海洋小單孢菌抗菌類群的分離檢出方法
2023-11-02 05:06:32
專利名稱：海洋小單孢菌抗菌類群的分離檢出方法
技術領域：
本發明涉及一種小單孢菌的分離檢出方法，尤其是一種能夠選擇性地把海洋小單孢菌抗菌類群分離檢出的方法。
背景技術：
小單孢菌(Micromonospora)是放線菌中的一個稀有屬，通常以較少的數量存在於土壤，海洋等生境中。近年來，由於該屬能夠產生各種抗菌抗腫瘤的活性物質而廣泛受到人們的注意。
楊宇容(楊宇容，雲南大學學報，1997，19(4)403-408，以下稱文獻1)報導了包括小單孢菌在內的稀有放線菌的分離技術，但採用的YIM培養基的分離數通常較低。李文均(李文均，國外醫藥抗生素素分冊，2002，23(1)18-22，以下稱文獻2)推薦了土壤風乾、苯酚處理和HV(+萘啶酸+衣酸)方法。上述文獻未涉及抗菌菌株的檢出技術。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能夠選擇性地分離海洋小單孢菌，並根據菌株的顏色特徵快速獲得抗菌類群的方法。
本發明的步驟為1)樣品製備樣品風乾15天以上，粉碎，過40～80目篩，110～120℃乾熱處理1～2h，稱取樣品溶解於相當於樣品5～15倍的無菌水中，加入終濃度為0.8％～1.2％的苯酚，35～45℃水浴20～30min，室溫靜置，上部菌懸液用於分離。
2)配置改良高氏一號培養基可溶性澱粉1％～3％，KNO30.5％～1.5％，K2HPO40.04％～0.06％，MgSO40.04％～0.06％，瓊脂1.5％～2％，餘為陳海水。常規高壓滅菌20～30min。
3)配置重鉻酸鉀(K7Cr2O7)溶液；放線菌酮溶液。分別用微孔濾膜過濾除菌。
4)倒平板取剛滅完菌的培養基，使培養基中的K7Cr2O7溶液和放線菌酮的終濃度分別為50～100ppm，倒平板。
5)小單孢菌分離取製備好的上述菌懸液於凝固的平板上，用無菌塗抹棒塗抹分散細胞，常溫倒置培養14～21天。
6)斜面轉接取分離平板上粉紅色的小菌落，轉接於伊英遜斜面，1周後塗散菌落，繼續培養7～14天即可獲得成熟的菌株。
原料氣一覽表
上表中，L表示「升」，m表示「米」，h表示「小時」。
採用上述工藝控制方法，可以使工件最表層滲入少量活性氮原子，從而增加工件最表層的淬透性以減少非馬氏體組織。
為進一步說明本發明的上述目的、工藝特點和效果，以下將對本發明進行詳細的描述。
(4)具體實施方式
以下將對本發明非馬氏體的工藝控制方法的技術方案和實施進行詳細描述。
滲碳淬火工件進爐經排氣區到滲碳區，由於加熱速度和周圍氣氛的關係，在到達滲碳區前，工件表層易形成氧化膜，此種晶界氧化是造成非馬氏體組織的重要原因之一，即氣氛中的H2O和CO2分解形成的氧原子在最外層形成氧化物後，接著沿晶界擴散，晶粒內的合金元素向晶界的氧擴散，並在此形成氧化物，造成氧化物附近基體合金元素減少，從而淬透性降低，易形成非馬氏體組織。因此，本發明的非馬氏體的工藝控制方法，其工序如下(1)裝架，並去除工件的鏽斑；(2)清洗，去除工件油漬、表面附著物；(3)熱爐內預先排氣，按表一的原料氣一覽表所列的參數在爐內預先排氣，注意保持原料氣純度、氨氣的乾燥度和流量；(4)熱爐進工件；(5)對上述工件進行滲碳；(6)在熱爐內通15至60分鐘的氨氣，注意氨氣的乾燥度和流量，此工抗菌活性測定的比較結果。
表4不同檢出技術獲得小單孢菌的抗菌比例(測定方法擴散法)
具體實施方式
實施例11)製備樣品樣品風乾15天，粉碎，過50目篩，120℃乾熱處理1.2h，稱取5g溶解於45ml無菌水中(動植物體和腐爛植物殘體勻漿機勻漿處理)，加入終濃度為1％的苯酚，40℃水浴(間歇振蕩)20min，室溫靜置5min，上部菌懸液用於分離。
2)配置改良高氏一號培養基可溶性澱粉2％，KNO30.5％，K2HPO40.04％，MgSO40.06％，瓊脂1.5％，餘陳海水。121℃滅菌25min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放線菌酮0.5％溶液。分別用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。
4)倒平板取剛滅完菌的培養基，使培養基中的K7Cr2O7溶液和放線菌酮的終濃度分別為80ppm、60ppm，倒平板。
5)小單孢菌分離取0.2mL製備好的上述菌懸液於凝固的平板上，用無菌塗抹棒塗抹分散細胞，26℃倒置培養20天。
6)斜面轉接取分離平板上粉紅色的小菌落，轉接於伊英遜斜面，一周後塗散菌落，繼續培養10天即可獲得成熟的菌株。
7)培養成熟後，挑取帶紫紅色的菌株，75％的這類菌株中具有抗菌活性。
實施例21)製備樣品樣品風乾18天，粉碎，過80目篩，115℃乾熱處理1.5h，稱取5g溶解於25ml無菌水中(動植物體和腐爛植物殘體勻漿機勻漿處理)，加入終濃度為0.8％的苯酚，45℃水浴(間歇振蕩)25min，室溫靜置10min，上部菌懸液用於分離。
2)配置改良高氏一號培養基可溶性澱粉3％，KNO31.5％，K2HPO40.05％，MgSO40.05％，瓊脂2％，餘陳海水。121℃滅菌20min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放線菌酮0.5％溶液。分別用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。
4)倒平板取剛滅完菌的培養基，使培養基中的K7Cr2O7溶液和放線菌酮的終濃度分別為50ppm、100ppm，倒平板。
5)小單孢菌分離取0.2mL製備好的上述菌懸液於凝固的平板上，用無菌塗抹棒塗抹分散細胞，25℃倒置培養16天。
6)斜面轉接取分離平板上粉紅色的小菌落，轉接於伊英遜斜面，一周後塗散菌落，繼續培養7天即可獲得成熟的菌株。
7)培養成熟後，挑取帶紫紅色的菌株，80％的這類菌株中具有抗菌活性。
實施例31)製備樣品樣品風乾20天，粉碎，過40目篩，118℃乾熱處理2h，稱取5g溶解於70ml無菌水中(動植物體和腐爛植物殘體勻漿機勻漿處理)，加入終濃度為1.2％的苯酚，35℃水浴(間歇振蕩)30min，室溫靜置8min，上部菌懸液用於分離。
2)配置改良高氏一號培養基可溶性澱粉1％，KNO31％，K2HPO40.05％，MgSO40.04％，瓊脂1.5％，餘陳海水。121℃滅菌30min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放線菌酮0.5％溶液。分別用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。
4)倒平板取剛滅完菌的培養基，使培養基中的K7Cr2O7溶液和放線菌酮的終濃度分別為100ppm、50ppm，倒平板。
5)小單孢菌分離取0.2mL製備好的上述菌懸液於凝固的平板上，用無菌塗抹棒塗抹分散細胞，24℃倒置培養21天。
6)斜面轉接取分離平板上粉紅色的小菌落，轉接於伊英遜斜面，一周後塗散菌落，繼續培養12天即可獲得成熟的菌株。
7)培養成熟後，挑取帶紫紅色的菌株，70％的這類菌株中具有抗菌活性。
實施例41)製備樣品樣品風乾25天，粉碎，過60目篩，110℃乾熱處理1.3h，稱取5g溶解於40ml無菌水中(動植物體和腐爛植物殘體勻漿機勻漿處理)，加入終濃度為1％的苯酚，40℃水浴(間歇振蕩)25min，室溫靜置4min，上部菌懸液用於分離。
2)配置改良高氏一號培養基可溶性澱粉2.5％，KNO31％，K2HPO40.06％，MgSO40.05％，瓊脂2％，餘陳海水。121℃滅菌25min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放線菌酮0.5％溶液。分別用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。
4)倒平板取剛滅完菌的培養基，使培養基中的K7Cr2O7溶液和放線菌酮的終濃度分別為70ppm、80ppm，倒平板。
5)小單孢菌分離取0.2mL製備好的上述菌懸液於凝固的平板上，用無菌塗抹棒塗抹分散細胞，26℃倒置培養14天。
6)斜面轉接取分離平板上粉紅色的小菌落，轉接於伊英遜斜面，一周後塗散菌落，繼續培養14天即可獲得成熟的菌株。
7)培養成熟後，挑取帶紫紅色的菌株，75％的這類菌株中具有抗菌活性。
實施例51)樣品製備海洋底泥樣品風乾15天，粉碎，過50目篩，120℃乾熱處理1h，稱取5g溶解於45ml無菌水中(動植物體和腐爛植物殘體勻漿機勻漿處理)，加入終濃度為1％的苯酚，40℃水浴(間歇振蕩)20min，室溫靜置5min，上部菌懸液用於分離。
2)配置改良高氏一號培養基可溶性澱粉2％，KNO31％，K2HPO40.05％，MgSO40.05％，瓊脂2％，陳海水95％。121℃滅菌20min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放線菌酮0.5％溶液。分別用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。
4)倒平板取剛滅完菌的培養基，每100mL培養基分別加入1mL的0.5％K7Cr2O7溶液和1mL的0.5％溶液。搖勻，倒平板。
5)小單孢菌分離取0.2mL製備好的上述菌懸液於凝固的平板上，用無菌塗抹棒塗抹分散細胞，26℃倒置培養16天。
6)斜面轉接取分離平板上粉紅色的小菌落，轉接於斜面，一周後塗散菌落，繼續培養10天即可獲得成熟的菌株。
7)培養成熟後，挑取帶紫紅色的菌株用於抗菌活性的研究，80％的這類菌株中具有抗菌活性。
實施例61)樣品製備海藻類植物樣品風乾30天，粉碎，過40目篩，120℃乾熱處理1.5h，稱取5g溶解於30ml無菌水中(動植物體和腐爛植物殘體勻漿機勻漿處理)，加入終濃度為1％的苯酚，50℃水浴(間歇振蕩)30min，室溫靜置5min，上部菌懸液用於分離。
2)置改良高氏一號培養基可溶性澱粉3％，KNO30.5％，K2HPO40.05％，MgSO40.05％，瓊脂2％，陳海水50％，自來水44.5％。121℃滅菌20min。
3)置K7Cr2O70.5％溶液；放線菌酮0.5％溶液。分別用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。
4)倒平板取剛滅完菌的培養基，每100mL培養基分別加入2mL的0.5％K7Cr2O7溶液和2mL的0.5％溶液。搖勻，倒平板。
5)單孢菌分離取0.2mL製備好的上述菌懸液於凝固的平板上，用無菌塗抹棒塗抹分散細胞，24℃倒置培養21天。
6)斜面轉接取分離平板上粉紅色的小菌落，轉接於斜面，一周後塗散菌落，繼續培養10天即可獲得成熟的菌株。
7)培養成熟後，挑取帶紫紅色的菌株用於抗菌活性的研究，75％的這類菌株中具有抗菌活性。
權利要求
1.海洋小單孢菌抗菌類群的分離檢出方法，其特徵在於其步驟為1)樣品製備樣品風乾15天以上，粉碎，過40～80目篩，110～120℃乾熱處理1～2h，稱取樣品溶解於相當於樣品5～15倍的無菌水中，加入終濃度為0.8％～1.2％的苯酚，35～45℃水浴20～30min，室溫靜置，上部菌懸液用於分離；2)配置改良高氏一號培養基可溶性澱粉1％～3％，KNO30.5％～1.5％，K2HPO40.04％～0.06％，MgSO40.04％～0.06％，瓊脂1.5％～2％，餘為陳海水；常規高壓滅菌20～30min；3)配置重鉻酸鉀(K7Cr2O7)溶液；放線菌酮溶液。分別用微孔濾膜過濾除菌；4)倒平板取剛滅完菌的培養基，使培養基中的K7Cr2O7溶液和放線菌酮的終濃度分別為50～100ppm，倒平板；5)小單孢菌分離取製備好的上述菌懸液於凝固的平板上，用無菌塗抹棒塗抹分散細胞，常溫倒置培養14～21天；6)斜面轉接取分離平板上粉紅色的小菌落，轉接於伊英遜斜面，1周後塗散菌落，繼續培養7～14天即可獲得成熟的菌株；7)培養成熟後，挑取帶紫紅色的菌株。
2.如權利要求1所述的海洋小單孢菌抗菌類群的分離檢出方法，其特徵在於在步驟1中，樣品風乾粉碎後過40～50目篩。
3.如權利要求1所述的海洋小單孢菌抗菌類群的分離檢出方法，其特徵在於在步驟2中K2HPO40.05％，MgSO40.05％，瓊脂2％，餘為陳海水。
4.如權利要求1所述的海洋小單孢菌抗菌類群的分離檢出方法，其特徵在於在步驟3中配置K7Cr2O70.5％溶液；放線菌酮0.5％溶液，分別用0.2μm微孔濾膜過濾除菌。
全文摘要
涉及一種能夠選擇性地把海洋小單孢菌抗菌類群分離檢出的方法。其步驟為製備樣品，取上部菌懸液用於分離；配置培養基；配置重鉻酸鉀(K
文檔編號C12Q1/04GK1626670SQ200310124158
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月12日 優先權日2003年12月12日
發明者黃耀堅, 鄭忠輝, 徐慶妍, 宋思楊, 蘇文金 申請人:廈門大學