一種治療副豬嗜血桿菌病的中藥複方注射劑及製備方法與流程
2023-11-01 17:34:17 1
本發明屬於獸藥領域，涉及一種治療副豬嗜血桿菌病的中藥複方注射劑及其製備方法。
背景技術：
副豬嗜血桿菌病，又稱豬多發性漿膜炎與關節炎或革拉瑟氏病（glasser,sdisease），是由副豬嗜血桿菌(haemophilusparasuis,hps)引起的一種豬的條件性傳染性疾病。本菌是豬上呼吸道中的常在菌，健康帶菌豬可成為傳染源。在轉群、斷奶後失去母源抗體保護，其它疾病導致免疫力下降時，可出現症狀，排出病原菌，主要通過呼吸道傳播。該病只發生於豬，從2周齡仔豬到4月齡的育肥豬均可感染，但多見於5-8周齡的保育豬。臨床上以體溫升高，發熱、咳嗽、呼吸困難，消瘦、關節腫大和運動障礙為特徵，少數豬表現神經症狀，病情嚴重時死亡率可高達50%。此外，該病還可以引起敗血症，並在急性感染後可能留下後遺症，即母豬流產，公豬慢性跛行。該病常並發或繼發於支原體肺炎、豬流感、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸症候群或豬圓環病毒病等，使豬群的病情複雜化，死亡率增加，經濟損失加重。本病是《生豬屠宰檢疫規程》法定檢疫對象的13種病之一，因此副豬嗜血桿菌病已逐漸成為世界範圍內影響養豬業的典型細菌性疾病。
目前，國內外主要通過抗生素藥物防治和疫苗免疫來防治此病。臨床上常用抗生素拌料或者注射的方式對整個豬群進行預防或治療，有時由於效果不好，還會加大劑量盲目濫用抗生素，不但導致該病原菌對許多抗生素產生耐藥性，還導致豬體內抗生素殘留，影響食品安全。雖然國內已研製出多價滅活苗，但由於副豬嗜血桿菌具有明顯地方性特徵，不同血清型之間的交叉保護率很低，因此商品疫苗的保護效果各豬場反映不一。綜上，基於該病在養豬業中的危害性及死亡率較高，且使用抗生素及疫苗均不能起到很好的防治效果，急需研究開發一種能夠很好的防治該病的安全性高、無耐藥、無殘留的藥物。
隨著人們健康意識的加強，毒副作用小、綠色無汙染無殘留的中藥製劑愈來愈受到人們的重視。中草藥屬於天然藥物，具有藥用、營養、來源廣、成本低、低毒低殘留、不易產生耐藥性等特點，且中藥含有多種有效成分，如生物鹼、有機酸、皂苷、多糖、倍半萜內酯、黃酮、植物甾醇類等，具有抗菌、抗病毒、消除炎症等作用，且能夠調節機體的免疫機能，提高豬對病原的抵抗能力。研究開展中草藥抗菌製劑的研製對於治療副豬嗜血桿菌及其他細菌性疾病的防治具有重要意義。
因此，本發明提供了一種組方合理、製備簡單、藥效強、安全性高且無殘留治療副豬嗜血桿菌病的中藥複方注射劑。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供治療副豬嗜血桿菌病的中藥複方注射劑及其製備方法,為實現上述目的，本發明採用以下技術方案：
一種治療副豬嗜血桿菌病的中藥複方注射劑，由以下述重量份的中藥材經水提醇沉法提取而製成的中藥注射液：金銀花6-10份，蒲公英6-10份，黃芩5-8份，白朮3-6份，甘草2-5份，所製備的注射液每1ml藥液相當於原生藥材3.0g。
進一步優選的，各組分重量比例為：金銀花8份，蒲公英8份，黃芩7份，白朮4份，甘草3份。
本發明還公開了一種治療副豬嗜血桿菌的中藥複方注射劑的製備方法，按照下述步驟進行：
（1）稱取金銀花，加入8-10倍量的15%乙醇回流提取2次，每次各1小時，合併提取液，減壓濃縮至相對密度為1.15-1.20的清膏，加乙醇使含醇量達65%，靜置24h，濾過，濾渣加乙醇使含醇量達65％，靜置24小時，濾過，合併兩次的濾液，減壓濃縮，所得濃縮液體積為總濾液的1/10，冷藏備用；
（2）稱取蒲公英、黃芩、白朮、甘草，與金銀花的藥渣合併，加入總重量4-10倍水，煎煮2次，每次1.5h，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.12-1.15的清膏，加乙醇使含醇量達75％，4℃靜置48小時，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，加入適量注射用水，調節ph值至約8.0；
（3）將步驟1)中濃縮液加入步驟2）的藥液中，並攪拌溶解，加入0.5％活性
炭，於60℃處理30分鐘，濾過，得濾液備用；
（4）濾液加入適量苯甲醇、亞硫酸氫鈉、吐溫-80，用8%氫氧化鈉溶液調節ph至6.5，並加注射用水適量，使得所製備的注射液每1ml藥液相當於原生藥材3.0g，攪拌均勻，濾過，灌封、滅菌，即得。
本發明中藥複方注射劑的使用方法：按照豬每1kg體重0.1ml，肌肉注射，每天1次，連用3-5天。
本發明組方中各組分藥理功效如下：
金銀花，味甘，性寒。具有清熱解毒、疏散風熱的功效；主治瘟病發熱、風熱感冒、咽喉腫痛、肺熱咳嗽、熱毒血痢、癰腫瘡毒等。近代藥理學研究顯示，金銀花是一種很強的廣譜抗菌中藥，還具有加強免疫機能的作用。
蒲公英，味苦、甘，性寒。具有清熱解毒、清熱利溼、疏肝洩熱、通利小便的功效，也具有很強的殺菌作用；主治熱毒癰腫、溼熱黃疸、熱淋澀痛、尿路閉塞等。
黃芩，味苦，性寒。具有清熱燥溼、瀉火解毒、止血的功效，也有很強的抗菌、抗炎抑菌的作用；主治肺熱咳嗽、胃腸溼熱、瀉痢、黃疸、便血、目赤腫痛、癰腫瘡毒等。
白朮，味甘、苦，性溫。具有利尿作用，能夠減少積液的產生；補氣健脾，提高機體抗病能力；另外還具燥溼化痰，祛風散寒，固表止汗、益氣安胎功效，以及抗菌、抗腫瘤的功效。主治脾氣虛弱、脾虛積滯、痰飲眩悸、自汗、水腫、風寒溼痺等。
甘草，味甘，性平，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，健脾和中，主要用於脾胃虛弱之腹脹納呆，乏力；調和諸藥，緩解某些藥物的毒性烈性，減輕藥物對機體的毒副作用。
配方中的金銀花、蒲公英均具有清熱解毒、疏肝洩熱、清肺熱咳嗽功效，且均具有較強的殺菌作用，且金銀花還能夠加強免疫機能，二藥聯用為君藥，清熱解毒、殺菌作用更強。黃芩、白朮、甘草為臣藥。黃芩清熱燥溼、瀉火解毒、治肺熱咳嗽，白朮燥溼化痰、祛風散寒、補氣健脾，二者兼具抗菌作用，一苦溫，一苦寒，合用可清熱燥溼，健脾安胎。白朮苦溫燥溼、能補脾陽、健運脾氣，甘草補氣和中、潤肺止咳，二藥合用具健脾和中、調補後天之本功效。甘草還可調和諸藥，緩解藥物的毒性烈性，減輕藥物對機體的毒副作用。以上諸藥協同增效，對副豬嗜血桿菌病具有較好的預防和治療效果。
具體實施例
以下結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明不僅限於這些實施例，在未脫離本發明宗旨的前提下，所作的任何改動均落在本發明的保護法範圍之內。
實施例1中藥複方注射劑配方
配方1：金銀花8kg，蒲公英8kg，黃芩7kg，白朮4kg，甘草3kg，共計30kg；
配方2：金銀花8kg，蒲公英8kg，黃芩6kg，白朮4kg，甘草4kg，共計30kg；
配方3：金銀花8kg，蒲公英7kg，黃芩7kg，白朮4kg，甘草4kg，共計30kg；
配方4：金銀花9kg，蒲公英8kg，黃芩7kg，白朮3kg，甘草3kg，共計30kg。
實施例2製備方法
（1）稱取金銀花，加入8-10倍量的15%乙醇回流提取2次，每次各1小時，合併提取液，減壓濃縮至相對密度為1.15-1.20的清膏，加乙醇使含醇量達65%，靜置24h，濾過，濾渣加乙醇使含醇量達65％，靜置24小時，濾過，合併兩次的濾液，減壓濃縮，所得濃縮液體積為總濾液的1/10，冷藏備用；
（2）稱取蒲公英、黃芩、白朮、甘草，與金銀花的藥渣合併，加入總重量4-10倍水，煎煮2次，每次1.5h，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.12-1.15的清膏，加乙醇使含醇量達75％，4℃靜置48小時，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，加入適量注射用水至5l，調節ph值至約8.0；
（3）將步驟1)中濃縮液加入步驟2）的藥液中，並攪拌溶解，加入0.5％活性
炭，於60℃處理30分鐘，濾過，得濾液備用；
（4）濾液加入100ml苯甲醇、20g亞硫酸氫鈉、50ml吐溫-80，用8%氫氧化鈉溶液調節ph至6.5，並加注射用水至10l，使得所製備的注射液每1ml藥液相當於原生藥材3.0g，攪拌均勻，濾過，灌封、滅菌，即得。
實施例3應用效果試驗
為了驗證本發明的中藥複方注射劑臨床使用安全性及對副豬嗜血桿菌病的治療效果，通過以下試驗進一步說明：
1急性毒性試驗
1.1預試驗
取20隻小鼠，按照序貫法進行預試驗，連續觀察7d，測得小鼠腹腔注射
100%致死量為34ml/kg，即102000mg/kg。
1.2ld50的測定
取體重20±2g健康小白鼠50隻，隨機分組，10隻/組，雌雄各半，人工照明12h，飼養觀察7d，於給藥前12h和給藥後4h內禁食不禁水；試驗時以適當劑量一次性腹腔注射，注射量為0.2ml/10g體重，組數為5，即距為0.7，觀察7d，記錄各組小鼠的中毒症狀，死亡時間和死亡數量，計算ld50。
1.3結果：腹腔注射後個別小鼠出現急性中毒症狀，有伏下少動、活動困難、不食、呼吸急促等現象，高劑量組給藥後0.5-5h內死亡；其他組也出現個別死亡，剖檢可見心臟腫大充血、肝臟充血、腸繫膜充血、腸水腫。8.1634mg/kg劑量組小鼠無幾乎不良反應。試驗結果經改良寇氏法計算，ld50=log-1【xm-d（∑p-0.5）】，ld50=16.076ml/kg。
表1半數致死量結果
2靶動物安全性試驗
2.1試驗動物
健康仔豬32頭，平均體重20±2kg。
2.2試驗方法
將仔豬隨機分為4組，每組8頭，在同一飼養條件下預飼7天，仔豬仍健康方可進行試驗。將第1、2、3組設為試驗組，分別肌肉注射本發明中藥注射劑0.1ml/kg、0.3ml/kg、0.5ml/kg，每天1次，連用5天；第四組為空白對照組，按照0.5ml/kg注射生理鹽水，每天1次，連用5天。對所有試驗仔豬用藥後連續觀察15天，記錄不良反應、採食飲水、精神狀態及體重變化等情況。
2.3試驗結果
與對照組比較，試驗1、2、3組仔豬均未發生明顯的不良反應，採食、飲水、精神狀態、活動均正常，平均體重增長差異不顯著。
3肌肉刺激性試驗
3.1試驗方法
取體重2kg左右的健康家兔4隻，雌雄各半，採用同體左右兩側自身對比法。剪去兔兩側後肢股四頭肌部位兔毛，消毒後一側注射本發明注射液0.2ml/(kg·只)，另一側注射等體積的生理鹽水作對照。48h後試驗家兔應健康如常，由耳緣靜脈注入空氣處死2隻，解剖取出注射部位肌肉，縱向切開，觀察注射部位肌肉組織的反應及藥液吸收情況，確定反應級數，檢查注射部位是否產生充血、水腫、硬塊、變性或壞死等刺激性反應。
表2刺激級數分類
結果：注射生理鹽水和本發明注射液的兩側均有輕微的腫脹，家兔處死解剖後未見股四頭肌有充血、硬塊以及變性壞死，刺激反應級數為1級，本發明注射液可作為肌肉注射劑使用。
4熱源檢查
4.1試驗方法
參照中華人民共和國2015年版獸藥典選擇適用家兔，並做好試驗前準備。
取適用的家兔3隻，在測定其正常體溫後的15min內從耳靜脈緩緩注入溫熱至約38℃的本發明中藥注射液（0.1ml/kg體重），然後每隔30min測定體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該家兔體溫的升高溫度。如3隻家兔中有1隻體溫升高0.6℃或0.6℃以上，或3隻家兔體溫升高均低於0.6℃，但體溫升高的總和達1.4℃或1.4℃以上，另取5隻家兔複試，檢查方法同上。
判斷標準：在初試3隻家兔中，體溫升高均低於0.6℃，並且3隻家兔體溫升高總和低於1.4℃；或在複試的5隻家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超過1隻，並且初試、複試合併8隻家兔的體溫升高總和為3.5℃或3.5℃以下，均認為供試品的熱原檢查符合規定。
在初試3隻家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超過1隻；或在複試的5隻家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超過1隻；或在初試、複試合併8隻家兔的體溫升高總和超過3.5℃，均認為供試品的熱原檢查不符合規。家兔升溫為負值時，均以0℃計。
4.2試驗結果
試驗初試的3隻家兔，體溫升高均低於0.6℃，且3隻家兔體溫升高總和低於1.4℃，認為本發明中藥注射液的熱原檢查符合規定。
5中草藥藥敏試驗
5.1病原菌的分離鑑定
在兩個疑似副豬嗜血桿菌發病豬場，無菌採集死亡6-8h內病豬心包腔滲出物、肝臟等接種於巧克力瓊脂培養基37℃培養48h。在巧克力瓊脂培養基上生長出邊緣整齊，小而透明的菌落，未見溶血現象。將此菌落塗片，革蘭氏染色，鏡檢有革蘭氏陰性大小不等、短小杆狀、球桿狀、纖細杆狀的細菌。挑取上述典型的菌落再連續培養2～3代，鏡檢時沒有雜菌，4℃保存待用。
衛星試驗：挑取巧克力瓊脂平板上的典型菌落，接種於2個兔鮮血瓊脂平板上，在其中一個兔鮮血平板上劃線接種兩行金黃色葡萄球菌，另一個作為對照，培養48h，在金黃色葡萄球菌劃線周圍生長呈明顯的「衛星現象」，離線越近，菌落越大，稍遠菌落較小。同時取試驗室保存的副豬嗜血桿菌標準株同法培養，出現同樣的「衛星現象」，說明分離的菌株與副豬嗜血桿菌標準株的培養特性一致。可以判定兩個豬場分離菌株均為副豬嗜血桿菌。
5.2牛津杯法藥敏試驗
藥液製備：本發明中藥注射液，生藥含量3g/ml；本發明優選組方中各單味藥按照相應劑量，單獨製備藥液，備用。
在「超淨臺」中，用經火焰滅菌的接種環挑取適量分離的副豬嗜血桿菌培養液接種於少量生理鹽水中，製成濃度為105cfu/ml的菌懸液，用滅菌棉拭子將菌懸液均勻緻密的塗布培養基表面，並以無菌操作將滅菌的牛津杯放置在培養基表面，輕壓使其與培養基接觸無空隙，每個平皿可放4-6隻牛津杯，數分鐘後，分別向各牛津杯中加入不同的待檢藥液，使藥液滿而不溢，並做好標記。置37℃培養8-18小時，觀察結果。
結果判斷標準：抑菌圈直徑（mm），20以上，極敏；15-20，高敏；10-14中敏；10以下，低敏；0，不敏。
5.3試驗結果
表3本發明中藥注射劑藥敏試驗結果
藥敏結果說明，本發明中藥注射液對副豬嗜血桿菌屬於高敏藥物，可以應用於臨床副豬嗜血桿菌病的治療。
6本發明藥物對臨床副豬嗜血桿菌病例的治療效果
2016.12月中旬，遼寧瀋陽遼中某豬場約200多頭保育豬（5-8周齡）發病，出現呼吸困難、咳嗽、消瘦、被毛粗亂的症狀，個別病豬關節腫大、跛行，個別行動困難，出現症狀到死亡較快。剖檢發現關節腔有粘液，胸腹積液，心臟表面纖維素性附著物，呈絨毛心，肺臟與胸腔膈肌粘連，肺葉結節並呈肉樣變，疑似副豬嗜血桿菌病。選擇該豬場病豬共80頭，分為四組進行治療試驗。同時實驗室進行細菌分離鑑定，並確診為副豬嗜血桿菌感染。
2017.1月，遼寧阜新地區一豬場，100多頭（6-8周齡）仔豬發病，病豬消瘦、食慾減退、氣喘、咳嗽、呼吸困難、鼻孔有粘液性分泌物，病情嚴重者出現症狀3d左右死亡。剖檢發現肺臟表面有大量纖維素性滲出物並與胸腔粘連，間質性肺炎並肉樣變，腹股溝淋巴結腫大出血，疑似副豬嗜血桿菌病。選擇該豬場病豬80頭，分為四組。同時實驗室進行細菌分離鑑定，並確診為副豬嗜血桿菌感染。
試驗分組及給藥：
表4試驗分組及給藥
試驗結果與分析：
表5本發明中藥注射劑治療效果-1
表6本發明中藥注射劑治療效果-2
註：感染對照組治癒頭數，是指豬未經給藥，個別症狀較輕，自愈。
試驗結果發現，本發明中藥注射液在遼寧地區2個副豬嗜血桿菌發病豬場進行治療，治癒率可達到85%以上,本發明藥物與頭孢噻呋鈉、恩諾沙星對比，治療效果更優。說明本發明中藥注射劑吸收快、療效迅速，對副豬嗜血桿菌有較好的治療效果。
綜上，本發明中藥注射劑的小鼠腹腔注射100%致死量為34ml/kg，按照本發明注射劑濃度3g/ml，0.4ml/20g體重腹腔注射，半數致死量ld50=16.076ml/kg；採用濃度3g/ml藥液對臨床分離的副豬嗜血桿菌進行藥敏實驗，抑菌圈大小為17mm，高度敏感；採用5倍臨床用量0.5ml/kg體重，進行靶動物豬的安全性試驗，每天1次，連用5天，試驗豬生理特徵表現正常。採用劑量0.1ml/kg體重治療臨床早期感染副豬嗜血桿菌的豬群進行治療，具有較好的效果，治癒率能達到85%以上。本發明中藥複方注射液，其組成均為純天然藥物，含有多種有效成分，對於病原體有良好的協同增效作用，不產生耐藥性，安全性高，無殘留及毒副作用，臨床使用效果確切，且製備工藝方便生產，可易於推廣使用。