檢測水貂阿留申病毒的特異性引物及其在篩選健康水貂中的應用的製作方法
2023-12-01 22:15:41
檢測水貂阿留申病毒的特異性引物及其在篩選健康水貂中的應用的製作方法
【專利摘要】檢測水貂阿留申病毒的特異性引物及其在篩選健康水貂中的應用，本發明的目的是針對水貂的阿留申病毒設計高靈敏度特異性檢測引物，並將該引物應用於篩選未患阿留申病的水貂，該方法通過快速準確的檢測水貂糞便是否攜帶阿留申病毒，進而判定宿主水貂是否適合作為育種的種貂，避免了用繁瑣的CIEP方法檢測。這種篩選方法穩定、有效、適用幾乎所有品種水貂並且與CIEP結果符合率高，在不傷害水貂的前提下，能迅速的檢測出攜帶病毒的陽性水貂，幾乎所有簡易實驗室均可應用。
【專利說明】檢測水貂阿留申病毒的特異性引物及其在篩選健康水貂中 的應用
【背景技術】
[0001] 水貂阿留申病（AMD)是由阿留申病毒引起的一種慢性進行性傳染病，該病的特點 是潛伏期長，呈慢性經過，可垂直感染，血液中丙種球蛋白異常增高以上，漿細胞增多，多發 生動脈炎，血管球性腎炎和肝炎，急性流產（Best SM et al.，2005)。因此又稱漿細胞增多 症或丙種球蛋白增多症。AMDV在分類上屬細小病毒科，細小病毒亞科，阿留申病毒屬，為單 股線狀DNA病毒。
[0002] 大量文獻表明，阿留申病已成為廣泛流行於世界各貂國家的一種重要傳染病 (Knuuttila et al. 2009);黑龍江1973年某場用碘反應對1300頭貂檢查，陽性率達22%。 吉林農大在北京、大連和吉林等地貂場先後檢查，12000隻水貂，結果表明種獸群發病率為 20-30 %，皮獸群高達50 %。
[0003] 水貂患阿留申病後，可使病貂睪丸發育不良，健康貂平均為8. 8克、患病貂為3. 2 克，無成活精子或精子甚少。母貂患病影響產仔及成活，如吉林農大調查表明，患病母貂仔 獸平均成活為2. 3隻，而健康母紹平均仔獸成活為5. 8隻（Zhenjun Wang et al. 2014)。
[0004] 挑選健康優質的水貂是選育優良水貂品種的前提條件，阿留申病對水貂的健康構 成嚴重威脅，患有阿留申病的水貂顯然不宜作為育種種貂。目前國內外大多通過檢疫淘汰 病貂來實現對病原的淨化，其中對流免疫電泳（CIEP)是現今世界公認的應用最為廣泛的 檢測方法。即採集疑似患病水貂血液，分離血清後，利用對流免疫電泳（CIEP)中抗原抗體 反應產生的沉澱線來判定該水貂是否患病。此外，也有將疑似AMDV的血液、尿液及臟器的 DNA作為PCR反應的模板，來篩選未患病水貂種貂，該方法顯得較為簡單，顯示出一定的優 勢。但是上述幾種方法在不同程度上存在繁瑣及取樣不便的情況，也阻礙了水貂的育種工 作，因此開發一種簡單、實用、快速的篩選未患阿留申病水貂種貂的方法顯得尤為重要。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種檢測阿留申病毒的高靈敏度特異性引物；
[0006] 本發明的另一目的在於將上述引物應用於篩選健康的水貂作為育種種貂，實現精 確度高、操作簡單、成本低廉的快速篩選。
[0007] 本發明的技術方案是這樣實現的：
[0008] 根據GeneBank上已登錄的阿留申病毒AMDV參考序列，設計AMDV特異性引物：
[0009] Al: 5 ' -GAAACCACGGTGGAGACA-3 '
[0010] A2:5，-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3 '
[0011] 該引物擴增片段長度為451bp。
[0012] 利用幹棉籤，取水貂肛門部位的糞便，並迅速溶解與純淨水中，拭子液凍融一次 後，利用DNA提取試劑盒提取該液體的總DNA。使用上述DNA作為模板，加入DNA擴增酶混 合物和AMDV的特異性檢測引物，通過PCR反應，PCR試驗條件為：2XEasyTaq PCR SuperMix 25ul、上下遊引物各IuU模板3uL、ddH20 20uL，PCR反應參數為：95°C預變性5min ;94°C變 性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環；72°C延伸IOmin。PCR產物經I %瓊脂糖凝 膠電泳檢測，如果出現大小約為451bp的條帶，則可以確定樣品中含有阿留申病毒（AMDV) 核酸，該宿主不能作為種貂，反之則可作為候選種貂。
[0013] 該PCR方法可檢出最低病毒量為IOOng AMDV DNA，用於確認糞便中是否存在阿留 申病毒。
[0014] 將同一水貂血樣進行阿留申病毒PCR與血清阿留申病毒抗體對流免疫電（CIEP) 符合率檢測，檢測結果符合率達到95 %。
[0015] 本發明提供的特異性檢測引物及其在篩選健康水貂中的應用，對不同品種的水貂 種群均適用，且實驗穩定性高，3個月後重複試驗結果不變，顯示出該方法良好的應用性。 本發明的積極效果是不傷害水貂：僅僅採取肛門拭子就可以鑑別水貂是否攜帶阿留申 病毒，有利於水貂育種工作中後備群體的建立。特異性引物在糞拭子中的應用效果穩定、有 效、適用幾乎所有品種水貂並且與CIEP結果符合率高，能迅速的篩選出健康的水貂作為 育種種貂，幾乎所有簡易實驗室均可應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1是以水貂糞便總病毒DNA為模板，以阿留申病毒特異性引物進行PCR反應的 產物電泳圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。
[0018] 實施例一：特異性引物的應用
[0019] 1、材料與方法
[0020] 1. 1供體水貂及試劑
[0021] 672份水貂肛門糞拭子分別採於大連、長春、哈爾濱、山東多家水貂養殖場， 2 XEasyTaq PCR SuperMix購於全式金生物技術有限公司（北京），DNA Marker DL2000購 於寶生物工程有限公司（大連），咽拭子病毒DNA/RNA提取試劑盒購於康為試劑生物科技有 限公司（北京）。
[0022] 1. 2水貂糞便總病毒DNA的提取
[0023] 利用幹棉籤，採取水貂肛門部位的糞便，並迅速溶解於純淨水中，拭子液凍融一次 後，參照咽拭子病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書操作（康為試劑生物科技有限公司）提取 總DM0
[0024] 1. 3水貂糞便阿留申病毒PCR檢測
[0025] 根據GeneBank上已登錄的阿留申病毒參考序列，設計引物，擴增片段長度為 451bp，
[0026] Al (上遊引物）：5' -GAAACCACGGTGGAGACA-3'
[0027] A2 (上遊引物）：5 ' -AAGAGITGACCTGGAGGG-3 '
[0028] PCR 試驗條件為：2XEasyTaq PCR SuperMix 25ul、上下遊引物各 IuU模板 3uL、 ddH2020uL，PCR 反應參數為：95°C預變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s， 30個循環；72°C延伸lOmin。
[0029] 該PCR方法可檢出最低病毒量為IOOng AMDV DNA ;根據PCR產物的電泳結果判定 糞便中是否存在阿留申病毒。
[0030] 2、水貂阿留申病毒PCR檢測結果
[0031] 提取672份水貂糞便總病毒DNA，經阿留申病毒特異性引物進行PCR反應，然後將 PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中408份樣品可見大小約為451的條帶（見說明書 附圖，圖1)，序列經BLAST對比分析後確認為水貂阿留申病毒基因，其與阿留申病毒標準株 (ADV-Utah lstrain)核酸相似度達到96-97%，確認為水貂阿留申病毒。
[0032] 672份水貂肛門糞拭子分別提取病毒DNA，隨機選取49份樣品用1%瓊脂糖凝膠電 泳檢測，結果49份樣品均可見DNA條帶。
[0033] 實施例二：應用特異性引物篩選感染阿留申病水貂的結果一致性實驗
[0034] 為了辨別該PCR方法檢測感染阿留申病毒的水貂檢測結果的一致性和穩定性，我 們採用不同時間段取同一水貂的樣品，分別在8月份、9月份和10月份採集同一水貂的糞 便，提取DNA後，進行特異性PCR擴增，在檢測的11隻水貂中實驗證明這3次PCR結果完全 一致，說明該方法能穩定的檢測出水貂阿留申病毒，並且能暗示出阿留申病毒感染水貂是 長期性的，該結果與文獻報導一致。
[0035] 表1應用特異性PCR擴增篩選在水貂不同生長期的一致性
【權利要求】
1. 一種檢測水貂阿留申病毒的高靈敏特異性引物，用於檢測水貂肛門拭子液是否攜帶 阿留申病毒，其特徵在於，所述引物序列為： A1:5 ' -GAAACCACGGTGGAGACA-3， A2:5 ' -AAGAGTTGACCTGGAGGG-3 '。
2. 權利要求1所述的檢測水貂阿留申病毒的高靈敏特異性引物在篩選健康水貂中的 應用，其特徵在於，所述應用是通過以下步驟實現的： (1) 對後備留種群的水貂逐一編號，利用幹棉籤取水貂肛門部位的糞便，並迅速溶解與 純淨水中，拭子液凍融一次後，利用DNA提取試劑盒提取該液體的總DNA ; (2) 使用上述DNA作為模板，加入DNA擴增酶混合物和阿留申病毒（AMDV)的特異性檢 測引物，進行RCR反應，所述PCR試驗條件為：2XEasyTaq PCR SuperMix 25ul、上下遊引物 各luL、模板3uL、ddH20 20uL，PCR反應參數為：95°C預變性5min ;94°C變性30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，30 個循環；72°C延伸 lOmin ; (3) PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現大小約為451bp的條帶，則可以確定 樣品中含有阿留申病毒（AMDV)核酸，該宿主不能作為種貂，反之則可以留種。
3. 根據權利要求2所述的高靈敏特異性引物在篩選健康水貂中的應用，其特徵在於， 應用此方法可檢出感染阿留申病的各品種的水貂，在3個月內的進行重複檢測結果一致， 與對流免疫方法檢測結果對比，其結果一致率達到95%。
【文檔編號】C12Q1/70GK104450967SQ201410777738
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月15日 優先權日:2014年12月15日
【發明者】易立, 程悅寧, 程世鵬, 陳立志, 仝明薇, 嶽志剛, 王建科, 趙航, 林鵬 申請人:中國農業科學院特產研究所