W/o/w型動物疫苗油乳佐劑的製備方法

2023-11-03 21:43:22 2

專利名稱：W/o/w型動物疫苗油乳佐劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及動物疫苗油乳佐劑的製備領域，尤其是一種W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法。
背景技術：
疫苗佐劑可以提高疫苗的免疫作用效果，其在免疫中的主要作用是提升機體免疫系統對抗原或免疫原的免疫應答反應，增強免疫反應強度和反應的持久性，從而提高機體對病毒或細菌的抵抗力。佐劑的研究是適應疫苗的應用而發展的，隨著養殖業、養殖技術的發展，動物疫苗用量越來越大，佐劑的用量也隨之增加。據統計，目前國內通過獸藥GMP認證的動物疫苗生產企業有70家，國內市場疫苗總容量約1800—2000億羽(頭)份，僅豬口蹄疫疫苗年用量約12億頭份(銷售額約10億人民幣)，禽流感疫苗350億隻份(銷售額約30億人民幣)。長期以來用於傳染病預防的主要疫苗是傳統獸用疫苗，傳統獸用疫苗中常用的佐劑主要是鋁鹽佐劑和油乳佐劑。鋁鹽佐劑在注射部位緩慢釋放抗原物質的效應比較弱，因而活性比較低，對許多抗原都不夠有效，主要適用於免疫能力強和可以大量生產的抗原。油乳佐劑常見的是水包油(0/W)和油包水(W/0)型，可以用於多種動物疫苗的製造，在疫苗製造行業應用廣泛，油乳劑中含有油和乳化劑，這類佐劑的作用機制是抗原包被在油相形成的微結構內，使之形成貯存庫而緩慢釋放，刺激機體細胞產生抗體。油乳佐劑可以提高疫苗的免疫作用效果，但是油和乳化劑的種類及添加量與疫苗的安全性密切相關， 通常動物接種此類疫苗後副反應比較嚴重。目前常用的油乳佐劑在注射部位有駐留的傾向，而且在接種部位附近容易產生無菌膿腫和肉芽腫，並且在接種期間可能引起劇烈的疼痛，並且易分層和穩定性較差，只能保證在4°C下存放2個月內不出現分層現象，而且粘稠度大，所用生物活性劑性能差，對動物造成的副作用大，本發明W/0/W型油乳佐劑可以彌補上述不足。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法。本發明佐劑含有均一的亞微粒油載體，穩定性高，在4°C下可達到12個月以內不分層，室溫下 6個月以內不分層，40°C時10天以內不分層。本發明所採取的技術方案是W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，包括以下步驟
(1)物質A的配製向0. 9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要0. 4 1. 6g 非離子嵌段共聚物L180，非離子嵌段共聚物L180的英文全稱為nonionic block copolymer L180 ；(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003和 HLB為14. 0 16. 0的親水基表面活性劑，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入0. 01 0. Ig嵌合共聚物P1003和0. 01 0. 08mLHLB為14. 0 16. 0的親水基表面活性劑，嵌合共聚物P1003的英文全稱是block copolymer P1003 ；
(3)物質C的配製將物質A和HLB值為3.5 6. 0的表面活性劑加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質A、HLB值為3. 5 6. 0的表面活性劑和輕質礦物油的體積比為 5 32:0. 5 5:5 32 ；
(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，混合均勻得物質D，物質B與物質C的體積比為50 75:25 50 ；
(5)將物質D高壓均質至乳液微粒達到要求，得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。優選的物質D中含有防腐劑，物質D中物質B、物質C和防腐劑的用量為50 75 mL 25 50 mL 1 10mg，防腐劑為慶大黴素、青黴素、氯黴素和福馬林中的一種。優選的HLB為14. 0 16. 0的親水基表面活性劑為吐溫40、吐溫60和吐溫80。優選的HLB為3. 5 6. 0的表面活性劑為Span60、Span80和Span83。優選的W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，包括以下步驟(1)物質A的配製向0. 9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要Ig非離子嵌段共聚物L180 ；
(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003和吐溫80，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入0. 05g嵌合共聚物P1003和 0. 02 ImL 吐溫 80 ；
(3)物質C的配製將物質A和SpanSO加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質
A、Span80和輕質礦物油的體積比為20:3:20；
(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，添加慶大黴素，混合均勻得物質D，物質
B、物質C和慶大黴素的用量為60mL 43 mL :3mg ；
(5)將物質D高壓均質得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。採用上述技術方案所產生的有益效果在於本發明佐劑含有均一的亞微粒油載體，穩定性高，在4°C下可達到12個月以內不分層，室溫下6個月以內不分層，40°C時10 天以內不分層，使用本發明佐劑的疫苗也可以達到同樣的效果；使用本發明佐劑的疫苗可在常溫下保存和運輸，大大降低疫苗造價；可以有效增強機體免疫應答能力，提高疫苗保護率；可以提高宿主對同源性抗原的口服耐受性，對畜禽安全環保健康養殖及重大動物疫病綜合防控有重要意義。非離子嵌段共聚物L180和嵌合共聚物P1003安全無副作用，表面活性劑易於採購，用本發明佐劑生產的疫苗，免疫性能優於市售商業佐劑生產的疫苗能更早的使機體產生抗體，並且產生的抗體特異性強；欲達到相同免疫效果，抗原的用量低，可以降低疫苗生產成本；本發明佐劑生產的疫苗對機體的作用時間長，即免疫期長。
具體實施例方式實施例1
ff/0/ff型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，包括以下步驟
(1)物質A的配製向0. 9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要Ig非離子嵌段共聚物L180 ；
(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003和吐溫80，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入0. 05g嵌合共聚物P1003和 0. 02 ImL 吐溫 80 ；
(3)物質C的配製將物質A和SpanSO加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質 A的量為20mL，Span80的量為3mL，輕質礦物油的量為20mL。(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，添加:3mg慶大黴素，混合均勻得物質D，物質B的量為60ml ；
(5)將物質D高壓均質3次，乳液微粒達到350nm，得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。一、本發明實施例1製備的佐劑用於豬流感病毒疫苗的免疫效果試驗
1、試驗材料(1)試驗動物8周C57/BL6小鼠 (2)病毒抗原=HlNl和H3N2
2、試驗方法
(1)試驗分組
①抗原
②抗原+商業佐劑
③抗原+本發明佐劑
(2)免疫分兩次對小鼠進行皮下注射，第一次注射0.25 mL疫苗(a組直接注射抗原水溶液)，3周後進行第二次注射，注射量為0. 25 mL。(3)免疫效果檢驗第二次注射2周後，收集血清，採用酶聯免疫吸附法(ELSIA)測定IgG、IgGU IgG2a和IgG2b的濃度；依照WHO方案測定血凝抑制效價(HI效價)。3、結果與分析
只注射抗原的小鼠不能引發或只可引發極其微弱的抗體反應。對於HINI病毒抗原c組與b組小鼠血清中IgG、IgGl、IgG2a和IgG2b的濃度比值分別為2609^1379^1:349^1:34%11 ；c組小鼠是b組小鼠HI效價的1. 4-3. 1倍。對於H3N2病毒抗原c組與b組小鼠血清中IgG、IgGl、IgG2a和IgG2b的濃度比值分別為3009^2129^1389^112%11 ；c組小鼠是b組小鼠HI效價的1. 8-3. 3倍。注坦:p<0.001; b:p<0. 003; c:p0. 05o由以上數據得出本發明佐劑疫苗的抗體反應明顯強於其他兩組，免疫效果顯著。二、本發明實施例1製備的佐劑疫苗增強宿主口服耐受性性能檢驗 1、試驗材料
(1)試驗動物6周CB6F1小鼠，D011. 10 TCR轉基因小鼠，BALB/c小鼠。(2)抗原
選用了 3種與小鼠同源性較高的蛋白抗原
①GtfB. 1: PhoA 一種由鏈球菌葡糖基轉移酶B (GtfB. 1)抗原肽區345-359和大腸桿菌磷酸酶(PhoA)氨基端融合而成的嵌合蛋白。本蛋白是通過前述基因工程的方法製成。②BSA:牛血清白蛋白，購自密蘇裡州聖路易斯Sigma公司。③OVA:卵白蛋白，購自密蘇裡州聖路易斯Sigma公司。
此外，選用了一種同源性低的抗原霍亂毒素(CT)。2、試驗方法
(1)試驗分組
①CB6F1小鼠對GtfB. 1 PhoA和BSA的口服耐受性研究
a)同源抗原溶於碳酸氫鹽，通過非腸道供給；
b)同源抗原溶於碳酸氫鹽，注入小鼠胃中；
c)同源抗原+本發明佐劑，注入小鼠胃中；
d)同源抗原+CT+本發明佐劑，注入小鼠胃中。②小鼠對OVA的口服耐受性研究
a) 20mg可溶OVA注入DOl 1. 10 TCR轉基因小鼠胃中; b ) 20mg可溶OVA注入BALB/c小鼠胃中；
c)2mg可溶OVA+本發明佐劑注入D011. 10 TCR轉基因小鼠胃中
d)2mg可溶OVA+本發明佐劑注入BALB/c小鼠胃中
(2)免疫(抗原供給)
分兩劑進行供給第一劑供給三周後進行第二次供給。GtfB. 1:: W10A和BSA供給量為Img/劑，CT供給量為10 μ g每劑。(3)免疫效果檢驗第二次供給2周後，收集血清，採用酶聯免疫吸附法(ELSIA)測定IgG濃度。3、結果與分析
(1) CB6F1小鼠對GtfB. 1 PhoA 口服耐受性研究
口服耐受是通過口服相應抗原誘導機體產生免疫耐受，蛋白抗原進入腸道，通過腸上皮組織或黏膜，誘導產生調節T細胞，從而產生耐受性。本研究結果發現
a)同源抗原溶於碳酸氫鹽經非腸道供給會出現強烈的IgG反應，幾乎不產生耐受性；
b)同源抗原溶於碳酸氫鹽注入小鼠胃中，部分小鼠出現IgG反應，不產生耐受性，部分小鼠產生耐受性。c)同源抗原與本發明佐劑合用製成相應疫苗，試驗小鼠均產生耐受性；
d)當同源抗原和非同源抗原CT同時與本發明佐劑合用製成相應疫苗，小鼠不呈現耐受性，均出現較強的抗體反應。(2 ) CB6F1小鼠對BSA的口服耐受性研究
CB6F1小鼠對BSA的口服耐受性與對GtfB. 1 PhoA 口服耐受性表現出了一致的結果。(3 )小鼠對OVA的口服耐受性研究
D011. 10 TCR轉基因小鼠的T細胞可以識別雞卵白蛋白的肽段323-339，本研究通過供給卵白蛋白抗原進行了 TCR轉基因小鼠和正常BALB/c小鼠對該抗原耐受性的研究。研究結果發現不同劑量OVA直接注入小鼠胃中和與本發明佐劑製成疫苗後注入小鼠胃中，小鼠均產生耐受性；2mg OVA通過與本發明佐劑製成疫苗後與20mg0VA直接注入小鼠胃中，經ELSIA檢測IgG濃度基本相同，即表現出的耐受水平相同。實施例2
W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，包括以下步驟(1)物質A的配製向0.9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要0. 4g非離子嵌段共聚物L180 ；
(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003 和HLB為14的親水基表面活性劑，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入 0. Olg嵌合共聚物P1003和0. 08mLHLB為14的親水基表面活性劑；
(3)物質C的配製將物質A和HLB為3.5的表面活性劑加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質A的量為16mL，HLB為3. 5的表面活性劑的量為2. 5mL，輕質礦物油的量為 16mL。(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，添加7mg青黴素，混合均勻得物質 D，物質B的量為52ml ；
(5)將物質D高壓均質3次，乳液微粒達到350nm，得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。實施例3
ff/0/ff型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，包括以下步驟
(1)物質A的配製向0.9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要1. 6g非離子嵌段共聚物L180 ；
(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003 和HLB為16的親水基表面活性劑，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入 0. 05g嵌合共聚物P1003和0. OlmLHLB為16的親水基表面活性劑；
(3)物質C的配製將物質A和HLB為6的表面活性劑加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質A的量為25mL，HLB為6的表面活性劑的量為2. 5mL,輕質礦物油的量為25mL。(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，添加2. Img福馬林，混合均勻得物質D，物質B的量為105ml ；
(5)將物質D高壓均質3次，乳液微粒達到350nm，得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。實施例4
ff/0/ff型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，包括以下步驟
(1)物質A的配製向0.9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要Ig非離子嵌段共聚物L180 ；
(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003和吐溫60，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入0. 05g嵌合共聚物P1003和 0. 025mL 吐溫 60 ；
(3)物質C的配製將物質A和Span83加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質 A的量為20mL，Span83的量為3mL，輕質礦物油的量為20mL。(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，添加8. 6mg氯黴素，混合均勻得物質D，物質B的量為43ml ；
(5)將物質D高壓均質4次，乳液微粒達到350nm，得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。實施例5 W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，包括以下步驟
(1)物質A的配製向0.9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要0. Sg非離子嵌段共聚物L180 ；
(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003和吐溫40，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入0. 08g嵌合共聚物P1003和 0. 05mL 吐溫 40 ；
(3)物質C的配製將物質A和Span60加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質 A的量為10mL，Span60的量為lmL，輕質礦物油的量為64mL。 (4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，添加1. 5mg慶大黴素，混合均勻得物質D，物質B的量為113ml ；
(5)將物質D高壓均質4次，乳液微粒達到350nm，得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。
權利要求
1.ff/0/ff型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)物質A的配製向0.9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要0. 4 1. 6g 非離子嵌段共聚物L180 ；(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003和 HLB為14. 0 16. 0的親水基表面活性劑，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入0. 01 0. Ig嵌合共聚物P1003和0. 01 0. 08mLHLB為14. 0 16. 0的親水基表面活性劑；(3)物質C的配製將物質A和HLB值為3.5 6. 0的表面活性劑加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質A、HLB值為3. 5 6. 0的表面活性劑和輕質礦物油的體積比為 5 32:0. 5 5:5 32 ；(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，混合均勻得物質D，物質B與物質C的體積比為50 75:25 50 ；(5)將物質D高壓均質至乳液微粒達到要求，得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。
2.如權利要求1所述的W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，其特徵在於，物質D 中含有防腐劑，物質D中物質B、物質C和防腐劑的用量為50 75 mL:25 50 mL :1 10mg，防腐劑為慶大黴素、青黴素、氯黴素和福馬林中的一種。
3.如權利要求2所述的W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，其特徵在於，HLB為 14. 0 16. 0的親水基表面活性劑為吐溫40、吐溫60和吐溫80。
4.如權利要求3所述的W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，其特徵在於，HLB為 3. 5 6. 0的表面活性劑為Span60、Span80和Span83。
5.如權利要求4所述的W/0/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)物質A的配製向0. 9g/100mL的NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，充分溶解混勻得物質A，非離子嵌段共聚物L180的用量為每IOmL所述NaCl溶液需要Ig非離子嵌段共聚物L180 ；(2)物質B的配製向質量分數為0.9g/100mL的NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003和吐溫80，充分溶解混勻得物質B，每IOmL所述NaCl溶液中加入0. 05g嵌合共聚物P1003和 0. 02 ImL 吐溫 80 ；(3)物質C的配製將物質A和SpanSO加入到輕質礦物油中，乳化均質得物質C，物質A、Span80和輕質礦物油的體積比為20:3:20；(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，添加慶大黴素，混合均勻得物質D，物質B、物質C和慶大黴素的用量為60mL 43 mL :3mg ；(5)將物質D高壓均質得到W/0/W型動物疫苗油乳佐劑。
全文摘要
本發明公開了一種W/O/W型動物疫苗油乳佐劑的製備方法，涉及動物疫苗油乳佐劑的製備領域，包括以下步驟(1)物質A的配製向NaCl溶液中加入非離子嵌段共聚物L180，溶解混勻；(2)物質B的配製向NaCl溶液中加入嵌合共聚物P1003和親水基表面活性劑，溶解混勻；(3)物質C的配製將物質A和表面活性劑加入到輕質礦物油中，乳化均質；(4)物質D的配製將物質B加入到物質C中，混合均勻；(5)將物質D高壓均質得到W/O/W型動物疫苗油乳佐劑。本發明佐劑含有均一的亞微粒油載體，穩定性高，在4℃下可達到12個月以內不分層，室溫下6個月以內不分層，40℃時10天以內不分層。
文檔編號A61K39/39GK102335425SQ20111032700
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者史記華, 楊美景, 王佔喜 申請人:石家莊維埃溫特生物技術有限公司