一種高效提取深層液態發酵生產樟芝菌絲體多糖的方法
2023-11-09 20:58:07 1
一種高效提取深層液態發酵生產樟芝菌絲體多糖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種高效提取深層液態發酵生產樟芝菌絲體多糖的方法，該方法是將樟芝發酵液分離的菌絲體通過超聲波和複合酶解進行處理、分離得到樟芝多糖。本發明改變了傳統的多糖「水提醇沉」的提取方式，提高了樟芝多糖的提取收率和產品品質，減少了生產中純化水用量和能源消耗，增加了經濟效益。
【專利說明】一種高效提取深層液態發酵生產樟芝菌絲體多糖的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物【技術領域】，具體是一種高效提取深層液態發酵生產樟芝菌絲體多糖的方法。
【背景技術】
[0002]樟芝又名樟生薄孔菌,牛樟燕，牛樟芝，紅樟芝，樟燕，樟郝，樟窟內郝，紅樟，隸屬真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，多孔菌科，薄孔菌屬多年生蕈類，是臺灣特有一種珍稀、尚未開發的名貴食、藥用真菌。只生長在臺灣山區海拔450~2000公尺間特有的牛樟樹樹幹腐朽之心材內壁,或枯死倒伏之牛樟木材陰暗潮溼之表面,發現著實不易。樟芝作為臺灣特有的菌種，自然環境中牛樟樹是其唯一的寄主，一般真菌不能在其上生長。由於樟芝可造成牛樟樹中心空洞腐朽，加上人對牛樟樹亂砍亂伐,致使牛樟樹數量相當稀少，目前已被列為一級保育樹種。近百年來，牛樟樹難得一見，而能夠長出牛樟芝的牛樟樹則更少，其結果導致野生樟芝資源嚴重短缺。因此樟芝十分珍貴，在港澳臺被稱為「神芝」，臺灣民間則稱樟芝為「森林中的紅寶石」。
[0003]近年來，研究得知樟芝能有效治療肝病及其它方面如:抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、降血脂、降血糖的疾病。研究發現，樟芝多糖是樟芝中的主要活性物質，具有免疫生理活性、預防及控制腫瘤等生理活性，主要含0-0^111(^11(0-0-葡聚糖))其作用是透過激發巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞以及自然殺手細胞等來增強免疫功能，進而達到抗腫瘤的效果。此外樟芝多糖還有強心、降血壓、降血糖、抗血栓等功效。
[0004]目前國內外對樟芝的研究還不是很透徹，採取的主要培養法是固體發酵法。由於此法發酵周期長，勞動強度大，佔地面積廣，受季節限制，而且容易汙染，不宜進行純種發酵等缺點，導致樟芝發酵規模一直得不到擴大。為此，以生物技術方法進行天然樟芝液體深層發酵培養可以縮短培養時間，獲得大量且純正的菌絲體，成本低，可實現發酵工業的連續化、自動化，提升生產效益，成為十分值得開發的途徑。國內外也有少量研究者對樟芝的深層發酵進行過研究，但往往其主要側重點是如何獲取更高的生物量，而目前國內關於液態發酵生產樟芝的功效成分多糖的相關報導很少。目前關於真菌類原料多糖的提取工藝多為傳統的水提醇沉法，即向乾燥後的菌絲體加入8-20倍重量的水，控制溫度80-100°C浸泡2_4h，靜止1-2h，然後反覆浸提2-3次，然後合併上清液進行濃縮，再用50-85%的酒精進行醇沉，最終烘乾即可得到粗多糖。此工藝的缺點是需加入大量水長時間進行浸提，並且為提高收率需反覆浸提2-3次，操作周期較長、勞動強度偏大，並且多糖的提取收率多在2-3%，產品成本比較昂貴。並且分離的上清液作為廢液直接棄液排掉，增加了治汙成本。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為了解決傳統多糖的水提醇沉的技術瓶頸，採用此發明能夠快速、高效生產出樟芝多糖。
[0006]為了實現上述目的，本發明主要按照下述步驟進行:
[0007]—種樟芝菌絲體多糖的提取方法，該方法包括下述步驟:
[0008]I)分離:將樟芝發酵液經分離，得到樟芝上清液和溼菌絲體；
[0009]2)超聲處理:向步驟I)所得的溼菌絲體中加入步驟I)所得2-5倍的樟芝上清液進行稀釋，攪拌均勻後進行超聲處理10-40min，得到超聲處理液；上清液的添加主要是作為水溶性溶液來進行提取菌絲體中的多糖，添加量偏少，提取不完全，收率偏低，並且在超聲過程中容易溫度偏高，影響設備使用；若添加過多，後期處理需消耗大量的能源，成本偏聞;
[0010]3)複合酶解:將步驟2)所得超聲處理液調節pH值為4-7，控制溫度30_70°C，然後向其加入相當於幹菌絲體重量0.2-3 %的纖維素酶以及相當於幹菌絲體重量0.2-3 %的蛋白酶，進行酶解l_4h，得到酶解液；
[0011]4)分離、濃縮:將步驟3)所得的酶解液進行分離，將分離所得到的上清液經低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高於75°C，真空度不低於0.085MPa，得到濃縮比重為
1.25~1.40的濃縮漿；
[0012]5)醇沉、烘乾:加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒精度為65-80 % (v/v)，靜置2-6h，將沉澱物進行真空烘乾，溫度50-75°C，真空度不低於0.085MPa ;烘乾至乾燥物水分含量為3~8%，即得菌絲體多糖提取物。
[0013]其中，步驟1)、4)所述的所述的分離為離心分離，採用三足離心機或高速離心機等離心設備進行，轉速控制在1500-5000rpm。
[0014]步驟2)超聲所用的設備為超聲波細胞粉碎機，其他同等超聲設備均可；超聲功率為 0.5-2.5kw0
[0015]所述的纖維素酶酶活為15000 μ /g~25000 μ /g,所述的蛋白酶的單位酶活為47000 μ /g ~53000 μ /g。
[0016]步驟4)所述的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高於75°C，真空度不低於0.085Mpa。
[0017]5)所述的真空烘乾的溫度控制在50-75 °C，真空度不低於0.085Mpa。
[0018]本發明中醇沉次數越多，多糖的含量越高。真空烘乾採用的真空乾燥箱，本發明提取的多糖含量在30-60%。
[0019]本發明具有以下幾個突出的優點:
[0020]傳統的工藝是至少用菌絲體乾重的20倍的純化水進行稀釋，而本工藝採用上清液進行稀釋，並且添加量只為菌絲體乾重的2-5倍；具有以下優點:1、本發明利用上清液替代純化水進行稀釋，減少了廢液排放，減少了治汙成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作為溶液稀釋時，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代純化水，節約了純化水，降低生產成本。
[0021]本發明提取路線簡潔，節約了大量的能源消耗:因減少了純化水的加入量，相應的在後期的分離、濃縮等工序減少了大量的電、蒸汽能源的消耗。
[0022]縮短了操作周期，減少了勞動強度:本發明改變了傳統的多次浸提，採用一次短時間處理，是傳統處理時間的1/3-1/6，減輕了工人的勞動強度。
[0023]提高了提取收率:傳統的水提多糖的提取收率在2_3%，此發明用超聲和酶解加劇了菌絲體胞內產物的溶出度，本發明提取多糖收率在4-5%，比傳統工藝提升了近I倍。
[0024]提升了產品品質:因本發明採用超聲和複合酶解處理菌絲體，將部分菌絲體的蛋白降解成可溶性的小分子物質，減少了在醇沉過程中雜質蛋白的含量，提升了多糖的產品品種，採用本發明提取多糖含量多在40%以上，比傳統工藝提升了 30%以上。
[0025]採用本發明可根據市場需求和產品標準，製得不同含量的高品質的多糖，多糖含量可在30-60%。
【具體實施方式】
[0026]以下通過具體實施例進一步說明本發明。但實施例的具體細節僅用於解釋本發明，不應理解為對本發明總的技術方案的限定。本發明使用於普遍的樟芝菌，其來源不受實施例的限制，實施例中使用的菌種編號為CGMCC N0.0543的樟芝菌種僅是為了舉例說明本發明的技術方案。
[0027]實施例1
[0028]本發明高效提取深層液態發酵生產樟芝菌絲體多糖的方法按下述步驟進行:
[0029]1、樟芝發酵液的製備:樟芝菌種購買於中科院微生物研究所(其菌種編號為CGMCC N0.0543)。將活化好的樟芝搖瓶菌株按接種量10% (v/v)接種於種子培養基(1L)，其中種子培養基組成為葡萄糖3%、蛋白腖0.2%、酵母粉1%、磷酸二氫鉀0.3%、七水硫酸鎂0.15%、豆油0.02%，用稀硫酸調節pH值4.8，通風比為1:0.3vvm，罐壓0.03Mpa，26~28°C振蕩培養7天即得樟芝種子液；將種子液按接種量15% (v/v)接入發酵培養基(50L)，其中發酵培養基組成為葡萄糖2.8 %、蛋白腖0.5 %、酵母粉1.0%、磷酸二氫鉀0.2 %、七水硫酸鎂0.2%、硫酸鋅 0.10%、豆油0.03%，用稀硫酸調節pH值4.8 ;通風比為1:0.5vvm，罐壓0.03Mpa, 26~28°C培養7天，發酵至發酵液香氣濃鬱(牛奶香味)、菌球變碎、濾液渾濁；pH值降至最低3.2並略有波動，還原糖降至最低0.6並略有波動；鏡檢菌絲細碎，大量孢子，無雜菌汙染，即得樟芝發酵液。其中上述培養基組成中的「 」均表示g/100ml。
[0030]2、樟芝發酵液分離:取上述樟芝發酵液1Kg通過高速離心機3000rpm進行分離，得到樟芝上清液液9.5Kg和0.5Kg的溼菌絲體(含水量為80% );
[0031]3、超聲處理:向步驟2所得的0.5Kg溼菌絲體中加入1.SKg的樟芝上清液進行稀釋，攪拌均勻後進行1.0kw超聲處理20min，得到超聲處理液2.3Kg ；
[0032]4、複合酶解:將步驟3所得超聲處理液調節pH值為5.5，在水浴控制溫度45 °C，然後向其緩慢加入纖維素酶2.0g (購自棗莊傑諾生物酶有限公司，單位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶1.Sg(購自棗莊傑諾生物酶有限公司，單位酶活50000 μ /g，下同)並不斷攪拌，攪拌均勻後計時進行酶解2h，得到酶解液；
[0033]5、分離、濃縮:將步驟4所得的酶解液用高速離心機5000rpm進行分離，將分離所得到的上清液1.9Kg用旋轉蒸發儀低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高於75°C，真空度不低於0.085MPa，得到濃縮比重為1.3(50°C熱測)的濃縮漿50g ；
[0034]6、醇沉、烘乾:向50g濃縮漿的中加入180ml的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒精度72% (v/v)，緩慢攪拌均勻後靜置2h，將底部沉澱物分離用真空乾燥箱進行烘乾，溫度60°C，真空度0.09MPa ;烘乾Ih得樟芝菌絲體多糖提取物12.6g。檢測水分含量為3.7%，多糖含量為42%，折合純多糖提取收率為5.29%。
[0035]發明中的多糖提取收率是按幹菌粉計算的。即多糖提取收率=菌絲體多糖提取物質量*多糖含量/ [溼菌絲體質量* (1-溼菌絲體含水量)]*100 %
[0036]實施例2
[0037]本發明高效提取深層液態發酵生產樟芝菌絲體多糖的方法按下述步驟進行:
[0038]1、樟芝發酵液的製備:樟芝菌種購買於中科院微生物研究所(其菌種編號為CGMCC N0.0543)。將活化好的樟芝搖瓶菌株按接種量12% (v/v)接種於種子培養基(20L)，其中種子培養基組成為葡萄糖3%、蛋白腖0.2%、酵母粉I %、磷酸二氫鉀0.3%、七水硫酸鎂0.15 %、豆油0.02%，用稀硫酸調節pH值4.8，通風比為1:0.3vvm，罐壓0.03Mpa,26~28°C振蕩培養7天即得樟芝種子液；將種子液按接種量18% (v/v)接入發酵培養基(100L)，其中發酵培養基組成為葡萄糖2.8%、蛋白腖0.4%、酵母粉1.2%、磷酸二氫鉀
0.2%、七水硫酸鎂0.2%、硫酸鋅0.10%、豆油0.03%，用稀硫酸調節pH值4.8 ;通風比為1:0.5vvm,罐壓0.03Mpa, 26~28°C培養7天，發酵至發酵液香氣濃鬱(牛奶香味)、菌球變碎、濾液渾濁；pH值降至最低3.2並略有波動，還原糖降至最低0.3並略有波動；鏡檢菌絲細碎，大量孢子，無雜菌汙染，即得樟芝發酵液。其中上述培養基組成中的「 ％ 」均表示g/100ml。
[0039]2、樟芝發酵液分離:取上述樟芝發酵液20Kg通過高速離心機3000rpm進行分離，得到樟芝上清液液19.0Kg和1.0Kg的溼菌絲體(含水量為80% );
[0040]3、超聲處理:向步驟2所得的1.0Kg溼菌絲體中加入2.6Kg的樟芝上清液進行稀釋，攪拌均勻後進行2.0kw超聲處理25min，得到超聲處理液3.6Kg ；
[0041]4、複合酶解:將步驟3所得超聲處理液調節pH值為5.0，在水浴控制溫度50°C，然後向其緩慢加入纖維素酶4.2g (購自棗莊傑諾生物酶有限公司，單位酶活20000 μ /g,下同)、蛋白酶3.Sg(購自棗莊傑諾生物酶有限公司，單位酶活50000 μ /g，下同)並不斷攪拌，攪拌均勻後計時進行酶解2h，得到酶解液；
[0042]5、分離、濃縮:將步驟4所得的酶解液用高速離心機5000rpm進行分離，將分離所得到的上清液2.SKg用旋轉蒸發儀低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高於75°C，真空度不低於0.085MPa，得到濃縮比重為1.4(50°C熱測)的濃縮漿105g ；
[0043]6、醇沉、烘乾:向105g濃縮漿的中加入350ml的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒精度74% (v/v)，緩慢攪拌均勻後靜置2.5h，將底部沉澱物分離用真空乾燥箱進行烘乾，溫度60°C，真空度0.09MPa ;烘乾Ih得樟芝菌絲體多糖提取物23.8g。檢測水分含量為
3.1%，多糖含量為45%，多糖提取收率為5.35%。
【權利要求】
1.一種樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特徵在於該方法包括下述步驟: 1)分離:將樟芝發酵液經分離，得到樟芝上清液和溼菌絲體； 2)超聲處理:向步驟I)所得的溼菌絲體中加入步驟I)所得2-5倍的樟芝上清液進行稀釋，攪拌均勻後進行超聲處理10-40min，得到超聲處理液； 3)複合酶解:將步驟2)所得超聲處理液調節pH值為4-7，控制溫度30-70°C，然後向其加入相當於幹菌絲體重量0.2-3 %的纖維素酶以及相當於幹菌絲體重量0.2-3 %的蛋白酶，進行酶解l_4h，得到酶解液； 4)分離、濃縮:將步驟3)所得的酶解液進行分離，將分離所得到的上清液經低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高於75°C，真空度不低於0.085MPa，得到濃縮比重為1.25~1.40的濃縮漿； 5)醇沉、烘乾:加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計檢測混合液酒精度為65-80% (v/v)，靜置2-6h，將沉澱物進行真空烘乾，溫度50-75 °C，真空度不低於0.085MPa ；烘乾至乾燥物水分含量為3~8%，即得菌絲體多糖提取物。
2.根據權利要求1所述的樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特徵在於所述的所述的分離為離心分離，轉速控制在1500-5000rpm。
3.根據權利要求1所述的樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特徵在於所述的纖維素酶酶活為15000 μ /g~25000 μ /g，所述的蛋白酶的單位酶活為47000 μ /g~53000 μ /g。
4.根據權利要求1所述的樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特徵在於步驟4)所述的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高於75°C，真空度不低於0.085Mpa。
5.根據權利要求1所述的樟芝菌絲體多糖的提取方法，其特徵在於步驟5)所述的真空烘乾的溫度控制在50-75°C，真空度不低於0.085Mpa。
【文檔編號】C08B37/00GK104072631SQ201410336261
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】王文風, 徐國華, 徐玲, 王英燕, 楊亞威, 黃盟盟, 張芙蓉 申請人:江蘇阜豐生物科技有限公司