一種用於鑑定中藥川貝母的引物對及其應用的製作方法

2023-11-04 18:32:22

本發明屬於分子生物學領域，涉及一種採用分子生物學手段鑑定中藥的方法，具體為一種用於鑑定中藥川貝母的引物對及其應用。
背景技術：
：川貝母為百合科貝母屬多種植物的乾燥鱗莖，是最具有代表性的川產名貴藥材之一。傳統中醫藥理論認為其具有清熱潤肺，化痰止咳，散結，降壓解痙等功效，主治肺熱燥咳、咳痰帶血、痰多胸悶等症，為止咳潤肺之「聖藥」。現代藥理學研究表明其具有較好的鎮咳、祛痰、平喘、抗菌、鎮靜、鎮痛、心血管活性、抗潰瘍、抗血小板聚集、抗腫瘤等作用。由於川貝母生長周期長、資源緊缺，已成為中藥材中價格最昂貴的根莖類藥材之一。2010版《中華人民共和國藥典》中收錄川貝母基源植物包括川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母和瓦布貝母，但我國已查明貝母屬植物超過50種，其中伊犁貝母、平貝母、米貝母、輪葉貝母等作為川貝母的混偽品頻繁出現，甚至葫蘆科有毒植物土貝母的鱗莖也被發現冒充川貝母出售。隨著需求量的增加，川貝母基源混亂的現象呈現不斷增加的趨勢，直接影響到川貝母臨床用藥的安全、療效。因此開展川貝母藥材更深入的鑑定研究，針對其制定一種高效、簡便的基源物種鑑定方法，對於川貝母臨床用藥，質量控制以及合理開發利用川貝母屬植物資源具有重要意義。dna條形碼技術是利用基因組中一段標準短序列來進行物種鑑定的分子診斷新技術，由於該技術基於dna片段進行物種鑑定和親緣關係的定位，了解其分支來源，甚至可以預知其進化方向等諸多用途，使其成為近年來生物分類學家關注的熱點。在中藥鑑定領域中，相對傳統中藥材鑑別方法(性狀鑑別、顯微鑑別、理化鑑別)，其具有不受物種外在形狀特徵、發育階段等因素影響的特點。目前已有芸香料、薔薇科、豆科、重樓屬等多個藥用植物豐富的植物科屬展開了dna條形碼研究並取得良好鑑定效果。其中核糖體dna中的its2區具有進化速率快，高度重複、長度適中等優點，成為藥用植物dna條形碼研究中最為重要候選序列之一。技術實現要素：本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種採用分子生物學手段鑑定川貝母混偽品，具有高效、簡便的的特點，本發明提供了一種用於鑑定中藥川貝母的引物對及其應用。技術方案：一種用於鑑定中藥川貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優選的，所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對及發卡結構序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fggcataataggcgggcgagctaatc1p1-rgcggtgagattagatcataatttcggtg2p2-fgctattagcattaatcgatcgaattc3p2-rgggatcgaattcatggattagtacacaat4p3-fgatccgggtctcttgagccccttg5p3-rgtaccgtgttcacgattgcctcagg6發卡結構cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對在製備鑑定中藥川貝母試劑盒中的應用。優選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。優選的，所述試劑盒鑑定中藥川貝母的步驟包括：(1)提取川貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋20～200倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10～100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優選的，所述川貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。優選的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。有益效果：(1)本發明所述引物對特異性好，靈敏度高，能夠準確識別目標片段；(2)本發明所述方法高效、簡便；(3)本發明所述方法能夠準確鑑定市售混偽品，為川貝母的鑑定分析提供科學依據。附圖說明圖1是實施例1～3pcr鑑定結果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實施例1pcr產物鑑定結果；2為實施例2pcr產物鑑定結果；3為實施例3pcr產物鑑定結果。具體實施方式實施例1一種用於鑑定中藥川貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥川貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥川貝母的步驟包括：(1)提取川貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋200倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述川貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例2一種用於鑑定中藥川貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥川貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥川貝母的步驟包括：(1)提取川貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋80倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋50倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述川貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例3一種用於鑑定中藥川貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上遊引物的5，端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在製備鑑定中藥川貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩衝液。所述試劑盒鑑定中藥川貝母的步驟包括：(1)提取川貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋20倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋100倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述川貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。sequencelisting蘇州市李良濟健康產業有限公司一種用於鑑定中藥川貝母的引物對及其應用7patentinversion3.3125dna人工序列1ggcataataggcgggcgagctaatc25228dna人工序列2gcggtgagattagatcataatttcggtg28326dna人工序列3gctattagcattaatcgatcgaattc26429dna人工序列4gggatcgaattcatggattagtacacaat29524dna人工序列5gatccgggtctcttgagccccttg24625dna人工序列6gtaccgtgttcacgattgcctcagg25740dna人工序列7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當前第1頁12