一種檢測肺癌相關基因熱點突變的試劑盒及其應用的製作方法

2023-11-09 09:56:27 2

本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種檢測肺癌相關基因熱點突變的試劑盒及其應用。
背景技術：
：肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。隨著醫學診斷技術特別是分子診斷技術的不斷提高，針對肺癌的新的基因不斷被發現，基於驅動基因的新型靶向藥物不斷湧現，肺癌精準治療成為了關注的熱點。肺癌相關基因(alk，braf，egfr、kras和nras)的熱點突變，有如下：alk基因的熱點突變，涉及1151tins、l1152r、c1156y、f1174la、l1196m、g1202r、s1206y、g1269a等；braf基因的熱點突變，v600e；egfr基因的熱點突變，涉及g719a、g719c、g719s、a763_y764insfqea、t790m、l858r等；kras基因的熱點突變，涉及g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、q61k、q61l、q61r、q61h等。目前已報導的檢測肺癌相關基因突變的方法有：1)直接測序法。用pcr擴增產物進行測序和ta克隆並再次測序以最終確定突變的鹼基位置。該方法比較繁瑣、耗時長，而且由於自身的限制導致其靈敏度不高，只能對含量大於20％的基因突變進行檢測。因此，此法不適合在臨床中應用。2)變性高效液相色譜法(dhplc)。該方法對已知和未知的突變位點均可以檢測，靈敏性在5％左右，但檢測過程中需要打開反應管，容易造成汙染，而且陽性結果不能確認具體位置，最終需要測序確認。3)高解析度溶解曲線(hrm)是基於核酸的物理性質，通過飽和染料結合於pcr擴增產物，監控產物溶解曲線的變化分析基因突變。檢測敏感性在5％左右，對於陽性結果並不能確認具體位置，最終需要測序確認。4)探針擴增組織突變法(arms)。利用引物的3』端末位鹼基必須與其模板dna互補才能有效擴增的原理，設計針對突變位點的特異性pcr擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物的3』鹼基與模板配對時pcr擴增反應才能正常進行，從而檢測出突變。通過設計兩個5』端引物，一個與正常dna互補，一個與突變dna互補，對於純合性突變，分別加入兩種引物及3』端引物進行兩個平行的pcr，結合有與突變dna完全互補的引物才可以延伸並得到pcr擴增產物，該檢測方法的靈敏度在1％左右。5)等位基因特異的taqman聚合酶鏈式反應(cast-pcr)。該方法採用優化taqman探針，通過一段特異設計的mgb探針來阻止引物與野生型dna結合，選擇性的優化擴增突變型dna，該檢測方法的靈敏度在1～0.1％左右。這些技術的靈敏度都不高，檢測的特異性差，不能滿足對肺癌檢測的需求。技術實現要素：本發明的目的是提供一種檢測肺癌相關基因熱點突變的試劑盒及其應用。首先，本發明要求保護引物對組和/或記載有「檢測待測者的肺癌相關基因是否發生突變的方法」的可讀性載體在製備用於檢測肺癌相關基因突變的試劑盒中的應用；所述肺癌相關基因為alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因。所述引物對組由(1)-(4)所示的特異於alk基因的4個引物對、(5)所示的特異於braf基因的1個引物對、(6)-(12)所示的特異於egfr基因的7個引物對和(13)-(14)所示的特異於kras基因的2個引物對組成；(1)由序列表中序列1和序列2所示的兩個單鏈dna組成的引物對1；(2)由序列表中序列3和序列4所示的兩個單鏈dna組成的引物對2；(3)由序列表中序列5和序列6所示的兩個單鏈dna組成的引物對3；(4)由序列表中序列7和序列8所示的兩個單鏈dna組成的引物對4；(5)由序列表中序列9和序列10所示的兩個單鏈dna組成的引物對5；(6)由序列表中序列11和序列12所示的兩個單鏈dna組成的引物對6；(7)由序列表中序列13和序列14所示的兩個單鏈dna組成的引物對7；(8)由序列表中序列15和序列16所示的兩個單鏈dna組成的引物對8；(9)由序列表中序列17和序列18所示的兩個單鏈dna組成的引物對9；(10)由序列表中序列19和序列20所示的兩個單鏈dna組成的引物對10；(11)由序列表中序列21和序列22所示的兩個單鏈dna組成的引物對11；(12)由序列表中序列23和序列24所示的兩個單鏈dna組成的引物對12；(13)由序列表中序列25和序列26所示的兩個單鏈dna組成的引物對13；(14)由序列表中序列27和序列28所示的兩個單鏈dna組成的引物對14。所述檢測待測者的肺癌相關基因是否發生突變的方法，具體可包括如下步驟：(a)從待測者的血漿樣本中提取游離核酸為模板，以所述引物對組中的各引物進行pcr擴增，得到擴增產物；(b)對所述擴增產物進行磁珠純化回收，得到回收產物1；(c)對所述回收產物1進行pcr富集，得到富集產物；(d)對所述富集產物進行磁珠純化回收，得到回收產物2；(e)對所述回收產物2進行高通量測序，根據測序結果確定所述待測者的肺癌相關基因是否發生突變。步驟(a)中，進行所述pcr擴增時，所述引物對組中的各引物對被分在兩組分別進行多重pcr擴增；其中一組中的引物有所述引物對1、所述引物對3、所述引物對5、所述引物對7、所述引物對9、所述引物對11和所述引物對13，另一組中的引物有所述引物對2、所述引物對4、所述引物對6、所述引物對8、所述引物對10、所述引物對12和所述引物對14。兩組多重pcr反應的反應體系，各引物均為等摩爾使用。兩組多重pcr反應的反應程序，退火溫度均為65℃。其中，所述高通量測序可為illumina測序，具體如nextseq500測序。其次，本發明還要求保護一種用於檢測肺癌相關基因突變的試劑盒。所述肺癌相關基因為alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因。本發明所提供的用於檢測肺癌相關基因突變的試劑盒中含有前文所述的引物對組。根據需要，所述試劑盒中還可含有前文所述的記載有「檢測待測者的肺癌相關基因是否發生突變的方法」的可讀性載體。另外，為了便於判斷所述待測者的肺癌相關基因是否發生突變，所述試劑盒中還可含有正常人基因組dna對照品。當然，所述試劑盒中還可含有pcr反應所需的常規試劑。再次，本發明還要求保護一種檢測待測者的肺癌相關基因是否發生突變的方法。該方法可為非疾病診斷治療方法，也可為疾病診斷治療方法。當該方法為疾病診斷治療方法時，該方法具體為通過檢測待測者的肺癌相關基因是否發生突變來診斷所述待測者是否患有肺癌。本發明所提供的檢測待測者的肺癌相關基因是否發生突變的方法，具體可包括如下步驟：(a)從待測者的血漿樣本中提取游離核酸為模板，以所述引物對組中的各引物進行pcr擴增，得到擴增產物；(b)對所述擴增產物進行磁珠純化回收，得到回收產物1；(c)對所述回收產物1進行pcr富集，得到富集產物；(d)對所述富集產物進行磁珠純化回收，得到回收產物2；(e)對所述回收產物2進行高通量測序，根據測序結果確定所述待測者的肺癌相關基因是否發生突變。步驟(a)中，進行所述pcr擴增時，所述引物對組中的各引物對被分在兩組分別進行多重pcr擴增；其中一組中的引物有所述引物對1、所述引物對3、所述引物對5、所述引物對7、所述引物對9、所述引物對11和所述引物對13，另一組中的引物有所述引物對2、所述引物對4、所述引物對6、所述引物對8、所述引物對10、所述引物對12和所述引物對14。兩組多重pcr反應的反應體系，各引物均為等摩爾使用。兩組多重pcr反應的反應程序，退火溫度均為65℃。其中，所述高通量測序可為illumina測序，具體如nextseq500測序。本發明以血漿作為檢測樣本，有多種優勢，首先可以替代有風險的侵入性組織活檢，並且不會受到病灶位置的局限，同時檢測到多個轉移病灶的遺傳變化，還可在整個治療過程中進行多次檢測。本發明方法克服了傳統檢測方法的不足(如由於ctdna在血液樣本中的含量非常低(<1.0％)，檢測難度大，並且大多數針對ctdna的檢測只能識別單一的熱點突變或少數幾個基因突變)，針對肺癌相關基因(alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因)熱點突變設計特異性引物14對，可準確有效地監測肺癌相關基因的突變，該檢測方法的靈敏度在0.05％。可準確有效地監測肺癌相關基因的突變。將來自患者的基因文庫進行分析，全面、系統、準確地解讀腫瘤藥物與基因的關係，獲得患者特異性腫瘤突變位點。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、本發明檢測肺癌相關基因突變的方法的建立及應用一、供試樣本來源於中國醫學科學院腫瘤醫院被臨床診斷為肺癌的患者的血漿樣本，編號為2015-r-oncoamp067(患者知情且同意)。採用康為世紀游離dna提取試劑盒cw2603s提取血漿游離dna，備用。二、檢測待測樣本肺癌相關基因突變情況其中，本發明涉及肺癌相關基因(alk，braf，egfr、kras和nras)的熱點突變，具體如下：(1)alk基因的熱點突變：涉及1151tins、l1152r、c1156y、f1174la、l1196m、g1202r、s1206y、g1269a等；(2)braf基因的熱點突變：v600e；(3)egfr基因的熱點突變：涉及g719a、g719c、g719s、a763_y764insfqea、t790m、l858r等；(4)kras基因的熱點突變：涉及g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、q61k、q61l、q61r、q61h等。本發明所提供的檢測待測樣本肺癌相關基因突變情況的大體流程如下：(1)step1pcr擴增，擴增目的基因片段；(2)瓊脂糖凝膠電泳，並磁珠純化回收；(3)pcr富集；(4)瓊脂糖凝膠電泳和磁珠純化回收；(5)高通量測序。1、肺癌相關基因突變檢測引物共14對，分別放在2個pool。具體見表1。表114對肺癌相關基因突變檢測引物2、將2ml血漿游離dna平分為2份，分別作為每個pool的模板。具體反應體系如表2和表3所示。反應程序如表4所示。表2pool-1的pcr反應體系組成體積(μl)5×phusionhfbuffer40dntps(2.5mm)19.2pool-1fpmix(1μm)4pool-1rpmix(1μm)4phusionhotstartⅱdnapolymerase4dna1ml血漿游離dnaddh2o補足到200μl表3pool-2的pcr反應體系表4pool-1和pool-2的pcr反應程序3、2％凝膠電泳製備2％瓊脂糖凝膠，pool-1和pool-2反應體系各取3.5μlpcr產物進行凝膠電泳檢測。電壓設置：200v；時間：10min。檢測結果可目的條帶約200bp，或者只有引物二聚體沒有目的條帶(產物量較低，凝膠無法顯示)均屬正常現象，可繼續下步實驗。4、產物純化將同一待檢樣本的pool-1產物和pool-2產物混合於1.5mlep管中；進行磁珠純化，具體步驟如下：1)瓊脂糖凝膠電泳檢測確定擴增有效後，對剩餘pcr產物進行磁珠純化；2)向pcr產物中加入1.2倍體積的磁珠(beckman公司的ampure，貨號是a63881)，上下抽吸混勻至少二十次；3)將混合液放在室溫下5分鐘，使dna充分被吸附在磁珠上。4)吸附結束後，置於磁力架上室溫放置5分鐘(不要旋轉tube)5)待溶液變得清澈後，用移液器將澄清的液體移棄(注意：槍頭不要碰到磁珠)。6)保持8連管在磁力架上不動，加入200μl80％酒精(酒精配置時間在兩周以內，並確保封閉好)，室溫放置30秒後移棄澄清液。7)重複步驟6)一次，並將管底的殘留液體徹底吸乾。8)將反應管從磁力架上移開，室溫放置5分鐘(此步驟是為了徹底揮發掉殘留的酒精，以免影響後續反應實驗)。9)加入33μl的ddh2o，槍頭吹打充分混勻，室溫放置3分鐘。10)將反應管置於磁力架上，室溫放置5分鐘。11)轉移步驟10)反應管中30μl澄清液與對應的已經貼好條形碼編號的離心管中，蓋上管蓋；12)文庫樣本可置於-20℃長期保存。5、pcr富集具體反應體系如表5所示。反應程序如表6所示。表5pcr富集的反應體系組成體積(μl)5×phusionhfbuffer10dntps(2.5mm)4.8富集反應fprimer(50μm)2富集反應rprimer(50μm)2phusionhotstartⅱdnapolymerase1step1pcr產物100ngddh2o補足至50表6pcr富集的反應程序6、2％凝膠電泳製備2％瓊脂糖凝膠，取3.5μlpcr產物進行凝膠電泳檢測。電壓設置：200v；時間：10min。使用凝膠成像系統對其進行掃描，在200～300bp之間有目的條帶。7、產物純化詳細步驟參見「4、產物純化」。8、qubit測定濃度使用invitrogenqubit(q32857)測定文庫濃度。9、高通量測序使用nextseq500進行高通量測序，獲得待檢樣本的序列信息。10、生物信息分析使用生物信息學軟體對待檢樣本序列信息進行分析，結果如表7所示。表7待測樣本肺癌相關基因突變情況檢測結果註：實驗過程中pcr及相關步驟會產生部分背景突變，經過研究對比在0.05％以下；因此該檢測中0.05％以下突變頻率的可信度會降低。邁基諾（重慶）基因科技有限責任公司一種檢測肺癌相關基因熱點突變的試劑盒及其應用gncln17109628patentinversion3.5123dna人工序列1tacctgatgatcagggcttccat23222dna人工序列2ctctgtaggctgcagttctcag22322dna人工序列3tctctcggaggaaggacttgag22422dna人工序列4cctctctgctctgcagcaaatt22522dna人工序列5actcttgctccttccatccttg22621dna人工序列6gttcatcctgctggagctcat21722dna人工序列7gggtgaggcagtctttactcac22824dna人工序列8cctttcttcccagagacattgctg24929dna人工序列9tcagtggaaaaatagcctcaattcttacc291030dna人工序列10cttcatgaagacctcacagtaaaaataggt301122dna人工序列11gcctcttacacccagtggagaa221222dna人工序列12tgtgccagggaccttaccttat221322dna人工序列13gcaccatctcacaattgccagt221422dna人工序列14ccttgttggctttcggagatgt221524dna人工序列15aaattcccgtcgctatcaaggaat241622dna人工序列16ctgccagacatgagaaaaggtg221719dna人工序列17catgcgaagccacactgac191819dna人工序列18ggcatgagctgcgtgatga191919dna人工序列19tacgtgatggccagcgtgg192024dna人工序列20ccaatattgtctttgtgttcccgg242119dna人工序列21gcctcctggactatgtccg192222dna人工序列22ggatcctggctccttatctccc222322dna人工序列23gccaggaacgtactggtgaaaa222424dna人工序列24cctaaagccacctccttactttgc242529dna人工序列25tacctctattgttggatcatattcgtcca292627dna人工序列26attataaggcctgctgaaaatgactga272722dna人工序列27tcctcatgtactggtccctcat222825dna人工序列28gtttctcccttctcaggattcctac25當前第1頁12