聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術的中藥提取方法
2023-11-30 12:23:06 2
專利名稱：聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術的中藥提取方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥提取方法，具體地涉及一種聯合應用全仿生消化技術和細胞 膜仿生固相萃取技術的中藥提取方法。
背景技術：
中藥的成分異常複雜，且多種有效成分在進入人體後相互配合、協同作用，而後起 到疾病的治療作用。傳統的提純分離技術(如煎煮法、回流、浸漬、滲漉等)和現代中藥提 純分離技術(如超微粉碎技術、超臨界萃取技術、逆流動態提取技術、吸附分離純化技術、 膜分離技術、多效薄膜濃縮乾燥技術、真空帶式乾燥技術、計算機控制技術等)均沿用「純 粹」、「傳統」的物理及化學手段，與吸收入人體的中藥有效成分的協同作用無關，因此易破 壞中藥有效成分的結構或組成，難以將中藥中含有的有效成分完全提取出來。仿生提取法(Bionic Extration method)則與上述提純方式不同，它是從生物藥 劑學的角度將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結合仿生提取法，它特別適用於中藥復 方中有效成分的提取，中藥複方是中醫臨床用藥的一大特點，其化學成分非常複雜，很難用 現代提純分離技術提純的某一成分的藥效和藥代參數來代表整個中藥複方。基於中藥復 方中部分有效成分已知，部分有效成分未知的現實，SBE法堅持「有成分論，不唯成分論，重 在基體的藥效學反應」的基本原則(鬱威，中藥提取分離技術原理與應用，中醫藥出版社 2005,364-369)，由於中藥大多使用口服吸收，因此，仿生提取法主要模仿口服藥物在口腔、 胃腸道中的吸收環境，以得到有效成分含量高的活性中藥提取液。但是，現有的仿生提取技術僅僅停留在將中藥中的有效成分萃取到胃、腸等仿生 液中，而上述仿生提取液存在溶液量大、口感差、易發生胃腸不適等的問題，無法像水煎劑 一樣直接口服使用；當然，也可以將其濃縮、或將其烘乾，但是，由於上述仿生液中帶有大量 的生物酶及一系列成分複雜的化合物，在加熱的過程中，其中所含有的有效成分易發生副 反應(如水解反應等)，導致有效成分的含量降低。
發明內容
本發明的目的在於提供一種聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技 術的中藥提取方法，以解決現有技術中存在的上述問題。本發明聯合應用全仿生消化技術 和細胞膜仿生固相萃取技術，反應條件溫和，可保持天然產物構象及有效成分原有藥效。本發明提供的技術方案如下聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術的中藥提取方法，其特徵在 於，它包括以下的步驟1)在一容器中加入中藥，而後加入模擬唾液，在36 38°C下振蕩3 6分鐘；2)而後向上述容器中加入模擬胃液，在36 38°C下繼續振蕩1 4小時，獲得中 藥的體外胃仿生消化液；
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3)向步驟2中獲得的體外胃仿生消化液中加入模擬十二指腸液和模擬膽汁，在 36 38°C下繼續振蕩5 10小時，而後使用孔徑為0. 45 μ m的濾膜抽濾，獲得體外胃腸全 仿生消化液；4)取蛋黃卵磷脂，將其溶於氯仿中，獲得蛋黃卵磷脂的氯仿溶液；將上述溶液移 入具塞的圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器上抽真空旋轉蒸發，使之形成均勻的多層脂質膜，而後 向其中充入氮氣以防止多層脂質膜被氧化；向其中加入步驟3中獲得的體外胃腸全仿生消 化液，將其加入水浴恆溫振蕩器中，在36 38°C下振蕩，使多層脂質膜全部進入全仿生消 化液中，而後在-80 -71°C冷凍lh，在36 38°C下融化，反覆凍融3次後，得到含單層脂 質體的凍融液，該單層脂質體中負載有中藥有效成分群；5)依次用孔徑為0. 45 μ m和0. 22 μ m的濾膜抽濾凍融液，從溶液中分離獲得負載 有中藥有效成分群的單層脂質體(單層脂質體粒徑為0. 3 0. 35 μ m)。本發明建立體外全仿生消化技術並應用於中藥提取的前處理，即一句化學仿生 (人工胃、人工腸)與醫學仿生(酶的作用)原理，建立人體仿生消化體系在不同消化階 段按照不同消化器官在一定時間內分泌出的消化液的成份和量，加入相應的仿生消化液， 再根據中藥不同劑型在人體消化器官中的排空時間合理安排各個階段的消化時間，並模擬 消化器官有規律的蠕動，建立中藥材和中藥水煎液的模擬消化過程，以此來獲得全仿生消 化液，該全仿生消化液更接近藥物在體內達到平衡後的有效成分群，合乎中醫藥理論的系 統觀、整體觀；另外，鑑於消化管和血管間的生物膜是類脂質膜，因此，本發明建立細胞膜仿 生萃取技術，提取可與模擬細胞膜(即單層脂質體)結合的有效成分群，達到中藥成份的活 性化、濃縮化，並具有可直接吸收的特點。模擬唾液、模擬胃液，模擬十二指腸液和模擬膽汁 的組成成分及製備方法可如表1中所示表1模擬唾液、模擬胃液、模擬十二指腸液及模擬膽汁的組成成份及製備方法模擬唾液模擬胃液模擬十二指腸液模擬膽汁IOmL15.7mL40mL30 mL89.6g/LKClNaCl 175.3g/LNaCl 175.3g/LNaCl 175.3g/LIOmL3.0mL40mL68.3 mLKSCN20g/LNaH2P0488.8g/LNaHCO3 84.7g/LNaHCO3 84.7g/LIOmL9.2 mLIOmL4.2 mLNaH2P0488.8g/LKCl 89.6gKH2PO4 8g/LKCl 89.6g/LIOmL18mL6.3 mL0.2 mLNa3P0457g/LCaCl2.2H20 2.2g/LKCl 89.6g/LHCl 37%g/g1.7 mLIOmLIOmLIOmLNaCl 175.3g/LNH4Cl 30.6g/LMgCl2 5g/LCaCl2.2H20 22.2g/L1.8 mL8.3 mL0.18 mLNaOH40g/LHCl 37%g/gHCl 37%g/g9mLCaCl2.2H2022.2g/L8mLIOmL4mL尿素25g/L葡萄糖65g/L尿素25g/LIOmL葡萄糖醛酸2g/L3.4 mL尿素25g/LIOmL33g/L葡萄糖胺鹽酸 ±k145 mg a-澱粉酶m Ig牛血清蛋白Ig牛血清蛋白1.8 g牛血清蛋白15 mg尿酸Ig胃蛋白酶3g胰酶6g膽汁50mg粘液素3g粘液素0.5 g月旨肪酶6.5±0.21.07±0.077.8±0.28.0tt0.2
用鹽酸或氫氧化鉀稀溶液調PH值，用超純水定容至500mL,在4Γ下保存。需要說明的是，人體在患病時，特別是患有消化系統疾病時，消化、吸收能力下降， 影響藥物的吸收，而本方法中獲得的負載有中藥有效成分群的單層脂質體具有高度活性 化、濃縮化、可直接吸收的特點，有助於保證藥效，並減輕消化系統負荷。在推薦的實施例中，還包括將步驟2中獲得的體外胃仿生消化液用孔徑為 0. 45 μ m的濾膜過濾的步驟。本發明中涉及的中藥可以是中藥材或中藥複方的粉劑或水煎液等，且每日/每次 給藥量的粉劑或水煎液中均含有有效劑量的藥物有效成分，在使用粉劑時，每克粉劑中依 次加入模擬唾液2. 0 3. OmL,模擬胃液90 IlOmL,模擬十二指腸液110 135mL和模擬 膽汁40 60mL ；在使用水煎液時，每mL水煎液中依次加入模擬唾液0. 01 0. 03mL,模擬 胃液0.5 0. 7mL,模擬十二直腸液0. 7 0. 9mL和模擬膽汁0. 28 0. 35mL。另外，相對 於粉劑而言，水煎劑在模擬胃液、模擬十二直腸液和模擬膽汁中的消化時間均有所下降。本發明中使用的蛋黃卵磷脂與全仿生消化液的重量體積比是0. 01g/1000mL。
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無機試劑 有機試劑 生物酶押備註
本發明中所述的超純水是指將水中的導電介質幾乎完全去除，又將水中不離 解的膠體物質、氣體及有機物均去除至很低程度的水，電阻率大於18MQ*cm，或接近 18. 3MQ*cm 極限值。與現有技術相比，本發明以單層脂質體為細胞生物膜模型，以單層脂質體-水分 配體系模擬中藥粉劑及水煎液在胃、腸中的全仿生消化液分別在人體胃腸中的分配、吸收 情況，以單層脂質體為固相萃取劑，提取負載有中藥有效成分群的單層脂質體，更合乎中醫 藥理論的系統觀、整體觀。本發明聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術，反 應條件溫和，具有保持天然產物構象及有效成分原有藥效的有益效果。
具體實施例方式實施例1按傳統煎煮方法獲得中藥水煎液，稱取黃芪粉末300g，放入600mL的燒杯中，每次 加超純水400mL，加熱至沸騰並保持微沸約lh，煎煮三次，合併三次煎煮液並加熱濃縮，用 0. 45 μ m濾膜過濾定容至IOOOmL,獲得黃芪的水煎液IOOOmL ；取黃芪的水煎液250mL加入容量瓶中，而後向其中加入模擬唾液5mL，在37°C下恆 溫下振蕩5min ；而後加150mL模擬胃液，繼續在37°C下振蕩2h，獲得405mL體外胃仿生消 化液；在所獲得的405mL黃芪水煎液體外胃仿生消化液中，加入195mL十二指腸模擬液 和75mL模擬膽汁，在37°C下繼續振蕩7h，取消化液用0. 45 μ m濾膜抽濾，獲得675mL體外 胃腸全仿生消化液；將體外胃腸全仿生消化液在4°C下恆溫保存。取0. 250mg蛋黃卵磷脂，將其溶於5mL氯仿中，獲得蛋黃卵磷脂的氯仿溶液；將上 述溶液移入具塞的圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器上抽真空旋轉蒸發lOmin，使之形成均勻的多 層脂質膜，而後向其中充入氮氣以防止多層脂質膜被氧化；向其中加入上述步驟中獲得的 全仿生消化液25mL，將其加入水浴恆溫振蕩器中，在37°C下振蕩0. 5h，使多層脂質膜全部 進入全仿生消化液中，而後在-71 °C冷凍lh，在37°C下融化，反覆凍融3次後，得到含單層脂 質體的凍融液，該單層脂質體中負載有中藥有效成分群；依次用孔徑為0. 45 μ m和0. 22 μ m 的濾膜抽濾所獲得的全部凍融液，從凍融液中分離獲得負載有中藥有效成分群的單層脂質 體(固體，粒徑為0. 3 0. 35 μ m)，冷凍乾燥後得到1. 25mg負載有黃芪水煎液仿生消化液 中有效成分群的單層脂質體；而後重複上述步驟，每次加全仿生消化液25mL，直到675mL的 胃腸全仿生消化液都製成冷凍乾燥的單層脂質體。取黃芪水煎液25mL濃縮成5mL的黃芪濃縮液，作為對照例備用。實施例2按傳統煎煮方法獲得雙黃連水煎液，稱取金銀花375g、黃芩375g和連翹750g，放 入600mL的燒杯中，每次加超純水400mL，加熱至沸騰並保持微沸約lh，煎煮三次，合併三次 煎煮液並加熱濃縮，用0. 45 μ m濾膜過濾定容至IOOOmL,獲得雙黃連水煎液IOOOmL ；取雙黃連水煎液250mL加入容量瓶中，向其中加入模擬唾液2. 5mL,在36°C下恆溫 下振蕩6min ；而後加125mL模擬胃液，繼續在36°C下振蕩4h，獲得377mL體外胃仿生消化 液；向上述獲得377mL體外仿生胃消化液中，加入178mL十二指腸模擬液和70mL模擬膽汁，在36°C下繼續振蕩10h，取消化液用0. 45 4!11濾膜抽濾，獲得6251^體外胃腸全仿生 消化液；將全仿生消化液在4°C下恆溫保存。取0. 250mg蛋黃卵磷脂，將其溶於5. OOmL氯仿中，獲得蛋黃卵磷脂的氯仿溶液； 將上述溶液移入具塞的圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器上抽真空旋轉蒸發lOmin，使之形成均勻 的多層脂質膜，而後向其中充入氮氣以防止多層脂質膜被氧化；向其中加入上述步驟中獲 得的全仿生消化液25mL，將其加入水浴恆溫振蕩器中，在36°C下振蕩0. 8h，使多層脂質膜 全部進入全仿生消化液中，而後在-80°C冷凍lh，在36°C下融化，反覆凍融3次後，得到含 單層脂質體的凍融液，該單層脂質體中負載有中藥有效成分群；依次用孔徑為0. 45 μ m和 0. 22 μ m的濾膜抽濾所得的全部凍融液，從凍融液中分離獲得負載有中藥有效成分群的單 層脂質體(固體，粒徑為0. 3 0. 35 μ m)，冷凍乾燥後得到1. 65mg負載有雙黃連水煎液仿 生消化液中有效成分群的單層脂質體。而後重複上述步驟，每次加體外胃腸全仿生消化液 25mL，直到625mL的胃腸全仿生消化液都製成冷凍乾燥的單層脂質體。取25mL雙黃連水煎液濃縮成5mL雙黃連濃縮液，作為對照例備用。實施例3準確稱取2. 50g桃仁粉末於IOOOmL容量瓶，加7. 5mL唾液，在38°C水浴恆溫下振 蕩3min後，加270mL胃液，繼續在38°C下振蕩lh，獲得桃仁粉末的胃仿生消化液，往其中加 332. 5mL十二指腸液和140mL膽汁，繼續在38°C下振蕩5h，用0. 45 μ m濾膜抽濾，獲得桃仁 粉末的胃腸全仿生消化液750mL，於4°C下保存待用。取0. 250mg蛋黃卵磷脂，將其溶於5. OOmL氯仿中，獲得蛋黃卵磷脂的氯仿溶液； 將上述溶液移入具塞的圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器上抽真空旋轉蒸發lOmin，使之形成均 勻的多層脂質膜，而後向其中充入氮氣以防止多層脂質膜被氧化；向其中加入上述步驟中 獲得的全仿生消化液25. OOmL，將其加入水浴恆溫振蕩器中，在38°C下振蕩0. 8h，使多層脂 質膜全部進入全仿生消化液中，而後在_75°C冷凍lh，在38°C下融化，反覆凍融3次後，得 到含單層脂質體的凍融液，該單層脂質體中負載有中藥有效成分群，依次用孔徑為0. 45 μ m 和0. 22 μ m的濾膜抽濾所得的全部凍融液，從凍融液中分離獲得負載有中藥有效成分群的 單層脂質體(固體，粒徑為0. 3 0. 35 μ m)，冷凍乾燥後得到0. 75mg負載有桃仁粉末仿生 消化液中有效成分群的單層脂質體。而後重複上述步驟，每次加全仿生消化液25mL，直到 750mL的胃腸全仿生消化液都製成冷凍乾燥的單層脂質體約22. 5mg。試驗例1本試驗例探討實施例1中負載有黃芪水煎液仿生消化液中有效成分群的單層脂 質體對小鼠急性化學性肝損傷的保護作用，並使用實施例1中濃縮的黃芪水煎液為對照進 行試驗。本試驗例採用CCl4誘導小鼠急性肝損傷為模型，檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和肝勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷 胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量，HE染色法對肝臟作病理檢查。結果負載有黃芪水煎液 中有效成分群的單層脂質體餵食小鼠後能顯著降低小鼠血清ALT、AST、肝勻漿MDA水平，升 高SOD和GSH-Px酶活性，減輕肝細胞損傷。比單純黃芪水煎液餵食小鼠，作用時間短，療效 更顯著。實驗方法
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分組與給藥KM清潔劑小鼠90隻，雄性，體重(18 22) g，按體重隨機分成4組， 分別為正常組、CCl4模型組、25mL黃芪濃縮液組、負載25mL黃芪水煎液中有效成分群的單 層脂質體。造模前灌胃給藥，負載25mL黃芪水煎液仿生消化液中有效成分群的單層脂質體 冷凍乾燥後稱重後以每次1. 25mg/kg灌胃，25mL黃芪水煎液組濃縮成5mL後，以5mL/kg灌 胃，每天給藥1次，連續7d，正常對照組和模型組給予等量溶媒。末次給藥後lh，除正常組外，其它各組小鼠按10ml/kg體重腹腔注射0. 014精 制花生油溶液，正常組注射相應體積的生理鹽水，禁食18h後，自小鼠後眼眶靜脈叢採血， 取肝臟、脾臟、胸腺稱重作相關指標檢測。觀察指標(1)收集血液，分離血清檢測ALT、AST水平；(2)取肝臟、脾臟、胸腺稱 重，計算肝臟、脾臟、胸腺指數。(3)取肝右葉製備10%肝勻漿，分別採用相關試劑盒測MDA、SOD、GSH-Px0 (4)取 肝左葉經10%甲醛固定，進行組織病理學檢查。統計分析病理組織學檢查結果採用Ridit分析方法，其它數據均以均值士標準 差( Γ 土s)表示，採用ANOVA，Dun-can』 s test進行分析處理。1、黃芪提取物對小鼠血清轉氨酶的影響表2結果顯示，模型組小鼠血清ALT、AS水平顯著升高。與模型組比較，黃芪水煎 液和負載有黃芪水煎液中有效成分群的單層脂質體均均能降低CCl4升高的ALT、AST水平。表2黃芪水煎液及有效成分群的單層脂質體對CCl4所致肝損傷小鼠血清ALT、 AST水平的影響(η= 10, T 士s)
權利要求
聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術的中藥提取方法，其特徵在於，它包括以下的步驟1)在一容器中加入中藥，而後加入模擬唾液，在36～38℃下振蕩3～6分鐘；2)而後向上述容器中加入模擬胃液，在36～38℃下繼續振蕩1～4小時，獲得中藥的體外胃仿生消化液；3)向步驟2中獲得的體外胃仿生消化液中加入模擬十二指腸液和模擬膽汁，在36～38℃下繼續振蕩5～10小時，而後使用孔徑為0.45μm的濾膜抽濾，獲得體外胃腸全仿生消化液；4)取蛋黃卵磷脂，將其溶於氯仿中，獲得蛋黃卵磷脂的氯仿溶液；將上述溶液移入具塞的圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器上抽真空旋轉蒸發，使之形成均勻的多層脂質膜，而後向其中充入氮氣以防止多層脂質膜被氧化；向其中加入步驟3中獲得的體外胃腸全仿生消化液，將其加入水浴恆溫振蕩器中，在36～38℃下振蕩，使多層脂質膜全部進入全仿生消化液中，而後在 80～ 71℃冷凍1h，在36～38℃下融化，反覆凍融3次後，得到含單層脂質體的凍融液，該單層脂質體中負載有中藥有效成分群；5)依次用孔徑為0.45μm和0.22μm的濾膜抽濾凍融液，從溶液中分離獲得負載有中藥有效成分群的單層脂質體。
2.根據權利要求1中所述的聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術的 中藥提取方法，其特徵在於還包括將步驟2中獲得的體外胃仿生消化液用孔徑為0. 45 μ m 的濾膜過濾的步驟。
3.根據權利要求2中所述的聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術 的中藥提取方法，其特徵在於所述的中藥為粉劑，每克粉劑中所依次加入的模擬唾液為 2. 0 3. OmL，模擬胃液為90 IlOmL,模擬十二指腸液為110 135mL，模擬膽汁為40 6 OmL ο
4.根據權利要求2中所述的聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術的 中藥提取方法，其特徵在於所述的中藥為水煎液，每mL水煎液中所依次加入的模擬唾液 為0. 01 0. 03mL，模擬胃液為0. 5 0. 7mL，模擬十二直腸液為0. 7 0. 9mL和模擬膽汁 為 0. 28 0. 35mL。
5.根據權利要求3或4中所述的聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取 技術的中藥提取方法，其特徵在於所使用的蛋黃卵磷脂與全仿生消化液的重量體積比是 0. 01g/1000mL。
全文摘要
本發明提供了一種聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術的中藥提取方法，該中藥提取方法主要包括以下的步驟在不同消化階段按照不同消化器官在一定時間內分泌出的消化液的成份和量，加入相應的仿生消化液(模擬唾液、模擬胃液、模擬十二指腸液和模擬膽汁)，再根據中藥不同劑型在人體消化器官中的排空時間合理安排各個階段的消化時間，獲得全仿生消化液；而後以單層脂質體-水分配體系模擬全仿生消化液在人體胃腸中的分配、吸收情況，得到負載有中藥有效成分群的單層脂質體。本發明聯合應用全仿生消化技術和細胞膜仿生固相萃取技術，反應條件溫和，具有保持天然產物構象及有效成分原有藥效的有益效果。
文檔編號A61K36/00GK101961355SQ20091011273
公開日2011年2月2日 申請日期2009年10月27日 優先權日2009年10月27日
發明者李順興, 鄭鳳英 申請人:漳州師範學院