基於磁性納米粒子-pamam納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法

2023-11-10 02:46:42 1

基於磁性納米粒子-pamam納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法
【專利摘要】本發明公開了基於磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法，步驟包括：製備PAMAM樹狀大分子，再利用PAMAM樹狀大分子製備磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料，將製備得到的磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料加入到金花茶葉萃取液中，在超聲或微波條件下萃取、磁分離金花茶中黃酮類物質。本發明利用磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料由金花茶、白花蛇舌草等植物濃縮液中萃取吸附具有弱酸性的黃酮類物質，並通過磁分離、微波輔助萃取等技術實現黃酮類物質的高效分離。
【專利說明】基於磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體是一種基於磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法。

【背景技術】
[0002]金花茶是世界上稀有的珍貴植物。與銀杉、桫欏、珙桐等珍貴「植物活化石」齊名，是我國八種國家一級保護植物之一，屬《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄II中的植物種，最早於1993年為我國植物學家左景烈在廣西防城發現。目前世界上己知金花茶組物40個品種和5個變種，主要分布在越南及我國廣西境內的亞熱帶南緣和熱帶北緣地區。
[0003]衛生部2010年第9號文件，批准金花茶、顯脈旋覆花(小黑藥)、諾麗果漿、酵母β -葡聚糖、雪蓮培養物等5種物品為新資源食品。研究發現，金花茶葉和花中富含總黃酮(異黃酮、雙黃酮、花色苷及新黃酮類等)、茶多酚，多種胺基酸及微量元素等。
[0004]黃酮類化合物是廣泛存在於自然界的一大類化合物，是色原烷的衍生物，其特點是具有C6-C3-C6的基本骨架。黃酮類化合物可以分為10多個類別:黃酮、黃烷醇、異黃酮、雙氫黃酮、雙氫黃酮醇、噢弄、黃烷酮、花色素、查耳酮、色原酮等，現已發現約4000餘種黃酮類化合物，主要存在於植物的葉、果實、根、皮中，實驗證明其具有廣泛的生理和藥理活性(包括抗氧化，清除氧自由基、抗病毒、抗癌、抗炎、抗衰老等)，因此對該化合物的研究已成為國內外醫藥界研究的熱門話題。傳統提取方法主要包括超濾法、酶解法、大孔樹脂吸附法、超臨界流體萃取法、超聲波法、微波場提取法等(張睿，徐雅琴，時陽.黃酮類化合物提取工藝研究.食品與機械，2003，01，21-22)，但往往制約於提取效率或成本。
[0005]目前關於金花茶中黃酮類物質活性成分研究大多局限在傳統紫外、色譜檢測或溶劑浸提、膜分離等，如:湛志華對金花茶葉中的化學成分進行了定性分析。通過定性分析，發現金花茶葉中黃酮類化合物約佔2.33%(湛志華.金花茶葉中黃酮成分的提取與分離[D].廣西師範大學，2006);彭曉等採用反覆矽膠柱色譜法、Sephadex LH-20柱色譜法、ODS柱色譜法、反覆重結晶等方法對金花茶花的化學成分進行分離純化，並通過理化常數測定和波譜分析等方法進行結構鑑定。從金花茶花的乙醇提取物中分離得到包括黃酮類物質在內的13個化合物(彭曉，於大永，馮寶民，唐玲，王永奇，史麗穎.金花茶花化學成分的研究.廣西植物，2011,31 (04)，550-553 )。唐前等採用紫外分光光度法測定金花茶、毛瓣金花茶、凹脈金花茶、四季金花茶、薄葉金花茶不同植物部位中總皂苷、總多酚(鞣質)、總黃酮的含量。如金花茶花蕾醇提物中總皂苷、總多酚(鞣質)、總黃酮的含量依次為:21.30%、6.56%,21.76% (唐前，羅燕英，王永奇等.金花茶組植物化學成分的定量分析，時珍國醫國藥，2009，20 (4)，769-771);陳全斌等以金花茶葉為原料提取黃酮，黃酮經水解，溶劑萃取、柱層析等手段，得到高純度甙元；經熔點、TLC、液相色譜、紅外光譜、核磁共振法等分析手段進行結構表徵，首次證實金花茶葉含有黃酮甙，其甙元為槲皮素和山奈酚(陳全斌，湛志華，張巧雲，廖娜.金花茶葉中黃酮甙元的分離提純及其表徵.廣西熱帶農業，2005，6，10-11)。
[0006]張彩霞等採用微波輔助提取白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)中的黃酮類化合物，並優化其提取工藝，對提取物的化學結構進行鑑定，發現影響黃酮提取率的因素主次順序為:提取溫度乙醇濃度提取時間料液比；最佳提取工藝為:乙醇濃度為80%，提取時間為40 min,料液比為1: 40，提取溫度為80°C，在此條件下白花蛇舌草中黃酮的提取率達2.86% (張彩霞，蔡定建，方文英.白花蛇舌草中黃酮提取工藝的優化及其結構鑑定.安徽農業科學，2011，39 (01)，131-133);李加林等通過正交實驗探討了提取溫度、提取時間、料液比及乙醇濃度對鹽膚木總黃酮提取率的影響。提取時間為10 min,溫度為60°C，料液比為1: 60，乙醇濃度為70%時提取效率最佳。研究結果顯示在最佳條件下總黃酮提取率達到6.65%。李加林，吳素珍，卑佔宇.鹽膚木總黃酮提取工藝研究.時珍國醫國藥，2009， 20,1116-1117)。
[0007]樹形分子(Dendrimer)是最近幾年出現的一類三維的、高度有序的新型大分子。聚醯胺-胺(PAMAM)是目前研究最廣泛、最深入的樹狀大分子之一，由於其具有高度支化、高度對稱及表面含有大量官能團等獨特的結構特點，廣泛應用於藥物載體、表面活性劑、催化劑、納米材料、膜材料等領域。樹狀大分子中結構單元每重複一次成為一次繁衍，得到的產物的代數就增加1，目前聚醯胺-胺(PAMAM)樹狀大分子已合成到10.0代發散合成法是目前合成PAMAM樹狀大分子採用最多、最成熟的一種合成方法，具有反應條件溫和、反應迅速、選擇性高等優點(譚惠民，羅運軍.樹枝形聚合物[M].北京:化學工業出版社，2001)。
[0008]聚醯胺-胺型樹狀大分子具有豐富的端氨基結構及內部仲、季胺結構，使整體聚醯胺-胺型樹狀大分子呈弱鹼性。黃酮類化合物大多具有酚羥基，整體呈弱酸性，易溶於鹼水，酸化後又可沉澱析出。其原因一是由於黃酮酚羥基的酸性，二是由於黃酮母核在鹼性條件下開環，形成2'-羥基查耳酮，極性增大而溶解(郭雪峰，嶽永德.黃酮類化合物的提取分離純化和含量測定方法的研究進展.安徽農業科學，2007，35 (26)，8083-8086)。本發明擬利用呈弱鹼性的PAMAM樹狀大分子材料與呈弱酸性的黃酮類物質的萃取吸附作用，實現金花茶中黃酮類物質的高效分離。
[0009]為更好地對PAMAM吸附後的黃酮類物質進行分離，本發明將PAMAM與磁性納米粒子如鐵氧體類(四氧化三鐵、Y -三氧化鐵、MeFe204 (Me=Co, Ni, Mn)), Fe, Co, Ni及其合金顆粒類、氮化鐵類(FeN，Fe2N, ε -Fe3N, Fe 16N2)等粒子複合製備磁性粒子-PAMAM納米複合材料，通過磁性作用將萃取吸附有弱酸性黃酮物質的磁性粒子-PAMAM納米複合材料從萃取液中分離；最後通過超聲輔助萃取技術將吸附的黃酮物質與磁性粒子-PAMAM納米複合材料進行分離。


【發明內容】

[0010]本發明的目的在於提供一種萃取率高的基於磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0011]為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
基於磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法，步驟包括:
I)PAMAM樹狀大分子的製備 PAMAM樹狀大分子以乙二胺為中心核進行準備，第一步將乙二胺與丙烯酸甲酯進行Michael加成反應，得到0.5代聚醯胺胺樹狀大分子，記作PAMAM G0.5，該反應在25°C下選擇性高；第二步是將得到的0.5代聚醯胺-胺型樹狀大分子與過量的乙二胺在25°C下反應，得到1.0代聚醯胺-胺型樹狀大分子，記作PAMAM Gl.0 ;每重複以上兩步反應，分子代數增長I代，在適當條件下，不斷重複以上兩個步驟得到不同代數的聚醯胺-胺型樹狀大分子;
2)磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料的製備
磁分離把磁性納米粒子分散於甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L ;將上述製備的25mL的磁性納米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀釋至150mL,並超聲處理30min ;然後加入1mL的3-胺丙基三甲氧基矽烷，強烈攪拌並超聲處理7h ;所得溶液用甲醇洗滌5次後進行磁分離，分散於甲醇獲得5wt%的溶液備用；
取50mL的5wt%的磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液，加入200mL含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的體積濃度為20%，把此混合液在室溫水浴中超聲7h ;然後用磁鐵收集磁性納米粒子，隨後用甲醇洗滌5次，並磁分離；在洗滌之後，向該磁性納米粒子的甲醇溶液中加入40mL含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的體積濃度為50%，室溫下超聲處理3h ;然後用甲醇洗滌該磁性納米粒子5次，並進行磁分離；重複地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，每循環一次就獲得更高代數的樹形分子修飾的磁性納米粒子；循環後的溶液用25mL甲醇洗滌3次，並用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得PAMAM樹形分子修飾的磁性納米粒子；
3)金花茶中黃酮類物質萃取分離
將製備得到的磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料加入到金花茶葉萃取液中，在超聲或微波條件下萃取0.5-3h，萃取結束後通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質的磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料分離，分離後的磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料採用有機溶劑萃取分離被磁性納米材料吸附的黃酮類物質，磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料洗淨活化後能重新循環使用。
[0012]作為本發明進一步的方案:磁性納米粒子包括Fe、Co、Ni及其合金顆粒類、鐵氧體類與氮化鐵類；鐵氧體類包括四氧化三鐵、Y -三氧化鐵與MeFe2O4,其中Me=Co、N1、Mn ;氮化鐵類包括 FeN、Fe2N, ε -Fe3N 與 Fe16N2。
[0013]作為本發明進一步的方案:有機溶劑包括乙醇、甲醇、DMS0、丙酮。
[0014]作為本發明進一步的方案:該方法還適用於富含黃酮類物質的植物葉、花朵、果實與根莖。
[0015]與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明利用磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料由金花茶、白花蛇舌草等植物濃縮液中萃取吸附具有弱酸性的黃酮類物質，並通過磁分離、微波輔助萃取等技術實現黃酮類物質的高效分離。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為PAMAM樹狀大分子的典型合成路線。
[0017]圖2所示為四氧化三鐵磁粒子-PAMAM複合材料合成及分離金花茶等植物中黃酮類物質示意圖。

【具體實施方式】
[0018]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0019]本發明的黃酮物質分離步驟，為更好地對PAMAM吸附後的黃酮類物質進行高效分離，本發明將PAMAM樹狀大分子與磁性納米粒子如鐵氧體類(四氧化三鐵、Y-三氧化鐵、MeFe2O4 (Me=Co, Ni, Mn) )、Fe，Co，Ni 及其合金顆粒類、氮化鐵類(FeN, Fe2N, ε-Fe3N,Fe16N2)等粒子和1.0-10.0代的PAMAM樹狀大分子複合製備磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料。該類複合材料因其球狀結構末端具有豐富的伯胺官能團，中間則有大量仲、叔、季胺等，整體呈弱鹼性，在水中溶解度在每100克水10-30克，對呈弱酸性的黃酮類物質有較強吸附效應，利於黃酮類物質的分離。本發明通過磁分離作用將萃取吸附有弱酸性黃酮類物質的磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料從萃取液中分離，隨後通過溶劑萃取技術將被萃取吸附的黃酮類物質與磁性納米粒子-PAMAM納米複合材料分離。
[0020]實施例1
金花茶葉濃縮液製備:採摘春季新鮮的金花茶原葉；採用電子秤稱重；對採摘的春季新鮮金花茶原葉按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優選出金花茶原葉洗淨後，粉碎；將粉碎後的金花茶原葉20公斤；加入丙酮(95%以上)50L，利用索氏提取器提取5-6小時，得提取液A ;提取後殘渣加入40L左右丙酮(95%以上)，在40-60攝氏度條件下超聲波處理約1.5小時，得提取液B，合併提取液A和B，利用旋轉蒸發儀旋轉蒸發除去大部分丙酮溶劑，得到有機相的金花茶濃縮液約2.0L。
[0021]四氧化三鐵磁粒子-4.0GPAMAM複合材料製備過程:在氮氣保護下，ρΗ=1.7時，配製0.085mol/L的三氯化鐵溶液和0.05mol/L的硫酸亞鐵的混合物。然後，往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，並劇烈攪拌，直至pH=9。所獲得的四氧化三鐵磁性納米粒子立即用水洗滌5次，然後用甲醇洗滌3次，磁分離把四氧化三鐵磁性納米粒子分散於甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述製備的25mL的四氧化三鐵磁性納米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀釋至150mL，並超聲處理30min。然後加入1mL的3-胺丙基三甲氧基矽烷，強烈攪拌並超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次後進行磁分離，產物分散於甲醇獲得5wt%的溶液備用。50mL的5wt%的四氧化三鐵磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然後加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液在室溫水浴下超聲處理7h。然後用磁鐵收集這些納米顆粒，隨後甲醇洗滌5次，並磁分離。在洗滌之後，往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然後用甲醇洗滌此納米粒子5次，並進行磁分離。不斷重複地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環四次得到四代(4.0G)樹形分子修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，並用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得4.0G PAMAM樹形分子修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0022]金花茶中黃酮物質萃取分離:將製備得到的四氧化三鐵磁粒子-4.0G PAMAM複合材料1g加入到第一步製備好的2.0L金花茶葉萃取液中，在400W條件下超聲萃取0.5h，萃取結束後通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質的Fe3O4-PAMAM納米複合材料分離。分離後吸附有黃酮物質的磁性複合材料採用乙醇萃取多次，以萃取出被吸附的黃酮類物質。合併萃取液，旋轉蒸發除去乙醇、無水硫酸鈉乾燥過夜即得到金花茶中的黃酮類物質。按保健食品檢驗與評價技術規範(2003版)中「保健食品中總黃酮的測定方法」，本發明所述黃酮物質分離純化方法，黃酮物質含量在85%以上。四氧化三鐵磁粒子-4.0G PAMAM磁性納米複合材料用水、乙醇洗滌多次後乾燥活化重新循環使用。
[0023]實施例2
金花茶花朵濃縮液製備:採摘秋季新鮮的金花茶花朵；採用電子秤稱重；對採摘的秋季新鮮金花茶花朵按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優選出金花茶花朵洗淨後，粉碎；將粉碎後的金花茶花朵10公斤；加入丙酮(95%以上)20-30L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取後殘渣加入20L左右丙酮(95%以上)，在40-60°C條件下超聲約1.5h，得提取液B，合併提取液A和B，利用旋轉蒸發儀旋轉蒸發除去大部分丙酮溶齊U，得到有機相的金花茶濃縮液約1.0L。
[0024]Y-Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM複合材料製備:將2mol/L氫氧化鈉溶液加入到lmol/L硫酸亞鐵溶液中，反應有白色絮狀沉澱Fe (OH)2生成，並迅速變成灰綠色沉澱:Fe6 (SO4) 2 (OH) 403。用膠頭滴管向上述含沉澱的溶液中滴加適量雙氧水，沉澱由綠色變為黑色後停止再加入。將上述含沉澱的溶液利用真空抽濾機分離沉澱，然後將其放入80°C乾燥箱中乾燥lh。將乾燥後的沉澱在馬弗爐中100-240°C焙燒半小時，得Y-Fe2O3紅色粉末。把製備好的磁性納米粒子分散於甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述製備的25mL的
Y-Fe2O3磁性納米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀釋至150mL,並超聲處理30min。然後加入1mL的3-胺丙基三甲氧基矽烷，強烈攪拌並超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次後進行磁分離，分散於甲醇獲得5wt %的溶液備用。50mL的5wt %的Y -Fe2O3磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然後加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室溫水浴下超聲處理7h。然後用磁鐵收集這些納米顆粒，用甲醇洗滌5次，並磁分離。洗滌之後,往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然後用甲醇洗滌此納米粒子5次，並進行磁分離。不斷重複地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環五次獲得五代(5.0G)樹形分子修飾的磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，並用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得5.0G PAMAM樹形分子修飾的Y-Fe2O3磁性納米粒子。
[0025]金花茶中花朵中黃酮物質萃取分離:將製備得到的Y -Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM複合材料5g加入到第一步製備好的1.0L金花茶花朵萃取液中，在400W條件下超聲萃取一定時間lh，萃取結束後通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質的Y-Fe203-5.0G PAMAM納米複合材料分離，分離後的吸附有黃酮物質的Y-Fe203-5.0G PAMAM納米複合材料採用有機溶劑甲醇萃取多次，合併萃取液，旋轉蒸發除去甲醇溶劑，無水硫酸鎂乾燥得到金花茶中的黃酮類物質，按保健食品檢驗與評價技術規範(2003版)中「保健食品中總黃酮的測定方法」，本發明所述金花茶花朵中黃酮物質分離純化方法，黃酮物質含量在85%以上。
Y-Fe2O3磁粒子-5.0G PAMAM複合材料則洗滌多次乾燥活化後循環使用。
[0026]實施例3
金花茶果實濃縮液製備:採摘11-12月新鮮的金花茶果實；採用電子秤稱重；對採摘的金花茶果實按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優選出金花茶果實洗淨後，粉碎，50°C真空乾燥8h除去水分，取粉碎後真空乾燥的金花茶果實15公斤；加入95%以上的乙醇45L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取後殘渣加入30L左右95%以上的乙醇，在40-60°C條件下超聲約1.5h，得提取液B，合併提取液A和B，利用旋轉蒸發儀旋轉蒸發除去大部分乙醇溶劑，得到有機相的金花茶濃縮液約1.5L。
[0027]CoxNihFe2O4納米鈷鎳鐵氧體磁性顆粒_3.0G PAMAM複合材料製備:x可以為0.1、0.3,0.5,0.7,0.9等，按化學計量比稱量硝酸鈷，硝酸鎳，硝酸鐵，檸檬酸；用蒸餾水溶解為透明的有色溶液。滴入氨水，使溶液PH值在7?8之間。90°C水浴中加熱4?5h至粘稠的膠體狀；在120°C下烘乾為乾燥凝膠。將乾燥凝膠在馬弗爐中以120°C /h加溫至850°C後，保溫lh，關掉電源，自然冷卻。將製得的磁性納米顆粒超聲分散於甲醇之中，獲得濃度為
0.0128mol/L。上述製備的25mL的CoxNihFe2O4磁性納米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀釋至150mL，並超聲處理30min。然後加入1mL的3-胺丙基三甲氧基矽烷，強烈攪拌並超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次後進行磁分離，分散於甲醇獲得5wt%的溶液備用。50mL的5 wt%的C0xNi^Fe2O4磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然後加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入室溫水浴中超聲處理7h。然後用磁鐵收集這些納米顆粒，用甲醇洗滌5次，並磁分離。在洗滌之後，往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然後用甲醇洗滌此納米粒子5次，並進行磁分離。然後重複地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環三次獲得三代(3.0G)樹形分子修飾的磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，並用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得3.0G PAMAM樹形分子修飾的CoxNi^xFe2O4磁性納米粒子。
[0028]金花茶果實中黃酮物質萃取:將製備得到的CoxNi^xFe2O4磁粒子-PAMAM複合材料(弱鹼性)適量7.5g加入到第一步製備好的金花茶果實萃取液1.5L中，在400W條件下超聲萃取一定時間1.5h，萃取結束後通過磁分離手段將吸附萃取黃酮類物質(弱酸性)的CoxNi1^xFe2O4-S.0G PAMAM納米複合材料分離，分離後的磁性複合材料(附有黃酮物質)採用有機溶劑乙醇萃取多次，合併萃取液，旋轉蒸發除去乙醇，室溫真空乾燥2h，得到金花茶中的黃酮類物質，按保健食品檢驗與評價技術規範(2003版)中「保健食品中總黃酮的測定方法」，本發明所述該黃酮物質分離純化方法，黃酮物質含量在85%以上。CoxNi^xFe2O4磁粒子-3.0G PAMAM複合材料則洗滌多次乾燥活化後重新循環使用。
[0029]實施例4
金花茶葉濃縮液製備:採摘春季新鮮的金花原葉；採用電子秤稱重；對採摘的春季新鮮金花茶原葉按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優選出金花茶原葉洗淨後，粉碎；將粉碎後的金花茶原葉5公斤；加入95%以上的甲醇15L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取後殘渣加入1L左右95%以上的甲醇，在40_60°C條件下超聲約
1.5h，得提取液B，合併提取液A和B，利用旋轉蒸發儀旋轉蒸發除去大部分甲醇溶劑，得到有機相的金花茶濃縮液約0.5L。
[0030]y -Fe4N-6.0G PAMAM複合材料製備過程:鐵粉10克，鐵粉粒度為0.1微米，氫氣還原後，按氨/氫氣比例3:4的比例通入氨氣及氫氣的混合氣體，在550攝氏度條件下氮化3h，將產物在氬氣氛下球墨1h後於240°C下進行4h退後得到Y -Fe4N,把Y -Fe4N納米粒子分散於甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述製備的25mL的Y-Fe4N磁性納米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀釋至150mL,並超聲處理30min。然後加入1mL的3-胺丙基三甲氧基矽烷，強烈攪拌並超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次後進行磁分離，分散於甲醇獲得5wt%的溶液備用。50mL的5wt%的Y-Fe4N磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然後加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室溫水浴中超聲處理7h。然後用磁鐵收集這些納米顆粒，用甲醇洗滌5次，並磁分離。在洗滌之後，往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然後用甲醇洗滌此納米粒子5次，並進行磁分離。不斷重複地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環六次得到六代(6.0G)樹形分子修飾的Y_Fe4N磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，並用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得6.0G PAMAM樹形分子修飾的Y -Fe4N磁性納米粒子。
[0031]金花茶中黃酮物質的萃取分離:將製備得到的Y -Fe4N磁粒子-PAMAM複合材料(弱鹼性)適量2.5 g加入到第一步製備好的0.5L金花茶葉萃取液中，在400W條件下超聲萃取一定時間2 h，萃取結束後通過磁分離手段將吸附萃取黃酮類物質的Fe304-6.0G PAMAM納米複合材料分離，分離後吸附有黃酮物質的Fe304-6.0G PAMAM納米複合材料採用有機溶劑乙醇萃取多次，合併萃取液，旋轉蒸發除去溶劑，室溫這空乾燥2h，得到金花茶中的黃酮類物質，按保健食品檢驗與評價技術規範(2003版)中「保健食品中總黃酮的測定方法」，本發明所述該黃酮物質分離純化方法，黃酮物質含量在85%以上。四氧化三鐵磁粒子-6.0GPAMAM複合材料則洗滌多次乾燥活化後循環使用。
[0032]實施例5
白花蛇舌草濃縮液製備:採摘秋季新鮮的白花蛇舌草，除去根，採用電子秤稱重；對採摘的秋季新鮮的白花蛇舌草按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優選出白花蛇舌草洗淨後，粉碎；將粉碎後的白花蛇舌草20公斤；加入95%以上的丙酮50L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A ;提取後殘渣加入40L左右95%以上的丙酮，在40_60°C條件下超聲波處理約1.5h，得提取液B，合併提取液A和B，利用旋轉蒸發儀旋轉蒸發除去大部分丙酮溶劑，得到有機相的白花蛇舌草濃縮液約2.0L。
[0033]四氧化三鐵磁粒子-4.0GPAMAM複合材料製備過程:在氮氣保護下，pH= 1.7時，配製0.085mol/L的三氯化鐵溶液和0.05mol/L的硫酸亞鐵的混合物。然後，往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，並劇烈攪拌，直至pH=9。所獲得的四氧化三鐵磁性納米粒子立即用水洗滌5次，然後用甲醇洗滌3次，磁分離把四氧化三鐵磁性納米粒子分散於甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述製備的25mL的四氧化三鐵磁性納米粒子的甲醇溶液，用甲醇稀釋至150mL，並超聲處理30min。然後加入1mL的3-胺丙基三甲氧基矽烷，強烈攪拌並超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次後進行磁分離，產物分散於甲醇獲得5wt%的溶液備用。50mL的5 wt%的四氧化三鐵磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然後加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液在室溫水浴下超聲處理7h。然後用磁鐵收集這些納米顆粒，隨後甲醇洗滌5次，並磁分離。在洗滌之後，往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然後用甲醇洗滌此納米粒子5次，並進行磁分離。不斷重複地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環四次得到四代(4.0G)樹形分子修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，並用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得4.0G PAMAM樹形分子修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0034]白花蛇舌草中黃酮物質萃取分離:將製備得到的四氧化三鐵磁粒子-4.0G PAMAM複合材料(弱鹼性)1g加入到第一步製備好的2.0L金花茶葉萃取液中，在400W條件下超聲萃取0.5h，萃取結束後通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質(弱酸性)的Fe3O4-PAMAM納米複合材料分離。分離後吸附有黃酮物質的Fe3O4- PAMAM納米複合材料採用乙醇萃取多次，以萃取出被吸附的黃酮類物質。合併萃取液，旋轉蒸發除去乙醇、無水硫酸鈉乾燥過夜即得到白花蛇舌草中的黃酮類物質。按保健食品檢驗與評價技術規範(2003版)中「保健食品中總黃酮的測定方法」，本發明所述黃酮物質分離純化方法，黃酮物質含量在85%以上。四氧化三鐵磁粒子-4.0G PAMAM磁性納米複合材料用水、乙醇洗滌多次後乾燥活化重新循環使用。
[0035]實施例6
鹽膚木葉濃縮液製備:採摘新鮮的鹽膚木葉；採用電子秤稱重；對採摘的新鮮鹽膚木葉按《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準進行篩選，將優選出鹽膚木葉洗淨後，粉碎；將粉碎後的鹽膚木葉10公斤；加入95%以上的乙醇20-30L，利用索氏提取器提取5_6h，得提取液A ;提取後殘渣加入20L左右95%以上的乙醇，在40-60°C條件下超聲約1.5h，得提取液B，合併提取液A和B，利用旋轉蒸發儀旋轉蒸發除去大部分乙醇溶劑，得到有機相的鹽膚木葉濃縮液約1.0L。
[0036]Y-Fe2O3磁粒子_5.0G PAMAM複合材料製備:將2mol/L氫氧化鈉溶液加入到lmol/L的硫酸亞鐵溶液中，反應有白色絮狀沉澱Fe (OH)2生成，並迅速變成灰綠色沉澱:Fe6 (SO4) 2 (OH) 403。用膠頭滴管向上述含沉澱的溶液中滴加適量雙氧水，沉澱由綠色變為黑色後停止再加入。將上述含沉澱的溶液利用真空抽濾機分離沉澱，然後將其放入80°C乾燥箱中乾燥lh。將乾燥後的沉澱在馬弗爐中100-240°C焙燒半小時，得Y-Fe2O3紅色粉末。把製備好的磁性納米粒子分散於甲醇之中，獲得濃度為0.0128mol/L。上述製備的25mL的
Y-Fe2O3磁性納米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀釋至150mL,並超聲處理30min。然後加入1mL的3-胺丙基三甲氧基矽烷，強烈攪拌並超聲處理7h。所得溶液用甲醇洗滌5次後進行磁分離，分散於甲醇獲得5wt %的溶液備用。50mL的5wt %的Y -Fe2O3磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液。然後加入200mL的20% (v/v)丙烯酸甲酯的甲醇溶液，把此混合液浸入到室溫水浴下超聲處理7h。然後用磁鐵收集這些納米顆粒，用甲醇洗滌5次，並磁分離。洗滌之後,往此磁性納米顆粒的甲醇溶液加入40mL的50% (v/v)的乙二胺甲醇溶液，室溫下超聲處理3h。然後用甲醇洗滌此納米粒子5次，並進行磁分離。不斷重複地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循環五次獲得五代(5.0G)樹形分子修飾的磁性納米粒子。此溶液用25mL甲醇洗滌3次，並用25mL水洗滌5次，磁分離收集獲得5.0G PAMAM樹形分子修飾的Y-Fe2O3磁性納米粒子。
[0037]鹽膚木葉中花朵中黃酮物質萃取分離:將製備得到的Y-Fe2O3磁粒子-5.0GPAMAM複合材料(弱鹼性)5g加入到第一步製備好的1.0L金花茶花朵萃取液中，在400W條件下超聲萃取一定時間lh，萃取結束後通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質的
Y-Fe203-5.0G PAMAM納米複合材料分離，分離後的吸附有黃酮物質的Y-Fe203_5.0G PAMAM納米複合材料採用有機溶劑甲醇萃取多次，合併萃取液，旋轉蒸發除去甲醇溶劑，無水硫酸鎂乾燥得到鹽膚木葉中的黃酮類物質，按保健食品檢驗與評價技術規範(2003版)中「保健食品中總黃酮的測定方法」，本發明所述金花茶花朵中黃酮物質分離純化方法，黃酮物質含量在85%以上。Y -Fe2O3磁粒子-5.0G PAMAM複合材料則洗滌多次乾燥活化後循環使用。
[0038]本發明所述技術同樣適用於其它富含黃酮類物質的植物葉、花朵、果實、根莖，如:茶葉、野菊花、銀杏、桑葉、艾葉、金銀花、柚子、橘子、大豆、生薑、八角、芹菜、菠蘿、番石榴、玉米須、敗醬、三葉草、魚腥草、甘草、鹽膚木、葉下珠、仙人掌、卷柏、白花蛇舌草、牛蒡、闊葉十大功勞、半邊旗、羅布麻、春花胡枝子、鎖陽、草珊瑚等，上述植物中黃酮類成分的萃取分離同樣採用類似的磁性粒子-PAMAM納米磁分離技術。
[0039]對於本領域技術人員而言，顯然本發明不限於上述示範性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特徵的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示範性的，而且是非限制性的，本發明的範圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和範圍內的所有變化囊括在本發明內。
[0040]此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。
【權利要求】
1.基於磁性納米粒子-?八納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法，其特徵在於，步驟包括: 1)樹狀大分子的製備 ？八嫩1樹狀大分子以乙二胺為中心核進行準備，第一步將乙二胺與丙烯酸甲酯進行110^61加成反應，得到0.5代聚醯胺胺樹狀大分子，記作？八嫩1 60.5，該反應在251下選擇性高；第二步是將得到的0.5代聚醯胺-胺型樹狀大分子與過量的乙二胺在251下反應，得到1.0代聚醯胺-胺型樹狀大分子，記作？八嫩1 61.0 ；每重複以上兩步反應，分子代數增長1代，在適當條件下，不斷重複以上兩個步驟得到不同代數的聚醯胺-胺型樹狀大分子； 2)磁性納米粒子納米複合材料的製備 磁分離把磁性納米粒子分散於甲醇之中，獲得濃度為0.0128001/1 ；將上述製備的251111的磁性納米粒子的甲醇溶液,用甲醇稀釋至1501111，並超聲處理30111111 ；然後加入101111的3-胺丙基三甲氧基矽烷，強烈攪拌並超聲處理71！；所得溶液用甲醇洗滌5次後進行磁分離，分散於甲醇獲得50%的溶液備用； 取50此的5被％的磁性納米粒子甲醇溶液為起始溶液，加入2001含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的體積濃度為20%，把此混合液在室溫水浴中超聲7卜；然後用磁鐵收集磁性納米粒子，隨後用甲醇洗滌5次，並磁分離；在洗滌之後，向該磁性納米粒子的甲醇溶液中加入40此含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的體積濃度為50%，室溫下超聲處理311 ；然後用甲醇洗滌該磁性納米粒子5次，並進行磁分離；重複地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，每循環一次就獲得更高代數的樹形分子修飾的磁性納米粒子；循環後的溶液用25此甲醇洗滌3次，並用25此水洗滌5次，磁分離收集獲得？八嫩1樹形分子修飾的磁性納米粒子； 3)金花茶中黃酮類物質萃取分離 將製備得到的磁性納米粒子-?八納米複合材料加入到金花茶葉萃取液中，在超聲或微波條件下萃取0.5-31！，萃取結束後通過磁分離手段將吸附萃取有黃酮類物質的磁性納米粒子-?八心\1納米複合材料分離，分離後的磁性納米粒子-?八納米複合材料採用有機溶劑萃取分離被磁性納米材料吸附的黃酮類物質，磁性納米粒子-?八嫩1納米複合材料洗淨活化後能重新循環使用。
2.根據權利要求1所述的基於磁性納米粒子-?八納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法，其特徵在於，磁性納米粒子包括？6、00? ^1及其合金顆粒類、鐵氧體類與氮化鐵類；鐵氧體類包括四氧化三鐵、V -三氧化鐵與16？6204，其中16二?:0、附、III ；氮化鐵類包括？6隊琴、2 與？6』2。
3.根據權利要求1所述的基於磁性納米粒子-?八納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法，其特徵在於，所述有機溶劑包括乙醇、甲醇、0180與丙酮。
4.根據權利要求1所述的基於磁性納米粒子-?八納米複合材料的金花茶中黃酮類物質分離方法，其特徵在於，該方法還適用於富含黃酮類物質的植物葉、花朵、果實與根莖。
【文檔編號】C08G83/00GK104492393SQ201410639271
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】程金生 申請人:程金生