一種腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統及其應用的製作方法

2023-11-05 06:30:57 2

專利名稱：一種腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬製藥領域，涉及一種用於腫瘤治療的主動靶向免疫脂質體載體，具體涉及一種腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統。
背景技術：
臨床上常用於惡性腫瘤的治療方案包括外科手術、放射治療、藥物化療和基因(免疫)療法等。其中藥物化療應用範圍較廣，不僅可以單獨用於治療，也可用於其它治療方案的輔助治療或鞏固治療。化療藥物的一般給藥形式進入體內後，半衰期較短，分布廣泛。為達到療效，有時只能採用大劑量衝擊的方式進行治療，因此往往治療藥物在殺傷腫瘤的同時，對正常機體組織造成較大的損傷，帶來較大的毒副作用。為了實現降低毒副作用、提高化療藥物療效的目標，一個有效的方式就是通過藥物劑型、藥物修飾等的手段實現化療藥物的靶向傳遞，即最大限度地增加特定部位(如腫瘤)的藥物濃度，減少化療藥物在正常組織器官中的分布。
腫瘤的靶向治療是利用腫瘤組織的某些生理特徵或腫瘤細胞所具有的區別於正常細胞的某些特異性結構分子作為靶點，使用特定的遞藥系統或能與靶分子特異結合的單抗、配體等靶向腫瘤的治療方法。腫瘤壞死治療(Tumor NecrosisTherapy，TNT)是靶向治療的有效方法之一。相對於正常細胞，腫瘤細胞增殖迅速並伴有異常分化，過快的細胞增殖引起瘤組織內部的血供障礙，從而引發細胞變性壞死。腫瘤組織內的微血管也因為快速增長和瘤細胞某些分泌成分的作用，在結構和功能上呈現出某些缺陷如細胞膜成分缺失，通透性增強等。這種缺陷有利於瘤組織的血流和營養灌輸，也為靶向分子的通透並與靶點結合提供了幫助。在腫瘤壞死部位，細胞壞死後暴露出DNA和組蛋白，形成TNT治療的靶點(Sharifi J，et al.Hybridoma and Hybridomics.2001，20305-312；Gaffar SA，et al.Journal of Immunoassay.1991，121-14)。TNT治療的原理是利用腫瘤組織微血管和細胞膜「易漏」(leaky)的特點，利用能與細胞核抗原成分特異性結合的靶向分子將放射性核素、藥物或蛋白靶向至腫瘤壞死部位，殺傷與壞死細胞相鄰的腫瘤細胞，從而擴大腫瘤細胞壞死的範圍，造成對腫瘤的特異性殺傷。
美國專利US6017514和US6071491公開了相關抗原為細胞內DNA和組蛋白的腫瘤壞死靶向單抗的製備及其在壞死組織檢測和腫瘤治療的應用。人鼠嵌合抗腫瘤細胞核單克隆單抗(chimeric Tumor Necrosis Therapy-3 monoclonalantibody，chTNT-3)是一種能特異性地結合腫瘤壞死區壞死細胞DNA的腫瘤壞死靶向單抗。chTNT-3是小鼠單抗可交區(Fv)基因與人單抗恆定區(Fc)基因的嵌合重組產物，人源部分佔70％，鼠源部分佔30％。由於採用人源化嵌合技術，chTNT-3大大降低了機體內人抗鼠抗體(Human anti-mouse antibody，HAMA)的產生。常規腫瘤細胞單抗只對特定腫瘤的細胞膜抗原有特異性親和，對於不同種類的腫瘤，需要採用相對應的不同品種的單抗進行治療。chTNT-3避開了這一局限，其對應的核抗原DNA、組蛋白等結構成分是細胞中的基本成分，由於血管和細胞膜的選擇性通透作用，只有在壞死細胞或病變細胞中能與chTNT-3接觸作用。由於許多腫瘤細胞在快速增殖期都會出現壞死，因此chTNT-3對一系列腫瘤，如肝癌、肺癌、腦癌、結腸癌等均有效，具有一定的廣譜性(Spicer KM，etal.Journal of Nuclear Medicine.2000，41272P-272P)。
脂質體是一種由磷脂雙分子層構成的具有水相內核的脂質微囊。親水性藥物可以被包封在脂質體的內水相中，親脂性藥物可以被包封在雙分子層中，兩親性藥物(弱酸或弱鹼)可以通過遠程載藥法包載藥物，如硫酸銨法包載阿黴素(HaranG，et al.Biochimica Et Biophysica Acta.1993，1151201-215)或pH梯度法包載長春新鹼(Boman NL，et al.Cancer Research.1994，542830-2833)。通過在脂質體的表面修飾PEG等親水性高分子克服了普通脂質體在體內循環系統滯留時間短迅速被清除的缺點，使脂質體能夠通過增強的通透性和滯留性(Enhanced Permeabilityand Retention，EPR)效應在實體腫瘤部位蓄積；在長循環的基礎上將特定的單抗或受體配基共價連接到脂質體表面製得空間穩定主動靶向脂質體，能識別相對應的抗原或受體，提高脂質體對腫瘤部位的選擇性，進一步減少化療藥物對正常機體的損傷。
生物素(Biotin)又稱維生素H，分子量為244.31Da，等電點約3.5，其結構中含一個咪唑環和一個噻吩環。親和素(Avidin，Av)是一種來源於雞蛋清的糖蛋白，分子量為約66kDa，等電點約10，由四個完全相同的亞基組成，每個亞基可通過其色氨酸與生物素分子中的咪唑酮環結合。親和素與生物素的親和力非常高(Kd為10-15mol/L)，遠高於抗原-抗體的親和力(Kd為10-11mol/L)，兩者結合快且不可逆，並可在較長時間內保持高度穩定性。鏈黴親和素(Streptavidin，SAv)來源於細菌Streptomyces avidinii，分子量60kDa。SAv與Av一樣由四個相同亞基組成，與生物素的親和力也與Av類似，但SAv不含糖基側鏈，是一種接近中性的蛋白(pH約5～6)，因此與帶電分子和細胞膜糖受體的非特異性結合均很低(Fan CZ.Pharmaceutical Sciences.2002，Master23-29；吳湖炳，et al.國外醫學·放射醫學核醫學分冊.1998，22248-251)。由於生物素與(鏈黴)親和素之間強烈的特異性結合作用，生物素-(鏈黴)親和素系統(Biotin-avidinsystem，BAS)被廣泛地應用於生物分析和腫瘤放射免疫顯像。

發明內容
本發明的目的是提供一種生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體給藥系統，以提高抗腫瘤藥物治療效果。
本發明需要解決的技術問題是，提供一種生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體給藥系統，該系統包括生物素化腫瘤壞死靶向單抗和表面PEG末端共價連接鏈黴親和素或親和素的空間穩定脂質體。脂質體內水相中包載抗癌化療藥物。
本發明的目的通過下述技術方案實現採用生物素化腫瘤壞死靶向單抗chTNT/B和鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體，給藥時首先給予chTNT/B預定位於腫瘤壞死部位，後給予鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體。
本發明所述的腫瘤壞死靶向單抗為人鼠嵌合抗腫瘤細胞核單克隆單抗chTNT-1、chTNT-2和chTNT-3中的一種，優選為chTNT-3。
本發明所涉及的表面可連接鏈黴親和素或親和素的空間穩定脂質體，其組分和摩爾含量百分比是高相變溫度磷脂醯膽鹼48％～68％膽固醇 30％～50％甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺 1％～15％吡啶二硫丙醯胺-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺0.2％～5％所述的高相變溫度磷脂醯膽鹼為二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)或氫化蛋磷脂醯膽鹼(HEPC)。
所述的膽固醇(CHOL)級別為分析純或分析純以上。
所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺結構通式為mPEG-PE，其中mPEG為甲氧基聚乙二醇，PE為磷脂醯乙醇胺。其中mPEG分子量為1000～10000，更佳的分子量為2000～5000；PE是二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、氫化大豆磷脂醯乙醇胺(HSPE)、氫化蛋磷脂醯乙醇胺(HEPE)、大豆磷脂醯乙醇胺(SPE)或蛋磷脂醯乙醇胺(EPE)其中的一種，優選DSPE或HSPE。
所述的吡啶二硫丙醯胺-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺結構通式為PDP-PEG-PE，其中PDP為吡啶二硫丙醯基，PEG為聚乙二醇，PE為磷脂醯乙醇胺。涉及的PEG分子量為1000～10000，更佳的分子量為2000～5000；PE可以是二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、氫化大豆磷脂醯乙醇胺(HSPE)、氫化蛋磷脂醯乙醇胺(HEPE)、大豆磷脂醯乙醇胺(SPE)或蛋磷脂醯乙醇胺(EPE)其中的一種，優選DSPE或HSPE。
甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺和吡啶二硫丙醯胺-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺中聚乙二醇的分子量有關，通常吡啶二硫丙醯胺-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺中聚乙二醇的分子量要大於或等於甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺中聚乙二醇的分子量。本發明優選甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺中聚乙二醇的分子量為2000，吡啶二硫丙醯胺-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺中聚乙二醇的分子量為3350或2000。
本發明的主動靶向免疫脂質體的製備涉及表面含PDP活性基團的空間穩定脂質體的製備，其方法如下將高相變溫度磷脂醯膽鹼、膽固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺和吡啶二硫丙醯胺-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺溶於氯仿，旋轉蒸乾成膜後置真空乾燥器中繼續乾燥超過2h。用緩衝液水化後，用高壓均質機分別通過孔徑為200nm和100nm核孔膜，得到小單室脂質體。
所用水化緩衝液為0.155mol/L硫酸銨溶液或50mmol/L鈣黃綠素水溶液。所用水化溫度為55℃～70℃。
本發明採用下述方法製備生物素化腫瘤壞死靶向單抗生物素氨基己糖酸-3-磺酸基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(Sulfo-NHS-LC-biotin)與chTNT-3按2～30摩爾比反應，分離純化後得到生物素取代度為2～15的生物化腫瘤壞死靶向單抗(chTNT-3/B)。
腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統中脂質體表面共價連接的蛋白可以是親和素或鏈黴親和素，優選為鏈黴親和素。
表面共價連接鏈黴親和素的空間穩定脂質體的製備方法如下鏈黴親和素經琥珀醯亞胺馬來醯亞胺苯基丁酸酯(SMPB)衍生化得馬來醯亞胺苯基丁醯基鏈黴親和素(MPB-SAv)；PDP脂質體經二硫蘇糖醇(DTT)還原成表面帶巰基的空間穩定脂質體後，與MPB-SAv反應過夜，經Sepharose CL-4B凝膠柱分離純化收集脂質體組分，即得表面共價修飾鏈黴親和素的空間穩定脂質體(SAv-SL)。其平均粒徑為80nm～150nm。
本發明涉及的生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統給藥時首先給予chTNT-3/B預定位於靶細胞或腫瘤壞死部位，間隔6～96h後給予SAv-SL，利用生物素和鏈黴親和素之間的特異性結合作用將脂質體靶向至腫瘤組織。優選時間間隔為12h～48h。
本發明涉及的生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統的體外靶向性評價通過其與固定Raji細胞的結合量來驗證。Raji細胞經化學處理(多聚甲醛，丙酮固定)後細胞膜的選擇性通透特性被破壞，核抗原在細胞內固定下來，但細胞的基本結構仍然得到較完整的保留。試驗結果表明，包載鈣黃綠素的生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體均能夠特異性地靶向固定Raji細胞內的核抗原，與固定Raji細胞的結合量均顯著高於陰性對照組，與腫瘤靶向壞死靶向單抗-空間穩定脂質體相當。
包載化療藥物阿黴素的脂質體對惡性腫瘤的治療作用與脂質體在血循環中的滯留時間和在腫瘤部位的蓄積量直接相關。對於非主動靶向的空間穩定脂質體而言，由於其半衰期較長，能夠通過EPR效應在腫瘤部位蓄積；主動靶向脂質體由於脂質體表面修飾了單抗或鏈黴親和素，血中滯留時間與非主動靶向的空間穩定脂質體相比有所縮短，但由於對腫瘤壞死部位的主動選擇性增強，因此其在腫瘤部位蓄積量高於空間穩定脂質體，抗腫瘤活性亦高於後者。
本發明涉及的給藥系統能將化療藥物攜帶至腫瘤壞死部位，化療藥物殺傷腫瘤壞死部位周圍的腫瘤細胞，從而形成新的壞死區，周而復始，使腫瘤壞死區不斷擴大，由此形成對整個腫瘤的殺傷作用。體內試驗結果表明，生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統的藥動學行為符合兩室模型，能顯著延長阿黴素生物半衰期，其在腫瘤組織中積蓄是一個漸進過程；以阿黴素為模型藥物，生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統抗皮下移植瘤藥效較好，抑瘤率61.9％，明顯高於非主動靶向的空間穩定脂質體抑瘤率49.1％。


圖1生物素化腫瘤壞死靶向單抗的免疫活性檢測其中，chTNT-3人鼠嵌合抗腫瘤細胞核單抗；MPB-chTNT-3馬來醯亞胺苯基丁醯基chTNT-3；chTNT-3/B(sub 3)生物素化chTNT-3，生物素取代度為3；chTNT-3/B(sub 5)生物素化chTNT-3，生物素取代度為5；chTNT-3/B(sub 8)生物素化chTNT-3，生物素取代度為8；IgG非特異性人源IgG。
圖2包載鈣黃綠素的生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體與固定Raji細胞的結合量其中，SL[Calc]包載鈣黃綠素的空間穩定脂質體；SAv-SL[Calc]包載鈣黃綠素的鏈黴親和素化空間穩定脂質體；chTNT-3/B+SAv-SL[Calc]包載鈣黃綠素的腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體；Calc游離鈣黃綠素。
圖3生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體在大鼠體內的藥代動力學曲線其中，SL[DXR]包載阿黴素的空間穩定脂質體；chTNT-3-SL[DXR]包載阿黴素的腫瘤壞死靶向單抗-空間穩定脂質體；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包載阿黴素的腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體；SAv-SL[DXR]包載阿黴素的鏈黴親和素化空間穩定脂質體；DXR游離阿黴素。
圖4靜脈注射生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體後荷H460移植瘤BALB/c裸鼠腫瘤中阿黴素的濃度其中，SL[DXR]包載阿黴素的空間穩定脂質體；chTNT-3-SL[DXR]包載阿黴素的腫瘤壞死靶向單抗-空間穩定脂質體；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包載阿黴素的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體；DXR游離阿黴素。
圖5靜脈注射生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體後荷H460移植瘤BALB/c裸鼠的腫瘤生長曲線其中，DXR游離阿黴素；SL[DXR]包載阿黴素的空間穩定脂質體；IgG-SL[DXR]包載阿黴素的非特異性人源IgG修飾的空間穩定脂質體；chTNT-3-SL[DXR]包載阿黴素的腫瘤壞死靶向單抗-空間穩定脂質體；SAv-SL[DXR]包載阿黴素的鏈黴親和素化空間穩定脂質體；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包載阿黴素的腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體。
具體實施例方式
實施例1 生物素化腫瘤壞死靶向單抗製備精密吸取10mg/mL Sulfo-NHS-LC-biotin DMSO溶液，加入10mg/mLchTNT-3溶液中，輕微攪拌，室溫反應2h。以pH 7.4的HEPES緩衝液(含25mmol/LHEPES和140mmol/L NaCl)為洗脫液過Sephadex G-50凝膠柱(10mm×120mm)，流速1mL/min，AKTA中壓層析系統280nm處檢測衍生化單抗chTNT-3/B組分並收集。採用Amicon Ultra-4離心超濾管(超濾膜截留分子量50,000)對chTNT-3/B離心濃縮，BCA法定量其蛋白含量為5mg/mL；HABA/Avidin法測定chTNT-3/B中生物素取代度為2～15。
實施例2 表面含巰基的阿黴素空間穩定脂質體製備將脂質體膜材(HSPC∶CHOL∶mPEG-HSPE∶PDP-PEG-HSPE＝5∶4∶0.2∶0.05，摩爾比)溶於氯仿中，旋轉蒸除有機溶劑製得均勻磷脂膜，減壓乾燥12h。加入一定體積155mmol/L硫酸銨緩衝液(pH 5.5)，使磷脂濃度為10mmol/L，65℃水浴振蕩2h，用高壓均質機或微型擠壓器依次擠壓通過0.2、0.1和0.08μm的核孔膜，各10次，即得帶PDP活性基團的空間穩定脂質體(PDP-SL)。將上述PDP-SL以123mmol/L檸檬酸鈉緩衝液(pH 5.5)洗脫通過Sepherose CL-4B凝膠柱更換外水相，加入阿黴素水溶液使最終其濃度為1mg/mL，65℃水浴振蕩20min。PDP-SL經二巰基蘇糖醇還原後，以pH 6.7的HEPES-Mes緩衝液(含25mmol/LHEPES、25mmol/L Mes和140mmol/L NaCl)為洗脫液過Sephadex G-50凝膠柱(16mm×150mm)，收集得到表面帶有游離巰基的空間穩定脂質體(HS-SL)。
實施例3 鏈黴親和素化空間穩定脂質體製備精密吸25m mol/L SMPB DMF溶液，加入10mg/mL SAv溶液中，使兩者摩爾比為20∶1，輕微攪拌，室溫反應1h。以pH 6.7的HEPES-Mes緩衝液(含25mmol/L HEPES、25mmol/L Mes和140mmol/L NaCl)為洗脫液過Sephadex G-50凝膠柱(10mm×120mm)，流速1mL/min，AKTA中壓層析系統280nm處檢測衍生化鏈黴親和素組分(MPB-SAv)並收集。採用Amicon Ultra-4離心超濾管(超濾膜截留分子量10,000)離心濃縮MPB-SAv，BCA法定量其蛋白濃度。精密吸取MPB-SAv，加入HS-SL脂質體中使其與HSPC的摩爾比為1∶1000，室溫反應過夜。以pH 7.4的HEPES緩衝液(含25mmol/L HEPES和140mmol/LNaCl)為洗脫液過Sepharose CL-4B凝膠柱，除去游離的MPB-SAv，收集脂質體組分，即得鏈黴親和素化空間穩定脂質體(SAv-SL)。
實施例4 生物素化腫瘤壞死靶向單抗的免疫活性檢測離心收集處於對數生長期的Raji細胞，按常規方法提取核抗原。以ELISA酶標法考察MPB-chTNT-3，chTNT-3/B和chTNT-3-SL中單抗的免疫活性，以chTNT-3為陽性對照，非特異性人源IgG修飾的空間穩定脂質體(IgG-SL)和表面帶PDP活性基團的空間穩定脂質體(PDP-SL)為陰性對照。
ELISA操作如下96孔板，每孔加入200μL 0.005％多聚賴氨酸，溼袋中4℃放置過夜；吸去多聚賴氨酸溶液，磷酸緩衝鹽水溶液(PBS)洗1次後加200μL核抗原(2μg/mL)，2000rpm離心10min，吸去上清液，加100μL 0.05％戊二醛於4℃固定15min；吸去固定液，PBS洗3次，每孔加入200μL 5％BSA，於37℃封閉1h；0.1％Tween-PBS洗3次後，分別加入100μL倍比稀釋的chTNT-3-SL及對照(chTNT-3、MPB-chTNT-3、chTNT-3/B、IgG-SL和PDP-SL)，37℃溫育1h；0.1％Tween-PBS洗3次後，加50μL辣根過氧化酶標記的羊抗人IgG(1∶2000)，37℃溫育1h；0.1％Tween-PBS洗3次，加底物TMB 100μL，室溫避光放置10min，加入50μL 2M H2SO4終止反應，於酶標儀450nm波長處(參比波長630nm)測定吸收值。
實施例5 生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統的體外靶向性評價收集對數生長期的Raji細胞，離心濃縮(4℃，1000r·min-1，5min)，PBS洗1次，2％多聚甲醛固定5～10min，PBS洗3次，-20℃丙酮處理3～10min，離心(4℃，1000r·min-1，10min)，PBS洗1次，細胞計數，保存於含1％BSA、0.02％疊氮鈉的PBS中。
採用50mmol/L鈣黃綠素溶液水化脂質體，MiniExtruder微型擠出器控制粒徑(80、100和200nm)，製備含有鈣黃綠素的空間穩定脂質體(SL[Calc])、空間穩定免疫脂質體(chTNT-3-SL[Calc]、IgG-SL[Calc])和鏈黴親和素化空間穩定脂質體(SAv-SL[Calc])，其中磷脂濃度均為10mmol/L。
生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統與固定Raji細胞結合試驗操作步驟如下(1)96孔白底螢光板，每孔加200μL 1％BSA，37℃封閉1h；(2)吸去封閉液，加100μL固定Raji細胞(3×106/mL)；(3)加入200μL 60μg/mL chTNT-3/B，室溫作用1h後離心(4℃，2000r·min-1，10min)，吸去上清液，用含1％BSA的PBS洗2次，每次300μL，再次離心(4℃，2000r·min-1，10min)後吸去上清液，加入200μL SAv-SL[Calc]，室溫作用1h；
(4)離心(4℃，2000r·min-1，10min)，吸去上清液，用含1％BSA的PBS洗2次，每次300μL，再次離心(4℃，2000r·min-1，10min)後吸去上清液。
(5)每孔加270μL PBS、30μL 2.5％Triton X-100，混勻，LS-55螢光分光光度計測定螢光吸收值F(激發波長490nm，發射波長520nm)。
實施例6 生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統在大鼠體內的藥動學研究取15隻SD大鼠，體重190～210g，隨機分成5組，乙醚麻醉後，按阿黴素5mg/kg體重的給藥劑量股靜脈注射游離阿黴素和各阿黴素脂質體製劑空間穩定脂質體(SL[DXR])、腫瘤壞死靶向單抗-空間穩定脂質體(chTNT-3-SL[DXR])、腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體(chTNT-3/B+SAv-SL[DXR])、鏈黴親和素化空間穩定脂質體(SAv-SL[DXR])，其中腫瘤壞死靶向單抗預定位空間穩定脂質體組在給藥前24h預先尾靜脈注射chTNT-3/B。分別於給藥後10min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h和72h尾靜脈取血0.5mL，置於檸檬酸鈉抗凝的塑料離心管中，3000r·min-1離心10min，取0.2mL血漿，置-20℃保存。樣品於測定前室溫解凍，HPLC法測定血樣中阿黴素濃度。
實施例7 生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統在荷瘤裸鼠體內的組織分布研究挑選同一批次H460移植瘤體積為0.7～0.8cm3的裸小鼠48隻，隨機分成4組，每組12隻，分別按阿黴素5mg/kg體重的給藥劑量尾靜脈注射SL[DXR]、chTNT-3-SL[DXR]、SAv-SL[DXR](24h前預先靜注5mg/kg體重chTNT-3/B)、DXR。於給藥後4h、24h和48h眼眶取血，處死裸小鼠後，取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，生理鹽水洗淨，用濾紙吸乾，稱重。HPLC法測定樣品中阿黴素濃度。
實施例8 生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統在荷瘤裸鼠體內的藥效學研究88隻雌性Balc/c-nu/nu裸小鼠接種H460腫瘤，1周後從中挑選出瘤體積相近的42隻(平均瘤體積為0.083cm3)，隨機分成7組，每組6隻。按阿黴素5mg/kg體重，於第1天、第8天給藥兩次，每次分別給予生理鹽水、DXR、SL[DXR]、IgG-SL[DXR]、chTNT-3-SL[DXR]、SAv-SL[DXR]和chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]。
表1是給藥後定期測量瘤徑計算體積抑瘤率。
表1

*P＜0.05，**P＜0.01vs預定位組(chTNT-3/B+SAv-SL[DXR])
權利要求
1.一種腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於通過下述方法製備採用生物素化腫瘤壞死靶向單抗chTNT/B和鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體，給藥時首先給予chTNT/B預定位於腫瘤壞死部位，後給予鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體。
2.根據權利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於所述的脂質體內水相中包載抗癌化療藥物。
3.根據權利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於所述的chTNT/B，chTNT與生物素以共價方式連接，chTNT/B中生物素取代度為2～15，其中chTNT選自人鼠嵌合抗腫瘤細胞核單抗chTNT-1、chTNT-2或chTNT-3中的一種。
4.根據權利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體含有高相變溫度磷脂醯膽鹼、膽固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺、鏈黴親和素或親和素-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺和抗腫瘤藥物。
5.根據權利要求4所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體，其組分和摩爾含量百分比是高相變溫度磷脂醯膽鹼48％～68％膽固醇 30％～50％甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺 1％～15％鏈黴親和素或親和素-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺0.2％～5％其中高相變溫度磷脂醯膽鹼選自氫化二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、氫化大豆磷脂醯膽鹼或氫化蛋磷脂醯膽鹼；甲氧基聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺的通式為mPEG-PE，其中mPEG為單甲氧基聚乙二醇，PE為磷脂醯乙醇胺；鏈黴親和素或親和素-聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺的通式為SAv(Av)-PEG-PE，其中SAv為鏈黴親和素，Av為親和素，PEG為聚乙二醇，SAv或Av通過共價方式與PEG鏈末端連接，PE為磷脂醯乙醇胺。
6.根據權利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體的mPEG-PE中mPEG的分子量為1000～10000。
7.根據權利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體的mPEG-PE中mPEG的分子量為2000～5000。
8.根據權利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體的SAv(Av)-PEG-PE中的SAv或Av與PEG鏈末端通過馬來醯亞胺與游離巰基加成的方式共價連接。
9.根據權利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體的SAv(Av)-PEG-PE中PEG的分子量為1000～10000。
10.根據權利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體的SAv(Av)-PEG-PE中PEG的分子量為2000～5000。
11.根據權利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體的mPEG-PE和SAv(Av)-PEG-PE中PE選自二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、二油醯磷脂醯乙醇胺、氫化大豆磷脂醯乙醇胺、氫化蛋磷脂醯乙醇胺、大豆磷脂醯乙醇胺或蛋磷脂醯乙醇胺。
12.根據權利要求2所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於所述的脂質體內水相中包載的抗癌化療藥物是阿黴素。
13.根據權利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體平均粒徑為80nm～150nm。
14.權利要求1或2的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統在製備抗腫瘤藥物中的用途。
15.根據權利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的先、後給藥時間間隔為6h～96h。
16.根據權利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統，其特徵在於，所述的先、後給藥時間間隔為12h～48h。
全文摘要
本發明公開了生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位脂質體給藥系統及其在腫瘤治療中的應用。本發明的脂質體給藥系統包括生物素化腫瘤壞死靶向單抗和PEG末端共價連接鏈黴親和素或親和素的空間穩定脂質體，通過一定時間間隔給藥。該脂質體給藥系統在體外能特異性地靶向腫瘤細胞核抗原。通過生物素化腫瘤壞死靶向單抗預定位策略，包載阿黴素的鏈黴親和素或親和素化空間穩定脂質體在腫瘤組織中能較好地靶向蓄積，抗腫瘤效果良好。
文檔編號A61K39/395GK1883454SQ20061002722
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月1日 優先權日2006年6月1日
發明者陸偉躍, 潘弘, 姚明, 鍾高仁, 周光興 申請人:復旦大學