預測物質的磷脂沉積症誘導特性的方法

2023-11-05 02:12:02 1

專利名稱：預測物質的磷脂沉積症誘導特性的方法
技術領域：
本發明涉及確定物質例如藥物化合物、或者藥物、或者藥物或食品添加劑的ADME-tox性質，這些物質在下文中在本說明書中有時總體稱為藥物 (dmg)，但不限於藥物。具體而言，本發明的目的是預測藥物的磷脂沉積症 (phospholipidosis)誘導或磷脂原性(phospholipidogenic)特性(在細胞中積累磷 脂)的方法，即預測藥物誘導的磷脂沉積症的方法。最有可能導致磷脂沉積症的化合物是陽離子的和兩親性的，通常稱作 CAD(陽離子兩親性藥物)。目前關於磷脂沉積症的基本機理的觀點為這些藥 物與磷脂形成複合物(complex),從而抑制磷脂降解酶的功能，並且由於削弱的降解以及增強的合成而導致磷脂在溶酶體中的積累。為此，需要評價可能 有用的化合物與脂質的結合的方法。本發明的目的在於通過評價所加入的物 質(通常為藥物)對陰離子表面活性劑(有利地為磷脂)的表面活性性質，尤其 是臨界膠束濃度(CMC)的影響來評價所述物質與所述陰離子表面活性劑的 相互作用。
背景技術：
存在若干種測定CMC的技術，例如螢光分析、光散射、超聲吸收、電 導率、接觸角和表面張力或表面壓力測量法。化合物的疏水性通常通過測量 它們在辛醇/水兩相體系中的分配係數(logP)來確定。兩親性和去汙性通常通 過測量物質對水的表面張力的影響來確定。磷脂沉積症(PLD)是已知的由某些藥物組分和藥物引起的副作用。磷脂 積累在細胞中，例如積累在肺、腎和肝中。磷脂在組織中的大量積累影響組 織正常的生理功能。特別是當長期使用藥物時該問題加重，因為較大量的磷 脂可以積累在細胞中。這又可導致慢性、不可逆的磷脂沉積症和器官衰竭。 對於醫藥行業來說這是嚴重而又費錢的問題，尤其是在藥物上市之後該問題 變得明顯因而必須從市場上撤回該藥物的情況下更是如此。目前存在兩種測試藥物是否會引起PLD的常用方法。 一種是使用細胞培養物並使用檢測在細胞中由藥物誘導的變化的方法。除了勞動密集之外， 該方法的缺點還在於這些分析中的再現性、尤其是實驗室之間的再現性傾向 於是差的。同樣地，細胞培養物需要持續的照顧，並且由於傳代培養中的遺 傳選擇，細胞培養物容易感染、容易受到生長環境的變化和細胞系的不穩定性的影響。另一種方法是使用動物試驗。以上兩種方法都是花錢多的，因此它們僅 可在藥物的後期開發過程中使用，並且都不適於新的藥物化合物的大規模篩 選，例如在先導化合物的優化中進行的大規模篩選。因此需要在開發過程早期揭示可能的PLD誘導特性的試驗，因為開發新藥物的成本隨著向產品開 發流水線末端的發展成指數級增加。這樣的試驗將在藥物開發中既省錢又省 時間，因為其可以識別併合理排除可能引起PLD的化合物。而且該信息還 可用於通過合適地調節化合物的物理化學性來改善化合物的化學性從而減 少其誘導PLD的可能性。發明內容本發明涉及預測物質呈現磷脂沉積症誘導特性的風險的方法，所述方法 包括將所述物質加入陰離子表面活性劑中以提供所述物質和表面活性劑的 混合物，並通過測定該混合物的臨界膠束濃度(CMC)來確定所述物質對所述 陰離子表面活性劑的CMC的影響，與添加所述物質之前所述表面活性劑的 CMC相比，所述混合物的CMC的降低表明所述物質具有呈現磷脂沉積症誘 導特性的風險。根據本發明，該方法 一 方面包括可將物質和表面活性劑的混合物的 CMC與純表面活性劑的CMC對比，由此與純表面活性劑相比，CMC的降 低表明，所述物質具有呈現磷脂沉積症誘導特性的風險。根據一個實施方式， 本發明還包括可將物質和表面活性劑的所述混合物的CMC與物質和表面活 性劑的第二混合物(其在表面活性劑中具有不同的物質濃度)的CMC對比，由於物質在其和表面活性劑的混合物中濃度的升高所導致該混合物的CMC 的降低表明，所述物質具有呈現磷脂沉積症誘導特性的風險。因此，如果物 質在第二混合物中的濃度低於其在所述混合物中的濃度，則與第二混合物的 CMC相比，所述混合物的CMC的降4氐表明，所述物質具有呈現磷脂沉積症 誘導特性的風險。所述後一可能性當然還意味著，由於物質在其和表面活性劑的混合物中 濃度的降低所導致的該混合物的CMC的升高表明，所述物質具有呈現磷脂 沉積症誘導特性的風險。因此，根據本發明的方法總體上包括如下步驟增加物質在陰離子表面 活性劑中的濃度，並通過測定物質和表面活性劑的混合物的CMC來確定所 述物質對所述陰離子表面活性劑的臨界膠束濃度(CMC)的影響，與增加所述 物質在所述表面活性劑中的濃度之前表面活性劑的CMC相比，該混合物的 CMC的降低表明，所述物質具有呈現磷脂沉積症誘導特性的風險。增加物質的濃度包括將該物質加入到不含該物質的純的表面活性劑中、 以及將該物質加入到該物質和表面活性劑的混合物中以增加該物質在表面 活性劑中的濃度。


在圖1中，顯示了測量的表面壓力兀與無量綱(除以mol/l)濃度的自然對 數ln(c/M)的關係圖的兩個實例純的DC8PS( 1,2-二辛醯基-s"-丙三氧基-3-[磷 酉吏-L-絲氨酉吏])(1 ，2-dioctanoyl隱sw-glycero隱3-[phospho-L隱serine])(口)、 和慶大審 素:DC8PS = 1:100)。點劃線和箭頭示意性地顯示獲得CMC的原理。圖2顯示CMC與藥物:脂質比的關係曲線的實例。連接線僅用於引導視 線。各符號如下氯氮平(B)、氟哌啶醇(o)、 l-苯基哌嗪(T)、氯丙嗪(羅)、 丙嗪(o)、心得安(羅)、乙胺碘呋酮(鎏)、慶大黴素(O)、和心舒寧(V)。圖3顯示產生對CMC最大影響一半的藥物:脂質比111/2與用最高達1:2 的藥物:脂質比所得到的CMC最小值的關係。各符號表示四組中之一的類別 第l組O):沒有引起磷脂沉積症的可能性；第2組在培養細胞中導致 磷脂沉積症，但在動物中具有低的導致磷脂沉積症的可能性；第3組0): 已知在動物中導致磷脂沉積症；和第4組(f):已在人類中導致磷脂沉積症 的物質(參見Ploeman, J,R H. T. M.， J. Kelder, T. Hafmans， H. van de Sandt, J. A. van Burgsteden, P. J. M. Salemink， and E. van Esch (2004)， Use of physicochemical calculation of pKa and CLogP to predict phospholipidosis-inducing potential: A case study with structurally related piperazines，五wr. 7b:dc.屍a/Zzo/.;以及Morelli， J. K., M. Buehrle, F. Pognan， L R. Barone， W. Fieles, and P. J. Ciaccio (2006), Validation of an in vitro screen forphospholipidosis using a high-content biology platform. Ce〃所o/. 7b:dco/.)。各縮 寫如下ama:金剛烷胺、amio-乙胺碘呋酮、amit-阿米替林、bus-丁螺 i走酮、clomi =氯丙n米口秦、cloz-氯氮平、clq-氯p查、cpz二氯丙"秦、desi =去 曱丙咪嗪、doxo-阿黴素、gmen-慶大黴素、hp-氟哌啶醇、hyz:羥嗪、 imi =丙咪口秦、kcz =酉同康唾、map =麥普替林、mia =米安色林(mianserin)、 nort =去曱替林、l-php = l匿苯基。底嚷、phx =心舒寧、prom =丙。秦、prop =心 得安、tcyc =四環素、和thio =曱碌u。達。秦。
具體實施方式
當溶液中表面活性劑的濃度增加時，其化學勢增加。化合物或物質在溶 液中的化學勢(Atkins, P. W,， Physical Chemistry,第五版，Oxford University Press, 1997)可視為表示將少量化合物加入到溶液中時體系自由能增加的系 數。在一些濃度下，體系將達到化學勢足以形成表面活性劑聚集體(通常為 膠束)的點，並且該濃度下過量的單體將形成聚集體或膠束，而低於該濃度 時則看不到聚集體，由此得名為臨界膠束濃度。在該點之後濃度的進一步增 加將不再顯著增加溶液中單體的濃度，而僅導致膠束數量的增加。在表面活 性劑和也可為表面活性劑的另 一化合物的混合物中，該混合物的臨界膠束濃 度取決於這兩種化合物之間相互作用的自由能。如果該表面活性劑和該另一 化合物之間的相互作用是有利的，則該混合物的臨界膠束濃度將低於單獨的 表面活性劑的臨界膠束濃度，或者低於其中該化合物濃度較低的混合物的臨 界膠束濃度。因此，藥物對表面活性劑的CMC的影響反映了藥物與表面活性劑之間 的相互作用自由能。這是令人感興趣的，因為已推測藥物與表面活性劑如磷 脂形成緊密的複合物的傾向會導致磷脂沉積症。藥物與表面活性劑的相互作 用自由能也說明了這種形成複合物的趨勢。以上圖示的試驗證明，測量藥物 對表面活性劑的CMC的影響提供了預測藥物誘導磷脂沉積症的可能性的良 好方法。然而，在生物膜和細胞中通常遇到的磷脂通常具有長的烷基鏈或醯 基鏈，即它們在其鏈中具有若干碳原子，通常具有14個以上的碳原子。這 種長鏈磷脂的CMC通常在納摩爾範圍內或低於納摩爾範圍，因此這對於這 裡使用的任何類型的實際測量來說都太小，就更不用說用於高通量篩選研究 了。本發明因此具有兩個方面使用藥物對表面活性劑CMC的影響來報告該藥物與表面活性劑(活細胞中的磷脂)形成複合物並引起磷脂沉積症的趨勢；和使用表面活性劑(有利地為短鏈磷脂)使得這些測量在實驗上是可行的。 根據本發明的一個實施方式，評價物質呈現磷脂沉積症誘導特性的風險 的方法還包括如下步驟測量所述物質在表面活性劑中的溶液在空氣-水界況，或者對於所述物質在表面活性劑中具有至少 一種濃度和對於純的表面活 性劑的情況，由該表面張力與表面活性劑濃度(例如其自然對數)的函數來確 定臨界膠束濃度(CMC)根據本發明的方法還包括評價物質:表面活性劑比Rw(其中CMC降低了 由增加物質:表面活性劑比所得到的CMC最大變化的50%)，並且將得到的 物質:表面活性劑比111/2與R1/2的預定邊界限(boundary-limits)對比；和/或評 價所述物質在表面活性劑中的最小CMC並將其與最小CMC的預定邊界限 對比；以及基於所述對比將藥物分類為至少兩個風險組(例如指示所述物質 誘導磷脂沉積症的風險的組或對所述物質誘導磷脂沉積症的風險進行分類 的組)之一。根據本發明，用於確定對CMC的影響的物質/表面活性劑摩爾比為0.0 ~ 2.0，優選為0.0~ 1.0或者0.0~0.5,即從純的表面活性劑(不含物質)至最高 達每摩爾的表面活性劑2摩爾的物質，通常為最高達每摩爾的表面活性劑0.5 摩爾的物質。在本發明的優選實施方式中，用於確定CMC的樣品體積可最高達50 |ul 且表面活性劑的濃度可最高達5mM。根據本發明的優選實施方式，對於物質和表面活性劑之間的至少一個比 值，通過分別測定純表面活性劑的CMC和含有所述物質的表面活性劑的 CMC來確定物質對CMC的影響。根據本發明，與相同的濃度的具有較差的CMC降低效應的物質相比， 具有較強的CMC降低效應的物質具有磷脂沉積症誘導特性的風險較大，和/ 或與需要較高濃度的物質來產生相同降低量的物質相比，具有較小的濃度即 足以引起CMC的預定降低量的物質具有磷脂沉積症誘導特性的風險也較 大。根據本發明的優選實施方式，陰離子表面活性劑是在所有鏈中總共含有 最多28個碳原子、優選10 28個碳原子，並通常在一個碳鏈中含有4 12個碳原子的磷脂。用於本發明的典型磷脂為磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯肌醇和磷脂醯肌醇磷酸，和以上物質各自的溶血脂質(lysolipid)、 過氧化脂質、氧化脂質、縮醛磷脂和二烷基脂質變體，以及具有足夠短的疏 水鏈以具有高於約l|iM的CMC的陰離子磷脂類似物和陰離子表面活性劑， 例如烷基和醯基磷酸酯或磷酸單曱酯等。根據本發明，還可使用表面活性劑的混合物。有利地使用藥物與表面活性劑的摩爾比為0~1的物質和表面活性劑的 混合物測量表面張力或表面壓力(其為純表面的表面張力-在物質的存在下 表面的表面張力)。通常需要至少4-5個點用於可靠地評價R,/2。根據本發明，可將藥物溶解在合適的溶劑例如DMSO或醇中。可簡單有效地進行表面活性(張力或壓力)測量，例如使用多孔板(well plate)進行測量，其中在多孔板的各行和列中具有例如不同的藥物和不同的藥 物濃度。 一種可用於這種表面活性測量的裝置為Kibron Inc.的MultiPi裝置。圖1顯示了使用表面壓力測量確定CMC的實例。 一旦本體濃度達到了 CMC，則表面壓力不再隨著濃度的進一步增加而顯著增加，因為濃度的這種 增加不再增加本體中的單體濃度和化學勢。基於該評價的CMC值，可作出 CMC與藥物:脂質比的關係曲線圖，如圖2所示。根據本發明的 一個實施方式，可使用三次插值函數(cubic interpolation function)來得到其中CMC降低50 %即CMC = V2(p+m)的藥物:表面活性劑比 R1/2,其中p為在純表面活性劑中所得到的CMC,且m為含有藥物的表面活 性劑的最小CMC。參考圖3，根據本發明的一個實施方式，將藥物的藥物:脂質比R^與限 定藥物誘導磷脂沉積症的不同風險的四個預定組的R!/2的預定邊界限對比。 而且可測定藥物的最小CMC並將其與最小CMC的相應邊界限對比。所述 四個風險組可定義為第l組沒有引起磷脂沉積症的可能性；第2組具 有低的導致磷脂沉積症的可能性；第3組已知在動物中導致磷脂沉積症； 和第4組已知在人類中已導致磷脂沉積症。邊界限是基於通過常規方法對 物質是否引起磷脂沉積症而進行的測試。評價所確定的結果的方法需要一組已知的化合物的磷脂原性可能性的 一些參考數據。這些數據可例如由細胞或動物實驗得到。使用來自這些參考 數據的值可對磷脂沉積症的風險水平進行歸類(assign)，該風險水平與最大CMC降低和R!,2的不同的測試參數值有關(參見圖3)。基於磷脂原性可能性 已知的化合物所歸屬的風險水平可評價未知化合物的磷脂原性可能性。根據本發明，如果藥物顯示任選地與高的最小CMC組合的高的R1/2， 則該藥物可分類為具有低的誘導磷脂沉積症的風險的藥物。另一方面，低的 111/2和/或低的最小CMC表明該藥物具有高的誘導磷脂沉積症的風險，這可 從例如圖3明顯看出。測試顯示，化合物與短鏈磷脂形成複合物的趨勢的直接測量與這些化合 物引起磷脂沉積症的趨勢良好地相關，並由此可用於評價未知化合物誘導磷 脂沉積症的可能性。實施例在實施例中，稱重並溶解適量的藥物粉末以製備62.5 mM的儲液(stock)， 並由該儲液製備12.5 mM和2.5 mM的稀釋液。在DMSO中製備儲液，除了 溶於水但不溶於DMSO的慶大黴素和既不溶於DMSO也不溶於水而必須溶 解在乙醇中的三苯氧胺之外。將磷脂1,2-二辛醯基-^-丙三氧基-3-[磷酸丄-絲氨酸](DQPS)溶於氯仿中，其濃度是通過使用高精度微量天平測定重量而 確定的。首先，製備磷脂溶液，將適量的溶於氯仿中的DC8PS轉移到新的試管 中並在溫和的氮氣流下蒸發至乾燥。接下來，將含有0.1 mMEDTA的20 mM HEPES緩沖液(pH 7.4)加到該乾燥的脂質上以產生5 mM的DC8PS濃度，並 劇烈混合樣品，隨後在60。C下溫育30分鐘，劇烈混合，並在60。C下再次溫 育30分鐘。然後使用移液管將各溶液吸移到96孔板中。首先，將175 pl的5 mM DC8PS溶液加入96孔板(其含有8行和12列)的第一列的各孔中。向所有其 它孔中加入105 pil的HEPES緩沖液。接下來，將7 pi的藥物儲液加入到第 一列的孔中。不同的藥物儲液即62.5 mM、 12.5 mM、和2.5mM的藥物儲液 分別提供1:2、 1:10、和l:50的藥物/磷脂摩爾比。在一些情況下，還測得1:1 的摩爾比，而這需要向第一列加入14 |Lll的藥物儲液。所有測量的每個板還含有其中僅加入代替藥物的7plDMSO的一行。因此，各板含有僅具有磷脂 的 一行和具有不同的藥物和/或不同的藥物:磷脂比的七行。使用多通道自動移液管混合第一列各孔中的內容物，然後將第 一列中70|Lll的溶液轉移到第二列中105W的緩沖液中。接下來，混合第二列各孔中的內容物，並將70^il的溶液轉移到第三列各孔中105nl的緩衝液中，並且像 這樣一列接一列地繼續下去直到達到第七列。這在後續各列之間產生大約 0.4的稀釋因子。這在不同列中產生大約如下的磷脂濃度(列數示於括號內) 5.0mM(1)、 2.0 mM (2)、 0.80 mM (3)、 0.32 mM (4)、 0.128 mM (5)、 51 ,(6)、 20|aM(7)、 8.2,(8)、 3.3|iiM(9)、 1.3拜(10)、 0.52 pM (11)、和0(12)。 於是不同的行含有例如以下組成A行中僅含磷脂、B行中藥物1:磷脂= 1:50、 C行中藥物1:磷脂=1:10、 D行中藥物l:磷脂=1:2、 E行中藥物2:磷 月旨=1:50、 F行中藥物2:磷脂l:10、 G行中藥物2:磷脂=1:2、和H行中藥 物3:磷脂=1:50。用移液管從96孔板各個孔中吸移50 pi的溶液並將其轉移到Kibron測 量板上相應的孔中，然後讓該分配物穩定10~ 15分鐘。此後，使用Kibron Delta-8多通道表面張力計測量各個孔中的表面張力，並通過使用專用軟體 評價達到最小表面張力(最大表面壓力)時的濃度而獲得臨界膠束濃度。
權利要求
1.預測物質呈現磷脂沉積症誘導特性的風險的方法，所述方法包括將所述物質加入到陰離子表面活性劑中以提供所述物質和表面活性劑的混合物，並通過測定該混合物的臨界膠束濃度(CMC)來確定所述物質對所述陰離子表面活性劑的CMC的影響，與添加所述物質之前所述表面活性劑的CMC相比，CMC的降低表明所述物質具有呈現磷脂沉積症誘導特性的風險。
2. 權利要求1的方法，包括將物質和表面活性劑的所述混合物的CMC 與純表面活性劑的CMC對比，與純表面活性劑相比，CMC的降低表明所述 物質具有呈現磷脂沉積症誘導特性的風險；或者將所述混合物的CMC與由 物質和表面活性劑組成的含有不同濃度物質的第二混合物的CMC對比，由 該物質在該表面活性劑中濃度的升高所導致的CMC的降低表明，所述物質 具有呈現磷脂沉積症誘導特性的風險。
3. 權利要求l的方法，進一步包括如下步驟測量所述物質在所述表面活性劑中的溶液在空氣-水界面處的表面張力；濃度的情奪況，或者對於所述物質在所述表面活性劑中具有至少一種濃度和對於純的表面活性 劑的情況，由該表面張力相對於該表面活性劑濃度的函數來確定臨界膠束濃度(CMC)。
4. 權利要求1 ~3中任一項的方法，包括確定當CMC降低了由增加物質:表面活性劑比所得到的CMC最大變化 的50 %時的物質:表面活性劑比R1/2;將所得的物質:表面活性劑比R!/2與111/2的預定邊界限對比；和/或確定 所述物質在表面活性劑中的最小CMC並將其與最小CMC的預定邊界限對 比；和基於所述各對比，將藥物分類為至少兩個風險組之一，所述風險組例如 指示所述物質誘導磷脂沉積症的風險或對所述物質誘導磷脂沉積症的風險 進行分類。
5. 權利要求4的方法，其中所述Rw對應於當CMC的值為CMC=V2(p+m) 時的物質/表面活性劑的比，其中p為在純的脂質中得到的CMC,且m為對含有該物質的表面活性劑所測定的最小CMC 。
6. 權利要求3的方法，其中所述函數為繪製的曲線。
7. 前述權利要求中任一項的方法，其中所述表面活性劑為磷脂。
8. 權利要求7的方法，其中所述磷脂為磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、 磷脂酸、磷脂醯肌醇或磷脂醯肌醇磷酸，或者前述物質的溶血脂質、過氧化 脂質、氧化脂質、縮醛磷脂、或二醚脂質(二烷基脂質)衍生物，磷脂類似物， 或類磷脂陰離子表面活性劑，其中所述磷脂在所有鏈中加起來的碳原子總數 少於28個。
9. 前述權利要求中任一項的方法，其中所述物質溶解在水溶性溶劑如 DMSO中。
10. 前述權利要求中任一項的方法，其中所述物質為兩親性和/或陽離子性物質。
11. 前述權利要求中任一項的方法，其中所述物質為藥物化合物。
12. 權利要求4的方法，其中使用四個風險組來指示所述物質誘導磷脂 沉積症的風險。
13. 權利要求12的方法，其中所述四個組定義為第l組沒有引起 磷脂沉積症的可能性；第2組具有低的導致磷脂沉積症的可能性；第3組 已知在動物中導致磷脂沉積症；和第4組已知已在人類中導致磷脂沉積症。
14. 前述權利要求中任一項的方法，包括在最高達2.0,優選最高達l.O 的範圍內的物質/表面活性劑摩爾比下測定CMC。
15. 前述權利要求中任一項的方法，其中用於測定CMC的樣品體積最 高達50 nl且所述表面活性劑的濃度最高達5mM。
16. 前述權利要求中任一項的方法，包括對於至少一個物質/表面活性劑 比值，測定純表面活性劑的CMC以及含有所述物質的所述表面活性劑的 CMC。
全文摘要
本發明涉及預測物質呈現磷脂沉積症誘導特性的風險的方法，該方法包括將所述物質加入到陰離子表面活性劑中以形成所述物質和所述表面活性劑的混合物，並通過測定該混合物的臨界膠束濃度(CMC)來確定所述物質對所述陰離子表面活性劑的CMC的影響，與添加所述物質之前所述表面活性劑的CMC相比，CMC的降低表明所述物質具有呈現磷脂沉積症誘導特性的風險。
文檔編號G01N33/50GK101600964SQ200780050942
公開日2009年12月9日 申請日期2007年12月4日 優先權日2006年12月5日
發明者帕沃·金納南, 朱哈-馬蒂·阿拉科斯凱拉 申請人:帕沃·金納南