一種利用尿苷提高聚合酶鏈式反應擴增效果的方法
2023-11-09 12:17:02 2
專利名稱：一種利用尿苷提高聚合酶鏈式反應擴增效果的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的方法，尤其是利用尿苷 (Uridine)提高聚合酶鏈式反應(PCR)擴增效果的方法。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(PCR)，又稱體外酶促基因擴增，是一種在體外模擬DNA體內複製的基因擴增技術，該技術由K. Mullis於1985年發明，能在耐熱DNA聚合酶的作用及特異性引物的引導下，在很短的時間裡就能在一個試管內實現只有在生物體細胞分裂增殖時才出現的基因的大量複製，一般來說，在數小時內就可以將目的基因擴增至百萬倍。在過去的20多年的時間裡，PCR技術在不斷進步和發展中逐漸成熟，形成了一整套完整的技術體系。常規PCR技術操作簡便，成功率很高，因而其在遺傳學、微生物學、乃至整個生命科學領域的研究中都得到了廣泛應用。但是PCR技術仍存在著不可避免的缺點， 如擴增的副反應多，擴增產物的產量少，保真度不高等。但對PCR反應影響最大的是擴增過程中的副反應的發生，這種情況輕則帶來在PCR產物中出現少量非目的產物，電泳圖上表現為明顯的非目的帶和少量拖尾現象的出現，重則帶來大量的非目的產物出現，在電泳圖上表現為幹擾很嚴重的拖尾和大量的彌散，導致主帶模糊或根本無主帶，整個擴增失效。雖然近年來一個又一個功能強大的引物設計軟體被開發出來，但高特異性引物只是提高PCR 反應效率的一個方面，對反應體系及反應條件進行優化組合則是解決這一問題的主要方面。根據多年來各國科學家的研究成果我們發現，通過向PCR反應體系中添加一定量的添加劑可以在不同程度上減少或消除副反應的發生。這些添加劑包括DMSO，Betain, BSA，甘油，Tween-20, NP-40,甲醯胺等。但這些添加劑都有各自的局限性，在各種不同的情況下效果差異很大，給應用帶來不便。因此開發更多更新的PCR反應優化劑是發展PCR技術過程中一項很重要的工作。鑑於PCR反應本身是一種模擬體內DNA複製的體外擴增方法，因此在本發明的摸索過程中，試圖從模擬細胞核內環境出發，尋找參與釀酒酵母細胞代謝的核內，並設計將這些核內以接近核內濃度的條件下添加入PCR反應體系中，以期獲得更為有效的PCR添加齊IJ。 尿苷就是通過這個思路被我們發現有明顯增進PCR反應特異性的作用。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供了利用尿苷Uridine)提高聚合酶鏈式反應(PCR)擴增效果的方法。該方法通過在PCR反應體系中添加尿苷達到對DNA片段的有效擴增。此方法明顯提高了反應特異性，應用成本低，使用簡便，易於掌握。本發明是通過以下技術方案來實現的利用尿苷提高聚合酶鏈式反應(PCR)擴增效果的方法是(1).尿苷溶液的配製40-50mg/mL的尿苷水溶液；(2).尿苷溶液的滅菌；
(3) .PCR體系的配置；(4). PCR體系的優化在PCR反應體系中添加尿苷溶液，尿苷終濃度為20_40mg/ mL ；(5). PCR條件的設定與運行；(6) .PCR 產物檢測。而且，所述的PCR體系的優化是尿苷終濃度的優選濃度範圍為20-30mg/mL。而且，所述的尿苷溶液是指尿苷完全溶解於純水、10XPCR緩衝液或者其它一切適用於PCR反應的液相中。本發明的優點和有益效果是1.本發明作為PCR增效劑的新成果，與已有方法相比，尿苷優化擴增的效果明顯， 確實提高了 PCR擴增的特異性，且尿苷較為低廉的價格使得其應用沒有增加很多成本。2.本發明中使用的PCR優化試劑尿苷，添加到體系中基本不影響PCR反應後的一般後續操作如電泳分離DNA產物。3.該尿苷提高聚合酶鏈式反應(PCR)擴增效果的優化方法易於掌握，使用簡便。
圖1為本發明中利用尿苷優化擴增片段長度為900bp左右的非高GC-DNA片段的結果電泳圖與不添加尿苷的反應結果電泳圖的對比圖；圖2為本發明中利用尿苷優化擴增片段長度為750bp左右的高GC-DNA片段的結果電泳圖，與不添加尿苷的反應結果電泳圖的對比圖。
具體實施例方式本發明結合附圖通過以下實施例進一步詳述，但不局限於下述實施例。本發明所涉及的PCR技術的優化方法是通過向PCR體系中添加尿苷來實現的，其具體操作方法如下1.尿苷Uridine)溶液的製備尿苷又名尿嘧啶核苷(Uridine)，1-β-D-Ribofuranosyl uracil,分子式為 C9H12N206分子量為M4. 20。尿苷固體粉末可以用市售產品，屬於現有技術，不再詳細敘述。所述的尿苷溶液的濃度為可以根據需要配置不同濃度大小的溶液，濃度的單位為質量體積比(W/V)，範圍在40-50mg/mL。一般推薦濃度為40mg/mL。以配置濃度為(W/V)40mg/ mL的尿苷溶液為例，先精確稱取40mg尿苷粉末，置於已滅菌的1. 5mL的小離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水，使其溶解，最後定容至lmL。2.尿苷溶液的滅菌溶液均需用高溫滅菌(12rC，40min)。3. PCR體系的配置PCR體系根據現有的技術，由待擴增DNA片斷的不同而各不相同。具體表現在 dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量應根據不同的模板和不同的擴增片段長度來選擇；PCR反應體系中的H2O為雙蒸水及以上級別水，體系中水的添加量應根據尿苷溶液添加的體積進行調整，即應扣除相應添加的尿苷溶液的體積。4. PCR體系的優化
在上述PCR反應體系中加入一定體積的尿苷溶液。5. PCR條件的設定與運行PCR反應條件中的預變性，變性及退火各階段的溫度和對應時間應根據不同模板和引物融解溫度來選擇；其中的延伸溫度根據所用聚合酶的合適溫度來選擇；其中的延伸時間根據所擴增片段的長度來選擇；其中的循環次數根據個人試驗目的和需要進行選擇。6. PCR產物的檢測一般用瓊脂糖凝膠電泳技術進行檢測，瓊脂糖凝膠的濃度及PCR產物的上樣體積需根據具體情況而定。所述的瓊脂糖凝膠電泳技術依照已有方法概括如下(1)製備所需要濃度的瓊脂糖凝膠，具體濃度大小應根據擴增DNA片段的大小來確定。(2)吸取一定體積的PCR產物上電泳槽點樣，同時點上合適分子量標記作為參照。(3)加上3-4V/cm的電壓進行電泳。(4)待指示劑到合適位置時，取出膠板於凝膠成象系統下觀察並照相記錄。實施例1尿苷對一般PCR (非高GC)的增效作用1)尿苷溶液配製40mg/ml ；2)尿苷溶液滅菌高溫滅菌(121°C，30min)；3) PCR反應體系的配置按以下順序和添加量配置體系於薄壁PCR管中10 X PCR 緩衝液1. 2 μ LdNTPs (25mM)0. 1 μ L模板(100ng/ul)0. 2 μ L引物 1(2.0 μ Μ)0· 75 μ L引物 2 O. 0 μ Μ)0· 75 μ LMg2+ (25mM)1. 2μ LTaq (5U/ μ L)0. 2 μ L尿苷0Omg/ml)or H2O 7. 6 μ L
引物1引物2擴增長度1TTTATGGTTGTTGCCCTCTCCTAAGAAGAAAAAGCCTGAGCTTGGT881其中，模板為人類Genome DNA，由本實驗室自行提取。Taq酶及PCR緩衝液購自北京三博遠志生物工程公司。共配置PCR體系2管，使用一對引物，編號分別為1，添加尿苷的編號分別為1』。其擴增的目的產物大小為900bp左右。4) PCR體系優化在上述12微升PCR反應體系中包含加入7. 6微升尿苷GOmg/ ml)溶液，這樣肌苷的終濃度為25. 3mg/ml。5)PCR條件的設定與運行。按以下條件在PCR儀上設定循環條件進行PCR熱循環預變性94 °C 4min
權利要求
1.利用尿苷提高聚合酶鏈式反應擴增效果的方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1).尿苷溶液的配製40-50mg/mL的尿苷水溶液；(2).尿苷溶液的滅菌；(3).PCR體系的配置；(4).PCR體系的優化在PCR反應體系中添加尿苷溶液，尿苷終濃度為20-40mg/mL ；(5).PCR條件的設定與運行；(6).PCR產物檢測。
全文摘要
一種利用尿苷(Uridine)提高聚合酶鏈式反應(PCR)擴增效果的方法，涉及生物技術領域，該方法是在原有的PCR擴增方法基礎上，通過向體系中添加一定量的尿苷來實現的。本發明優化擴增的效果明顯，操作簡便，易於掌握。
文檔編號C12N15/10GK102181427SQ20101062236
公開日2011年9月14日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者呂志偉, 張治洲, 徐仲, 王有志, 鄭嘉祺 申請人:山東大正醫療器械股份有限公司