與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記SIsv0377的製作方法

2023-11-05 18:39:02

專利名稱：與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記SIsv0377的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種分子標記，特別是涉及一種與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記。本發明還涉及擴增該分子標記的引物、該分子標記和引物在穀子育性基因定位或穀子遺傳育種中的用途。
背景技術：
我國是穀子(Setaria italica L. Beauv.)的原產國，是世界上穀子的集中種植國，穀子在我國的國民經濟和社會生產中佔有重要的地位，對旱作生態農業建設有重要意義。因此，加速穀子的育種進程尤為重要。由於穀子只是區域重要性作物，因此當前有關谷 子的研究手段和方法相對較落後，如何應用先進科學的研究手段搞好穀子育種是一個嚴峻的問題。隨著分子生物學的發展，分子標記技術的出現，為穀子的遺傳研究及育種開闢了新 的思路和手段。開發具有我國特色的重要性狀基因的分子標記並進行輔助選擇育種研究，將對提高我國穀子育種水平起到促進作用。穀子是最節水的穀類作物，用水量僅為玉米的1/2-2/3，是我國西部乾旱地區和貧瘠山區解決糧食問題唯一現實的選擇。在耕地資源不斷減少、水資源日益短缺、平衡膳食熱逐漸升溫、畜牧業不斷發展的形勢下，大力推進穀子產業既能增加糧食產出、促進畜牧業發展，又能推廣節水農業、帶動相關產業發展，一舉多得，社會效益顯著。穀子是典型的自花授粉作物，穀子的育性與否與穀子的育種關係密切，直接影響到穀子的育種工作。

發明內容
本發明的目的是提供一種與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記。本發明的另一目的是提供一種可用於PCR擴增與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記的引物對，以及由該引物對擴增獲得的分子標記。本發明的再一目的是提供上述分子標記在穀子育性基因定位、檢測以及穀子輔助育種中的用途以及上述分子標記的檢測方法。本發明的目的還包括提供一種包括上述分子標記的載體，以及含有該載體的重組細胞；提供一種包括使用上述分子標記的穀子育性基因的定位方法，和使用所述分子標記的穀子輔助育種方法。為了實現上述目的，本發明採用了以下技術方案本發明公開了一種與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記，所述分子標記含有SeqID No. I所示序列；優選的所述分子標記具有Seq ID No. I所示序列。需要指出的是,所述育性基因指穀子自交能夠結實的基因，即含有該基因的穀子樣本植株全穗籽粒均可育，可進行自花授粉。本發明還公開了一種擴增與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記的引物對，所述引物對的引物I含有Seq ID No. 2所示序列，引物2含有Seq ID No. 3所示序列；優選的所述引物I具有Seq ID No. 2所不序列，引物2具有Seq ID No. 3所不序列；Seq ID No. 2 :5，-TAGGCTTGTAGCACTTGCCT-3，；Seq ID No. 3 :5』 -TTCATGTCCTCGGGTATGAG-3』本發明還公開了一種與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記，所述分子標記是由上述的引物對以育性的穀子基因組DNA為模板經PCR擴增得到的。優選的由上述引物對擴增得到的分子標記含有Seq ID No. I所示序列。在本發明的一個實施方案中，所述分子標記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)為穀子基因組中Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SeqID No. I的5』端和/或3』端以外的核苷酸序列也是穀子基因組中的序列，優選的，為穀子基因組中Seq ID No. I的5』端和/或3』端的上下遊序列。本領域技術人員可以理解，只 要擴增或者檢測育性的穀子基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增到含有SeqID No. I所示的序列。Seq ID No. I的5』端和/或3』端的上下遊序列的長度為適當長度，並不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小於10，OOObp、小於5，OOObp、小於2，000bp、小於 I, 500bp、小於 I, 200bp、小於 I, OOObp、或者小於 800bp。在本發明的一個實施方案中，所述分子標記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No. I的5』端和/或3』端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動子、增強子、終止子、酶切位點、引物序列等等。其中，術語「可操作地」在本發明中定義為一種如下構象，在該構象中，控制序列例如啟動子被適當地置於Seq IDNo. I的一個位置上，以致該控制序列指導Seq ID No. I編碼的多肽的產生。本發明還公開了一種重組載體，其含有本發明的分子標記。所述重組載體可以是插入有本發明的分子標記的表達載體或者克隆載體。獲得上述重組載體後，本領域技術人員可以理解，根據不同的需要，將重組載體轉化到合適的細胞中，得到含有該重組載體的重組細胞。因此，本發明還公開了一種含有所述重組載體的重組細胞。本發明還公開了本發明的分子標記的製備方法，包括下述步驟使用育性的穀子的基因組DNA作為模板，以上述引物對進行PCR擴增，得到的608bp擴增產物即含有所述分子標記；優選地，還包括將PCR擴增產物進行純化的步驟。對本領域技術人員而言，可以理解，也可以DNA化學合成的方法得到本發明的分子標記。本發明還公開了所述分子標記的檢測方法，包括步驟根據上述分子標記的核苷酸序列設計引物，以被檢測穀子基因組DNA為模板進行擴增，並判斷擴增產物中是否存在該分子標記。優選的，所述引物為上述分別含有Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的引物對。例如，可以以被檢測穀子的基因組DNA為模板，以上述引物(Seq ID No. 2和SeqID No. 3)進行PCR擴增，得到擴增產物。可以將得到的擴增產物進行測序或者凝膠電泳。本發明還公開了所述的分子標記在穀子育性基因定位或檢測中的用途。本發明還公開了一種穀子育性基因定位的方法，所述方法包括使用本發明的分子標記的步驟。本發明還公開了所述的分子標記在穀子輔助育種中的用途。本發明還公開了一種穀子輔助育種方法，所述方法包括檢測本發明的分子標記或使用本發明中擴增分子標記的引物對的步驟。
本發明的分子標記可用於今後的分子標記輔助育種中，本領域技術人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發明的分子標記來篩選穀子是否含有控制育性的基因(例如，可以參考，DNA分子標記在小麥抗病育種中的用途，隴東學院學報(自然科學版)，2006年4月第16卷第I期，P65-69)。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發明的擴增分子標記的引物對。所述檢測還可以通過測序方法進行。該穀子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優點。在本發明中，具體地，所述穀子可以為張谷I號、穀子A2不育系、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產生的F2代。其中，張谷I號、張雜谷3號或張雜谷3號自交產生的部分F2代的表現型與父本張谷I號相同；穀子A2不育系、張雜谷3號自交產生的部分F2代與母本穀子A2不育系的表現型相同。由於採用以上技術方案，使本發明具備的有益效果在於
本發明提供了與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記將基因組DNA序列與穀子育性基因聯繫起來，有利於穀子分子標記輔助育種體系的建立；所述分子標記與穀子育性基因的遺傳緊密連鎖距離為I. 75cM。本發明的分子標記及分子標記擴增引物可以簡便、快速、高通量地應用於穀子育種實踐和資源及品種鑑定。


圖I :分子標記引物(Seq ID No. 2和Seq ID No. 3)對F2代480個單株擴增的部分結果。其中泳道1-12為F2代中12株表現型和基因型與父本相同的穀子單株的PCR擴增產物；泳道13-24為F2代中12株表現型和基因型與母本相同的穀子單株的PCR擴增產物。泳道 M 為 marker，其為 IOObp DNA Ladder ;其分子量包括1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 以及 lOObp。
具體實施例方式本發明公開了一種引物對以及與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記SIsv0377。利用本發明的引物對，以穀子基因組DNA為模板進行PCR，可以得到與穀子育性基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記在本發明中命名為分子標記SIsv0377。需要指出的是，本領域技術人員可以理解，除了通過上述PCR擴增獲得本發明的分子標記外，還可以通過化學合成獲得本發明的分子標記。本發明的引物對分別含有序列表Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列，Seq ID No. 2 :5，-TAGGCTTGTAGCACTTGCCT-3，；Seq ID No. 3 :5，-TTCATGTCCTCGGGTATGAG-3』本領域技術人員熟知，在上述Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列中，可在其5 』端或3』端分別增加I 10個鹼基，所增加的鹼基類型可根據穀子基因組DNA上與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3相匹配區域的鹼基類型並依據鹼基配對原則來確定，由此得到的引物對與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3的擴增產物基本相同(上遊和下遊引物之間的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的5』端或3』端分別增加I 10個鹼基並能擴增得到基本相同DNA片段的引物對，均包括在本發明的引物對中。在本發明具體的實施方式中，本發明的引物對優選為Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列。
本發明將父本可育和母本部分不育的純合子雜交，獲得Fl代(張雜谷3號，可育)，再以Fl代自交產生F2代群體，共480個單株。優選的採用SV分子標記開發方法，首先對父本進行 de novo 測序(60X contig N50 22K, scaffold N50 320K ；Total size 400Mb)，母本重測序(IOX);然後根據父母本測序數據，利用華大自主開發的SOAP軟體比較父母本之間的序列差異，分別在父本差異序列的5』端和3』端外側約50bp位置，隨機選取20bp左右的長度設計差異序列擴增的引物，根據不同的差異序列設計了 1105對引物。以父母本及Fl的DNA為模板進行擴增，從1105對引物中篩選出616對具有多態性和有效性的引物。採用開發出的616對引物，對F2群體的480個個體進行PCR檢測，並進行數據統計分析，用Map Makerf. 0軟體進行遺傳圖譜繪製，得到本發明所述的與育性基因緊密連鎖的分子標記，及其擴增引物。採用篩選出的引物對擴增得到的父本序列，即本發明中的分子標記SIsv0377。對F2個體進行性狀分析，並根據基因性狀數據和表型性狀數據將穀子育性基因定位在遺傳圖譜上。下面通過具體實施例並結合附圖對本發明作進一步詳細說明。以下實施例僅僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。 實施例I :穀子F2代分離群體的構建父本抗拿捕淨，株型高，旗葉長而窄，剛毛紅色，穎殼紅色，可育，葉色偏綠，花粉黃白色，抽穗期為晚期。父本為張谷I號種子。母本不抗拿捕淨，株型矮，旗葉短而寬，剛毛綠色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃，花粉棕色，抽穗期為早期。母本為穀子A2不育系種子。本發明中，上述母本的部分不育是指每一穗中大約5%的籽粒可育，其餘不育。F2群體構建父本和母本雜交得到Fl代(Fl的表現型與父本的表現型相同)，Fl自交得到F2。其中Fl是張雜谷3號種子。共得F2代單株480株。上述張谷I號種子、穀子A2不育系種子及張雜谷3號種子可參見中國專利申請《與穀子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記SIsv0372》，
發明者張耕耘, 全志武, 張厚寶, 彭小華 申請人:深圳華大基因科技有限公司, 深圳華大基因研究院