一種siv載體的製備方法
2023-11-05 13:02:27
專利名稱：一種siv載體的製備方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，涉及一種SIV載體的製備方法。
背景技術：
SIV (Simian Immunodeficiency Virus)即猴免疫缺陷病毒,SIV 載體是一種基於猴免疫缺陷病毒(SIV)的載體。目前，常見的SIV載體的製備方法是磷酸鈣共沉澱轉染法，該方法受pH的值變化的影響比較大。該製備方法工藝複雜，生產效率低，無法滿足大規模工業化生產的要求。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術中存在的不足，提供一種SIV載體的製備方法。該製備方法構思巧妙、流程簡單，生產成本低，生產效率大幅提高，滿足了 SIV載體大規模工業化生產的要求。為實現上述目的，本發明解決其技術問題所採用的技術方案是
一種SIV載體的製備方法，將培養皿用膠原蛋白進行處理，在轉染過程中使用Opt1-MEM培養基，在轉染過程中增加DNA濃度。本發明通過優化SIV載體生產時的轉染條件，獲得原有技術約2倍的SIV載體生產量，達到事半功倍的效果，對促進SIV載體的實用化具有重大意義。具體包括1)使用Collagen處理過的培養皿提高SIV載體生產量的技術；2)轉染時使用Opt1-MEM培養基提高SIV載體生產量的技術；3)轉染時增加DNA濃度提高SIV載體生產量的技術。本發明的有益效果在於本發明構思巧妙、流程簡單，生產成本低，生產效率大幅提高，可以實現SIV載體的大規模工業化生產。
本發明將通過例子並參照附圖的方式說明，其中
圖1是本發明實施例1生產量評價結果 圖2是本發明實施例2生產量評價結果 圖3是本發明實施例3生產量評價結果 圖4是本發明實施例4生產量評價結果圖。
具體實施例方式本說明書中公開的所有特徵，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特徵和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。實施例1 :選用3個直 徑IOcm的普通培養皿(dish)和3個Collagen-Type I處理過的同尺寸培養皿，採用相同方法進行SIV-GFP的生產，比較使用兩種培養皿在SIV載體生產性上的差別。
具體方法為(DNA32μδ +1.5ml 2xBES Buffer)和1. 5ml 167mM CaCl2 混合 20 分鐘後與12ml DMEM培養基混合，5ml/dish分別加入3個長有293T/17細胞(添加前用DMEM洗一遍細胞)的培養皿中，3小時後以5ml/dish加入含20%FBS的DMEM培養基過夜培養，第2天去掉培養液，用DMEM洗一遍後，以10ml/dish加入含IOmM NaB的DMEM過夜，轉染48小時後收取上清，檢測SIV-GFP的滴度。現有技術中使用普通細胞培養瓶進行SIV載體的生產，本發明使用Collagen處理培養皿可以改善細胞生長狀態，有利於提高SIV載體的生產量。實驗結果表明，使用Collagen處理過的培養皿進行SIV載體的生產可以提高約30%的生產量。實施例2 :選用直徑IOcm的普通培養皿(3個/組)，採用同樣條件配製DNA混合物，將DNA混合物分別和DMEM培養基，IMDM培養基，Opt1-MEM培養基這3種不同培養基混合後添加進培養皿來進行SIV-GFP的生產，比較轉染時使用不同培養基在SIV載體生產性上的差別。現有技術中使用DMEM培養基進行轉染，具體方法同實施例1。磷酸鈣共沉澱轉染法受PH的變化的影響比較大，使用PH較穩定的培養基可改善轉染效率，從而有利於提高SIV載體的生產量。Opt1-MEM是Invitrogen公司開發的培養基,pH比較穩定,可以廣泛用於各種轉染試劑的轉染。實驗結果發現轉染時使用Opt1-MEM進行SIV載體的生產可以提高約40%的生產量。實施例3:選用直徑IOcm的普通培養皿(3個/條件)，分別採用不同條件(I倍DNA濃度，1. 5倍DNA濃度，2. O倍DNA濃度)配製DNA混合物，將DNA混合物和DMEM培養基混合後添加進培養皿來進行SIV-GFP的生產，具體方法同實施例1。比較轉染時使用不同DNA濃度在SIV載體生產性上的差別。SIV載體是使用磷酸鈣共沉澱轉染法來生產的，轉染時的DNA濃度對轉染效率有一定影響，雖然過量DNA的使用會對細胞產生毒性，但在允許範圍內適當提高DNA濃度會改善轉染效率，從而有利於提 高SIV載體的生產量。實驗結果發現使用原有技術2倍DNA濃度進行轉染，可以提高約43%的SIV載體生產量。實施例4 :選用225cm2方瓶，在相同細胞條件下分別採用I倍DNA濃度配製DNA混合物、DMEM培養基和2. O倍DNA濃度、Opt1-MEM培養基進行SIV-GFP的生產。實驗結果發現採用2. O倍DNA濃度、Opt1-MEM培養基進行SIV-GFP的生產可以提高約100%的SIV載體生產量。本發明並不局限於前述的具體實施方式
。本發明擴展到任何在本說明書中披露的新特徵或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過程的步驟或任何新的組合。
權利要求
1.一種SIV載體的製備方法，採用磷酸鈣共沉澱轉染法，其特徵在於將培養皿用膠原蛋白進行處理，在轉染過程中使用Opt1-MEM培養基，在轉染過程中增加DNA濃度。
全文摘要
本發明公開了一種SIV載體的製備方法，採用磷酸鈣共沉澱轉染法，將培養皿用膠原蛋白進行處理，在轉染過程中使用Opti-MEM培養基，在轉染過程中增加DNA濃度。本發明構思巧妙，生產成本低，所製備的託伐普坦片劑體外溶出度高，藥物的生物利用度和臨床療效好。
文檔編號C12N15/867GK103060378SQ20111032453
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月24日 優先權日2011年10月24日
發明者朱義, 遊軍, 朱亞峰, 長谷川戶 申請人:四川百利藥業有限責任公司, 日本Dnavec株式會社