J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡及應用的製作方法

2023-11-04 04:44:42

專利名稱：J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，主要用來診斷J亞群禽白血病感染的禽類，或用來監測雞群是否攜帶J亞群禽白血病病毒。
背景技術：
J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)感染引起的一種腫瘤性傳染病。 呈全球性爆發，對世界肉種雞業造成了毀滅性打擊。近年來禽白血病的10個亞群中，J亞群禽白血病對養禽業的危害最為嚴重，相對之前對蛋雞等危害較重的A、B亞群禽白血病對養禽業的危害更為突出。該病以垂直傳播為主，通過引種和種苗的銷售等方式造成大面積擴散。我國白羽肉種雞均從國外引進，且未對新出現的ALV-J採取任何防範措施，加之我國的養殖條件相對落後，使ALV-J在我國造成的損失高於其它任何國家。2000年，J亞群禽白血病在我國白羽肉種雞中全面爆發，造成了巨大的經濟損失；2002 — 2005年間，ALV-J病毒突破種間屏障，造成廣東、廣西三黃雞、中國麻雞雞群中爆發J亞群禽白血病，使許多養殖場倒閉；2007年和J亞群禽白血病密切相關的血管瘤病在蛋雞群及商品蛋雞群中爆發，並很快席捲全國。由於ALV-J病毒自身的特殊性以及引起疾病的複雜性，世界獸醫技術研究人員對 ALV-J的防治研究未見顯著成就，至今無法控制ALV-J的有效方法和防治ALV-J感染的藥物和疫苗。對ALV-J的防控，發達國家主要採取淨化淘汰，這不僅需要有一套行之有效的的淨化方案，而且必須要有靈敏、方便、快捷的淨化工具——ALV-J診斷試劑。ALV-J的檢測方法較多，如瓊脂擴散、ELISA、PCR、LAMP等技術，但它們使用起來存在操作不變、成本較高、設備要求高、對人員技術要求高等這樣那樣的缺點，膠體金試紙卡具有方便、快捷、靈敏、經濟實惠、適合基層快速檢測等特點。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術而提供了一種J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，以雞組織、血液、拭紙等為檢測樣品，可簡便、快速地檢測雞群是否感染、攜帶ALV-J，為雞群特別是種雞的ALV-J淨化提供快捷工具，降低了淨化成本，節約人力物力。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，包括有襯板，其上設置有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特徵在於金標墊上包被有膠體金標記的鼠抗J亞群禽白血病病毒gp85蛋白的單克隆抗體；硝酸纖維素膜上包被有兔抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體構成的檢測線和兔抗鼠IgG多克隆抗體構成的質控線。按上述方案，所述的膠體金墊上附著有的1. 8mg/ml鼠抗J亞群禽白血病病毒gp85 蛋白的單克隆抗體計25μ1，可與雞J亞群禽白血病病毒特異性結合。滿足試紙卡檢測的靈敏度要求，同時也可滿足與兔抗鼠多抗結合的要求。金標墊的製備方法如下取膠體直徑為20 士 5nm的膠體金溶液，用碳酸鈉調整至PH8. 0，加入鼠抗J亞群禽白血病病毒gp85蛋白的單克隆抗體，室溫攪拌，BSA封閉，離心，棄沉澱；上清液離心，棄上清，將沉澱以與原體積相同的PBS溶解，如上重複離心2次，所得沉澱物用40%原體積的PBS重懸，將重懸的混合液均勻分散在玻璃纖維上，使其乾燥備用。按上述方案，所述的檢測線中兔抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體含量為 0. 3^0. 5 μ g/ml ；質控線中兔抗鼠IgG含量為1. 2 2. 2 μ g/ml。按上述方案，所述的檢測線包被方法如下取所述濃度0. 3、. 5 μ g/ml兔抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體10μ 1，在預定的檢測線位置劃線，乾燥後即為檢測線。按上述方案，所述的質控線包被方法如下取所述濃度為1. 2^2. 2 μ g/ml的兔抗鼠IgG多克隆抗體5μ 1，在預定的質控線位置劃線，乾燥後即為質控線。本發明還提供了上述雞J亞群禽白血病抗體快速檢測試紙卡的檢測方法，其特徵在於包括有以下步驟將試紙卡平放，取研磨凍融離心後的待檢組織、血液或肛門拭紙樣品 100 μ 1滴在樣品墊上，根據檢測線和質控線的顯色狀態，判斷檢測結果如果質控線、檢測線均出現，判定為陽性；質控線出現，檢測線不出現，判定為陰性；質控線、檢測線均不出現或質控線不出現而檢測線出現，均判定檢測結果無效。本發明所述的禽白血病分Α、B、C、D、E、F、G、H、I和J等10個亞群，其中A、B、C、
D、Ε、J亞群均可感染雞，J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)感染引起的一種腫瘤性傳染病，其囊膜蛋白gp85具有亞群特異性，感染過的雞可產生亞群特異性抗體。 gp85蛋白上有多個抗原決定簇，可與相應的單克隆抗體特異性結合。本發明設計了針對ALV-J gp85蛋白的單克隆抗體、兔抗J亞群禽白血病多克隆抗體(兔抗ALV-J的多克隆抗體)及兔抗鼠多克隆抗體，用膠體金標記鼠抗ALV-J gp85蛋白的單克隆抗體3A1，捕獲雞組織、血液、肛門拭紙中的ALV-J病毒粒子，若樣品陽性，金標鼠抗 ALV-J gp85蛋白的單克隆抗體在檢測線富集，則會形成肉眼可見的檢測線(T線)，越過檢測線的金標鼠抗ALV-J gp85蛋白的單克隆抗體與兔抗鼠的多抗結合形成肉眼可見的質控線 (C 線)。本發明的優點在於本發明中J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡檢測方法，可快速檢測雞體是否感染或攜帶J亞群禽白血病病毒，具有反應快速、敏感性高、特異性強、 操作簡單、適合「欄圈邊」檢測、經濟實惠等優點。


圖1為本發明的結構示意其中，1 一吸水墊；2 —襯板；3 —硝酸纖維素膜；4 一金標墊；5 —樣品墊；6 —質控線； 7一檢測線；
圖2為檢測結果判定，其中，A:C、T均出現紅色線判為陽性；B 僅C出現紅色線而T沒出現紅色線判為陰性；C、D 只要C不出現紅色線結果均判為無效檢測。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細的說明。
實施例1 J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白的製備
用基因工程技術高效表達J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白。參考GENBANK 上已經發表的J亞群原型毒株HPRS-103的gp85基因序列，設計一對擴增gp85基因的引物，上遊引物 Pl :5，-TCCGAATTCGGAGTTCATCTATTGCAACAA-3 『，下遊引物 P2 :5 『-GTACTCGAGTTAGCGCCTGCTACGGTGG TG-3'。P1 和 P2 的 5'端分別引入EcoR I 和 Xho I 酶切位點。擴增長度為921bP，反應條件為95°C預變性5min後，按94°C 30s, 57°C 45s, 72°C Imin進行33個循環，最後72°C延伸lOmin，PCR產物連接到pMD_18T載體上，將連接產物轉化到DH5a感受態中，塗布於含IOOg / mL氨卞青黴素(Amp)的LB平板，37°C培養16小時， 挑單菌落，鹼裂解法抽提重組質粒，以PCR和雙酶切鑑定陽性克隆，並序列測定驗證。陽性克隆的酶切產物與pET-28a表達質粒連結，構建重組表達質粒pETj8a-gp85，並轉化表達菌BL21，挑單菌落接入5mL含100g/mL卡那黴素(Kan)的LB培養基中，37°C、250r/min震蕩培養10h，然後按1 100轉接500mL LB (100g/mL Kan)的培養基，37°C、250r/min震蕩培養汕，加入終止濃度為lmmol/ L IPTG誘導表達4h。4°C、4000r / min離心lOmin，收集誘導表達菌體。利用QIAGEN公司的his-鎳親和層析柱，在變性條件下採用PH梯度洗脫純化J亞群禽白血病重組His-gp85蛋白，主要步驟如下將收集的菌體沉澱按8mL / g的比重重懸於緩衝液 B (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, PH8. 0)中，在室溫下輕微振蕩 45 60min (避免產生氣泡)，400w超聲波擊打30次，1200rpm，4°C離心30min，取上清加入到含 2mLNi-NTA填料的經緩衝液B平衡的純化柱中，封閉純化柱，200r/min, 37°C振蕩30min，使重組蛋白和Ni2 + -NTA固相充分結合後，讓純化柱垂直放置，待Ni-NTA填料沉積後，將純化柱用 IOmL 緩衝液 C (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, 20mM imidazol PH6.3)洗脫 2 次後，再用 IOmL bufferD (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, PH5. 9)洗脫 2 次，最後用 IOmL bufferE (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M uregi, PH4. 5)洗脫目的蛋白，收集洗脫液進行SDS-PAGE鑑定，採用BCA法測定純化His-gp85蛋白含量，計算表達量。結果顯示， 含pETj8a-gp85重組質粒的表達菌成功表達分子量為38KD的J亞群禽白血病亞群特異性 gp85抗原蛋白，其表達量為4aiig/L，可用於製備單克隆抗體。實施例2 J亞群禽白血病病毒gp85蛋白單克隆抗體製備
將實施例1中的J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白與弗氏佐劑等量混合，充分乳化，以50g IOOg/只免疫BALB/c系小鼠3次，每次間隔15 30天，第3次加強免疫後3 4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，於75%酒精浸泡5 lOmin，無菌取其脾細胞；剪碎並經100目尼龍網過濾，lOOOr/min離心lOmin，收集脾細胞；將IX IO8的脾細胞與 2 5X IO7的SP2/0骨髓瘤細胞混合，1000r/min離心lOmin，棄上清，在37°C的水浴中將 0. 7 Iml的40% 50%PEG4000 (pH8. 5 9. 0)緩緩加入細胞，溫育Imin後，緩慢加入無血清1640培養基15ml，以終止PEG的作用，37°C水浴5 lOmin，1000r/min離心lOmin，棄上清，將細胞重懸於HAT選擇培養基中，並加入96孔培養板(IOOuL/孔)，置37°C 5%C02培養箱中培養。培養7-10天後，用8g llg/ml的ALV-J gp85蛋白重組蛋白包被96孔酶標板，以ELISA檢測雜交瘤的培養上清，挑取強陽性細胞克隆(0D492=0. 8以上)，經連續3次的有限稀釋法克隆化，建立雜交瘤細胞株，將雜交瘤細胞腹腔注射經降植烷致敏一周的BALB/ c系小鼠，每隻小鼠注射5X IO5個細胞，誘生小鼠腹水，製備囊膜蛋白單克隆抗體。所建立的7株雜交瘤細胞株染色體為92-98，其分泌的單克隆抗體特異識別J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白，與GST及其它菌體蛋白不發生交叉反應，親和力常數達10_9，輕鏈亞型為κ或λ，重鏈亞型為IgG2a，IgG2b、IgG3。實施例3兔抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體的製備
將J亞群禽白血病病毒接種於DFl細胞，37°C培養8 — 9天，收集檢測為陽性的病毒液6000r/min，4°C離心30min去沉澱；上清用27000 r/m 4°C離心lh，沉澱用少量pH7. 2， 0. 01mol/L PBS (0. 01M，PH7. 4)重懸。以 PBS 製備質量分數 25%，；35%，45%，55% 和 65% 不連續梯度蔗糖，加樣品至梯度界面上，4°C 27000r/ min離心2 h。分別收集不同濃度處的蛋白帶至離心管中，用20倍體積的PBS稀釋後，27000r/min離心池脫糖。最後用適當體積的PBS懸浮沉澱，用NanodroplOOO分光光度儀0D280和0D260吸光值，並根據公式計算病毒蛋白含量蛋白含量(mg/mL) =(1.45X0擬80-0. 74X0擬60) X稀釋倍數，測得ALV-J病毒蛋白含量為17. :3mg/mL，可用於兔抗ALV-J病毒多克隆抗體的製備。將J亞群禽白血病病毒蛋白加弗氏佐劑按1 :1混合充分乳化，經皮下和肌肉注射免疫健康紐西蘭大白兔3 4次，末次免疫10天後，靜脈採血，以ELISA測定其血清抗體效價在1 2000以上時，心臟採血或頸動脈放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸銨法粗提免疫兔血清IgG，並用Superdex 200凝膠層析進行純化，不重述。所製備的抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體用於檢測試紙卡的研製。實施例4兔抗鼠IgG多克隆抗體的製備
採取高免小鼠血液，分離血清，以辛酸-硫酸銨法粗提小鼠血清IgG，首先用4倍血清體積的0. 06M pH4. 8醋酸緩衝液稀釋血清，以IM NaOH調pH至4. 5 ；在室溫下邊攪拌邊逐滴加入辛酸，每毫升血清加入25ul辛酸，4°C靜置2h，12000r/min離心30min，取上清；在溶液中加10倍體積磷酸鹽緩衝液PBS，用5M NaOH調pH至7. 4，冰浴至4°C ；按每毫升混合液加0，277g硫酸銨並攪拌30min，4°C靜置4h，12000 r/min離心30min，棄上清；沉澱以 0. 05M PBS (0. 01M,PH7. 4)重懸裝入透析袋，透析除鹽，直至用BaC12檢測無白色沉澱為止， 用PEG8000進行濃縮。用Superdex200凝膠層析進行純化粗提小鼠血清IgG (同實例2)， 用NanodroplOOO分光光度儀0D280和0D260吸光值，並根據公式計算IgG含量蛋白含量 (mg/mL) =(1. 45X0D280-0. 74X0D260) X 稀釋倍數，測得小鼠 IgG 的蛋白含量為 13. Img/ mL，可用於兔抗小鼠IgG多克隆抗體的製備。以50 100ug/kg體重的小鼠IgG蛋白加弗氏佐劑充分乳化，經皮下和肌肉注射免疫健康紐西蘭大白兔3 4次，末次免疫10天後，靜脈採血，以ELISA測定其血清抗體效價在1 2000以上時，心臟採血或頸動脈放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸銨法粗提免疫兔血清IgG，並用Superdex 200凝膠層析進行純化，不重述。所製備的抗小鼠IgG多克隆抗體用於檢測試紙卡的研製。實施例5金標墊的製備
取膠體直徑為18nm的膠體金溶液100ml，用碳酸鈉調整至pH8. 0，加入1. 8mg鼠抗 ALV-J gp85蛋白的單克隆抗體，室溫攪拌20min，10%BSA封閉。將上述標記物3000r/min 離心20min，棄沉澱，上清液12000 r / min離心30 min， 棄上清，將沉澱以與原體積相同的PBS (0. 01mol/L ρΗ8· 2，含0. 1% BSA、0. 05%疊氮鈉)溶解，如上重複離心2次。 最後沉澱物用40%原體積的PBS重懸，以Iml溶液鋪35cm2的比例，均勻鋪在玻璃纖維上，使其乾燥備用。實施例6硝酸纖維素膜的包被
將本研究室研製的兔抗J亞群禽白血病的多克隆抗體用PBS(0.01M，pH7. 4)配製成 0. 3 0. 5μ g/m的濃度，取10 μ 1用噴膜機在預定的檢測線位置劃線；
取所述本室研製的兔抗鼠多克隆抗體，用PBS(0.01M，pH7. 4)配製成濃度為1. 2 2. 2 μ g/ml的溶液，取5 μ 1溶液，用噴膜機在預定的質控線位置劃線。實施例7檢測試紙卡的組裝
在乾燥室內，室溫20 - 25°C，溼度小於3096，將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊等按圖1所示固定到支撐薄片上。其中硝酸纖維素膜位於支撐薄片襯板中部，其包被有T 線的一端與金標墊的1/5搭接，包被有C線的一端與吸水墊的1/5搭接，，樣品墊與金標墊的1/2搭接。最後切成寬度為3. 5cm的小條，然後裝入測試卡。每10個一包，加入小袋乾燥劑，抽真空封裝。4 8°C保存，有效期一年。實施例8快速檢測試紙卡的穩定性檢測設計溫度37°C、4°C
設計時間:0天、7天、21天、28天、2月、4月、6月、8月、12月、18月
保存方法拭紙卡真空封裝(在37°C、4°C同時各保存一盒) 檢測指標敏感性
表1本發明試劑盒試紙卡穩定性檢測結果
權利要求
1.J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，包括有襯板(2)，其上設置有樣品墊(5)、金標墊(4)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(1 )，其特徵在於金標墊上包被有膠體金標記的鼠抗J亞群禽白血病病毒gp85蛋白的單克隆抗體；硝酸纖維素膜上包被有兔抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體構成的檢測線(7)和兔抗鼠IgG多克隆抗體構成的質控線(6)。
2.按權利要求1所述的J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，其特徵在於所述的膠體金墊上附著有的1. 8mg/ml鼠抗J亞群禽白血病病毒gp85蛋白的單克隆抗體計25 μ 1，可與雞J亞群禽白血病病毒特異性結合。
3.按權利要求2所述的J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，其特徵在於所述的金標墊的製備方法如下取膠體直徑為20 士 5nm的膠體金溶液，用碳酸鈉調整至ΡΗ8.0，加入鼠抗J亞群禽白血病病毒gp85蛋白的單克隆抗體，室溫攪拌，BSA封閉，離心，棄沉澱；上清液離心，棄上清，將沉澱以與原體積相同的PBS溶解，如上重複離心2次，所得沉澱物用40% 原體積的PBS重懸，將重懸的混合液均勻分散在玻璃纖維上，使其乾燥備用。
4.按權利要求1或2或3所述的J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，其特徵在於所述的檢測線中兔抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體含量為0. 3^0. 5 μ g/ml ；質控線中兔抗鼠IgG含量為1. 2 2. 2 μ g/ml。
5.按權利要求4所述的J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，其特徵在於所述的檢測線包被方法如下取所述濃度0. 3^0. 5 μ g/ml兔抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體10 μ 1， 在預定的檢測線位置劃線，乾燥後即為檢測線。
6.按權利要求4所述的J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，其特徵在於所述的質控線包被方法如下取所述濃度為1. 2 2. 2 yg/ml的兔抗鼠IgG多克隆抗體5 μ 1，在預定的質控線位置劃線，乾燥後即為質控線。
7.權利要求1-6任一項所述的雞J亞群禽白血病抗體快速檢測試紙卡的檢測方法，其特徵在於包括有以下步驟將試紙卡平放，取研磨凍融離心後的待檢組織、血液或肛門拭紙樣品100 μ 1滴在樣品墊上，根據檢測線和質控線的顯色狀態，判斷檢測結果如果質控線、 檢測線均出現，判定為陽性；質控線出現，檢測線不出現，判定為陰性；質控線、檢測線均不出現或質控線不出現而檢測線出現，均判定檢測結果無效。
全文摘要
本發明涉及一種J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡，包括有襯板，其上設置有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特徵在於金標墊上包被有膠體金標記的鼠抗J亞群禽白血病病毒gp85蛋白的單克隆抗體；硝酸纖維素膜上包被有兔抗J亞群禽白血病病毒多克隆抗體構成的檢測線和兔抗鼠IgG多克隆抗體構成的質控線。本發明的優點在於本發明中J亞群禽白血病病毒快速檢測試紙卡檢測方法，可快速檢測雞體是否感染或攜帶J亞群禽白血病病毒，具有反應快速、敏感性高、特異性強、操作簡單、適合「欄圈邊」檢測、經濟實惠等優點。
文檔編號G01N33/577GK102426242SQ20111035307
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月9日 優先權日2011年11月9日
發明者劉麗娜, 張蓉蓉, 楊峻, 溫國元, 王紅琳, 羅玲, 羅青平, 艾地雲, 邵華斌 申請人:湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所