一種基於膠乳的三聚氰胺快速檢測方法及試劑盒的製作方法
2023-12-02 00:59:01
一種基於膠乳的三聚氰胺快速檢測方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液及其製備方法，包含包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的試劑盒，以及使用包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液檢測樣品中三聚氰胺的方法。
【專利說明】一種基於膠乳的三聚氰胺快速檢測方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學、醫學、生物學和食品安全的交叉學科領域，更具體涉及一種基於聚苯乙烯膠乳微球檢測三聚氰胺的方法。
【背景技術】
[0002]在食品行業中，通過凱式定氮法(GB/T5009.5-2010 ;第一法)測定氮原子含量從而間接計算蛋白質含量。近年來，一些不法商販將化工原料三聚氰胺添加到食品或飼料中，以求提高通過凱式定氮法測定的表觀蛋白含量。三聚氰胺可導致人體泌尿系統產生結石，如膀胱結石和腎結石等疾病，因此被嚴格禁止添加到食品中。
[0003]目前三聚氰胺的檢測方法有高效液相色譜法、液質聯用、氣質聯用法等，這些方法雖然檢測靈敏度高，但前處理步驟操作時間長，儀器價格昂貴，且需取樣並送回實驗室進行檢測，不適合樣品中三聚氰胺的現場快速篩查。目前可用於現場快速檢測的方法如酶聯免疫吸附試驗，相較之下應用起來較靈活，但檢測成本依然很貴，對技術操作人員操作也有一定的技術要求，而膠體金卡雖然操作十分簡便、但只能是定性分析，不能實現準確的定量分析。
[0004]免疫比濁法(J.M.Singer et al.，Am.J.Med.21，888-92; 1956)主要用於微生物和病毒感染等的檢測和臨床診斷。在免疫比濁法中，將抗體包被在微球表面。當包含特定抗原的樣品與乳膠懸液混合時，導致可見的凝集，增加了樣品的渾濁度。通過測量樣品與抗體包被乳膠懸液反應後的吸光度，並與使用已知濃度的抗原繪製的標準曲線進行比較，從而測定樣品中抗原的濃度。
[0005]免疫比濁法中使用的微球包括多種類型，例如玻璃、矽石、納米金屬、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺顆粒等。可通過被動吸附或化學共價偶聯，例如碳化二亞胺(EDC)法、溴化偶聯等方式將抗體連接到微球上。在膠乳微球表面包被抗體的方法通常需要首先活化膠乳微球表面的官能團，使其能夠與抗體蛋白反應。例如，通常使用EDC活化膠乳微球表面的羧基，使其與蛋白質的氨基偶聯。
[0006]通常認為通過使用碳化二亞胺(EDC)/N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)的活化法更有利於蛋白質與微球之間的相互作用，因此是最為常用的偶聯方法。此外，還有使用EDC/NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)混合物的活化法。然而，這兩種方法中要先後使用兩種試劑，反應系統和方法較為複雜，極易導致微球發生凝集，不利於抗體包被微球的工業化生產。
[0007]與此相比，單獨使用EDC的活化法(或稱作一步EDC法)的步驟較為簡單且產率較高。然而，一步EDC法多用於不包含羧基的配體(例如寡核苷酸，如DNA)與表面帶有羧基的微球之間的偶聯。如果待偶聯的配體也包含羧基基團(例如蛋白質，如抗體)，其可能被EDC活化，導致配體之間的聚合，從而無法獲得期望的產物。
[0008]因此，需要開發一種避免微球或抗體之間相互凝集產生沉澱，從而適合穩定生產抗體包被微球的生產工藝，從而獲得能夠利用免疫比濁法快速、準確檢測樣品中的三聚氰胺。
【發明內容】
[0009]目前，EDC活化法中多使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)作為活化緩衝劑，但本發明人經實驗發現使用MES緩衝的EDC溶液無法製備包被三聚氰胺抗體的微球溶液。本發明人經大量實驗表明，在膠乳體系中，加入活化液後極易使帶羧基的微球相互凝集產生沉澱，保持膠乳狀態則需要改進活化緩衝液的成分。因此，本發明人對EDC活化法進行了大量研究，結果發現包含吐溫20的磷酸鹽緩衝液能夠提供有利於抗體與微球之間偶聯的最適環境，能夠避免微球相互凝集產生沉澱，適合穩定生產抗體包被微球，從而完成了本發明。
[0010]在第一方面，本發明提供了一種包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的製備方法，所述方法包括以下步驟:將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩衝液中，其中，所述活化緩衝液為包含0.5?1.0g/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩衝液，pH7.4-7.8。
[0011]在優選的實施方案中，本發明的製備方法使用一步EDC活化法活化所述膠乳微球表面的羧基。在本發明中，術語「一步EDC活化法」是指在活化過程中不使用除碳化二亞胺外的其他活化劑的EDC活化法。所述「其他活化劑」包括諸如Sulfo-NHS、NHS的試劑。
[0012]在一個【具體實施方式】中，本發明的製備方法包括以下步驟:
[0013]I)將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩衝液中，其中，所述活化緩衝液為包含0.5?L Og/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩衝液，pH7.4-7.8。
[0014]2)加入活化劑混合反應，其中所述活化劑為碳化二亞胺；
[0015]3)加入三聚氰胺單克隆抗體，進行包被反應；
[0016]4)加入淬滅液終止反應；
[0017]5)加入封閉液以封閉游離的羧基，從而獲得包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。
[0018]在本發明中，所述膠乳微球可以是通常用於免疫檢測的任何膠乳微球，例如聚苯乙烯微球、聚丙烯醯胺微球等。已知有很多廠商提供各種不同型號的膠乳微球，例如Microparticles GmbH,PolyMicrospheres Inc.等。本領域技術人員可以根據具體需要選擇適合的表面帶有羧基的膠乳微球。
[0019]在本發明中，優選使用聚苯乙烯膠乳微球。本發明所述膠乳微球的粒徑可以在100-200nm之間,優選130_170nm。在本發明中，使用表面帶有羧基的膠乳微球,從而通過碳化二亞胺反應與三聚氰胺單克隆抗體連接。所述膠乳微球的羧基含量為100-200 μ eq/g，優選 160 ?170μ eq/g。
[0020]在本發明中，碳化二亞胺的加入量可由本領域技術人員根據具體需要確定。例如，可以加入羧基數量15%-30%的碳化二亞胺。
[0021]本發明使用的三聚氰胺單克隆抗體可以通過本領域已知的方法製備，例如雜交瘤技術等；也可以通過商購獲得，例如購自北京博奧生物技術有限責任公司(型號bsm-2182M)等。
[0022]在本發明中，膠乳微球與三聚氰胺單克隆抗體之間的比例可由本領域技術人員根據具體需要確定。膠乳微球與三聚氰胺單克隆抗體之間的比例通常在5:1至10:1之間，優選10:1。所加入的抗體過多或過少都易導致膠乳微球發生凝集。
[0023]本發明使用的淬滅液可以是通常用於終止碳化二亞胺連接反應的任何試劑，例如60-80g/L甘氨酸,優選75g/L甘氨酸。[0024]本發明使用的淬滅液可以是通常用於封閉膠乳微球游離的羧基的任何試劑，例如血清白蛋白，如180-220g/L牛血清白蛋白，優選200g/L牛血清白蛋白。
[0025]由本發明所述方法製備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液可以現配現用。在使用時，通過離心去除上清，使用復溶液清洗膠乳微球，並定容至指定的濃度。所述復溶液可以包含8-15g/L甘氨酸、0.5-1.5g/L疊氮鈉、8_13g/L山梨醇、3_8g/L牛血清白蛋白和
1.5-2.5g/L EDTA.Na2, ρΗ7.8-8.2。
[0026]優選地，所述復溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L疊氮鈉、10.0g/L山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2, ρΗ8.0。
[0027]也可以將按照本發明所述方法製備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球復溶在所述復溶液中，並在2?8° C下低溫保存。
[0028]在一個實施方式中，本發明所述的製備方法包括以下步驟:
[0029]I)使用活化緩衝液將粒徑130_170nm，羧基含量為160?170 μ eq/g的聚苯乙烯膠乳微球稀釋1%的膠乳液，其中所述活化緩衝液包含0.5?lg/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩衝液，ρΗ7.4-7.8 ；
[0030]2)加入羧基數量15%_30%的碳化二亞胺，混勻後反應5min ；
[0031]3)以膠乳微球與三聚氰胺單克隆抗體為10:1的比例加入三聚氰胺單克隆抗體，並在37。C、300rpm反應2-3小時；
[0032]4)加入75g/L甘氨酸，中止包被反應；
[0033]5)加入200g/L牛血清白蛋白，在37° C、300rpm反應30_60min，從而封閉游離的
竣基;
[0034]6)離心去除上清，使用復溶液清洗，其中所述復溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L 疊氮鈉、10.0g/L 山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2，ρΗ8.0-8.2 ；
[0035]7)重複步驟6)三次，隨後使用所述復溶液定容至膠乳濃度為0.1%，並在2-8° C下低溫保存。
[0036]與常用的MES緩衝活化液相比，本發明採用的活化緩衝液提供了三聚氰胺單克隆抗體與表面帶有羧基的膠乳微球進行偶聯的最適離子濃度和ΡΗ，避免了在加入三聚氰胺抗體後發生不利的凝集現象。
[0037]本發明採用的復溶液提供了有利於包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液保持穩定的最適離子濃度和pH。使用所述復溶液可以將包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液在常溫下保持I年以上，同時避免抗體脫落。
[0038]在第二方面，本發明提供了所述活化緩衝液用於製備包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的用途。
[0039]在第三方面，本發明提供了一種用於檢測樣品中三聚氰胺的試劑盒，所述試劑盒包含以下組分:
[0040]I) Rl試劑:包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩衝液，pH7.0-7.6 ；
[0041 ] 2) R2試劑:包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液；和
[0042]3)三聚氰胺標準品。
[0043]所述Rl試劑是通常用於免疫比濁法的緩衝劑。本領域技術人員可以根據需要配製適合的緩衝劑。在本發明中，可使用包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩衝液，例如包含3%PEG6000和(λ 2%吐溫20的40mM磷酸鹽緩衝液，pH7.0-7.6，優選ρΗ7.4。在需要長期保存的情況下，還可任選地添加0.1%疊氮鈉以用作防腐劑。
[0044]所述R2試劑是包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。所述三聚氰胺抗體和膠乳微球如本發明第一方面所述。優選地，所述R2試劑是根據本發明第一方面所述製備方法製備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。所述膠乳微球溶液的濃度可以為1%(10倍濃縮液)或 0.1%。
[0045]所述試劑盒還可任選地包含使用所述試劑檢測樣品中三聚氰胺的說明書。
[0046]與常規檢測三聚氰胺的方法相比，本發明所述的試劑盒操作簡單、成本低、檢測速度快，且能定量進行分析。
[0047]所述試劑盒可用於檢測樣品中三聚氰胺的濃度。因此，在第三方面，本發明提供了所述試劑盒用於檢測樣品中三聚氰胺濃度的應用。所述樣品可以為食品，特別是乳製品，如鮮奶、奶粉、奶酪，奶油和酸奶。
[0048]第四方面，本發明提供了一種用於檢測樣品中三聚氰胺濃度的免疫比濁方法，其包括以下步驟:
[0049]I)將所述樣品與包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩衝液(ρΗ7.0-7.6)，混合溫育；
[0050]2)加入包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液；
[0051]3)測量所得混合物在加入所述膠乳微球溶液後1s至5分鐘之間任意兩個時間點的吸光度差值AA54tl ；
[0052]4)根據使用三聚氰胺標準品繪製的標準曲線確定樣品中的三聚氰胺濃度。
[0053]使用三聚氰胺標準品繪製的標準曲線的方法是本領域已知的。通常，將濃度已知的三聚氰胺標準品與適合的緩衝劑(例如，本發明所述的Rl試劑)混合溫育，隨後，加入包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液，混合後溫育5分鐘，並根據吸光度的變化繪製標準曲線。
[0054]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:
[0055]本發明所述三聚氰胺檢測試劑盒及其方法，通過加入Rl、R2兩種試劑，根據反應前後吸光度變化而定量分析樣品三聚氰胺的濃度。
[0056]本發明所有試劑配製簡單、操作容易，R2試劑中偶聯物不易脫落，穩定性很強，試劑製作成本低，耗時短，能夠在較短時間內大量生產。對檢測的技術人員的技術要求不高、檢測速度快、檢測全過程只需7分鐘，此外，不依賴專業儀器，可以真正實現實時快速檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0057]圖1為顯示不同濃度的三聚氰胺標準品在反應過程中吸光度變化的反應曲線圖，其中橫坐標為反應時間，縱坐標為吸光度變化。
[0058]圖2為不同時間下測得的標準曲線，其中橫坐標為反應物濃度(ppb)，縱坐標為吸
光度變化。
[0059]圖3為根據不同濃度標準品的吸光度差值繪製標準曲線，其中橫坐標為反應物濃度(PPb)，縱坐標為吸光度變化。
[0060]圖4為顯示穩定性實驗的對比結果，其中，橫坐標為反應時間(min)，縱坐標為吸光度變化。檢測濃度為27ppb，時間間隔為7天、在37度條件下保存。【具體實施方式】
[0061]以下通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明並不限於這些【具體實施方式】。
[0062]實施例1:緩衝劑Rl的配製
[0063]40mM、PH7.4的PBS配製:①稱取磷酸二氫鈉0.0624g，用超純水定容10ml ;②稱取磷酸氫二鈉7.16g，用超純水定容500ml ;③稱取氯化鈉0.14g，加入①試劑3.8ml和②試劑 16.2ml。
[0064]此為40mM，PH7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)。
[0065]Rl的配製:
[0066]PEG6000 0.3g
[0067]疊氮鈉0.0lg
[0068]吐溫-2020ul
[0069]稱量好各種化學品後，用40mM、PH7.4的PBS定容至1ml。
[0070]由於PEG6000在常溫下不溶解，因此將該試劑放置60度水浴鍋中加熱，並不斷攪動混勻。溶解後的試劑為無色透明液體。
[0071]配好試劑後於2-8° C冰箱中保存，，保存期限為12個月。
[0072]實施例2:用於製備和保存包被三聚氰胺抗體的膠乳微球的試劑
[0073]活化緩衝液:
[0074]1mM的PBS (PH7.4)的準備:將實施例1製備的40mM的PBS稀釋四倍，隨後，在所得1mM PBS中加入0.70g/L的吐溫-20。
[0075]復溶液:
[0076]甘氨酸11.3g/L
[0077]疊氮鈉1.0g/L
[0078]山梨醇10.0g/L
[0079]BSA 5.0g/L
[0080]EDTA.Na2 2.0g/L
[0081]先稱量各種固體化合物，然後用超純水定容，為增加溶解速度，可置於37度溫箱中。最後，加氫氧化鈉溶液(20%)調PH8.00±0.08。配好的試劑為無色澄清透明的液體。配製好的復溶液可保存在2-8° C冰箱中，保存期限為12個月。
[0082]淬滅液:
[0083]甘氨酸75g/L
[0084]稱取甘氨酸後，用超純水定容。混勻後，該溶液為無色透明液體。配好試劑後於2-8度冰箱中保存。保存期限為60天。
[0085]封閉液:
[0086]BSA 200g/L
[0087]稱量BSA固體，用超純水定容，放置60度水浴鍋中，邊加熱邊搖動瓶子，加速溶解。溶解後的BSA溶液為淡黃色的液體。配製好的封閉液可保存在2-8° C冰箱中，保存期限為60天。[0088]實施例3:包被三聚氰胺抗體的膠乳微球的製備工藝
[0089]反應體系為10ul。
[0090]活化
[0091]取1.5ml離心管，加入活化緩衝液70ul，用移液器取1ul的聚苯乙烯膠乳微球(購自美國PolyMicrospheres公司，粒徑大小130_170nm,羧基含量160-170 μ eq/g)到此離心管中，不斷吹打，使膠乳顆粒均勻的分散到活化緩衝液中，從而獲得白色乳濁液。
[0092]稱量固體碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCA ;購自上海共價化學科技有限公司)溶於活化緩衝液中，濃度為0.001mg/ul。在上述膠乳顆粒緩衝液中加入1ul EDCA溶液，在常溫下活化5min。活化好的膠乳體系仍為白色乳濁液，但粘稠度有所下降。
[0093]偶聯
[0094]將活化好的膠乳體系加入三聚氰胺單克隆抗體(購自北京博奧森生物技術有限責任公司，型號bsm-2182M)，加入量為1ul (10mg/ml )，添加時應迅速用槍頭吹打，儘量在短時間內快速混勻。混勻後得到白色乳濁液。將加有三聚氰胺抗體的膠乳體系置於37° C、300rpm的恆溫振湯器中反應2小時。完成後體系仍為白色乳池液。
[0095]淬滅
[0096]此時三聚氰胺膠乳偶聯物已形成，在體系中加入淬滅液80ul，用槍頭吹打混勻，於37度、300rpm恆溫振蕩器中反應30min。結束後體系應無沉澱物。
[0097]封閉
[0098]加入封閉液17ul，用槍頭吹打混勻，放置於30度、300rpm恆溫振蕩箱中，封閉時間為45min。封閉結束後,該體系為白色乳濁液,且無沉澱物。
[0099]純化
[0100]將離心管放入冷凍高速離心機中，45000g、8min離心(注:在離心前應將離心機預冷到10度，防止高速離心時產生較高溫度)，離心後，白色膠乳微球大部分都沉澱在離心管底部，上清液中含有極少量微球，但仍然看起來無色透明，倒掉上清液，或用槍頭將上清液取出，加入10ul復溶液，用槍頭吹打混勻，再置於超聲波清洗儀中將微球分散。超聲波清洗儀功率99%，時間lmin。重複此步驟三次。最後一次加入復溶液lml。
[0101]此時溶液為白色乳濁液，經檢測體系中沒有無顆粒狀沉澱。此為R2試劑，吸光度約為0.2-0.9，如吸光度過高，可再次進行稀釋。
[0102]保存
[0103]該試劑應置於2-8° C冰箱中密封保存，保存期限為12個月。
[0104]實施例4:不同EDC活化方法對膠乳系統穩定性的影響
[0105]在本實施例中，採用常規的EDC+NHS的活化方法進行膠乳微球的活化，並與本發明的活化方法進行比較。具體步驟如下:
[0106]首先，按照實施例3的描述使用EDC活化膠乳微球:
[0107]用移液器取1ul的聚苯乙烯膠乳微球(購自美國PolyMicrospheres公司，粒徑大小130_170nm，羧基含量160-170 μ eq/g)到離心管中，不斷吹打，使膠乳顆粒均勻的分散到本發明的活化緩衝液中，至終濃度1%。
[0108]稱量固體EDCA(購自上海共價化學科技有限公司)溶於本發明的活化緩衝液中，濃度為0.001mg/ul。在上述膠乳顆粒緩衝液中加入1ul上述EDCA溶液，振蕩混勻，反應5min，測吸光值I。
[0109]隨後，將所得膠乳微球平均分成兩份，其中一份不添加NHS，另一份加入NHS，用量約為EDC用量的2-3倍，混勻後，測量兩份樣品的吸光值2。
[0110]表1:不同活化方法對膠乳體系穩定性的影響
[0111]
【權利要求】
1.一種包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的製備方法，其包括: 1)將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩衝液中，其中，所述活化緩衝液為包含0.5?lg/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩衝液，pH7.4-7.8 ； 2)加入活化劑，混合反應，其中所述活化劑為碳化二亞胺； 3)加入三聚氰胺單克隆抗體，進行包被反應； 4)加入淬滅液終止反應；和 5)加入封閉液以封閉游離的羧基，從而獲得包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。
2.如權利要求1所述的方法，其中，使用一步EDC活化法活化所述膠乳微球表面的羧基。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述活化緩衝液為包含0.7g/L吐溫20的1mM磷酸鹽緩衝液，PH7.4。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述膠乳微球為粒徑為100-200nm，羧基含量為100-200 μ eq/g的聚苯乙烯膠乳微球。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述方法還包括以下步驟: 6)將步驟5獲得的膠乳微球溶液離心去除上清，使用復溶液清洗，其中所述復溶液包含8-15g/L甘氨酸、0.5-1.5g/L疊氮鈉、8-13g/L山梨醇、3_8g/L牛血清白蛋白和1.5-2.5g/L EDTA.Na2, ρΗ7.8-8.2 ；7)重複步驟6)三次，隨後將溶於所述復溶液的膠乳溶液在2-8°C下低溫保存。
6.如權利要求5所述的方法，其中，所述復溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L疊氮鈉、10.0g/L 山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2, ρΗ8.0。
7.通過權利要求1-6中任一項所述方法製備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。
8.用於檢測樣品中三聚氰胺的試劑盒，其包含: 1)Rl試劑:包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩衝液，ρΗ7.0-7.6 ； 2)R2試劑:權利要求7所述的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液；和 3)三聚氰胺標準品。
9.一種用於檢測樣品中三聚氰胺濃度的方法，其包括以下步驟:1)將所述樣品與包含PEG6000和吐溫20的磷酸鹽緩衝液(pH7.0-7.6)，混合溫育； 2)加入權利要求7所述的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液； 3)測量所得混合物在加入所述膠乳微球溶液後1s至5分鐘之間任意兩個時間點的吸光度差值ΛΑ540 ;和 4)根據使用三聚氰胺標準品繪製的標準曲線確定樣品中的三聚氰胺濃度。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述樣品選自鮮奶、奶粉、奶酪、奶油和酸奶。
【文檔編號】G01N33/577GK104034893SQ201310074726
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月8日 優先權日:2013年3月8日
【發明者】王琳, 張小波, 鄭清林 申請人:北京普析通用儀器有限責任公司