1990b.Radosevich, JA, Combs SG和ST Rosen.人胎兒發育中MCA 44-3A6的表達Tumor Biology. 12: 321-329, 1991。Radosevich, JA， Siddique FS, Rosen ST和WJ Kabat.由單克隆抗 體44-3A6識別的腺癌抗原的細胞周期和EM評價Br. J. Can. 63:86-87, 1991.Rosen ST, Mulshine JL, Cuttitta F和PG Abrams.肺癌生物學 (Biology of Lung Cancer) Marcel Dekker, Inc. New York, NY,第37巻， 1988.Sambrook J, Fritsch EF和T Maniatis.《分子克隆》實驗室手冊第 二版Cold Spring Harbor Lab. Press., 1990.Sastry L, Alting誦Mees M, Huse WD, Short JM, Hay BN, Janda KD, Benkovis SJ和Lemer.為了產生單克隆催化抗體而在大腸桿菌中克隆 免疫學所有組成部分 一重鏈可變區特異性cDNA文庫的構建 PNAS. 86: 5728-5732, 1989.Siddique FS, Iqbal Z和JA Radosevich.在A549細胞中由單克隆抗 體44-3A6識別的腫瘤相關抗原的表達由於釣而變化Tumor Biology. 13: 142-151, 1992.Sinkule J, Rosen ST和JA Radosevich. 單克隆抗體44-3A6阿黴 素免疫綴合物不同綴合方法的比較體外抗腫瘤功效Tumor Biology. 12: 198-206， 1991.SpagnoloDV,WitakerD, CarrelloS等，在肺癌、轉移到肺和胸膜 的癌以及胸膜惡性間皮瘤的診斷中將單克隆抗體44-3A6用於細胞塊 Am. J. Clin. Path . 95: 322-329, 1991.Stahel, RA (chairman).關於肺肺瘤和鑑別抗原的第三屆國際 IASLC專題討論會Inter. J. Cancer增刊8: 6-26, 1994.Wang Q, VanDusen WJ, Petroski CJ， Garsky VM, Stem AM和PA Friedman.牛肝天冬氨醯(3-羥化酶J. Biol. Chem. 266: 14004-14010, 1991.Xu N., Chen C-Y A和Shyu A-B. 通過富含AU的元件調節胞質 mRNA的命運控制mRNA脫&泉苷化和衰變的關4建序列特徵Mol. Cell. Biology. 17:4611 -4621, 1997.序列表 Radosevich， James A.編碼癌症新標記的基因 21511/90185 PCT/US99/05365 1999-03-11<160〉9 PatentInVer. 2.0 1 2442 DNA 迷路蛋白<220〉 <221〉 CDS (70)...(834) 1cgggagcttg aaggacacaa gaatgggagg aaaggcggac tctcaggaac ttcattcttc 60acgtggttt atg gtg att gca ttg ctg ggc gtc tgg aca tct gta get gtc 111 Met Val lie Ala Leu Leu Gly Val Trp Thr Ser Val Ala Val 15 10gtt tgg ttt gat ctt gtt gac tat gag gaa gtt eta gga Val Trp Phe Asp Leu Val Asp Tyr Gl。 G上u Val Leu Gly 15 20 25ate tat gat get gat ggt gat gga gat ttt gat gtg gat lie Tyr Asp Aia Asp Gly Asp Gly Asp Phe Asp Val Asp 35 40gtt tta tta gga ctt aaa gag aga tct act tea gag cca Val Leu Leu Gly Leu Lys Glu Arg Ser Thr Ser Glu Pro 50 55cca gaa gag get gag cca cac act gag ccc gag gag cag Pro Glu Glu Ala Glu Pro His Thr Glu Pro Glu Glu Gin 65 70 75gag gca gaa ccc cag aat ate gaa gat gsa gca asa gaa Glu Ala Glu Pro Gin Asn lie Glu Asp Glu Ala Lys Glu 80 85 90tec ctt etc cat gaa atg gta cac gca gaa cat gtt gag Ser Leu Leu His Glu Met Val His Ala Glu His Val Glu 95 100 105ttg caa caa gaa gat gga ccc aca gga gaa cca caa csa Leu Gin Gin Glu Asp Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gin Gin 115 120ass eta gga 159 Lys Leu Gly 30gat gec aaa 207 Asp Ala Lys 45gca gtc ccg 255 Ala Val Pro 60gtt cct gtg 303 Val Pro Valcaa att cag 351 Gin lie Gingga gaa gac 399 Gly Glu Asp 110gag gat gat 447 Glu Asp Asp 125gag ttt cx:t atg gcg act gat gta gat gat aga ttt gag acc ctg gaa 495Glu Phe Leu Met Ala Thr Asp Val Asp Asp Arg Phe Glu Thr Leu Glu130 135 140cct gaa gta tct cat gaa gaa acc gag cat agt tac cac gtg gaa gag 543Pro Glu Val Ser H.is Glu Glu Thr Glu His Ser Tyr His Val Glu Glu 145 150 155aca gtt tea caa gac tgt aat cag gat atg gaa gag atg atg tct gag 591 Thr Val Ser Gin Asp Cys Asn Gin Asp Met Glu Glu Met Met Ser Glu . 160 165 170cag gsa Gin Glu 17533tAsnCC3Asptec Ser 180agt Sergaa GluCC3Progta Val185gaa Glugat AspGluaga ttg Arg Leu 190639cac cat gat aca gat gat gta aca tac caa gtc tat gag gaa caa gca 687 His His Asp Thr Asp Asp Val Thr Tyr Gin Val Tyr Glu Glu Gin Ala 195 200 ' 205gta tat Vai TyrGlucct Pro 210Ct3Leugaa Glu33tgaa Gluggg215lieGlu3tClie3C3ThrGlu 220gta act Val Thr735get ccc cct gag gat aat cct gta gaa gat tea cag gta att gta gaa 783 Ala Pro Pro Glu Asp Asn Pro Val Glu Asp Ser Gin Val lie Val Glu 225 230 235gaa gta age att ttt cct gtg gaa gaa cag cag gaa gta cca cca gat 831 G丄u Val Ser lie Phe Pro Val Giu Glu Gin Gin Glu Val Pro Pro Asp 240 245 250act taaagcttca aasagactgc ccctaccacc acaggaggac cagcctaacc 884 255atacgctccaaaagatggctgtgatagatcttgtgaagcasttactgagca-gatcaagat944ct ttgggaaggatgttttgaatgsattatsgtccactggc3ttttsgtgt10043tttttttttctttttagssscacacatttctaaaetatgtcatgttacattectgeatgt1064cccttttg3tagesttagtggatccattggstttcttttttctttttgtgagacagc仁tt1124tagtcttacctgsstttatgtgtgtttttccgacagtggtattggtgatg1184tagcagcaattgtgttggcagggttttcatatattattagtaattaacactaactgttgg12"actgacttgtgtacactgtgttsaacatgatttaaaagctctttgtgtta1304gcactcttasaaaegctaacagagatcstcsttsgctgtgaagatttgagttgtststac1364ctgeactgatsttcttstcasaast ttctacattagctttaagtgttcag3tt33C3Ctt"24ttgasacctttgtagcttttagctgattaattagaaaaattsat3tttC3gtgaaagttt1484ttt3ttt3ttttttt333tgagaggggaaagctgaiaattccttgttaaga15"aagaatggccctsctsttatcatgeaaaaatgctttgttggcacctcsgs1,aatagctatagtctcttcsgcatttgttt33atttt3gs3sacctgtsta166425asttactggtgcataactta33g3ttdttctgcctttggctaattgagtaattcccctcc1724sgcsctagagaccgctcsgtgctcttsctagatgaactcagtaacgccttgagctgggtt17B4gattgaggatgtgtgaaaaagctcacagsgcccgatgcctgctgctatttc3cggcaatg18"agcctttttct ttctacactgaagattttcttcttatttaatgtggtttattttgggctc1904gctctgttgaaaataatcctttgtcagaaaagaaggtagctaccacatca1964ttttgaaaggaccatgagcaaagccataagaagtggtttgatcgatst3t2024taggggtsgctcttgstt.ttgttaacattaagataaggtgsctttttccccctgctttts2084caaagatacttctstatttttatcactatagatcatsgttattatacaat2144gtagtgagtcctgcatgggt3ctcgstgtgtaatgaaacc2204aagaasagcaataat.tttctsaagctgtgctgtcggtgattactcawtt2264tcttcattttgaagctacttcatatttttt2324tsgggaasctaaggagtgacatagsactgatgaatgagtaaaagtsagttttgctggatt2384tttgtagaactctggacgttgaggattcattatgctgtggttaactttaastattttt2"22 255 PRT 迷路蛋白 2 Met Vallie Ala Leu Leu Gly Val Trp Thr Ser Val Ala 5 10Val Val 15Phe Asp LeviAsp Ala Asp 35Leu Gly Leu 5020 GlyLysAsp Asp GluTyr G丄yGlu Glu Val Leu Gly Lys 25Asp Phe Asp Val Asp Asp 40Ala 。5Trp Tyr Lys Vai LeuGly lie 30Ser Thr Ser Glu Pro Ala Val Pro Pro Glu 55 60Glu 65Ala Glu Pro H丄s Thr Glu Pro Glu Glu Gin Val Pro Val Glu7075Glu Pro Gin Asn lie Glu Asp Glu Ala Lys Giu Gin lie8590Leu His Glu Met Val His Ala Glu His Val Glu Gly Glu100105Gin Ser 95Asp Leu 110Ala 80LeuGinGin Glu Asp Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gin Gin Glu Asp Asp Glu Phe115120125Leu Met Ala Thr Asp Val Asp Asp Arg Phe Glu Thr Leu Glu Pro Glu130135140Va丄Ser His Glu Glu Thr Glu His 145 150Ser Gin Asp Cys Asn G'ln'Asp Met 165Asn Pro Asp Ser Ser Glu Pro Val 180Asp Thr Asp Asp Val Thr Tyr Gin 195 200Glu Pro Leu Glu Asn Glu Gly lie 210 215Pro Glu Asp Asn Pro Val Glu Asp 225 230Ser lie Phe Pro Val Glu Glu Gin .245Ser Tyr Ms Val Glu Glu Thr Val 155 160Glu Glu Met Met Ser Glu Gin Glu 170 175Val Glu Asp Glu Arg Leu Ms His 185 190Val Tyr Glu Glu Gin Ala Val Tyr 205Glu lie Thr Glu Val Thr Ala Pro 220Ser Gin Val lie'Val Glu Glu Val 235 240Gin Glu Val Pro Pro Asp Thr 250 2553 28 PRT 小白蛋白 3Val Lys Lys AlaGlu Glu Asp Glu 20Phe Ala lie Ue Asp Gin Asp Lys Ser Gly Phe lie 5 10 15Leu Lys Leu Phe Leu Gin Asn Phe 254 28 PRT 鈣調蛋白 4Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Ala Gly Asp Gly Thr lie 15 10 15Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu 20 25 5 28 PRT 肌釣蛋白-C 5Leu Ala Asp Cys Phe Arg Thr Phe Asp Lys Asn Ala Asp Gly Phe lie 15 10 15Asp lie Glu Glu Leu Gly Glu lie Leu Arg Ala Thr 20 25 6 10 PRT 未知未知有機體的描述未筌定的肽 6Ala Pro Pro Glu Asp Asn Pro Val Glu Asp 1 5 ■ 10 7 10 PRT 未知未知有機體的描述未鑑定的肽 7Glu Glu Gin Gin Glu Val Pro Pro Asp Thr 1 5 10 8 10 PRT 未知未知有機體的描述未鑑定的肽 8Asp Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gin Gin Glu 1 5 109 11 PRT 未知未知有機體的描述未鑑定的肽 9Giu Gin Glu Asn Pro Asp Ser Ser Glu Pro Val 15 10
權利要求
1.具有圖1所示核苷酸序列的分離的cDNA分子。
2. 權利要求1的分離的cDNA分子的區段，其中所述區段在所迷 核苷酸序列中從起始密碼子(ATG)延伸至終止密碼子TAA,並包含765 個鹼基對。
3. 足夠編碼Lab蛋白中可用抗體MCA 44-3A6檢測的表位的、分 離的cDNA的區段。
4. 由權利要求1的cDNA區l殳編碼的賓^基酸序列。
5. 標記的、在嚴格條件下能與/W基因或其片段雜交的探針在制 備用於診斷細胞樣品中癌細胞的i^斷試劑中的用途。
6. 具有胺基酸序列PTGEPQ的分子。
7. —種肽，選自長度在3-20個胺基酸之間的、排列如圖2中氨 基酸的所有序列，其中n個胺基酸的序列的第一個胺基酸的位置選自 由位置1到n-3至n-20。
8. 針對肽的抗體，所述肽具有選自權利要求4-7任一項的序列的 胺基酸序列。
9. 權利要求8的抗體，進一步定義為單克隆抗體。
10. 在哺乳動物中產生的抗體，所述抗體針對由權利要求2或3 的DNA分子編碼的胺基酸序列或包含一表位的其片段。
11. 衍生權利要求2的cDNA的分離的基因組DNA分子。
12. 包含權利要求2或3的分離的cDNA分子的載體。
13. 載體，包含編碼具有根據權利要求4-7任一項的氨基S吏序列 的分子的cDNA分子。
全文摘要
分離了編碼稱為迷路蛋白(Lab)之蛋白的cDNA分子，並測定了其核苷酸序列。該蛋白、或從該蛋白衍生出的肽，是可用於確定新的癌症種類的標記。對這些癌症的診斷分析使用抗Lab的抗體，或者使用與lab基因或其片段雜交的核苷酸探針。可用於或者防止Lab(或lab)測試陽性的受治療者癌症復發、或者預防癌症的初始發生的疫苗，使用得自Lab的蛋白或肽。用經過免疫原性分析的Lab表達來監測癌症治療的效果。將lab的反義分子用於治療。在患病的正常細胞例如腺細胞中用lab的有義分子恢復失去的lab功能。
文檔編號C07H21/04GK101260401SQ200810003148
公開日2008年9月10日 申請日期1999年3月11日 優先權日1998年3月17日
發明者A·拉多舍維奇 詹姆斯 申請人:伊姆瓦爾克斯公司