用於診斷、預防和/或護理特徵為β-澱粉和/或澱粉樣物質在人和/或動物器官和組織中異...的製作方法

2023-11-02 10:19:02 2

專利名稱：用於診斷、預防和/或護理特徵為β-澱粉和/或澱粉樣物質在人和/或動物器官和組織中異 ...的製作方法
用於診斷、預防和/或護理特徵為β -澱粉和/或澱粉樣物 質在人和/或動物器官和組織中異常沉積的人和/或動物 病理的產物及它們的應用、和用於確定這種病理風險的篩選方法
阿爾茨海默氏病是老人痴呆的最普通的形式。其為退化性疾病，臨床特徵為認知 功能的不斷下降，神經病理學特徵為β-澱粉質(Αβ)和τ蛋白的不溶性聚集體在大腦皮 層和皮質下灰質中的積累。Αβ以細胞外澱粉質的形式沉積在神經纖維網(老年斑)中和腦 血管(嗜剛果紅血管病)中，而τ形式的蛋白形成異常神經元內間絲(神經元纖維變性) (Love S. Neuropathologicalinvestigation of dementia -.a guide for neurologists. J NeurolNeurosurg Psychiatry 76, Suppl 5 :v8_14,2005)(圖 1)。
在95%的情況下，阿爾茨海默氏病是偶發性的，而在約5%的情況下其具有家族 特徵並且和下列3種基因的突變有關染色體14上的早老素1 (PSEN 1)、染色體1上的早 老素2(PSEN 2)、和染色體21上的β-澱粉質前體(ΑΡΡ)。在這些情況下，所述疾病通常比 偶發性形式更早發作，並且以高滲透性常染色體顯性類型的機理來傳播。
AD的發病原理仍未完全理解，但是在最近十幾年，「澱粉質瀑布」假說(Wilquet et al. Amyloid-beta precursor proteinprocessing in neurodegeneration.Curr Opin Neurobiol 14 :582-8,2004 ；Lee et al.Perspectives on the amyloid-beta cascadehypothesis. J Alzheimers Dis 6 :137-45，2004)日益被證實，其在家族(FAD)和 偶發性形式中都將核心作用歸因於Αβ。
A β通過稱為「澱粉質源途徑」的分解代謝途徑衍生自其β -APP前體(圖幻。這 種途徑通過兩種蛋白酶(β-分泌酶和Y-分泌酶)來提供用於蛋白的分子上遊和下遊 的裂解。β -分泌酶(BACE)的切斷產生長的可溶性N-末端片段(sAPP β )和99個胺基酸 的C-末端肽(C99)。其進一步被Y-分泌酶切成對應於A β和小的C-末端肽(Al⑶)的兩 個片段(Selkoe DJ. Deciphering thegenesis and fate of amyloid β -protein yields novel therapies forAlzheimer disease. J Clin Invest 110 :1375-81,2002)。事實 上，Y-分泌酶具有兩個主要的裂解位點，其導致形成「短」和「長」形式的Αβ (Αβ1-40和 Αβ 1-42)，在正常條件下它們的比例為10 1。類似地，BACE可在肽的不同點發揮作用，從 而在N-末端區域產生截短形式(例如A β 11-40、Αβ 11-42和A β 3_42)，這通常導致AD增 力口(Liu et al. Characterization of Aβ ll_40/42peptidedeposition in Alzheimer' s disease and young Down' s syndromebrains implication of Alzheimer' s disease. Acta Neuropathol 112 :163-74,2006)。由於蛋白被另一種蛋白酶(α -分泌酶)在Αβ殘 基16-17切斷，因此β APP可進行稱為「非澱粉質源」的可選擇的分解代謝途徑。因此，後 面酶的作用排除澱粉質的形成。
澱粉質瀑布假說由多個證據支持
· AD 的基因 APP 決定家族形式突變(Rademakers et al.，Genetics of Early-Onset Alzheimer Dementia. Scientific WorldJournal 16:497-519,2003)；
基因APP的額外拷貝的存在(這在唐氏綜合症中證實)足以確定AD的臨床病理學描述；
· AD的大多數遺傳決定形式與Αβ的產生增加、Αβ42/Αβ40比例增大有關 (Kahle et al. Attack on 澱粉質· EMBO Rep 4 :747-51,2003)；
·Αβ、特別是「長」的42-殘基形式表現出強的聚集為低聚物以形成澱粉質原 纖維(其表示老年斑的主要要素)的趨勢(Armstrong RA. Plaques and tangles and thepathogenesis ofAlzheimer' s disease. Folia Neuropathol44 :1-11,2006)；
·Αβ、特別是42胺基酸形式是神經毒性的(Butterfield et al. Amyloid beta-peptide(1~42)contributes the oxidative stressand neurodegeneration found in Alzheimer disease brain. Brain Pathol 14 :426-32,2004)；
轉基因鼠(與AD關聯的APP基因的載體)在中樞神經系統中積累 β-澱粉質，並且表現出行為-認知範圍的缺陷，這取決於年齡而加重(Kurt et al. Neurodegenerativechanges associated with beta-amyloid deposition in thebrains of mice carrying mutant amyloid precursor proteinand mutant preseniIin-ltransgenes Exp Neurol 171 :59-71,2001)；
針對表達人APP的轉基因鼠的Αβ的變異降低了澱粉質斑的形成，並且改 善了 其神經學缺陷(Lemere et al. Amyloid-beta immunization in Alzheimer』 s diseasetransgenic mouse models and wildtype mice. NeurochemRes 28:1017—27, 2003)。
關於遺傳決定形式，約80%的家族AD情況與PSEN 1和PSEN 2突變關聯(Rocchi et al. Causative and susceptibility genesfor Alzheimer' s disease -.a review. Brain Res Bull 61 :1-24,2003) 0兩種早老素都涉及Αβ (其為Y-分泌酶的大分子 絡合物的部分)的產生，並且它們的突變情況涉及Αβ (上述所有Αβ 1-42)產生的增 加，這具有形成神經毒性聚集體的高的趨勢。約5%的FAD由位於APP基因上的突變引 起(Rocchi et al. Causative andsusceptibility genes for Alzheimer' s disease a review. Brain ResBull 61 :1-24，2003)(圖2)。這些突變中的一些通過利於在二級 β-片層結構富集Αβ構象來發揮它們的病原作用，結果是溶解度和針對聚集的趨勢降 低。另一方面，其他突變幹擾APP的加工，原因在於它們位於分泌酶發揮作用的分子位點 處(例如「瑞典型突變」KM670/671NL)。仍有其他者利用完全未知的機理來引起長的和 不溶形式的Αβ (Αβ1-42和Αβ1-43)的生產積累。在與APP或早老素突變關聯的AD情 況中，Αβ 1-42增加直到其佔分泌的Αβ肽的15-40%為止，而在正常條件下其只佔其的 5-10% (Rocchi et al. Causative and susceptibility genes forAlzheimer's disease a review. Brain Res Bull 61 1-24,2003 ；Lleoet al.Clinical, Pathological, and Biochemical Spectrum ofAlzheimer Disease Associated with PS—lMutations. Am J GeriatrPsychiatry 12 :146-56. 2004)。
本發明的技術任務是提供用於診斷、和/或預防、和/或護理特徵為β -澱粉物質 和/或澱粉樣物質在人和/或動物組織和/或器官中異常沉積的人和/或動物病理的產物 及它們的應用、和用於確定這種病理風險的篩選方法。
根據本發明的技術任務以及其他目的通過下列記錄的獨立權利要求中所揭示的 內容而獲得。
本發明的其他特徵由從屬權利要求限定。
本發明的另外特徵和優點從附

圖1-19支持的下列描述中更加清晰可見。
本發明涉及人APP基因的新型點狀突變的近期發現。所述突變的特徵在於在人 APP基因￠876 的編碼序列的密碼子673處胞嘧啶被胸腺嘧啶置換，對應於根據GenBank 資料庫的命名法的人APP770 (NM000484. 2)異構體的核苷酸2212 (轉換c. 2212 > T)，這可 在網站上http: //w驟.ncbi. nlm. nih. gov.得到。為了本專利，通過澱粉樣物質，旨在A β 的蛋白聚集體不再具有澱粉質本身的染色和/或超微結構特性。這種突變(其在蛋白序列 中引起ΑΡΡ770的673(Ala673Val)位處丙氨酸被纈氨酸置換，這對應於A β的胺基酸殘基 2)在患者的純合性中進行鑑定，所述患者患有具有早老性發病的嚴重形式的痴呆症。患者 頭脊柱液的分析表明總τ蛋白和磷酸化τ明顯減少，這在阿爾茨海默氏病中觀察到。另 一方面，Aβ 1-40和Αβ 1-42的血漿水平相對於對照受試者增加，並且也相對於在雜合性方 面具有相同突變的患者增加。另外，相對於對照纖維原細胞，得自患者的皮膚活組織檢查的 纖維原細胞在它們的培養基中釋放較高量的Aβ 1-40和Αβ 1-42。總之，該數據(其詳細記 錄在下面示出的幾個實施例中)表明在純合性狀態下，突變Ala673Val和可描述為阿爾茨 海默氏病的痴呆症相關聯，並且與APP基因的其他突變類似，通過增加A β生產來影響APP 的加工。
不同家族成員的基因學研究證實存在純合性的Ala673Val突變的另一家族攜帶 者。較之患者的這種相對年輕者經歷神經心理評價，這檢測到不同認知功能折中的初始信 號。而且，基因學分析允許鑑定相同的雜合突變中的多個攜帶受試者，吃驚的是即使它們中 的一些年齡增長(壽命九十)，神經學的進展方面仍沒有發展(圖4)。對從基因APP開始轉 錄的RNA進行的基因表達研究證實在這些受試者中，等位基因(即野生型和突變的)都被 轉錄。因此，雜合子中不存在疾病不可能是因為基因阻遏機理(「病理性」等位基因的轉錄 的抑制)。因此可假設與截至目前APP基因中所描述(全部常染色體顯性並且完全滲透) 的相反，Ala673Val突變具有常染色體隱性類型的表達。因而斷定一些明顯突發形式的AD 可能在基因學上以常染色體隱性傳播的形式產生。
為了研究該現象的分子基礎，我們合成兩種A β 1 -40肽，一種野生型(DAEF RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)，另一種在2位含有取代丙氨酸的纈氨酸 (DVEFRHDSGYEVHHQKL VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)。所述兩種肽進行化學-物理和形態學 分析以評價它們的二級結構、聚集動力學、以及聚集體的形態和性質。這些研究表明突變的 肽傾向於形成比野生型更大的澱粉質原纖維。非常吃驚的是，由等摩爾量的所述兩種肽構 成的混合物就其本身而言不僅聚集少於突變的肽，而且還少於野生型肽。對於澱粉樣化的 這種「抑制」作用和臨床觀察是一致的，在所述臨床觀察中所述疾病專門地在Ala673Val突 變的純合子受試者中顯現，而在細胞水平(野生型和突變的)共表達兩種肽的雜合子沒有 生病。在該數據的基礎上，甚至可認為雜合子個體由於突變的Αβ肽在存在其對應的野生 型的條件下具有較小的纖維原性傾向而可以避免阿爾茨海默氏病。
為了證實下列假設容納突變的Αβ的N-末端區域在聚集方面具有重要作用以 及Ala673Val突變具有抑制作用，對應於A β的第一六種胺基酸合成兩種肽，一種具有野生 型序列(DAEFRH)，另一種在2位含有取代丙氨酸的纈氨酸(DVEFRH)。然後所述兩種六肽和 Αβ 1-40野生型共溫育，並且在隨後的時間內進行檢查。研究證實兩種六肽抑制Αβ 1-40的自發原纖維形成傾向，並且突變的六肽的作用大於對應的野生型。
該數據在AD和更多通常特徵在於蛋白以不溶和毒性聚集體的形式聚集在中樞神 經系統或其他組織中的疾病的治療策略的範圍內開啟了新的可能。
我們發明的第一應用包括根據本領域技術人員已知的方法製備含有人APP的 cDNA的載體(具有Ala673Val)和使用所述載體，以轉染可用於發病機理研究和治療的細胞 系。
第二應用包括根據本領域技術人員已知的方法使用根據前述申請的構建體作為 載體來製備轉基因非人哺乳動物(其能夠表達具有Ala673Val突變的人APP)、作為APP的 單一形式(純合子動物)、或者和野生型人APP或含有另一種突變(雙轉基因)的組合。這 種動物可用作研究人和/或動物病理(其特徵在於β-澱粉和/或澱粉樣物質在器官和組 織中的異常形成和沉積)的發病機理、診斷、預防和護理的模型。在目前實施方案中，優選 的動物是鼠、特別是用於內源性APP的敲除的鼠株C57BL6，並且優選病理為AD。
考慮到突變的肽潛在可能干擾A β的聚集和原纖維形成，我們發明的另一種可能 應用表示為在體內基因治療ONA直接轉移到患者的細胞或組織中)或體外基因治療(DNA 首先轉移到從有機體分離的細胞中，實驗室培養並因此進行修飾，然後其可重新引入患者 中)中產生含有病理的APP (具有Ala673Val突變)的構建體，所述病理的特徵在於β-澱 粉物質在組織和器官中的異常沉積。構建體向靶細胞中的轉移可以藉助於病毒型載體來實 現，例如(a)逆轉錄病毒，其具有使它們的DNA整合到擴增細胞染色體中的能力；(b)而慢 病毒，其也允許將基因物質轉移到沒有擴增的細胞中；(c)腺相關病毒，其不將它們的DNA 整合到細胞染色體中，而是可以僅用於小尺寸的基因；(d)腺病毒，其可以轉運大尺寸的基 因，但是仍然確保它們的有限時間期限的表達；或(e)單純皰疹病毒，其僅傳染數種類型的 細胞，特別是神經元細胞。可選擇地，可以使用非病毒載體(如脂質體)。受到具有Αβ的 異常積累的病理影響而引入有機體的具有Ala673Val突變的APP可以提供突變的β-蛋白 源，其能夠抑制澱粉物質在組織中的積累。
另一種可能的應用表示為根據本領域技術人員已知的方法(RNA幹擾法，RNAi)， 使用負感知mRNA (含有本發明的突變)以抑制信使在用於Ala673Val突變的純合子受試者 中的翻譯。翻譯的抑制具有這樣的目的，所述目的引起突變的肽的生產的中斷，這具有針對 聚集的強的趨勢。基於應用於我們的發明的RNAi技術的試驗還可以用於疾病(其特徵在 於澱粉和/或澱粉樣物質在組織和器官中的異常形成和沉積)的發病機理的研究。
我們發明的另一種應用提供具有Ala673Val突變的人APP和含有這種突變的天然 或合成肽在人和/或動物病理(其特徵在於澱粉和/或澱粉樣物質在組織和器官中的 異常形成和沉積)的診斷、預防和護理中的應用。
我們優選的實施方案提供低分子量肽(如六肽DVEFRH)的應用，其合適地配製用 於口腔和/或胃腸外施用，包括鞘內施用。優選的病理為AD。所述治療提供施用單一肽或 關聯的數種肽，以用作單獨治療或聯合其他藥物治療。
我們發明的進一步應用提供通過本領域技術人員已知的技術製備針對根據前述 應用的蛋白和/或肽的抗體，以用於人和/或動物病理(其特徵在於β -澱粉和/或澱粉 樣物質在組織和器官中的異常形成和沉積)的診斷、預防和/或護理。
我們優選的實施方案提供單克隆抗體，其能夠識別人APP和由其衍生的並含有這種突變的肽中的Ala673Val突變。這種抗體可用於診斷目的以識別具有Ala673Val突變的 APP，或合適地配製以治療特徵在於缺少這種突變的APP的澱粉樣變性病。優選的澱粉樣變 性病是AD。
上述申請以實施例的形式記錄，並且不以任何方式限制本發明的進展。 實施例
實施例1 :APP基因新變異的鑑定和這種突變的攜帶患者的臨床顯型的描述
通過下列方式進行突變的鑑定從患者淋巴細胞中提取基因組DNA，經過聚合酶 鏈式反應(PC 、使用引物 5，-GTTTTGGGTAGCCTTTG-3 和 5，-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3， 對基因APP的外顯子16和17進行擴增，然後根據已經描述的技術(Wakutani et al. Novel amyloid precursor protein gene missense mutation(D678N)in probably familial Alzheimer' s. JNeurol Neurosurg Psychiatry75 :1039-42,2004) ^ X^t ψ ±| 產物進行測序(圖5)。由於突變消除了限制性內切酶HpYCH4V在外顯子16內部的特 定酶切位點，因此Ala673Val的存在還通過下列方面示出外顯子16通過PCR(引物 5，-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3，和 5，-TACTTTAATTATGATGTAATA-3，)擴增，PCR 產物被 HpYCH4V消化，以及片段在2. 5%瓊脂糖凝膠上的分離。在野生型等位基因中，HpYCH4消化 產生91和78個鹼基對(bp)的兩種片段，而突變的等位基因產生169個bp的單一片段(圖 6)。
Ala673Val突變在沒有家族痴呆症的純合性患者中進行鑑定，其受到進化的心 理-有機綜合症(evolutive psycho-organicsyndrome)的影響，該綜合症在36歲發病， 並且具有逐漸嚴重的記憶不足、計劃困難和行為紊亂(圖4，III 18)。針對嚴重的多部分 (multi-sector)認知衰退，臨床描述發展為不自主運動和肌陣攣類型、帕金森症以及痙攣 性四肢輕癱有關。
家族基因學研究允許鑑定第二純合子受試者的Ala673Val突變(圖4，III 20)和 不同雜合子受試者(圖4，II 10、III 1、1112、III 8、III 12、IV 1)。純合子(即患者的 妹妹，年輕5歲)目前具有和疾病發作一致的認知劣化的初始信號；另一方面，沒有雜合子 受試者表現出神經病學病理，即使在年齡增加的情況下也是如此。這種觀察表明Ala673Val 突變是常染色體隱性的，從而使得在以純合性的形式存在時，目前為止上述中只有一種和 表達病理顯型的AD有關聯。
應該強調，APP基因的相同密碼子容納Ala673Thr多態性。這種多態性在雜合 性受試者中遇到，而沒有AD的臨床信號或神經病理學改變的暗示(Peacock et al. Novel polymorphismin the A4region of the amyloid precursor protein gene in a patientwithout Alzheimer' s disease. Neurology 43:1254-56,1993)。
對患者進行的實驗室和裝置研究表明
廣泛的腦萎縮，普遍涉及腦髓的前部區域、RM處；
和由未受到痴呆症影響的受試者所表示的對照組相比(Αβ 1-40 = 109士 12pg/ ml, ρ = 0. 003 ；Aβ 1-42 = 20士6pg/ml，p = 0. 004)，肽 Αβ 1-40 和 Αβ 1-42 在血漿中明顯 增多(分別為似6士93pg/ml和46士7pg/ml)(圖7)；
相對於陰性對照(Αβ 1-40 = 34. 4士3. 8pg/ml ；A β 1-42 = 4. 4士0. 6pg/ml)，Αβ在通過皮膚活組織檢查從患者中取出的纖維原細胞的培養基中增加(Αβ1-40 = 87. 3 士9. 5pg/ml ；A β 1-42 = 8. 8 士0. 2pg/ml)(圖 8)；
·Αβ 1-42士43pg/ml 對 392士 115pg/ml (對照組，ρ = 0.0004)降低(圖 9)，以及 在腦脊液中，τ蛋白(420pg/ml ；正常範圍90_150pg/ml)和磷_ τ (63. 3pg/ml ；對照中的平 均濃度19. lpg/ml)增加(圖10)，所述改變完全類似於阿爾茨海默氏病中觀察到的那些。
實施例2 含有Ala673Val突變的A β肽的化學-物理特性的分析
為了確定Ala673Val突變的效果並證實其在AD發病機理中的作用，我們合成了兩 種 A β -40 肽，一種具有野生型(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)序列，另一 種在2位的丙氨酸>纈氨酸(DVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)。所述肽通過 固相合成法經過利用合成器433A(AppliedBiOSyStemS)來製備。然後根據Ball et al. (Int JPept Prot Res40 :370-9,1992)由 Bonetto et al. (J Biol Chem 277 :31327-34,2002) 所介紹的修飾方法，使用親脂性探針(4-十二烷基氨基羰基芴-9-基甲基琥珀醯亞氨基碳 酸酯)將和樹脂結合的肽在N-末端衍生化。在從樹脂分離後，所述肽通過HPLC法、經過 使用反相柱C4 (Waters)來純化，獲得純度> 95 %。肽鑑定通過MALDI-T0F光譜法來確定 (Reflex III Brucker Model)。
對於下面記錄的物理-化學研究(除非另有說明)，將肽野生型A β 1-40、突變的 A β 1-40和含有等摩爾的兩種肽的混合物的樣品溶解於IOmM NaOH中，隨後在50mM Tris HCl (pH7. 0)中稀釋，直到最終濃度為0. 25和0. 125mM。然後將上述樣品在37°C下溫育1、 4、8、對小時以及3、5、10、15和20天。每次都分析等份的樣品以確定二級結構、聚集、以及 聚集體的超微結構和光學-染色性能。
二級結構
由Αβ的二級結構突變導致的變化根據由Clippingdale etal. (J Pept Sci 5 227-49,2001)所描述的技術、藉助於圓二色光譜法來進行研究。將肽稀釋在150mM磷酸鹽 緩衝液(PH 7.4)中至最終濃度為ΙΟΟμΜ，使用Jasco-810分光偏振儀在37°C的恆溫下進 行測定。通過使用Imm的測試管和20nm/min的掃描速度來獲得光譜。在獲得緩衝溶液的 光譜後，如果需要，通過使用加權移動平均法除去噪音。
分析證實，突變的肽強烈地傾向於在β-片層呈現出大量的二級構象。在所有檢 查的次數中，不僅相對於野生型肽，而且相對於由突變肽和野生型肽構成的等摩爾混合物， 其β-片層含量都較高(圖11)。
這表明Aβ摺疊的Ala673Val突變條件引起二級β -片層結構的顯著增加。
聚集
野生型A β 1-40、突變的A β 1-40和它們等摩爾混合物的聚集通過下列方式來評 價確定可以用離心過濾法沉澱的肽的量。在不同的溫育時間，30μ 1的等份樣品在4°C下 以15，000g/15分鐘來離心過濾。將小球溶解於25 μ 1的純甲酸中，然後將溶液注射到設置 有 PRLP-SΙΟΟΑ柱(4.6x150mm)(Labservice Analytica,Polymer Laboratories)的 HPLC 中。通過下列方式進行洗脫使用洗脫液A (由在水中的0. 1% TFA構成)和洗脫液B (由 在乙腈中的0. 08% TFA構成)作為流動相，流速為0. 7ml/min，在20分鐘內施加15-60%線 性梯度的洗脫液B。通過測定洗脫液在214nm處的吸收度來改善對應於肽的峰。
可以被沉澱的肽的量被計算為初始溶液中存在的肽的總量的百分數。
這些試驗證實與野生型肽相比，突變的肽聚集更多更快，並且吃驚的是，由兩種肽 形成的混合物沉澱少於突變的肽和野生型肽(圖12)。
聚集體的超微結構和和染色性能
聚集體的超微結構特性和光學-染色性能分別在用剛果紅著色後藉助於電子顯 微鏡和偏振光顯微鏡來研究。
對於超微結構研究，將5 μ 1的野生型A β 1-40、突變的A β 1-40和它們等摩爾混合 物的混懸液在1小時-20天的溫育時間吃取出，沉積在包覆i^ormvar-Carbon的鎳網上5分 鍾，用鈾醯的過飽和溶液陰性著色，然後在電子顯微鏡(EM109Zeiss)下觀察。在溫育的第 二十天，將等份樣品以15，000g/15分鐘離心過濾。將這樣獲得的小球固定於在磷酸鹽緩衝 液(pH 7.4)中的2. 5%的戊二醛，並且後固定在四氧化鋨中，在丙酮中脫水，並包含在 環氧樹脂(Spurr，Electron Microscopy Sciences)中。在銅網上收集超小部分(500 A), 用醋酸鈾醯和檸檬酸鉛染色，然後在電子顯微鏡下觀察。
為了證實是否以及以何種測量方式聚集體由澱粉質構成，在不同溫育時間，在聚 賴氨酸化(polylysinated)載玻片(Bio-Optical)上收集5 μ 1各樣品的溶液，用剛果紅染 色，然後用偏振光顯微鏡(Nikon Eclipse E-800)檢測。
超微結構分析表明在第一個2天的溫育中，野生型A β 1-40肽形成無定形聚集體、 低聚物和很少的細絲狀結構。在48小時後，短原纖維材料出現，沒有分支並且不規定(前 原纖維)，僅在72小時溫育後，觀察到長的分支原纖維，直徑約8nm並且插入有無定形和前 原纖維材料。隨後，原纖維密度增加，並且無定形和前原纖維材料的量成比例增加。僅在15 天溫育後，大部分材料由緻密原纖維網絡構成。
另一方面，突變的肽Aβ 1-40的聚集動力學非常快。事實上，從溫育M小時開始， 存在缺少各種衍生物的長的、規則原纖維(圖13)，在5天後，樣品由緻密原纖維網絡構成而 沒有前原纖維和無定形材料。
吃驚的是，不僅相對於突變的肽、而且相對於野生型肽，兩種肽的等摩爾混合物都 形成較少原纖維，在20天溫育後，大多數聚集體由無定形材料構成(圖14)。
用剛果紅染色的製劑的偏振光觀察表明突變的肽A β 1-40比野生型A β 1-40更具 澱粉樣化性，兩種肽的混合物具有低的形成澱粉質的傾向。事實上，在突變的A β 1-40樣品 中在M小時溫育後存在雙折射材料的少量聚集體(圖13)，在野生型A β 1-40樣品中在72 小時後以及在兩種肽的混合物在5天後才出現這種情況。在稍後時間，在突變的Αβ 1-40 和野生型Αβ 1-40樣品中觀察到雙折射材料顯著增加，而在兩種肽的混合物中觀察到非常 少量的增加，即使在20天溫育後也是如此(圖14)。
該數據證實聚集研究的結果，並且證明(i)突變的肽Αβ 1-40比野生型Αβ 1-40 更具澱粉樣化性，和(ii)兩種肽的混合物具有低的形成澱粉質原纖維的傾向。
實施例3.通過合成肽(含有Ala673Val突變的A β的N-末端區域的同源物)抑 制澱粉樣化
由於突變的A β 1-40和野生型A β 1-40肽的混合物的物理化學研究表明 八1動73￥31突變對於々0聚集可具有抑制作用，因此我們通過使用對應於Αβ的第一六個 胺基酸的兩種合成肽來驗證該假設，一種具有野生型序列(DAEFRH)，另一種在2位含有取 代丙氨酸的纈氨酸(DVEFRH)。將兩種六肽和野生型Αβ 1-40以等摩爾濃度或過量(六肽Αβ1_40 = 5 1)濃度共溫育。如實施例2所述製備混合物以用於超微結構和組織 化學研究。該研究表明兩種六肽(突變的和野生型的)都抑制A β 1-40的原纖維形成，這 說明Αβ的N-末端區域的突變位點在聚集中發揮重要作用(圖15)。然而，突變的六肽產 生較對應的野生型更高的活性，這強調了 Ala673Val突變的重要性(由於對原纖維形成的 抑制作用)。
實施例4 用野生型人APP或在A β的2位含有Ala > Val突變的那種進行細胞 系的轉染
通過基因工程方法(Tesco et al. APP substitutions V715Fand L720P alter PS !conformation and differentially affect Aβ andAICD generation. JNeurochem 95 :446-56,2005 ；Sudhir et al. Release of Amino-Amino terminal Fragments from AmyloidPrecursor Protein Reporter and Mutated Derivatives in CulturedCell . J Biol Chem 267 :25602-08,1992)，產生兩種載體，所述載體分別含有野生型人APP751的 cDNA和在A β的2位具有Ala > Val突變的人ΑΡΡ751的cDNA。使用這些載體轉染兩種細 胞系(C0S7和CH0)，其中使用ELISA法在培養基中進行A β計量。
通過定點突變法(Quik Change XL Site-DirectedMutagenesis Kit, Mratagene)、使用寡核苷酸
5 』 -GATCTCTGAAGTGAAGATGGATGTAGAATTCC-3 '和 5 『 -GTCATGTCGGAATTCTACATCCATC TTCACTT 3，將在A β的2位的Ala > Val突變插入人ΑΡΡ751的cDNA。然後，野生型和突 變形式的APP通過PCT、經過使用下列引物來擴增
5』 -CCCGGATATCGCCACCATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3，和 5』 -ACCGAAGCTTTGTGGCGGGG GTCTAGTTC-3』(第一個含有限制性內切酶EcoRV識別的位點，第二個具有用於酶HindIII 的位點)，在載體pcDNA 3. 1的限制性位點EcoRV和HindIII處克隆。這樣製得的構建體 通過 iTop Ten One Shot(Invitrogen)細胞的轉化進行擴增，通過 kit Endofree Plasmid Maxi Kit^liagen)進行純化，並通過電穿孔用於轉染C0S7和CHO細胞。轉染效率通過 Western blot法、使用定向於蛋白N-末端區域(殘基61-88)的抗體22C11 (Chemicon International Inc.)、經過細胞裂解液中的APP的量來評價。APP表達水平用於比較通過 使用兩種構建體轉染細胞而產生的A β的水平。在表達野生型和突變的人APP的C0S7和 CHO 的培養基上，然後用 ELISA(Immuno-BiologicalLaboratories Gunma)計量肽Αβ 1-40, A β 1-42和在N-末端的截短形式。
研究證實
相對於用野生型APP轉染的細胞9士8. 6pg/ml和4士0. 8pg/ml)，在用突變 的APP轉染的C0S7細胞的培養基中Aβ 1-40和Αβ 1_42顯著增加(分別為116. 8士90. 5pg/ ml 和 20 士 12. 3pg/ml)(圖 16)；
相對於用野生型APP轉染的細胞8士 11. 8pg/ml和4. 2士0. 8pg/ml)，在用突 變的APP轉染的CHO的培養基中Aβ 1-40和Αβ 1-42顯著增加(分別為84. 6士9pg/ml和 9. 6 士 3. 4pg/ml)(圖 17)；
相對於用野生型APP轉染的細胞(1. 1 士0. 3pg/ml)，在用突變的APP轉 染的C0S7細胞的培養基中，Αβ、特別是Αβ 3-42的N-末端處的截短形式明顯增加 (2. 5 士0. 3pg/ml)。13
該數據表明在A β的2位的Ala > Val突變改變了 APP的加工，從而支持澱粉樣 化途徑，同時A β 1-40、A β 1-42和N末端的截短形式的產量增加。
實施例5 轉基因鼠(在A β的2位具有Ala > Val突變的攜帶者)的產生
我們製備了這樣的構建體，其攜帶在A β的2位具有Ala > Val突變的人ΑΡΡ，以 用於產生轉基因鼠，對所述轉基因鼠進行行為學、神經生理學、神經影像學、神經病理學、生 物化學和分子學測試，以限定和該基因缺陷有關的疾病的顯型特性，並進行發病機理和治 療研究。
將野生型ΑΡΡ751的cDNA克隆到載體pTSC21中，其含有啟動子鼠Thy 1. 2(限制 性位點HindIII和EcoRV)(圖18)。然後使該構建體進行定點突變，並且通過報導用於細胞 轉染的相同方案(參見實施例4)插入在A β的2位的Ala > Val突變(Mratagene)，其用 於產生始於株C57B1/6的轉基因鼠。
獲得轉基因陽性的6個奠基者(3雄和3雌)，它們生下了在中樞神經系統過表達 在Αβ的2位具有Ala > Val突變的人APP的三個品系。兩個最優品系交雜用於內源性 APP的C5781/6敲除鼠的品系(已經可得到的品系)，以獲得在缺乏鼠APP的情況下表達突 變的人APP的動物(huAPPmut/m0APPQAl，圖19)。最後，這些將交雜用於野生型人APP的轉基 因鼠，以獲得雜合子動物(huAPP_/huAPPwt)。
在純合性和雜合性的情況下表達具有A β的2位突變的人APP的鼠用於阿爾茨海 默氏病的發病機理研究、診斷、預防和護理，更通常用於特徵在於澱粉和/或澱粉樣物質在 器官和組織中異常沉積的人和/或動物疾病。
術語
AD=阿爾茨海默氏病
AI⑶=C-末端片段，其衍生自通過Y -分泌酶酶切APP
APP = β -澱粉質蛋白前體
APP070 =用於內源性APP的敲除動物
APP673a = APP 野生型
APP673v =在密碼子673處具有Ala > Val突變的APP
A β = β -澱粉質，衍生自APP代謝的肽
BACE = β -分泌酶
bp =鹼基對
COS細胞=用SV40病毒的缺陷突變株轉染的成年雄性非洲綠猴的腎臟細胞
Cellule CHO =衍生自中華倉鼠卵巢細胞的細胞
DHPLC =變性高效液相色譜法
DNA =脫氧核糖核酸
FAD =家族形式的阿爾茨海默氏病
HPLC=高效液相色譜法
huAPP =正常人 APP
huAPPmut =表達人APP的轉基因鼠，其中A β的2位Ala > Val突變
huAPPwt =表達野生型人APP的轉基因鼠
MAPT =編碼τ蛋白的基因
moAPP =鼠 APP
moAPP+/+ =具有正常APP表達的鼠
moAPP070 =用於內源性APP的敲除鼠
mRNA=信使 RNA
Mut =突變的
Pqw =巨細胞病毒的啟動子
PCR=聚合酶鏈式反應
PSENl =早老素 1
PSEN2=早老素 2
RM=核磁共振
RNA =核糖核酸
RNAi = RNA 幹擾
sAPP β =衍生自通過β -分泌酶酶切APP的可溶性片段
SSCP =單鏈構型多態性分析法
Wt =野生型
權利要求
1.一種基於以純合子或雜合子形式、在編碼人APP基因￠8767 的序列的密碼子673 處胞嘧啶被胸腺嘧啶置換的研究，對人生物材料進行篩選以確定病理的方法，所述病理的 特徵在於由Αβ的任何異形體形成的澱粉和/或澱粉樣物質的異常沉積，所述研究對 應於ΑΡΡ770異形體(ΝΜ_000484. 2)的核苷酸2212 (c. 2212C > T轉變)，所述突變導致在 APP770的殘基673處或在對應於A β的2位的APP的其他異形體的類似殘基處丙氨酸被纈 氨酸置換。
2.根據權利要求1所述的篩選方法，基於信使RNA(mRNA)被這樣的基因轉錄的研究，所 述基因編碼根據點1具有所述突變的人APP的各種異形體，或在APP770的密碼子673處具 有其他突變。
3.根據權利要求1所述的篩選方法，基於含有所述Ala673Val突變的蛋白APP和/或 其異形體的研究，所述突變對應於A β的2位或在ΑΡΡ770的密碼子673處具有其他突變。
4.根據權利要求1和2所述的篩選方法，其特徵在於，其包含從任何生物材料分離所述 基因組DNA和/或RNA和對它們進行測序。
5.根據前述權利要求中的一項或多項所述的篩選方法，其特徵在於，其包括通過所述 DNA的非同位素分析來研究所述突變。
6.根據前述權利要求中的一項或多項所述的篩選方法，其中所述突變的研究通過使用 限制性內切酶和/或DHPLC (去活高效液相色譜法)和/或SSCP (單鏈構型多態性分析法) 和/或原位雜交法來進行。
7.根據前述權利要求中的一項或多項所述的篩選方法，其特徵在於，所述DNA得自從 患者血液中分離的白細胞。
8.根據權利要求1-7所述的篩選方法，其特徵在於一種所述病理是典型形式或以非典 型顯型表達的AD。
9.構建體，其特徵在於，其在任何非內源性啟動子控制下攜帶人APP或它們片段的不 同異形體，所述人APP或它們片段在ΑΡΡ770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突 變或其他突變。
10.根據前述權利要求所述的構建體，其特徵在於其在啟動子Thyl.1或Thyl. 2控制 下攜帶人APP或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有 Ala673Val突變或其他突變。
11.根據權利要求9所述的構建體，其特徵在於其在巨細胞病毒(P。mv)的啟動子控制 下攜帶人APP或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有 Ala673Val突變或其他突變。
12.任意細胞系，其特徵在於，其以穩定或瞬間方式用根據權利要求9-11所述的構建 體轉染。
13.轉基因非人哺乳動物，其特徵在於，其以雜合子或純合子形式攜帶所述DNA序列或 其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片段的不同異形體，所述人APP或它們片 段在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突變或其他突變。
14.提供敲除用於內源性APP的轉基因非人哺乳動物，其特徵在於，其攜帶所述DNA序 列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片段的不同異形體，所述人APP或它 們片段以純合子形式(基因型APP673v/APP673v)、或半合子形式(基因型APPQ/APP673v)、或雜合子(基因型APP673A/APP673v)在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val (APP673v) 突變或其他突變。
15.根據權利要求13和14所述的轉基因非人哺乳動物，其特徵在於，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變(或在APP770或它們片段的密碼子673處的其 他突變)和其他突變相關聯。
16.根據權利要求13-15所述的轉基因非人哺乳動物，其特徵在於，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變、(或在APP770或它們片段的密碼子673處的 其他突變)和在編碼早老素1 (PSEm)的基因中的突變相關聯。
17.根據權利要求13-15所述的轉基因非人哺乳動物，其特徵在於，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變、(或在APP770或它們片段的密碼子673處的 其他突變)和在編碼早老素2(PSEN2)的基因中的突變相關聯。
18.根據權利要求13-15所述的轉基因非人哺乳動物，其特徵在於，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變、(或在APP770或它們片段的密碼子673處的 其他突變)和在編碼τ蛋白(MAPT)的基因中的突變相關聯。
19.根據權利要求13-15所述的轉基因非人哺乳動物，其特徵在於，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變、(或在APP770或它們片段的密碼子673處的 其他突變)和基因PSEm和/或PSEN2和/或MAPT中的突變組合相關聯。
20.根據權利要求13所述的轉基因非人哺乳動物，其特徵在於，其是敲除物，其中所述 內源性APP在內源性啟動子控制下通過非同源重組經過人APP或其片段而置換，所述人APP 或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突變或其他突變。
21.根據權利要求13-20所述的轉基因哺乳動物，其特徵在於，其為齧齒動物。
22.根據權利要求13-20所述的轉基因哺乳動物，其特徵在於，其是任何株的鼠。
23.轉基因動物，其特徵在於，其是任何動物有機體，所述動物有機體表達人APP或其 片段，所述人APP或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突變或 其他突變，所述基因型的特徵在權利要求13-20中有所描述(例如線蟲、黑腹果蠅、斑馬魚寸J ο
24.轉基因有機體，其特徵在於，其是任何真核或原核微生物，所述微生物表達人APP 或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突變 或其他突變，所述基因型的特徵在權利要求13-20中有所描述(例如細菌，如大腸桿菌、酵 母菌、黴菌等)。
25.信使RNA(mRNA)或其片段，其含有核苷酸序列，所述核苷酸序列對應於(「正感 知」mRNA)或互補於(「負感知」mRNA)DNA，所述DNA編碼人APP，所述人APP在APP770的密 碼子673處具有Ala673Val突變或其他突變。
26.根據前述權利要求的RNA或其片段的應用，它們用於已知為RNA幹擾(RNAi)的技術範圍和所有其可能的應用。
27.根據權利要求25和沈的RNA或其片段在人和/或動物病理的診斷、預防和治療中 的應用，所述病理表示由Αβ的任何異形體形成的β-澱粉和/或澱粉樣物質在人和/或 動物器官和組織中的異常沉積。
28.根據前述權利要求所述的物質的應用，其中一種所述病理表示為具有典型或非典 型顯型的AD的偶然或遺傳形式。
29.人APP的異形體，其特徵在於，其在ΑΡΡ770的密碼子673處具有Ala673Val突變或 其他突變。
30.人APP的片段，包括所有Aβ的異形體，所述A β包括在N-末端處截短和/或在 C-末端處延伸的那些，其特徵在於，其在ΑΡΡ770的密碼子673處具有Ala673Val突變或其 他突變。
31.如前述權利要求所述的人APP的片段，其表示為Aβ 1-40、A β 1_42、在A β 1-40和 Aβ 1-42的N-末端處截短形式、以及在Aβ 1-40和Αβ 1-42的C-末端處延伸形式、或它們 的部分序列。
32.合成肽，其特徵在於，它們類似於根據權利要求30和31所述的人APP的片段。
33.根據權利要求30-32所述的肽，其特徵在於，它們含有至少一種右旋形式的胺基酸殘基。
34.根據權利要求30-33所述的肽，其特徵在於，它們含有一種或多種胺基酸殘基，所 述胺基酸殘基通過使用任何類型的化學基團結合來修飾。
35.根據權利要求30-34所述的模擬化學結構、非蛋白或只有部分蛋白用於藥物製劑， 所述藥物製劑被設計用於人和/或動物病理的診斷和/或預防和/或護理，所述病理的特 徵在於β-澱粉物質和/或澱粉樣物質在人和/或動物組織和器官中的異常沉積。
36.根據權利要求30-35所述的物質，其特徵在於，它們偶合分子，所述分子起到載體 的作用，所述載體能夠攜帶這些物質至特定位點，在所述位點中所述物質具有用於人和/ 或動物病理的診斷和/或預防和/或護理的功能，所述病理的特徵在於β -澱粉物質和/ 或澱粉樣物質在人和/或動物組織和器官中異常沉積。
37.根據權利要求30-36所述的物質在藥物製劑中的應用，所述藥物製劑被設計用於 人和/或動物病理的診斷和/或預防和/或護理，所述病理的特徵在於β -澱粉物質和/ 或澱粉樣物質在人和/或動物組織和器官中異常沉積。
38.根據前述權利要求所述的物質的應用，其中一種所述病理表示為具有典型或非典 型顯型的AD的偶然或遺傳形式。
39.根據權利要求30-36所述的物質的應用，其特徵在於，它們為載體，所述載體能夠 攜帶任何類型的化合物至特定位點，在所述位點中所述物質具有用於人和/或動物病理的 診斷和/或預防和/或護理的功能，所述病理的特徵在於β -澱粉物質和/或澱粉樣物質 在人和/或動物組織和器官中異常沉積。
40.根據權利要求25和30-36所述的物質在研究人和/或動物疾病的發病機理中的應 用，所述疾病的特徵在於β-澱粉物質和/或澱粉樣物質在人和/或動物組織和器官中異 常沉積。
41.根據前述權利要求所述的物質的應用，其特徵在於，一種所述病理表示為具有典型或非典型顯型的AD的偶然或遺傳形式。
42.根據權利要求四-34所述的蛋白和/或肽的多克隆抗體。
43.單克隆抗體或它們的片段(單鏈抗體，納米體)，其針對根據權利要求四-34所述 的蛋白和/或肽。
44.根據權利要求42和43所述的抗體在藥物製劑中的應用，所述藥物製劑瞄準人和/ 或動物病理的診斷和/或預防和/或護理，所述病理的特徵在於β -澱粉物質和/或澱粉 樣物質在人和/或動物組織和器官中異常沉積。
45.抗體針對根據前述權利要求所述的蛋白和/或肽的應用，其中一種所述病理表示 為具有典型或非典型顯型的AD的偶然或遺傳形式。
46.根據權利要求9-11所述的構建體在人和/或動物病理的體細胞基因治療中的應 用，所述病理的特徵在於β-澱粉物質和/或澱粉樣物質在人和/或動物組織和器官中異 常沉積。
47.根據權利要求9-11所述的構建體的應用，其中根據權利要求46所述的體細胞治療 通過使用天然或合成的脂質或聚合物作為攜帶載體而獲得。
48.根據權利要求9-11所述的構建體的應用，其中根據權利要求46所述的體細胞基因 治療通過使用生物劑作為載體而獲得。
49.前述權利要求所述的構建體的應用，其中根據權利要求46所述的體細胞基因治療 通過使用病毒劑作為載體(腺病毒、腺相關病毒、SV40、逆轉錄病毒等)而獲得。
50.根據權利要求9-11所述的構建體在人自身細胞的轉染中的應用，所述應用用在所 述病理的細胞治療，所述人自身細胞受到根據權利要求37和38所述的病理的影響。
51.根據權利要求9-11所述的構建體在異源或異種細胞的轉染中的應用，所述應用用 在根據權利要求37和38所述的病理的細胞治療。
52.根據權利要求12所述的細胞和根據權利要求13-Μ所述的基因改造的有機體作為 模型用於根據權利要求37和38所述的病理的發病機理以及診斷、預防和護理研究中的應 用。
53.根據權利要求12所述的細胞和根據權利要求1314所述的基因改造的有機體用於 根據權利要求四-31所述的蛋白和/或肽的製備中的應用。
全文摘要
本發明涉及基於在純合性或雜合性的情況下對β-蛋白的2位的點狀突變Ala＞Val(對應於含有770個胺基酸的β-蛋白的Ala673Val突變前體)的研究，對從人和/或動物有機體分離的生物材料進行篩選以確定表現為β-澱粉和/或澱粉樣物質在人和/或動物器官和組織中異常沉積的人和/或動物病理的風險的方法。本專利提供下列可行性(1)產生表達Ala673Val突變的單細胞或多細胞轉基因有機體；(2)合成或製備具有這種突變的肽和/或它們的衍生物、和/或含有相同突變的核酸；(3)使用這些產物研究特徵為β-澱粉和/或澱粉物質的異常沉積的病理的發病機理以及這些疾病的預防、診斷和護理。
文檔編號C12N15/11GK102037136SQ200880121317
公開日2011年4月27日 申請日期2008年10月10日 優先權日2007年10月12日
發明者A·馬蒂尼, F·塔格利維尼, G·迪費德, M·莫斌 申請人:卡羅貝斯塔神經學會I.R.C.C.S.基金會