Tr1細胞、間充質幹細胞和其用途的製作方法

2023-12-03 10:54:21 2

專利名稱：Tr1細胞、間充質幹細胞和其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及Trl細胞和間充質幹細胞。更具體地說，本發明涉及Trl細胞和間充質 幹細胞的用途，其用於治療過度的、功能障礙的或不受控的自身或非自身T細胞介導反應， 例如自體免疫疾病或炎症性疾病。
背景技術：
免疫系統的功能在於消除可能含有病原體的外來細胞，同時保持對自體抗原的無 反應性或耐受性。耐受性表現為自體反應性T細胞的耗盡或無反應性，後者的特徵在於T 細胞存活但反應性低。然而，在若干環境中，免疫系統可攻擊自身組分，引起自體免疫疾病。 自體免疫疾病被認為是由對自體抗原的異常免疫反應引起，發生異常免疫反應的原因是自 體抗原免疫原性發生改變或暴露於交叉反應性模擬抗原。需要改進自體免疫疾病或其它不當免疫反應的當前治療，其使用例如抗 TNF化合 物、皮質類固醇、硫唑嘌呤(azathioprine)或環孢黴素A(cyclosporineA)等常規免疫抑制 齊U。這些治療是非選擇性的且無法區分正常的免疫反應與異常的免疫反應。這些藥物通常 具有不良的副作用，包括全面抑制免疫系統從而導致發生感染和瘤形成的風險很高，以及 發展例如糖尿病、骨質疏鬆、白細胞減少症和高血壓等疾病。不能承受常規非特異性藥物治 療或對常規非特異性藥物治療不起反應的患者需要使用治療這些病症的替代方法。這些替 代方法是基於誘導免疫抑制和/或特異性免疫耐受，目的在於沉默對自體抗原的病原性反 應，同時保持宿主防禦機制完好無損。業已考慮了使用MSC的替代方法。間充質幹細胞(MSC)是多能幹細胞，其可輕易地分化成包括成骨細胞、肌細胞、軟 骨細胞和脂肪細胞的譜系。MSC在其表面表達主要組織相容性複合體(MHC)I類抗原，但表 達有限的II類抗原且不表達B7或⑶40共刺激分子，暗示這些細胞具有低免疫原性。MSC 還以不依賴MHC的方式抑制T細胞增殖反應。MSC的這些免疫學特性可增強其移植物植入， 且限制受體免疫系統識別和排斥移植後的同種異體細胞的能力。專利申請案US2002/044923公開了使用已經修飾而攜帶抗原的MSC來治療或抑制 不需要或異常的免疫反應，例如在自體免疫疾病中所發生的。在沒有共刺激信號的情況下 呈遞抗原到T細胞會誘導以下抗原特異性狀態τ細胞對隨後的抗原激發具有低反應性或 甚至無反應性。專利申請案W02005/093044 (Pittenger等人)描述MSC可如何用於治療與免疫系 統有關的疾病病狀和病症。Pittenger等人認為1/MSC可刺激樹突狀細胞(DC)產生β幹 擾素(IFN-β )，其增強腫瘤抑制和針對病毒感染的免疫性，且2/MSC可通過引起調節性T細 胞(Treg細胞)和/或DC釋放白細胞介素-IO(IL-IO)來抑制自體免疫疾病。然而，實施 例中所示的所有實驗都是在活體外實現，且Pittenger等人在此專利申請案中沒有證明注 射MSC可有效地治療與免疫系統有關的疾病病狀和病症。專利申請案US2002/085996涉及使用MSC預防、減輕或治療移植排斥反應和/或移植物抗宿主反應，但在關於自體免疫病症方面卻沒有記載。業已考慮了使用調節性T細胞的其它替代方法。現已鑑別了具有不同表型和不同作用機制的若干調節性T(Treg)細胞亞群。這些 亞型包括⑶4+⑶25+Treg細胞，其經由細胞-細胞接觸抑制免疫反應；Th3細胞，其主要分 泌TGF-β ；和Trl細胞，其分泌高水平的IL-10和低到中等水平的TGF-β。這些Trl細胞 產生IL-10、IL-5和IFN-Y，伴隨產生或不產生TGF-β，但同時很少產生或不產生IL-2或 IL-4，且在多克隆TCR介導的活化後增殖程度很低。專利申請案US2007/009497 和 W02006/090291 公開 了使用 CD4+CD25+Treg 細胞治 療自體免疫和炎症性病症。專利US6281012公開了使用抑制性T細胞減輕或抑制宿主移植排斥反應。這些抑 制性T細胞是被定義為通過暴露於同種抗原而在混合淋巴細胞反應中致敏，且隨後與間充 質幹細胞一起培養的τ細胞。這些抑制性T細胞因此包含同種異體Trl細胞。經由專利申請案W02006/018674，申請人公開了使用Trl細胞治療動脈粥樣硬化。 在促炎性細胞是針對消化道菌群的共生菌的克羅恩病小鼠模型中，申請人還發現對小鼠施 用針對經血液遞送的抗原的Trl細胞可預防結腸慢性炎症。申請人:現在旨在提供一種新穎的替代療法以改進自體免疫疾病或其它不當免疫 反應的現有療法。此新穎療法仍然基於誘導免疫抑制和/或特異性免疫耐受，目的在於沉 默對自體抗原的病原性反應，同時保持宿主防禦機制完好無損。此新穎療法是基於使用包 含Trl細胞和間充質幹細胞的組合物。申請人驚奇地發現，用包含Trl細胞和間充質幹細 胞的組合物治療可獲得比只用MSC或Trl細胞治療更好的結果。不希望受理論束縛，申請 人認為此組合物可在受試對象中誘導抗原特異性免疫耐受以治療過度的、功能障礙的或不 受控的自身或非自身T細胞介導免疫反應，經由諸如以下的不同路徑1/通過MSC以不依賴抗原的方式抑制T細胞增殖反應，2/通過Trl細胞所分泌的IL-10抑制T細胞增殖反應且誘導T細胞耐受，3/通過MSC活體內誘導Trl細胞。

發明內容
本發明因此涉及一種組合物，其包含Trl細胞和間充質幹細胞。在本發明的一實施方案中，所述組合物進一步包含Trl細胞對其具有特異性的抗原。在本發明的一實施方案中，Trl細胞對通常為健康受試對象所耐受的抗原具有特 異性。在本發明的一優選實施方案中，所述通常為健康受試對象所耐受的抗原為過敏 原、自體抗原、食物抗原或微生物抗原。優選地，所述過敏原選自包含花粉、屋塵蟎、貓科動 物或齧齒動物過敏原、溼氣的組，所述自體抗原選自包含胰島素、髓鞘蛋白、熱休克蛋白、橋 粒芯糖蛋白、關節蛋白、其片段、變異體和混合物的組，所述食物抗原選自包含卵清蛋白、酪 蛋白、大豆蛋白、麥醇溶蛋白(gliadin)、其片段、變異體和混合物的組，且所述微生物抗原 選自包含大腸桿菌(Escherichia coli)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、陰溝腸 桿菌(Enterobacter cloacae)禾口共生菌蛋白的組。
在本發明的另一實施方案中，所述Tr 1細胞和MSC是自體的。在本發明的另一實施方案中，可分開地封裝Trl細胞和MSC以待依序或同時施用。本發明還涉及一種包含如上所述的組合物的藥物。本發明還涉及一種醫藥組合物，其包含如上所述的組合物以及一種或一種以上醫藥學上可接受的賦形劑。本發明的另一目的是一種在罹患涉及過度的、功能障礙的或不受控的自身或非自 身T細胞介導免疫反應的疾病的受試對象中誘導抗原免疫特異性耐受性的方法，其包含對 所述受試對象施予有效量的如上所述的藥物或醫藥組合物。在本發明的一實施方案中，所述疾病為自體免疫疾病、過敏性疾病或炎症性疾病。在一優選實施方案中，所述自體免疫疾病選自包含韋格納氏病 (Wegener 『 sdisease)、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、克羅恩病 (Crohn' sdisease)、類風溼性關節炎、多發性硬化和胰島素抵抗性糖尿病的組。在一優選實施方案中，所述過敏性疾病選自包含哮喘、鼻炎、蕁麻疹、異位性皮炎、 纖維化疾病和食物過敏的組。在一優選實施方案中，所述炎症性疾病選自包含類風溼性關節炎、多發性硬化和 克羅恩病的組。在本發明的一實施方案中，所述Trl細胞和所述MSC是同時或依序施用。本發明的另一目的是提供一種促進有需要的受試對象中的組織再生的方法，其包 含對所述受試對象施予有效量的本發明的藥物或醫藥組合物。本發明的另一目的是提供一種治療有需要的受試對象中的纖維化的方法，其包含 對所述受試對象施予有效量的本發明的藥物或醫藥組合物。本發明的另一目的是提供一種促進有需要的受試對象中器官或組織的血管再生 的方法，其包含對所述受試對象施予有效量的本發明的藥物或醫藥組合物。


圖1 在存在或不存在MSC和/或Trl細胞的情況下活化的T細胞所產生的IFN-γ 的檢測結果。MLR是在Transwell的下室中單獨培養，或在上室中在存在MSC、Trl或MSC和Trl 的情況下培養。4天後收集上清液且通過ELISA測量IFN-γ分泌。圖2 :MSC共施用可改良Trl細胞療法在小鼠結腸炎模型中的功效。Balb/c小鼠經含DSS的飲用水處理7天，在第一天靜脈內注射Trl細胞和MSC。每 日監測臨床得分和體重。
具體實施例方式定義
本文所用的術語「調節性T細胞」或「T抑制物」是指抑制或阻止另一 T淋巴細胞 的活化，或在另一實施方案中，抑制或阻止另一 T淋巴細胞的效應物功能和增殖的T細胞群 體。本文所用的術語「Trl細胞」是指靜息時表型為⑶4+⑶25-FoxP3-且在活化後能夠分泌高水平的IL-IO和低到中等水平的TGF-β的細胞。Trl細胞部分地由其獨特的細胞因 子性質表徵其產生高水平的11^-10，顯著水平的16 -0和中等水平的IFN-γ，但產生很少 或不產生IL-4或IL-2。細胞因子的產生典型地是在細胞培養物中，在用T淋巴細胞的多克 隆活化物(例如抗⑶3+抗⑶28抗體或白細胞介素-2、PMA+離子黴素(ionomycin))活化 之後進行評估。或者，細胞因子的產生是在細胞培養物中，在用抗原呈遞細胞所呈遞的特異 性T細胞抗原活化之後進行評估。高水平的IL-10對應於至少約500pg/m，典型地大於約 1000、2000、4000、6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000 或 20000pg/ml 或以上。顯 著水平的TGF- β對應於至少約100pg/ml，典型地大於約200、300、400、600、800或IOOOpg/ ml或以上。中等水平的IFN- γ對應於Opg/ml與至少400pg/ml之間的濃度，典型地大於約 600、800、1000、1200、1400、1600、1800 或 2000pg/ml 或以上。很少的或無 IL-4 或 IL-2 對應 於小於約500pg/ml，優選小於約250、100、75或50pg/ml或以下。本文所用的術語「抗原」是指蛋白質或肽，其與使用本發明細胞所調節的特定疾病 有關，或用於任何本發明方法中。在一實施方案中，術語「抗原」可指以合成方法衍生的分 子或天然衍生的分子，其與目的抗原具有序列同源性，或與目的抗原具有結構同源性，或兩 者皆有。在一實施方案中，抗原可為模擬抗原表位(mimetope)。本文所用的術語「抗原特異性」是指細胞群體的一種性質，因此供應特定抗原或此 抗原的片段會導致，在一實施方案中，在MHC的情形下呈遞所述抗原時發生特異性調節性T 細胞增殖。在另一實施方案中，供應所述抗原或其片段會導致調節性T細胞產生IL-10。在 一實施方案中，調節性T細胞群體表達單克隆T細胞受體。在另一實施方案中，調節性T細 胞群體表達多克隆T細胞受體。本文所用的術語「自體抗原」是指正常地在受試對象體內表達的抗原。在一實施 方案中，自體抗原是指當在體內表達時可導致自體反應性T細胞馴化的抗原。在一實施方 案中，自體抗原是在作為自體免疫疾病靶標的器官內表達。在一實施方案中，自體抗原是在 胰臟、甲狀腺、結締組織、腎、肺、肝、消化系統或神經系統內表達。在另一實施方案中，自體 抗原是在胰臟β細胞上表達。術語「通常為健康受試對象所耐受的抗原」是指不會在健康受試對象中誘導促炎 性反應的所有自體或非自體分子或實體。這些耐受抗原可為自體抗原、消化抗原、吸入抗 原、菌群抗原或接觸抗原。本文所用的術語「受試對象」是指哺乳動物，尤其是人類。本文所用的術語「有效量」是指足以引起有益或期望臨床結果(例如改善臨床病
症)的量。本文所用的術語「治療」 一般是指試圖改變所治療個體或細胞的自然進程的臨床幹預，且可被執行用於預防目的或在臨床病理的過程中執行。期望效果包括(但不限於) 預防疾病發生或復發，緩解症狀，制止、減少或抑制疾病的任何直接或間接病理後果，預防 轉移，降低疾病發展速率，改善或緩和疾病狀態，和引起緩解或改善的預後。本文所用的術語「自體免疫疾病」是指針對自體抗原的免疫反應。本文所用的術語「炎症性病狀」或「炎症性病症」在一實施方案中是指由「炎症性 反應」(在另一實施方案中也稱作「炎症」)引起的任何病症，或在另一實施方案中是指症狀 包括炎症的任何病症。舉例來說，由炎症引起的炎症性病症可為敗血性休克，且症狀包括炎症的炎症性病症可為類風溼性關節炎。本文所用的術語「過敏性反應」是指針對一般無害、無毒的抗原或過敏原的免疫系 統攻擊。在一實施方案中，過敏症可包括(但不限於)枯草熱、哮喘、異位性溼疹，以及對毒 櫟和毒葛、屋塵蟎、蜂毒、堅果、貝類、青黴素或其它藥物或任何其它誘導過敏性反應的化合 物的過敏。本發明本發明涉及一種組合物，其包含Trl細胞和間充質幹細胞(MSC)。在本發明的一實施方案中，MSC可通過收集含MSC的組織和分離並擴增所述MSC而獲得。獲得的MSC可為同種群體，或可為富含MSC的混合細胞群體。同種MSC可通過培 養貼壁骨髓或骨膜細胞、或脂肪組織的基質_血管部分來獲得，且MSC可由特異性細胞表面 標誌物鑑別。同種MSC組合物是通過陽性選擇不含與造血細胞或分化的間充質細胞相關的 標誌物的貼壁骨髓、脂肪組織的基質-血管部分或骨膜細胞來獲得。這些分離的間充質細 胞群體展現僅與間充質幹細胞有關的表位特徵，具有在培養物中再生但不分化的能力，且 具有在活體外誘導或活體內放在損傷組織部位時分化成特定間充質譜系的能力。為了獲得 受試人類的間充質幹細胞，必需將骨髓或其它MSC來源中的稀少的多能間充質幹細胞與其 它細胞分離開來。骨髓細胞可從髂嵴、股骨、脛骨、脊骨、肋骨或其它骨髓腔獲得。人類間充 質幹細胞的其它來源包括胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒和青少年皮膚、血液和脂肪組織。專利US5486359例如描述一種獲得富含MSC的細胞群體的方法，其以引用的方式 併入本文。在本發明的一實施方案中，Trl細胞可通過以下步驟獲得a)從受試對象分離祖細胞群體，b)通過在存在IL-10的情況下培養所述祖細胞群體來獲得樹突狀細胞群體，c)在存在抗原的情況下將步驟b)的細胞與從所述受試對象分離的CD4+T淋巴細 胞群體接觸，以使所述CD4+T細胞分化成Trl細胞群體，和d)從步驟c)回收Trl細胞群體。在步驟b)中，IL-10在培養基中的存在量為50到250U/ml，優選為100U/ml。所 述獲得Trl細胞的方法描述於Wakkach等人(Immunity 2003年5月；18(5) 605-17)中， 其以引用的方式併入本文。所述方法也可使用地塞米松(Dexamethasone)、維生素D3、或致耐受性的或不成 熟的DC代替步驟b)的DC來進行。在本發明的另一實施方案中，Trl細胞可通過以下步驟獲得a)在含有適當量的IFN-α的培養基中培養從受試對象分離的CD4+T細胞群體，和b)回收Trl細胞群體。IFN-α在培養基中的存在量優選為5ng/ml。在步驟a)中，培養基可進一步包含 適當量的IL-10，優選為100U/ml。在步驟b)中，Trl細胞群體是在包含IL-15的培養基中培養以允許增殖，IL-15在培養基中的存在量優選為5ng/ml。所述獲得Trl細胞的方法描述於專利US6746670中，其 以引用的方式併入本文。
在本發明的另一實施方案中，Trl細胞可通過以下步驟獲得a)在存在由人造抗原呈遞細胞呈遞的抗原的情況下，活體外活化⑶4+T細胞群 體，和b)回收活化的⑶4+T細胞，其包含至少10%的Trl細胞。
優選地，人造抗原呈遞細胞表達HLA II系統分子和人類LFA-3分子，但不表達共 刺激分子 B7-1、B7-2、B7-H1、CD40、CD23 禾口 ICAM-1。所述獲得Trl細胞的方法描述於專利申請案W002/. 92793中，其以引用的方式並 入本文。在本發明的另一實施方案中，Trl細胞可通過以下步驟獲得a)在存在抗原和適當量的IL-10的情況下，活體外活化⑶4+T細胞群體，和b)回收Trl細胞群體。IL-10在培養基中的存在量優選為100U/ml。所述方法描述於Groux等人(Nature 1997,389(6652) :737_42)中，其以引用的方式併入本文。在本發明的另一實施方案中，抗原特異性Trl細胞可通過以下步驟獲得a)用抗原刺激白細胞群體或外周血單核細胞(PBMC)群體，b)從刺激的群體回收抗原特異性Trl細胞群體，c)任選地，擴增所述抗原特異性Trl細胞群體。白細胞涵蓋若干類型的細胞，其由各自的重要性、分布、數量、壽命和潛力表徵。這 些類型有多核或粒性白細胞，其中發現了嗜酸性、嗜中性和嗜鹼性白細胞；和單核細胞或 外周血單核細胞(PBMC)，其是大型白細胞且由免疫系統中的細胞類型(淋巴細胞和單核細 胞)組成。白細胞或PBMC可通過所屬領域技術人員所知的任何方法從外周血分離。對於 分離PBMC，適宜使用離心法，優選為密度梯度離心法，更優選為不連續密度梯度離心法。替 代方案是使用特異性單克隆抗體。在某些實施方案中，PBMC典型地是藉助於聚蔗糖-泛影 葡胺(Ficoll-Hypaque)，使用標準程序從全血產物分離。在其它實施方案中，PBMC是藉助 於白細胞去除法回收。所述方法描述於專利申請案W02007/010406中，其以引用的方式併入本文。在另一實施方案中，Trl細胞可通過以下步驟獲得a)在存在抗原的情況下，培養白細胞群體或外周血單核細胞(PBMC)群體與間充 質幹細胞，b)回收Trl細胞群體。所述方法也可用稚T細胞或記憶T細胞代替PBMC或白細胞來進行。如此獲得的Trl細胞群體可進一步通過在存在細胞因子如白細胞介素_2和白細 胞介素_4的情況下培養來進行擴增。或者，Trl細胞擴增培養也可使用白細胞介素-15和 白細胞介素-13。在另一實施方案中，Trl細胞可通過以下步驟獲得a)培養⑶4+T細胞與先前經地塞米松(約10_7M)和選定抗原處理的樹突狀細胞，b)在培養開始後1周回收Trl細胞群體。在上述方法中，Trl細胞可通過W02005/000344中所述的鑑別方法進行表徵。Trl 細胞的所述鑑別方法是基於檢測編碼CD4分子的基因的表達產物和選自包含CD18和/或⑶Ila和⑶49b的組的分子的同時存在情況。Trl細胞可通過Elisa、流式細胞術或免疫親 和純化方法，使用針對所述標誌物的抗體來鑑別和/或純化。Trl細胞也可通過使用流式細胞術或磁珠的陽性選擇或陰性選擇來富集。所述方 法也描述於W02005/000344中，其以引用的方式併入本文。
在本發明的另一實施方案中，所述包含Trl細胞和MSC的組合物可通過共培養MSC 與自體T細胞歷經1到2周來獲得。在本發明的一優選實施方案中，包含所述Trl細胞和所述MSC的組合物進一步包 含Trl細胞對其具有特異性的抗原。在本發明的一實施方案中，Trl細胞對其具有特異性的抗原可與本發明的組合物 分開地施用，例如飲食抗原可在食物中施予受試對象。在另一實施方案中，Trl細胞對其具 有特異性的抗原是添加到本發明的組合物中。在本發明的一優選實施方案中，所述Trl細胞對其具有特異性的抗原是通常為健 康受試對象所耐受的抗原。在本發明的一實施方案中，所述通常為健康受試對象所耐受的抗原是過敏原。過 敏原的清單可見於http://www. allergen, org八在一優選實施方案中，所述過敏原選自包含花粉、屋塵蟎、貓科動物或齧齒動物過 敏原、溼氣的組。在本發明的另一實施方案中，所述通常為健康受試對象所耐受的抗原是食物抗原。術語「食物抗原」是指來自食品的免疫原性肽，例如以下非限制性清單的食物 抗原牛抗原，例如脂質運載蛋白(lipocalin)、鈣結合S100、α-乳清蛋白、β -乳球蛋 白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白或酪蛋白。食物抗原也可為大西洋鮭(atlantic salmon) 抗原，例如小白蛋白(parvalbumin)；雞抗原，例如卵類粘蛋白(ovomucoid)、卵清蛋白、 Ag22、伴白蛋白(conalbumin)、溶菌酶或雞血清白蛋白；花生、蝦抗原，例如原肌球蛋白 (tropomyosin)；小麥抗原，例如凝集素(agglutinin)或ω-5麥醇溶蛋白；芹菜抗原，例如 芹菜肌動蛋白抑制蛋白(profilin)；胡蘿蔔抗原，例如胡蘿蔔肌動蛋白抑制蛋白；蘋果抗 原，例如奇甜蛋白(thaumatin)、蘋果脂質轉移蛋白、蘋果肌動蛋白抑制蛋白；梨抗原，例如 梨肌動蛋白抑制蛋白、異黃酮還原酶；鱷梨抗原，例如內切幾丁質酶(endochitinase)；杏 抗原，例如杏脂質轉移蛋白；桃抗原，例如桃脂質轉移蛋白或桃肌動蛋白抑制蛋白；大豆抗 原，例如HPS、大豆肌動蛋白抑制蛋白或(SAM22)PR-10蛋白。在本發明的另一實施方案中，所述通常為健康受試對象所耐受的抗原是自體抗原。術語「自體抗原」是指從所述個體的蛋白質衍生的免疫原性肽。舉例來說，其可 以是以下非限制性清單的自體抗原乙醯膽鹼受體、肌動蛋白、腺苷酸轉運蛋白(adenin nucleotide translocator)、β -腎上腺素受體、芳香族L-胺基酸脫羧酶、脫唾液酸糖蛋 白(asioaloglycoprotein)受體、殺菌/滲透性增強蛋白(Bpi)、鈣敏感受體、膽固醇側鏈 裂解酶、IV型膠原蛋白Oy鏈、細胞色素P4502D6、結蛋白(desmin)、橋粒芯糖蛋白-1、橋 粒芯糖蛋白-3、F-肌動蛋白、GM-神經節苷脂、穀氨酸脫羧酶、穀氨酸受體、H/K ATPase, 17-[α]-羥化酶、21-羥化酶、IA-2 (ICAS 12)、胰島素、胰島素受體、1型內因子、白細胞功能抗原1、髓鞘相關糖蛋白(myelin associated glycoprotein)、髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein)、髓鞘少突膠質細胞蛋白(myelin oligodendrocyte protein)、肌球蛋白、 P80-螺旋蛋白(coilin)、丙酮酸脫氫酶複合物E2(PDC-E2)、鈉/碘同向轉運體(sodium iodidesymporter)、SOX-IO,甲狀腺和眼睛肌肉共用蛋白(thyroid and eye muscle sharedprotein)、甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、促甲狀腺激素受體、組織轉穀氨醯胺 酶、轉錄輔活化因子P75、色氨酸羥化酶、酪氨酸酶、酪氨酸羥化酶、ACTH、氨醯基-tPvNA-組 氨醯合成酶、心磷脂(cardiolipin)、碳酸酐酶II、著絲粒相關蛋白、DNA依賴性核小體刺 激性ATPase、纖維蛋白(fibrillarin)、纖維粘連蛋白(fibronectin)、葡萄糖-6-磷酸異 構酶、β_2-糖蛋白I、高爾基體蛋白(golgin) (95、97、160、180)、熱休克蛋白、半橋粒蛋白 180、組蛋白H2A、組蛋白H2B、角蛋白、IgE受體、Ku-DNA蛋白激酶、Ku-核蛋白、La磷蛋白、 髓過氧化物酶(myeloperox ydase)、蛋白酶3、RNA聚合酶1_11、信號識別蛋白、拓撲異構酶 I、微管蛋白、波形蛋白(vimenscin)、髓鞘相關少突膠質細胞鹼性蛋白(MOBP)、蛋白脂蛋白 (proteolipid protein)、少突膠質細胞特異性蛋白(0SP/緊密連接蛋白11)、環核苷酸3' 磷酸二酯酶(CNPase)、BP抗原1 (BPAGl-e)、轉醛醇酶(transaldolase) (TAL)、人類線粒體 自體抗原 PDC-E2 (Novo 1 和 2)、0ffl)C-E2 (Novo 3)和 BC0ADC-E2 (Novo 4)、大皰性類天皰疫 (BP) 180、層粘蛋白(Iaminin) 5 (LN5)、DEAD盒蛋白48 (DDX48)或胰島素瘤相關抗原_2。食物抗原或自體抗原優選是重組或合成抗原。抗原優選是選自包含卵清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、麥醇溶蛋白、花生蛋白、其片 段、變異體和混合物的組的食物抗原。抗原優選是選自包含胰島素、髓鞘蛋白、熱休克蛋白、橋粒芯糖蛋白、關節蛋白、蛋 白酶3、其片段、變異體和混合物的組的自體抗原。術語食物抗原或自體抗原的「變異體」在本文中是指與天然抗原幾乎相同且具有 相同生物活性的抗原。天然抗原與其變異體的最小差別可在於例如胺基酸取代、缺失和/ 或添加。所述變異體可含有例如保守性胺基酸取代，其中胺基酸殘基經具有類似側鏈的氨 基酸殘基取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基家族在所屬領域中已有定義，包括鹼性側鏈 (例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電的極性側鏈 (例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例 如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β _分支側 鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨 酸)。在本發明的一實施方案中，所述通常為健康受試對象所耐受的抗原是微生物抗原。微生物抗原包括(但不限於)來源於例如細菌、古細菌、真菌、病毒、原生動物、寄 生蟲、藻類、粘菌或朊病毒等微生物的抗原。所述微生物的實例是肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)、金黃色葡萄 球菌(Staphylococcusaureus)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenza)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、腦膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis)、大腸桿菌、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、卡他莫拉 菌(Moraxella catarrhal is)、分枝桿菌(Mycobacteria)、沙門氏菌(Salmonella)、弧菌(Vibrio)、鏈黴菌(Str 印 tomyces)、幽門螺旋菌(Helicobacter)、乳酸球菌(Lactococcus) 和李斯特菌(Listeria)。抗原優選是選自包含大腸桿菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌和共生菌蛋白的組的微 生物抗原。在本發明的一優選實施方案中，所述Trl細胞和MSC是自體的。這意味著MSC和Trl細胞或其前體是從同一受試對象獲得且將施予其所來源的受 試對象。MSC和Trl細胞是自體的可首先允許長期的移植不存在細胞的排斥反應且不存 在同種異體反應。其次，在需要MSC呈遞抗原的情況下，自體情形使得其可能實現。本發明還涉及一種如上所述的組合物，其中Trl細胞和MSC是分開地封裝以待依 序或同時施用。依序意味著MSC可首先注射，且Trl細胞隨後注射，優選在MSC注射 後的第24到 48小時注射。本發明還涉及一種包含如上所述的組合物的藥物。本發明還涉及一種醫藥組合物，其包含如上所述的組合物以及一種或一種以上醫 藥學上可接受的賦形劑。本發明的另一目的是提供一種在罹患涉及過度的、功能障礙的或不受控的自身或 非自身T細胞介導免疫反應的疾病的受試對象中誘導抗原免疫特異性耐受性的方法，其包 含對所述受試對象施予有效量的如上所述的藥物或醫藥組合物。適當的載劑和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩衝鹽水。組合物可經調配 以供腸胃外、肌肉內、靜脈內、腹膜內、注射、鼻內吸入、肺吸入、皮內、關節內、鞘內或經由消 化道施用。本發明的藥物或醫藥組合物典型地是通過肌肉內、腹膜內或靜脈內注射，或通過 直接注射入患者淋巴結，優選通過靜脈內注射而施予患者。對受試對象的施用量典型地是104/kg到109/kg細胞，優選是105/kg到107/kg細 胞且更優選是約IOfVkg細胞。所述的施用途徑和劑量僅打算作為指導，因為熟練技術人員能夠依據例如患者的 年齡、體重和病症，容易地確定用於任何特定受試對象的最佳施用途徑和劑量。在一優選實施方案中，所述涉及過度的、功能障礙的或不受控的自身或非自身T 細胞介導免疫反應的疾病是自體免疫疾病、過敏性疾病或炎症性疾病。自體免疫疾病包括(但不限於)糖尿病、多發性硬化和類風溼性關節炎。可治療的 與自體免疫疾病相關的特定病症包括自體免疫性(橋本氏(Hasimoto' s))甲狀腺炎、甲 狀腺機能亢進(格雷夫氏病(Graves' disease)) I型糖尿病、胰島素抵抗性糖尿病、自體免 疫性腎上腺功能不全(艾迪生病(Addison' s disease)),自體免疫性卵巢炎、自體免疫性 睪丸炎、自體免疫性溶血性貧血、陣發性冷性血紅蛋白尿、自體免疫性血小板減少症、自體 免疫性嗜中性粒細胞減少症、惡性貧血、純紅細胞貧血、自體免疫性凝血障礙、重症肌無力、 自體免疫性多神經炎、多發性硬化、天皰瘡和其它大皰類疾病、風溼性心臟炎、古德帕斯丘 症候群(Goodpasture' s syndrome)、心臟病術後症候群、系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節 炎、舍格倫症候群(Sjorgen' s syndrome)、多發性肌炎、皮肌炎、硬皮病；炎症性腸疾病克羅恩病、潰瘍性結腸炎；慢性阻塞性肺病；慢性炎症性疾病、乳糜瀉(Coelic disease), 韋格納氏病、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、自體免疫性肝炎、脊椎關節炎。所述自體免疫疾病優選選自包含韋格納氏病、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化 性膽管炎、克羅恩病、類風溼性關節炎、多發性硬化和胰島素抵抗性糖尿病的組。過敏性疾病包括(但不限於)哮喘、鼻炎、蕁麻疹、異位性皮炎、纖維化疾病和食物 過敏。炎症性病症包括(但不限於)心血管疾病、類風溼性關節炎、多發性硬化、克羅恩 病、炎症性腸疾病、系統性紅斑狼瘡、多發性肌炎、敗血性休克、移植物抗宿主疾病、宿主抗 移植物疾病、哮喘、鼻炎、牛皮癬、與癌症相關的惡病質或溼疹。所述炎症性疾病優選選自包 含類風溼性關節炎、多發性硬化和克羅恩病的組。在本發明方法的一實施方案中，所述耐受的抗原特異性Trl細胞和所述MSC是同 時或依序施用。依序意味著MSC可首先注射，且Trl細胞隨後注射，優選在MSC注射後的第24到 48小時注射。在本發明方法的另一實施方案中，本發明的藥物或醫藥組合物可與傳統療法組合 施用，或在另一實施方案中，與較低劑量的所述傳統療法組合施用。舉例來說，本發明方法 可伴隨免疫抑制劑的施用一起進行，所述免疫抑制劑的劑量或所述免疫抑制劑的數目可減 少。本發明的另一目的是提供一種在受試對象中促進組織再生的方法，其包含對所述 受試對象施予有效量的如上所述的藥物或醫藥組合物。欲治療的組織的實例包括(但不限於)肌肉、骨頭和軟骨再生。適當的載劑和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩衝鹽水。組合物可經調配 以供腸胃外、肌肉內、靜脈內、腹膜內、注射、鼻內吸入、肺吸入、皮內、關節內、鞘內或經由消 化道(例如經由皮耶爾貼片(Peyers patches))施用。優選地，本發明的藥物或醫藥組合 物可直接施予變性組織。對受試對象的施用量典型地是104/kg到109/kg細胞，優選是105/kg到107/kg細 胞且更優選是約IOfVkg細胞。所述的施用途徑和劑量僅打算作為指導，因為熟練技術人員能夠依據例如患者的 年齡、體重和病症以及所治療傷口的範圍和嚴重性，容易地確定用於任何特定受試對象的 最佳施用途徑和劑量。本發明的另一目的是提供一種在受試對象中治療纖維化的方法，其包含對所述受 試對象施予有效量的如上所述的藥物或醫藥組合物。欲治療的纖維化的實例包括(但不限於)肝硬化、與晚期腎病相關的腎纖維化和 肺纖維化。適當的載劑和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩衝鹽水。組合物可經調配 以供腸胃外、肌肉內、靜脈內、腹膜內、注射、鼻內吸入、肺吸入、皮內、關節內、鞘內或經由消 化道施用。本發明的藥物或醫藥組合物典型地是通過肌肉內、腹膜內或靜脈內注射，或通過 直接注射入患者淋巴結(優選通過直接靜脈內注射)而施予患者。
對受試對象的施用量典型地是104/kg到109/kg細胞，優選是105/kg到107/kg細 胞且更優選是約IOfVkg細胞。所述的施用途徑和劑量僅打算作為指導，因為熟練技術人員能夠依據例如受試對 象的年齡、體重和病症以及所治療纖維化的範圍和嚴重性，容易地確定用於任何特定受試 對象的最佳施用途徑和劑量。本發明的另一目的是提供一種在組織或器官需要血管再生的受試對象中促進所 述組織或器官的血管再生的方法，其包含對所述受試對象施予有效量的如上所述的藥物或 醫藥組合物。誘導血管再生可用於治療冠狀動脈和外周動脈供血不足，且因此可以是治療冠狀 動脈疾病、缺血性心臟病和外周動脈疾病的非侵入性和治癒性方法。血管再生可在除心臟 外的組織和器官的疾病和病症的治療，以及除心臟外的器官的發育和/或維持中起重要作 用。血管再生可在內部和外部傷口以及皮膚潰瘍的治療中起重要作用。血管再生對於將軟 骨吸收與骨形成相結合以及正確的生長板形態發生也是至關重要的。血管再生在胚胎著床 和胎盤生長，以及胚胎血管系統的發育中也起重要作用。適當的載劑和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩衝鹽水。組合 物可經調配 以供腸胃外、肌肉內、靜脈內、腹膜內、注射、鼻內吸入、肺吸入、皮內、關節內、鞘內或經由消 化道施用。本發明的藥物或醫藥組合物典型地是通過肌肉內、腹膜內或靜脈內注射，或通過 直接注射入患者淋巴結(優選通過直接靜脈內注射)而施予患者。對受試對象的施用量典型地是104/kg到109/kg細胞，優選是105/kg到107/kg細 胞且更優選是約IOfVkg細胞。所述的施用途徑和劑量僅打算作為指導，因為熟練技術人員能夠依據例如患者的 年齡、體重和病症，容易地確定用於任何特定受試對象的最佳施用途徑和劑量。實施例實施例1製備MSC間充質幹細胞是從Balb/c小鼠的脂肪組織的基質_血管部分獲得。脂肪組織用 0. 膠原酶消化30分鐘，且濾過70 μ篩網。粘附細胞在含有10% FCS和10%馬血清且 補充有穀氨醯胺和青黴素和鏈黴素的RPMI培養基中培養。頻繁監測細胞在脂肪細胞和成 骨細胞譜系中的分化能力。製備Trl細胞卵清蛋白特異性Trl細胞是在存在照射的同基因抗原呈遞細胞的情況下，從來自 用卵清蛋白肽323-339和IL-10活化的DOl 1-10卵清蛋白特異性TCR轉基因小鼠的稚CD4+T 淋巴細胞分化而來。細胞隨後通過有限稀釋法克隆，以獲得卵清蛋白特異性Trl細胞的單 克隆群體。實驗1和2所用的細胞是從Trl克隆的培養物獲得。T細胞的活化分析評估Trl細胞和MSC在抑制MLR方面的抑制能力。MLR安置於含有IO6個反應細 胞(responder cell) (Balb/c 小鼠)和 IO6 個照射的脾細胞(C57 BL6 小鼠)的 Transwell 的下室中。MSC (3 X IO4個細胞)和Trl細胞(IO5個細胞)添加到上室中。4天後，收集MLR上清液且通過ELISA測量IFN- γ的分泌。測定IFN-Y產牛的方法通過從BD Biosciences購買的市售ELISA評估由活化的T淋巴細胞產生的γ幹擾素。觀察結果(圖1)結果證實MSC與Trl細胞獨立地抑制T細胞活化，這是通過促炎性T淋巴細胞所 釋放的IFN- γ的減少而測量到。共培養MSC和Trl細胞導致抑制作用大於單獨的MSC或 Trl細胞，表明這兩種類型的細胞展示協同作用，使得對T細胞活化和IFN-γ釋放的抑制作 用得到增強。實施例2用右旋葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sodium Sulfate) (DSS，5 %飲用水溶液)處理 BALB/c小鼠以誘導急性結腸炎。一組小鼠組不進行處理，或在第1天用含有或不含來源於 脂肪組織的MSC(0.5X106/小鼠)的IO6個卵清蛋白特異性Trl細胞以靜脈內方式處理。7 天后，基於以下得分評估小鼠的臨床體徵0-無臨床體徵1-體重減輕2-體重減輕+輕微腹瀉3-體重減輕+嚴重腹瀉4-體重減輕+嚴重腹瀉+糞便出血結果顯示MSC共施用可改良Trl細胞療法在此結腸炎模型中的功效(圖2)。
權利要求
一種組合物，其包含Tr1細胞和間充質幹細胞。
2.根據權利要求1所述的組合物，其進一步包含所述Trl細胞對其具有特異性的抗原。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其中Trl細胞對通常為健康受試對象所耐受的 抗原具有特異性。
4.根據權利要求1或2所述的組合物，其中所述通常為健康受試對象所耐受的抗原為 過敏原、自體抗原、食物抗原或微生物抗原。
5.根據權利要求1到4中任一權利要求所述的組合物，其中所述Trl細胞和MSC是自 體的。
6.根據權利要求1到5中任一權利要求所述的組合物，其中Trl細胞和MSC是分開地 封裝以待依序或同時施用。
7.—種藥物，其包含根據權利要求1到6中任一權利要求所述的組合物。
8.—種醫藥組合物，其包含根據權利要求1到6中任一權利要求所述的組合物以及一 種或一種以上醫藥學上可接受的賦形劑。
9.一種在罹患涉及過度的、功能障礙的或不受控的自身或非自身T細胞介導免疫反應 的疾病的受試對象中誘導抗原免疫特異性耐受性的方法，其包含對所述受試對象施予有效 量的根據權利要求7所述的藥物或根據權利要求8所述的醫藥組合物。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述疾病是自體免疫疾病、過敏性疾病或炎症性 疾病。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述疾病是選自包含韋格納氏病(Wegener's disease)、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、克羅恩病(Crohn' s disease)、類 風溼性關節炎、多發性硬化和胰島素抵抗性糖尿病的組的自體免疫疾病。
12.根據權利要求9所述的方法，其中所述疾病是選自包含類風溼性關節炎、多發性硬 化、克羅恩病的組的炎症性疾病。
13.根據權利要求9所述的方法，其中所述疾病是選自包含哮喘、鼻炎、蕁麻疹、異位性 皮炎、纖維化疾病和食物過敏的組的過敏性疾病。
14.根據權利要求9到13中任一權利要求所述的方法，其中所述Trl細胞和所述MSC 是同時或依序施用。
15.一種在有需要的受試對象中促進組織再生的方法，其包含對所述受試對象施予有 效量的根據權利要求7所述的藥物或根據權利要求8所述的醫藥組合物。
16.一種在有需要的受試對象中治療纖維化的方法，其包含對所述受試對象施予有效 量的根據權利要求7所述的藥物或根據權利要求8所述的醫藥組合物。
17.一種在有需要的受試對象中促進器官或組織的血管再生的方法，其包含對所述受 試對象施予有效量的根據權利要求7所述的藥物或根據權利要求8所述的醫藥組合物。
全文摘要
本發明涉及包含Tr1細胞和間充質幹細胞的組合物，以及治療自體免疫疾病、過敏性疾病或炎症性疾病的方法。
文檔編號A61K39/00GK101835889SQ200880112753
公開日2010年9月15日 申請日期2008年10月17日 優先權日2007年10月17日
發明者納薩莉·貝爾蒙特, 阿爾諾·福薩特 申請人:特克賽爾公司