歐洲夾竹桃提取物的製作方法
2023-11-02 07:13:12
專利名稱：歐洲夾竹桃提取物的製作方法
技術領域：
本發明涉及幹擾素(ifn)誘導物的領域-一組特殊的潛在抗病毒化合物，特別夾竹桃(Nerium Oleander)特殊提取物、其成分和組合物，組合物含歐洲夾竹桃和洋甘草(Glycyrrhiza glabra)提取物的固定組合、剌五加(Eleutherococcussenticosus)提取物，也涉及用物質的特徵信息傳送裝置製備提取物的方法。
2.本領域的一般背景和狀態IFN-s賦予細胞抗病毒狀態的能力是它們的定義活性以及基本性質。IFNs對於高等脊椎動物存活是必需的，因為它們提供抗病毒感染的早期防線-免疫應答前幾小時到幾天。此重要作用已通過缺失IFNα/β和γ受體的小鼠對病毒感染異常敏感得到證明。多種途徑參與抗不同類型病毒和涉及不同病毒的多種補償防禦機制。幹擾素作用的抗病毒機制包括dsRNA-依賴的蛋白激酶(PKR)、2-5A合酶和Mx蛋白途徑。PKR途徑介導信號轉導、蛋白質合成抑制和轉錄控制，2-5A系統途徑-RNA切割，Mx蛋白幹擾病毒複製、削弱流感發展和其它在病毒轉錄水平和其它步驟的負鏈RNA病毒。
病毒複製中任何階段似乎被IFNs抑制，包括進入和/或脫殼(猿病毒40、逆轉錄病毒)、轉錄(流感病毒、皰疹性口炎病毒)、RNA穩定性(細小核糖核酸病毒)、翻譯起始(呼腸孤病毒、腺病毒、疫苗)、成熟、裝配和釋放(逆轉錄病毒)。與抗病毒活性一起，IFNs抑制細胞生長和控制細胞凋亡。
γ-IFN對免疫系統的效果包括在多種不同細胞類型中誘導MHC II型蛋白表達的能力，從而促進CD4+T細胞反應的發展。它進一步包括產生活化巨噬細胞，它是先天和適應性免疫反應中的關鍵效應細胞群，參與殺死微生物靶。γ-IFN也調節體液免疫，通過調節特異T輔助細胞亞群的發展或直接在B細胞水平和它們的功能上-增殖的發展、免疫球蛋白分泌和IG重鏈轉換。
IFN誘導物代表一組特殊的潛在抗病毒化合物。它們的主要需求是(1)高IFN-誘導活性，(2)沒有od副作用，(3)廣範圍的抗微生物活性，(4)廣泛的治療安全性和(5)在水和生物液體中良好的溶解性。IFN誘導物可用於抗很多不同的感染和情況。IFN誘導物在不同細胞和器官中刺激IFN生成，確定它們在B肝和C肝、流感、鼻病毒和腸道病毒感染、腦炎、狂犬病等中應用的策略。
已證明洋甘草提取物的活性成分甘草皂苷誘導幹擾素形成。觀察到甘草皂苷抗牛痘、單純皰疹I、新城病、皰疹性口炎和流感A病毒的抗病毒活性。
一些出版物顯示歐洲夾竹桃葉提取物具有抗腫瘤、免疫調節和抗的菌活性，它由於存在強心苷而眾所周知為劇毒植物。這些研究結果對於這些作用引起的功效和主要作用成分有很大爭論。
如美國專利5,135,745《夾竹桃屬提取物、製備方法和其使用》(Extracts ofNerium species，methods of preparation，and use therefore)所述，歐洲夾竹桃的水提取物用於緩解動物中的細胞增殖性疾病。專利揭示了富含多糖的夾竹桃屬提取物，所含免疫活性多糖用於治療哺乳動物中的細胞增殖性疾病，其中活性多糖包括酸性同聚半乳醛聚糖或阿拉伯-半乳醛聚糖。專利也揭示製備夾竹桃屬的方法，其所含免疫活性多糖用於緩解哺乳動物中的細胞增殖性疾病，通過在無機溶劑中煮沸植物物質幾小時以獲得約1010密度。專利進一步揭示緩解細胞增殖性疾病(惡性、腺癌、牛皮癬)的方法，通過施用(腸胃外、皮下、肌肉內、腹膜內、腔內、靜脈內、經皮、鼻咽或黏膜吸收)富含多糖的夾竹桃屬提取物。
然而，從未科學證明歐洲夾竹桃提取物和其成分可具有IFN-誘導和/或抗病毒活性。夾竹桃屬從未用於結合其它草藥，特別是甘草提取物用於治療任何疾病。現有技術中所述製備夾竹桃提取物的方法不包括用物質的特徵信息傳送技術治療以增強終產物的活性。
幾乎不令人驚訝，病毒反擊，不僅針對一般的宿主防禦，而且針對特定IFN系統，通過新機制和經合成新蛋白及模擬並因此幹擾宿主系統的蛋白來攪亂宿主系統。γ-IFN主要在T細胞中產生。
許多因子參與T細胞的活化和抑制。因此，可能有多種T細胞誘導IFN的模式。研究日益顯示固定組合早有治療病毒疾病的大於預期的醫藥益處的草藥，這是由於成分組合有協同效果且作用於不同的分子靶。在一些病例中，草藥的醫藥價值可能完全是由於物質組合且不能單獨通過一種或兩種「活性」成分複製。一些植物的複雜組合是傳統醫學的一般方法，特別是東方醫學如印度草藥療法和印度部分地區行醫的制度(Unani)、中國和日本的Kampo。
遵循此觀念，本專利申請揭示了兩種植物提取物的固定組合的功效，提取物根據它們的活性成分標準化甘草皂苷(洋甘草)和多糖(歐洲夾竹桃)。專利申請進一步揭示物質的特徵信息傳送技術對提取物的IFN-誘導活性的潛在效果[Gotovski Yu等.，俄羅斯專利2070405、2070406、2065297，1996]。此外，專利申請揭示了全血細胞培養(IFN-誘導活性)和人鱗狀癌HEp-2細胞的體外實驗，人鱗狀癌HEp-2細胞是由小鼠腦心肌炎病毒(殺病毒效果)感染的。
發明的概述本發明涉及各種實施方案。一方面，發明涉及的殺病毒組合物包含γ-IFN-誘導有效量的夾竹桃提取物，用直接傳送γ-IFN-信息特徵加工提取物和通過物質的特徵信息傳送裝置傳送人體組織特異反應病毒的信息特徵。
病毒可以是易受幹擾素存在攻擊的任何病毒。特別是，病毒可以是甲、乙、丙或丁型肝火病毒、或HIV病毒、或引起麻疹的病毒。
產生上面組合物時，提取物可獲得自植物的任何部分。特別是，提取物產生自碎葉、莖和/或花。
在發明的一方面，γ-IFN信息特徵和傳送裝置可以是Transfer-P。
在發明的另一方面，發明涉及製備殺病毒組合物的方法，組合物包含γ-IFN-誘導有效量的歐洲夾竹桃提取物，方法包括使歐洲夾竹桃提取物接觸直接傳送γ-IFN-信息特徵和人體組織對病毒特異反應的信息特徵的傳送，通過物質的特徵信息傳送裝置。在此方法中，病毒尤其可以是甲、乙、丙或丁型肝炎、HIV、或引起麻疹的病毒。更特別的是，Transfer-P裝置可用於加強溶液以形成有效的抗病毒組合物。
在發明的另一個實施方案，發明涉及的殺病毒組合物包含γ-IFN-誘導有效量的歐洲夾竹桃和洋甘草提取物。在此組合物中，歐洲夾竹桃提取物可獲得自碎葉、莖和/或花，洋甘草提取物可獲得自根，而植物的其它部分也可作為提取物來源。
上面的組合物也可包括已加工的提取物，用直接傳送γ-IFN-信息特徵加工提取物和通過物質的特徵信息傳送裝置和傳送人體組織特異反應病毒的信息特徵。病毒尤其可以是甲、乙、丙或丁型肝炎、HIV、或引起麻疹的病毒。在此組合物中，γ-IFN-信息特徵和傳送裝置可以是Transfer-P。
在發明的另一方面，發明涉及製備組合物的方法，包括使歐洲夾竹桃和/或洋甘草提取物接觸直接傳送γ-IFN-信息特徵和人體組織對病毒特異反應的信息特徵的傳送，通過物質的特徵信息傳送裝置。病毒尤其可以是甲、乙、丙或丁型肝炎、HIV或引起麻疹的病毒，裝置尤其可以是Transfer-P。
發明也涉及治療病毒感染的方法，包括施用任何上述組合物給需要的人。病毒感染尤其可由甲、乙、丙或丁型肝炎、HIV或麻疹病毒引起。
發明的這些和其它目的從下列發明描述、參考附圖和所附權利要求中更能充分理解。
附圖的概述從下面給出的詳細描述中更能充分理解本發明，附圖僅用於闡明目的，因而不限制本發明，其中
圖1顯示歐洲夾竹桃特殊提取物的HPLC。細節示於圖上。框插入表示多糖MW校準曲線。
圖2顯示NO多糖部分PS-I、PSII和PS-III水解產物的TMS-酯。鑑定的峰值如下1-三羥基丁酸；2-核糖；3-阿拉伯糖；4-木糖；5-來蘇糖；6-甘露糖；7-塔羅糖；8-山梨糖醇；9-葡萄糖；10-半乳糖醛酸；11-未鑑定化合物X。插入框表示化合物X-TMS酯的質譜。
圖3顯示水解(AS-1)前(A)和後(B)的FC-NO∶GG提取物-TMS衍生物的層析譜鑑定總離子電流(Total Ion Current)模式中的峰。
圖4顯示NOE、GGE、NOSE、FC-NO∶GG、FC-NO∶GG-SE、NO-PS-I、NO-PS-II、NO-PS-III在人全血細胞體外培養中對γ-IFN(pg/ml)誘導的效果。
圖5顯示NO、GG、ES、FC-NO∶GG、FC-NO∶GG-SE、FC-NO∶GG∶ES-SE和FC-NO∶GG∶ES-SE在人全血細胞體外培養中對γ-IFN(pg/ml)誘導的效果。
較佳實施方案的詳細描述在本專利申請中，「a」和「an」用於指單數和複數對象。
本發明涉及新的γ-幹擾素-誘導劑，更特別是歐洲夾竹桃提取物、其活性成分和與洋甘草提取物的固定組合，也涉及用物質的特徵信息傳送技術製備它們的方法，用於增強提取物活性並因而用作潛在抗病毒藥物。
一般，為獲得夾竹桃屬提取物，水抽提空氣乾燥的葉、花和莖，在高溫乾燥幾小時(足以分解毒性強心苷)，根據美國專利號5,135,745使用，該專利揭示了提取物本身以及施用(腸胃外、皮下、肌肉內、腹膜內、腔內、靜脈內、經皮、鼻咽或黏膜吸收)此提取物用於緩解細胞增殖性疾病(惡性、腺癌、牛皮癬)。
本發明涉及製備歐洲夾竹桃葉特殊提取物的新方法，提取物表現出新特性，特別是IFN誘導活性。此特殊提取物與美國專利提取物所述顯著不同，製備提取物沒有用物質的特徵信息傳送技術任何處理，特別是評估IFN誘導活性的體外實驗。
這些提取物的活性成分顯示是50到500 KDa多糖，含三羥基丁酸、核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、甘露糖、塔羅糖、山梨糖醇、葡萄糖和半乳糖醛酸。
發明的另一個目標是歐洲夾竹桃葉與洋甘草根的固定組合，能用於治療哺乳動物的病毒疾病，它在全血細胞培養(IFN-誘導活性)和人鱗狀癌HEp-2細胞的體外實驗表現出γ-IFN誘導和殺病毒活性，人鱗狀癌HEp-2細胞是由小鼠腦心肌炎病毒(殺病毒效果)感染的。這些歐洲夾竹桃與洋甘草提取物的固定組合(FC-NO∶GG)活性高於各單獨成分(NOE和GGE)。特殊提取物的固定組合(FC-NO∶GG-SE)通過物質的特徵信息傳送裝置的處理獲得，活性顯著高於樣品FC-NO∶GG(沒有這種處理)。
為確定患病毒疾病即乙或C型肝炎的病人是否獲益於以本發明提取物為基礎的治療，4個診斷為急性乙和丙型肝火的病人用標準化特殊提取物的固定組合(FC-NO∶GG-SE)處理。液體提取物根據多糖含量(0.7-1.1mg/ml)、甘草皂苷(0.85-1.15mg/ml)和物質的特徵信息來標準化，提取物每天口服劑量為1-1.5ml×2，服用1.5-6個月。在治療結束時，所有4種病例中實驗室測試的HbsAg(n＝2)和HCV PCR(n＝2)均為負。
本發明不限於本文所述特定實施方案的範圍。確實，根據上面描述和附圖，除了本文所述的發明的多種修改對於本領域技術人員是顯然的。這些修改屬於所附權利要求範圍內。提供下列實施例用於闡述本發明，而不是限制。
實施例實施例1-製備歐洲夾竹桃L.提取物(NOE)加入約10g空氣乾燥、切成條的歐洲夾竹桃葉、分枝和花到200ml圓底燒瓶中的100ml蒸餾水，加熱至100℃並保持沸騰3小時。沸騰中，加入蒸餾水以維持恆定水位。沸騰後，使混合物溫度為20-25℃，用粗糙濾器過濾以和植物物質分離並從顆粒物質中取出。用蒸餾水使濾液體積至100ml並無菌過濾到無菌燒瓶中，用孔大小為0.45μM和0.22μM的微孔濾器。
技術要求總糖含量-3.9-4.1mg/ml，總多糖含量-1.4-1.6mg/ml，幹渣-10-12mg/ml。
實施例2.製備歐洲夾竹桃L.特殊提取物(NOSE)加入約10g空氣乾燥、切成條的歐洲夾竹桃葉、分枝和花到200ml圓底燒瓶中的100ml蒸餾水，加熱至100℃並保持沸騰3小時。沸騰中，加入蒸餾水以維持恆定水位。沸騰後，使混合物溫度為20-25℃，用粗糙濾器過濾以和植物物質分離並從顆粒物質中取出。用蒸餾水使濾液體積至100ml並無菌過濾到無菌燒瓶中，用孔大小為0.45μM和0.22μM的微孔濾器。無菌過濾後，物質的特徵信息傳送「Transfer-P」(Imedis-BRT Ltd.，Moscow)設備的5個活性電極在填充線(fillingline)上。在直接傳送γ-IFN-信息特徵和人體組織對一些病毒組(甲、乙、丙或丁型肝炎、HIV或麻疹)特異反應的信息特徵傳送上安裝設備，用裝有PaulyShmidt的「物質生物共振資料庫」的「Imedis生物共振」軟體(Imedis-BRT Ltd.，Moscow)。溶液4℃貯存1年。
Transfer-P裝置購自Imedis-BRT Ltd.，Moscow。Transfer-P轉移順勢療法製劑性質的能量-信息轉移(如需要可反向)到能改變效能的載體上。此裝置不需計算機且不能連接到計算機。此裝置不限於任何特定維數，Transfer-P裝置裝入小的塑料底盤(157×95×40mm)。提供裝置所有需要的電線。裝置重量僅為0.15kg。Transfer-P裝置沒有電源。
Transfer-P裝置允許一個人完成物質性質的能量-信息直接轉移到中性載體上，或反向；改變順勢療法的效能並因而用R.Voll藥物測試單獨選擇的效能；完成順勢療法遠程無接觸的影響病人且檢查它們的效果；轉移到大體積液體載體(水、生理溶液、醇等)。
技術要求總糖含量-3.9-4.1mg/ml，總多糖含量-1.4-1.6mg/ml，幹渣-10-12mg/ml。
實施例3.分離歐洲夾竹桃多糖(NOPS)將20μl NOE應用到磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物HPLC柱的Shodex SugerIonpak K-804離子交換樹脂凝膠(Showa Denko K.K.，Japan)，用水洗脫柱以獲得PS部分I-III，圖1。這些部分通過它們的TMS-衍生物的GC-MS進一步確定它們的單糖組成特徵。
實施例4.製備洋甘草提取物(GGE)洋甘草提取物(GGE)如上面NOE(實施例1)所述製備。
技術要求甘草皂苷含量-2.0-2.5mg/ml，總糖含量-4.3-4.5mg/ml，總多糖含量-2.8-3.0mg/ml，幹渣-12-14 mg/ml。
實施例5.製備歐洲夾竹桃和洋甘草提取物的固定組合(FC-NO∶GG-SE)加入約5g空氣乾燥、切成條的歐洲夾竹桃葉、分枝和花以及5g空氣乾燥、切成條的洋甘草根到200ml圓底燒瓶中的100ml蒸餾水，加熱至100℃並保持沸騰3小時。沸騰中，加入蒸餾水以維持恆定水位。沸騰後，使混合物溫度為20-25℃，用粗糙濾器過濾以和植物物質分離並從顆粒物質中取出。用蒸餾水使濾液體積至100ml並無菌過濾到無菌燒瓶中，用孔大小為0.45μM和0.22μM的微孔濾器。無菌過濾後，物質的特徵信息傳送「Transfer-P」(Imedis-BRT Ltd.，Moscow)設備的5個活性電極在填充線上。在直接傳送γ-IFN-信息特徵和人體組織對一些病毒組(甲、乙、丙、丁型肝炎、麻疹)特異反應的信息特徵傳送上安裝設備，「Imedis生物共振」軟體裝有PaulyShmidt的「物質生物共振資料庫」(Imedis-BRTLtd.，Moscow)。
技術要求總糖含量-5.0-5.4mg/ml，總多糖含量-1.4-1.6mg/ml，甘草皂苷-1.15mg/ml，幹渣-13-15mg/ml。游離和結合的單糖通過它們的TMS-衍生物的GC-MS確定特徵，圖2。
實施例6.提取物的IFN-γ誘導活性測試樣品用於進一步稀釋測試樣品的貯存液中提取物和它們成分的濃度為(a)10.4mg/ml歐洲夾竹桃提取物(NOE)與1.5mg/ml歐洲夾竹桃多糖(NOPS)；(b)13.9mg/ml洋甘草提取物(GGE)與2.9mg/ml洋甘草PS和2.3mg/ml甘草皂苷；(c)13.9mg/ml固定組合(FC)的NOE∶GGE與1.2mg/ml PS和1.15mg/ml甘草皂苷；(d)13.9mg/ml固定組合的歐洲夾竹桃和洋甘草特殊提取物FC-NO∶GG-SE與1.2mg/ml PS和1.15mg/ml甘草皂苷；(e)10.4mg/ml歐洲夾竹桃特殊提取物(NOSE)與1.5mg/ml NOPS；(f)0.2mg/ml NO-PS-I；(g)0.2mg/ml NO-PS-II；和(h)1.0mg/ml NO-PS-III。
然後溶液(a)、(b)、(e)、(f)和(g)用水稀釋10倍(1∶9)，溶液(c)、(d)稀釋5倍(1∶4)，以獲得稀釋(1∶10)，具有甘草皂苷和PS與所有其它樣品(a)-(g)相等的濃度。從這些溶液中製備測試樣品的其它稀釋度(1∶100、1∶1000和1∶10000)。
培養基中提取物和它們的成分的終濃度比測試樣品小10倍，因為1體積測試樣品加入9體積培養基。
培養過程研究了提取物和它們的成分在全血細胞培養中對IFN-γ生成的效果，如Wang等.，2000所述。健康供體(n＝6)的全血收集到4ml無菌肝素化(肝素鋰)真空抽血管(Vacuete，Greiner)。100μl血樣品加入12孔組織培養平板(Falcon)的各孔中，孔含800μl培養基(RPMI-1640培養基，含2ml L-穀氨醯胺、1mM丙酮酸鈉、100 IU青黴素和鏈黴素以及10％胎牛血清)和100μl測試溶液，溶液具已知濃度的活性成分甘草皂苷和多糖(PS)。細胞在含6％CO2的增溼器空氣中培養72小時，在有12孔板適配器的JOUAN BR4離心轉子中以3000rpm離心15分鐘。收集無細胞的培養物上清並貯存於-80℃直到使用。
IFN-γ測定細胞培養物上清中的IFN-γ含量用商業購買的人幹擾素-γTiterZymeEIA試劑盒(Assay Designs，Inc.，MI，USA)如說明書圖表所述確定。製成IFN-γ標準校準曲線，IFN-γ濃度用450nm的光密度數據自動計算，數據通過多通道微型板-讀數器PR-2100(Sanofi，Pasteur)獲得。所有測量一式兩份進行，記錄平均數和標準偏差。
結果所有測試樣品在1∶100稀釋時有活性(實際最終稀度1∶1000)，圖3。這對應於10到30μg/ml提取物濃度、多糖-1.5到3μg/ml和甘草皂苷-2.2μg/ml(2.7μM)。在較低濃度，它們失活，在較高濃度-細胞毒性。圖3顯示歐洲夾竹桃提取物(NOE和NOSE)刺激γ-IFN生成，多糖I-III是這些提取物的活性成分。圖3也顯示歐洲夾竹桃與洋甘草提取物的固定組合(FC-NO∶GG)活性高於各單獨成分(NOE和GGE)。此外，圖3顯示使用物質的特徵信息傳送技術在全血體外測試中顯著增強IFN誘導。測試樣品NOSE和FC-NO∶GG-SE通過物質的特徵信息傳送裝置的處理獲得，活性顯著高於樣品NOE和FC-NO∶GG(沒有這種處理)；所有這些樣品具有相同濃度的活性成分。
實施例7.FC-NO∶GG提取物的抗病毒活性材料和方法多種方法可用於體外和體內抗病毒篩選植物物質(Vlietinck和VandenBerghe，1991)。在我們的研究中，我們使用前述用於腦炎病毒的方法(Fokina等.，1991)。
使用下列材料具Earl溶液的Eagle生長培養基，含10％胎牛血清(FBS)，購自Chumakov’sInstitute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis，Moscow，Russia。0.25％胰蛋白酶溶液。Chumakov’s Institute of Poliomyelitis and ViralEncephalitis，Moscow，Russia。
0.02％依地酸鈣鈉(Versenate)溶液。Chumakov’s Institute of Poliomyelitisand Viral Encephalitis，Moscow，Russia。
胎牛血清(FBS)。Chumakov’s Institute of Poliomyelitis and ViralEncephalitis，Moscow，Russia。使用前各批FBS在56℃滅活30分鐘。
維持培養基-Eagl e基本培養基，含2％胎血清。
Goriaew血球計(Krasnogvardeec Company，Sankt-Petersburg，Russia)。
50ml和250ml小瓶(Costar Co.)0.02-1 ml可調整自動單通道和多通道取樣器(Labsystems，Finland)。
96孔MaxiSorp Nunc微型板-COSTAR。
0.025ml多通道取樣器(具有定劑量頭)。
0.025ml和0.1ml取樣器。
有CO2供應的恆溫器。
用於稀釋的無菌容器和移液管。
具已知濃度的病毒懸浮液。
方法傳代和維持人鱗狀癌HEp-2細胞(高加索，喉)及小鼠胚胎細胞NIH 3T3(NIHSwiss)，培養。
再播種細胞從含細胞培養物的小瓶中倒出生長培養基；加入0.25％胰蛋白酶溶液(或等體積0.25％胰蛋白酶溶液和1∶5000依地酸鈣鈉溶液到小瓶。0.5ml溶液足夠用於25cm2表面的小瓶。溫和搖動小瓶使溶液均勻分布在細胞表面上；維持小瓶貯存於36℃，除非所有細胞從生長表面分離(通過顯微鏡檢測控制)細胞重懸浮於生長培養基(4.5ml每25cm2表面的小瓶)，忽略胰蛋白酶作用。經薄取樣頭在懸浮液中吸幾次以分散細胞聚集；在生長培養基中稀釋細胞懸浮液到所需濃度，或以1∶2 v/v比例稀釋；細胞懸浮液播種到小瓶中，密封並置於36℃恆溫器。
培養細胞培養物48-72小時以獲得單層，然後將生長培養基換成維持培養基。每5-7天混雜細胞培養物。
細胞計數細胞數可通過血細胞計數器在懸浮液中確切計數。計數前經薄滴管反覆吸使細胞充分分散。用0.9ml Eagle培養基中0.1％錐蟲藍稀釋0.1ml細胞懸浮液。死細胞顏色為藍色。
通過Paster吸管充分混合懸浮液並用於血細胞計數器的室中。
在室的兩個網的10個小正方形中計數細胞，排除細胞，置於線上。
如果檢測到細胞聚集，不考慮結果，用重懸浮細胞懸浮液重複計數。
通過獲得自3個樣品的結果計算正方形中平均細胞數。
通過公式計算1ml中細胞濃度C＝M×25000其中C＝1ml中細胞的起始濃度M＝10個小正方形中細胞的平均值(3個樣品)。
用於微型板孔中的細胞數通常需為2-3×104個細胞每0.1ml生長培養基。
結果為評估FC-NO∶GG滅病毒活性，研究了它在Hep-2細胞中對腦心肌炎病毒(EMCV)複製的效果。兩種等體積NG提取物與EMCV的混合物孵育2-3小時，然後加入48小時齡的Hep-2細胞。
實驗開始前，無菌過濾所有提取物，通過孔大小為0.8和0.2μm的微濾器(Gelman Sciences)。
測試進行如下0.2ml測試藥物溶液應用於各微型板的孔，孔包被Hep-2細胞和NIH 3T3細胞單層，除了最後(H)一行的孔(對照)。製備3個微型板用於各細胞培養物。
0.2ml測試藥物溶液應用於微型板的最後一行H的每孔(對照-沒有細胞)，EMCV的稀釋溶液以50和100 TCD50劑量(組織細胞毒性劑量)製備。
通過Koerber公式計算病毒效價log TCD50＝L-d(S-0.5)其中L-起始測試濃度的對數d-對數連線稀釋間的差異S-給出陽性結果(細胞病變效應)的測試對象比例的總和兩種等體積NG提取物與EMCV的混合物孵育2-3小時。0.2ml孵育混合物應用於各微型板的孔，孔包被Hep-2細胞單層，除了最後H行的孔(對照)。製備3個微型板。
孵育48小時後，在顯微鏡下評估結果，然後細胞用結晶紫著色(加入0.2ml到各孔)。
測試結果通過孔的數量評估，其中提取物保護細胞單層不受病毒的細胞病變作用，病毒劑量為50和100 TCD50(表1)。
表1.NS-提取物對EMCV的殺病毒作用(3次測試系列的平均數)
因此，在1/500稀釋和低病毒負荷(50 TCD50)時，NG保護66.6％細胞單層，在較高病毒劑量(100 TCD50)-25％。在1/1000稀釋時沒有觀察到任何殺病毒作用。
表2.1/500稀釋NG的統計分析χ2的數據(3次測試系列的平均數)
*對對照顯著結論總之，歐洲夾竹桃和洋甘草特殊提取物的固定組合(FC-NO∶GG)稀釋1/500，顯著抑制體外對小鼠腦心肌炎病毒的殺病毒效果。
實施例8.B型肝炎和C型肝炎患者中FC-NO∶GG提取物的抗病毒活性研究了特殊提取物的標準固定組合(FC-NO∶GG-SE)名為NatuGuard(S.A.V.Virex Ltd.)在B型肝炎和C型肝炎患者中的臨床效果。液體提取物NatuGuard根據多糖(0.7-1.1mg/ml)、甘草皂苷(0.85-1.15mg/ml)含量和物質的特徵信息來標準化，口服劑量為1-1.5ml，每天2次。病例報導自Husni Abu-Seir博士的私人診所，安曼，約旦。記錄4個病例報導。結果概述於下。
病例1號病人Raa』d Kherfan年齡14歲16/8/1997入院，診斷為急性B型肝炎。醫學史上第一個用NatuGuard治療的病例。治療5周後，HbsAg為陰性。
病例2號病人Asma F.Ibrahim年齡11歲14/2/1998診斷為B型肝炎。用Natu Guard治療8周後，HbsAg為陰性。
病例3號病人Rabya Fouad年齡18歲27/11/1999診斷為C型肝炎。用Natu Guard治療6個月後，HCV PCR為陰性。
病例4號病人Abdel Haq Saif年齡35歲21/3/1998診斷為C型肝炎。用Natu Guard治療4個月後，HCV PCR為陰性。
實施例9.製備剌五加(Eleu therococcus senticosus)提取物(GGE)剌五加提取物(ESE)如NOE(實施例1)所述製備。
說明五加苷B含量-0.01-0.10mg/ml，五加苷E含量-0.02-0.10mg/ml。
實施例10.製備歐洲夾竹桃、洋甘草和剌五加提取物的固定組合(FC-NO∶GG∶ES-SE)加入約5g空氣乾燥、切成條的歐洲夾竹桃葉、分枝和花以及5g空氣乾燥、切成條的洋甘草根、約5g空氣乾燥、切成條的剌五加根到200ml圓底燒瓶中的150ml蒸餾水，加熱至100℃並保持沸騰3小時。沸騰中，加入蒸餾水以維持恆定水位。沸騰後，使混合物溫度為20-25℃，用粗糙濾器過濾以和植物物質分離並從顆粒物質中取出。用蒸餾水使濾液體積至100ml並無菌過濾到無菌燒瓶中，用孔大小為0.45μM和0.22μM的微孔濾器。無菌過濾後，物質的特徵信息傳送「Transfer-P」(Imedis-BRT Ltd.，Moscow)設備的5個活性電極在填充線上。在直接傳送γ-IFN-信息特徵和人體組織對一些病毒組(甲型、乙型、丙型、丁型肝炎、麻疹)特異反應的信息特徵傳送上安裝設備，「Imedis生物共振」軟體裝有PaulyShmidt「物質生物共振資料庫」(Imedis-BRT Ltd.，Moscow)。
技術要求總糖含量-5.0-5.4mg/ml，總多糖含量-1.4-1.6mg/ml，甘草皂苷-1.15mg/ml，五加苷B含量-0.01-0.10mg/ml，五加苷E含量-0.02-0.10mg/ml，幹渣-10-20mg/ml。
實施例11.提取物的IFN-γ誘導活性測試樣品用於進一步稀釋測試樣品的貯存液中提取物和它們的成分的濃度為(a)10.4mg/ml歐洲夾竹桃提取物(NOE)與1.5mg/ml歐洲夾竹桃多糖(NOPS)；(b)13.9mg/ml洋甘草提取物(GGE)與2.9mg/ml洋甘草PS和2.3mg/ml甘草皂苷；(c)13.9mg/ml剌五加提取物(ESE)與0.05mg/ml五加苷B和0.6mg/ml五加苷E。
(d)13.9mg/ml固定組合(FC)的NOE∶GGE與1.2mg/ml PS和1.15mg/ml甘草皂苷；(e)13.9mg/ml固定組合(FC)的NOE∶GGE∶ESE與1.2mg/ml PS和、1.15mg/ml甘草皂苷、0.05mg/ml五加苷B和0.6mg/ml五加苷E；(f)13.9mg/ml固定組合的歐洲夾竹桃和洋甘草特殊提取物FC-NO∶GG-SE與1.2mg/ml PS和1.15mg/ml甘草皂苷；(f)13.9mg/ml固定組合的歐洲夾竹桃、洋甘草和剌五加特殊提取物FC-NO∶GG-SE與1.2mg/ml PS、1.15mg/ml甘草皂苷、0.05mg/ml五加苷B和0.6mg/ml五加苷E。
然後溶液用水稀釋以獲得(1∶10)稀釋，具有甘草皂苷、五加苷和PS與所有其它測試樣品(a)-(f)相等的濃度。從這些溶液中製備測試樣品的其它稀釋度(1∶100、1∶1000和1∶10000)。
培養基中提取物和它們的成分的終濃度比測試樣品小10倍，因為1體積測試樣品加入9體積培養基。
培養過程研究了提取物和它們的成分在全血細胞培養中對IFN-γ生成的效果，如Wang等.，2000所述。健康供體(n＝6)的全血收集到4ml無菌肝素化(肝素鋰)真空抽血管(Vacuete，Greiner)。100μl血樣品加入12孔組織培養平板(Falcon)的各孔中，孔含800μl培養基(RPMI-1640培養基，含2ml L-穀氨醯胺、1mM丙酮酸鈉、100 IU青黴素和鏈黴素以及10％胎牛血清)和100μl測試溶液，溶液具已知濃度的活性成分甘草皂苷和多糖(PS)。細胞在含6％CO2的增溼器空氣中培養72小時，在有12孔板適配器的JOUAN BR4離心轉子中以3000rpm離心15分鐘。收集無細胞的培養物上清並貯存於-80℃直到使用。
IFN-γ測定細胞培養物上清中的IFN-γ含量用商業購買的人幹擾素-γTiterZymeEIA試劑盒(Assay Designs，Inc.，MI，USA)如說明書圖表所述確定。製成IFN-γ標準校準曲線，IFN-γ濃度用450nm的光密度數據自動計算，數據通過多通道微型板-讀數器PR-2100(Sanofi，Pasteur)獲得。所有測量一式兩份地進行，記錄平均數和標準偏差。
結果所有測試樣品在1∶100稀釋時有活性(實際最終稀釋度1∶1000)，圖3。這對應於10到30μg/ml提取物濃度、多糖-1.5到3μg/ml、甘草皂苷-2.2μg/ml(2.7μM)和五加苷-0.05μg/ml。在較低濃度，它們失活，除了歐洲夾竹桃、洋甘草和剌五加提取物的固定組合(FC-NO∶GG∶ES)，它在1∶1000稀釋時有活性(提取物終濃度從1到3μg/ml、多糖-0.15到0.3μg/ml、甘草皂苷-0.22μg/ml(0.27μM)和五加苷-0.005μg/ml。圖1顯示所有測試的提取物剌激γ-IFN生成。圖1也顯示歐洲夾竹桃、洋甘草和剌五加提取物的固定組合(FC-NO∶GG∶ES)活性高於各單獨成分(NOE、GGE和ESE)。此外，圖3顯示使用物質的特徵信息傳送技術在全血體外測試中顯著增強IFN誘導。測試樣品NOSE和FC-NO∶GG-SE通過物質的特徵信息傳送裝置的處理獲得，活性顯著高於樣品NOE和FC-NO∶GG和FC-NO∶GG-SE(沒有這種處理)；所有這些樣品具有相同濃度的活性成分。
本文引用的所有參考文獻全部納入供參考。
本領域技術人員會意識到或能確定僅使用常規實驗，本文特別描述的發明特定實施方案有許多等價物。這些等價物包括在權利要求範圍內。
權利要求
1.一種殺病毒組合物，其特徵在於，所述組合物包括γ-IFN-誘導有效量的歐洲夾竹桃提取物，用直接傳送γ-IFN-信息特徵加工提取物和通過物質的特徵信息傳送裝置傳送人體組織特異反應病毒的信息特徵。
2.如權利要求1所述的組合物，其特徵在於，病毒是甲、乙、丙、丁型肝火、HIV或麻疹。
3.如權利要求1所述的組合物，其特徵在於，提取物獲得自碎葉、莖和/或花。
4.如權利要求1所述的組合物，其特徵在於，裝置是Transfer-P。
5.一種殺病毒組合物，其特徵在於，所述組合物包括γ-IFN-誘導有效量的歐洲夾竹桃提取物、洋甘草和剌五加提取物。
6.如權利要求5所述的組合物，其特徵在於，歐洲夾竹桃提取物獲得自碎葉、莖和/或花，洋甘草提取物獲得自根，剌五加提取物獲得自根。
7.如權利要求5所述的組合物，其特徵在於，用直接傳送γ-IFN-信息特徵加工提取物和通過物質特徵信息傳送裝置傳送人體組織特異反應病毒的信息特徵。
8.如權利要求5所述的組合物，其特徵在於，病毒是甲、乙、丙、丁型肝炎、HIV或麻疹。
9.如權利要求7所述的組合物，其特徵在於，裝置是Transfer-P。
10.一種製備如權利要求1所述組合物的方法，其特徵在於，所述方法包括使歐洲夾竹桃提取物接觸直接傳送γ-IFN-信息特徵和通過物質的特徵信息傳送裝置傳送人體組織對病毒特異反應的信息特徵。
11.如權利要求10所述的組合物，其特徵在於，病毒是甲、乙、丙、丁型肝炎、HIV或麻疹。
12.如權利要求10所述的組合物，其特徵在於，裝置是Transfer-P。
13.一種製備如權利要求7所述組合物的方法，其特徵在於，所述方法包括使歐洲夾竹桃提取物接觸直接傳送γ-IFN-信息特徵和通過物質的特徵信息傳送裝置傳送人體組織對病毒特異反應的信息特徵。
14.如權利要求13所述的組合物，其特徵在於，病毒是甲、乙、丙、丁型肝炎、HIV或麻疹。
15.如權利要求13所述的組合物，其特徵在於，裝置是Transfer-P。
16.一種治療病毒感染的方法，其特徵在於，所述方法包括施用權利要求1所述組合物給需要的人。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，病毒感染由甲、乙、丙、丁型肝炎、HIV或麻疹病毒引起。
18.一種治療病毒感染的方法，其特徵在於，所述方法包括施用權利要求5所述組合物給需要的人。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，病毒感染由甲、乙、丙、丁型肝炎、HIV或麻疹病毒引起。
全文摘要
本發明涉及歐洲夾竹桃(Nerium oleander)特殊提取物的γ－幹擾素－誘導活性、其成分和組合物，組合物含歐洲夾竹桃和洋甘草(Glycyrrhiza glabra)特殊提取物的固定組合，以及用物質的特徵信息傳送技術製備這些提取物的方法。
文檔編號A61P31/12GK1589891SQ20041005892
公開日2005年3月9日 申請日期2004年7月21日 優先權日2003年7月26日
發明者A·帕諾斯彥, S·M·阿爾－穆卡裡希 申請人:S·A·V·凡萊克斯有限公司