檢測b因子的免疫共振散射光譜法的製作方法

2023-11-09 05:12:32

專利名稱：檢測b因子的免疫共振散射光譜法的製作方法
技術領域：
本發明涉及B因子的檢測方法，具體地說是檢測B因子的免疫共振散射光譜法。
背景技術：
-B因子(BF)，又稱C3激活劑前體(C3PA)，是補體旁路活化途徑中的一個重 要成分。屬P2球蛋白，分子量10萬D，僅有一條多肽鏈，富含甘氨酸，對熱 不穩定，5(TC， 30分鐘即被滅活。B因子在D作用下裂解成抗原性不一的a與 b兩個片段。B因子必須與C3b等和Mgh存在下結合成C3b.B後，才受D作用釋放出Ba，形成C3"Bb，該複合物具有C3轉化酶活性，作用於Q生成更多C3b，在有P因子條件下形成(Qb)nBb P，即為替代途徑中的Cs轉化酶。B因子以及其它補體成分的代謝率很高，正常人血漿內的補體每天約有1/2 更新。合成率與血漿中補體水平明顯相關，血漿補體值反映了合成和分解之間 的平衡。在炎症時合成率增加，使補體值增高，而當某些疾病補體利用增加時， 可使補體降低至正常範圍以下。臨床表明患腎小球腎炎、系統性紅斑狼瘡、肝病、B因子降低，妊娠高血壓 綜合症、惡性腫瘤、甲狀腺功能亢進症患者的B因子水平高於正常水平。因此， 人體血漿中B因子的測定對於了解旁路系統功能、腎小球腎炎的變化及分類、 肝病、惡性腫瘤等皆有較大的價值。目前B因子的檢測方法有免疫化學法(包括單向瓊脂擴散法和火箭電泳法) 和溶血法，雙抗體夾心ELISA。其中，經典的免疫沉澱法(單向擴散、火箭電泳 等)可以檢測B丙子的含量，但單向擴散法靈敏度不高，精確性、重現性較差、 流程太長；火箭電泳法操作複雜；溶血法則常用於測定B因子的活性；雙抗體 夾心ELISA法避免了對特異件抗體的標記，但增加了操作步驟，並且需要使用 抗第2種動物的酶標抗體，試劑成本較高，所用的酶底物常為苯胺類、苯酚類 還原性染料，穩定性較差，見光或空氣極易被氧化，更為不足的是苯胺類底物 具有致癌作用，而且測定過程包括包被、孵育、洗滌、免疫反應、顯色等步驟， 耗時很長，至少需要24小時，操作比較繁瑣。
近年來，還有人採用免疫透射比濁法測定B因子，雖簡便快速，但靈敏度不高。此外，還有研究者用表面等離子體共振的B因子傳感器測定B因子，雖 檢測下限低，但操作複雜；還有採用壓電免疫傳感器測定B因子，該傳感器靈 敏度高，選擇性和重現性均好，但操作流程長而且複雜。本發明免疫共振散射 光譜法檢測B因子尚未見報導。

發明內容
本發明的目的是要為克服現有技術的不足，而公開一種簡便、快速、且靈 敏度高的免疫共振散射光譜體外檢測B因子的方法。本發明方法的原理是免疫複合物的共振散射效應當血清中的B因子與特異性羊抗人B因子抗體相結合後，形成不溶性免疫複合物，此複合物具有共振 散射效果，在PEG的作用下，該複合物進一步聚集，散射強度明顯增強。共振 散射強度大小反映了血清中B因子含量，B因子含量可由校準血清所作的B因 子濃度——共振散射校正值曲線算出。本發明檢測B因子的免疫共振散射光譜法包括以下步驟1. 製備已知B因子濃度的測試體系，在具塞刻度試管中依次加入一定pH 值的Na2HP04- NaH2P04緩衝溶液(PBS)、 一定量的羊抗人B因子溶液， 一定 已知濃度的B因子溶液，搖勻，再加入一定量的PEG6000溶液，加入二次蒸餾 水定容，充分搖勻，具塞試管置於35 37'C水浴反應5 20分鐘；2. 依據步驟l的方法，製備試劑空白對照體系；3. 將上述體系所得溶液分別倒入石英比色皿中，置於螢光分光光度計上在入ex—人em二O條件下，同步掃描獲得體系的共振散射光譜，同時測定390 420nm波長處的同步共振散射強度I，以不加B因子抗原作為試劑空白，測定 390 420nm波長處的共振散射強度，即空白值U;4. 根據測定結果，計算共振散射校正值AI (AI二I一Ib)，以加入的B因子 抗原濃度c為橫坐標，AI為縱坐標，繪製工作曲線；5. 依照步驟l的方法製備檢測體系，其中加入的是未知B因子抗原濃度的 被測物，按步驟3、 4的方法，求被測物的AI;6. 根據工作曲線，即可計算出某檢測樣品中B因子抗原在一定線性範圍內
的濃度。步驟1所述的具塞試管為5mL的具塞試管，依次加入的Na2HP04-NaH2P04 緩衝溶液，其pH值為7.0 7.4，體積為0.30 0.80mL，加入的羊抗人B因子(稀 釋比為l: 20 1: 30)溶液為50pL~300|iL，加入的己知的B因子抗原濃度為 0.04 14.0 pg/mL，加入的PEG6000濃度為15~30 %，體積為0.30~1.00 mL，加 入二次蒸餾水定容至3ml;所述的水浴溫度為35 37 °C，水浴反應時間為5 20min;步驟3所述的同步共振散射強度的最佳測定波長為400 nm;步驟4所述的測定B因子的線性範圍為0.04 14.0 pg/mL。本發明與現有的方法相比，本方法將免疫反應與共振散射光譜技術相結合， 方法靈敏度高，檢測限低，可達到pg/mL水平，用於檢測低濃度的B因子所需 樣品用量少，操作簡便，測定耗時短，並且所用試劑無毒安全、成本低廉。


圖1為本發明實施例1的B因子免疫複合體系的共振散射光譜圖；圖2為本發明實施例1的B因子的工作曲線；圖3為本發明實施例2的B因子免疫複合體系的共振散射光譜圖；圖4為本發明實施例2的B因子免疫複合體系的紫外可見吸收光譜圖；圖5為B因子、B因子及羊抗人B因子與B因子生成的免疫複合微粒體系的共振散射圖。具體實施例下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的闡述下列所述實施例描述了免疫複合物的共振散射效應當血清中的B因子與特異性羊抗人B因子抗體相結合後，形成不溶性免疫複合物，此複合物具有共 振散射效果，在PEG的作用下，該複合物進一步聚集，散射強度明顯增強。共 振散射強度大小反映了血清中B因子含量，B因子含量可由校準血清所作的B 因子濃度一共振散射校正值曲線算出。實施例1:1.製備已知B因子濃度的測試體系，在5mL的具塞比色管中依次分別加入 pH7.2的Na2HP04-NaH2P04緩衝溶液(PBS) 0.40mL、羊抗人B因子溶液(稀 釋比l: 20，上海北加試劑有限公司)200)iL， 12pg/mL的B因子抗原(上海北 加試劑有限公司)20， 140， 260， 380， 500， 620， 740|uL，搖勻後再加入15% 的PEG6000溶液0.40mL，加入二次蒸餾水定容至3.0 mL，搖勻，具塞試管置於
37'C水浴反應5分鐘，取出流水冷卻；2. 依照步驟l的方法，但不加B因子抗原，製備試劑空白對照體系；3. 將上述體系所得溶液分別倒入石英比色皿中，置於Cary Eclipse螢光分 光光度計(美國Varian公司)上在A ex—人em=0條件下，同步掃描獲得體系的共 振散射光譜(如圖l所示)，同時測定400nm波長處的共振散射強度I，以不加 B因子抗原作為試劑空白，測得的共振散射強度為空白值Ib;4. 根據以上測定結果，分別計算共振散射校正值AI (Al=I—Ib)，以加入 的B因子抗原濃度c為橫坐標，AI為縱坐標，繪製即得工作曲線A》31.84 c +5.05， (n=8， R=0.9901)(如圖2所示);5. 按步驟(1)的方法製備檢測體系，其中加入的是12pg/mL B因子抗原 標準品400jLiL，平均測定三次，測得的AI為56， 58， 58;6. 根據工作曲線，求出步驟5的測定體系的B因子抗原濃度平均值為1.64 pg/mL，與實際加入的B因子抗原濃度一致，相對標準偏差為2.45%。圖1中，曲線1至6的B因子濃度依次為0， 0.08，0.56， 1.04， 2.00，2.96|ig/mL， 表明羊抗人B因子與B因子生成的免疫複合微粒在390 420nm處的散射信號 隨著B因子濃度的增加呈線性增加。
實施例2:1. 在5mL的具塞比色管中分別依次加入pH7.2的Na2HP04-NaH2P04緩衝 溶液0.40mL、羊抗人B因子溶液(稀釋比l:20，上海北加試劑有限公司)200^iL， 12嗎/mL的B因子抗原(上海北加試劑有限公司)50， 100， 200， 400， 800pL， 搖勻，再加入15。/。的PEG6000溶液0.50mL，加入二次蒸餾水定容至3.0 mL;2. 步驟1的具塞試管置於37t:水浴，反應5分鐘後，取出流水冷卻；3. 將步驟2所得溶液倒入石英比色皿中，置於Cary Eclipse螢光分光光度 計(美國Varian公司)上在入ex—入加二O條件下，同步掃描獲得體系的共振散射 光譜，同時測定400nm波長處的共振散射強度I;4. 以不加B因子抗原作為試劑空白，測得的共振散射強度為空白值Ib;5. 根據以上測定結果，計算共振散射校正值AI (Al二I一Ib)，以加入的B 因子抗原濃度c為橫坐標，AI為縱坐標，繪製即得工作曲線A^ 26.58c + 4.15
(n=6， R=0.9950);6.按步驟1的方法製備檢測體系，其中加入的是12jig/mLB因子抗原標準 品500nL，平均測定3次，測得AI為56、 58、 58，根據工作曲線，求得樣品B 因子濃度平均值為1.9 嗎/mL。圖3、圖4中，曲線1至6的B因子濃度依次為0， 0.2， 0.4， 0.8， 1.6， 3.2jxg /mL。圖4表明B因子免疫複合體系，其在278 nm處有強吸收峰，且強度隨著 體系B因子濃度的增加，免疫複合體系的吸光度增大。圖5中，曲線l-6分別為h pH 7.2 Na2HP04-NaH2P04+0.20 mL羊抗人B因子(1:20); 2: pH 7.2 Na2HP04- NaH2P04 + 0.20 mL羊抗人B因子(1:20) + 2.5% PEG6000;3: pH 7.2 Na2HP04- NaH2PO4+0.56 P g/mL B因子； 4: pH 7.2 Na2HP04- NaH2PO4+0.56 U g/mL B因子+ 2.5% PEG6000; 5: pH 7.2 Na2HP04- NaH2PO4+0.20 mL羊抗人B因子(l :20) + 0.56 P g/mL B 因子；6: pH 7.2 Na2HP04- NaH2PO4+0.20 mL羊抗人B因子(l :20) + 0.56 u g/mL B 因子+2.5%PEG6000。該圖表明，羊抗人B因子、B因子及羊抗人B因子與B因子生成的免疫復 合微粒的散射信號較弱，在PEG存在時，共振散射強度羊抗人B因子、B因子 及羊抗人B因子與B因子生成的免疫複合納米的散射信號增強不大，但羊抗人 B因子與B因子生成的免疫複合納米的散射信號明顯增強，在400nm附近存在 強共振散射峰，表明B因子與特異性羊抗人B因子抗體相結合後，形成不溶性 免疫複合物，此複合物具有共振散射效果，在PEG的存在作用下，該複合物進 一步聚集，散射強度明顯增強。
權利要求
1.一種檢測B因子的免疫共振散射光譜法，其特徵是該方法包括如下步驟(1)製備已知B因子濃度的測試體系在具塞刻度試管中依次加入一定pH值的Na2HPO4-NaH2PO4緩衝溶液、一定量的羊抗人B因子溶液，一定已知濃度的B因子溶液，搖勻，再加入一定量的PEG6000溶液，加入二次蒸餾水定容後，在溫水中水浴反應；(2)依據步驟1的方法製備空白對照體系；(3)將(1)、(2)所得溶液分別移至石英比色皿中，置於螢光分光光度計上，同步掃描獲得體系的共振散射光譜，在390-420nm波長處測定同步共振散射強度I和空白值I0；(4)根據測定結果計算出共振散射校正值ΔI，以加入的B因子抗原濃度為橫坐標，ΔI為縱坐標，繪製工作曲線；(5)依照步驟1的方法製備檢測體系，其中加入的是未知B因子抗原濃度的被測物，按步驟(3)、(4)的方法，求被測物的ΔI；(6)根據工作曲線，計算出被測物中B因子抗原在一定線性範圍內的濃度。
2. 如權利要求1所述的檢測B因子的免疫共振散射光譜法，其特徵是步 驟(1)所述的Na2HP04- NaH2P04緩衝溶液的pH值為7.0-7.4，體積為 0.30-0.80mL，加入的羊抗人B因子，溶液稀釋比為1: 20-1: 30，體積50 juL 300 pL，加入的B因子抗原濃度為0.04 14.0嗎/mL，加入的PEG6000濃度為15 30 %，體積為0.30 1.00mL，所述的定容體積為3ml。
3. 如權利要求1所述的檢測B因子的免疫共振散射光譜法，其特徵是步 驟(2)所述的水浴溫度35 37'C，水浴反應時間為5 20分鐘。
4. 如權利要求1所述的檢測B因子的免疫共振散射光譜法，其特徵是步 驟(2)所述的同步共振散射強度的最佳測定波長為400nm。
5. 如權利要求1所述的檢測B因子的免疫共振散射光譜法，其特徵是測 定B因子抗原濃度的線性範圍為0.04~14.0 pg/mL。
全文摘要
本發明公開了用檢測B因子的免疫共振散射光譜法，本發明利用免疫複合物的共振散射效應來檢測，當血清中的B因子與特異性羊抗人B因子抗體結合後，形成不溶性的複合物，此複合物具有共振散射效果，在PEG的作用下，該複合物聚集，散射強度明顯增強。B因子含量即可由校準血清所作的B因子濃度——共振散射校正值曲線算出。本發明的優點在於與現有的方法相比，本方法將免疫反應與共振散射光譜技術相結合，方法靈敏度高，檢測限低，可達到μg/ml水平，用於檢測低濃度的B因子所需樣品用量少，操作簡便，測定耗時短，並且所用試劑無毒安全，成本低廉。
文檔編號G01N33/68GK101158689SQ20071005060
公開日2008年4月9日 申請日期2007年11月19日 優先權日2007年11月19日
發明者李紀順, 蔣治良 申請人:廣西師範大學