一種溶磷草酸青黴菌p8的製作方法

2023-12-01 11:46:01

專利名稱：：一種溶磷草酸青黴菌p8的製作方法
技術領域：
：本發明屬於微生物菌劑領域，具體地，涉及一種溶磷草酸青黴菌(屍emW〃&wojra/z'CMm)P8、含有該菌的溶磷菌劑及其用途。
背景技術：
：全世界範圍內嚴重缺磷的威脅向人類襲來，地球上天然磷礦的使用壽命只有50年。我國磷肥需求量大、磷礦資源嚴重不足。磷肥施入土壤後90。/。左右被土壤固定，形成溶解性極低的磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁等化合物，進入土壤難溶磷資源行列。土壤磷素90%以上為無機磷，北方土壤的難溶磷50%以上以磷酸鉤的形態存在，磷酸鐵磷酸鋁次之。經過幾十年的磷肥施用，我國土壤全磷增加。利用溶磷微生物，提高土壤磷的有效性、提高磷肥的利用效率和節約磷肥資源，以及促進磷素吸收、增加作物產量，對於我們這樣一個13億人口大國的目前和未來的糧食安全意義重大。Staltrom(1903)和Sachett"a/.(1908)發現土壤溶磷微生物以來，前蘇聯20世紀40年代開展了溶磷微生物的研究(Pikovskaya,1948),蒙金娜1935年從土壤中分離出解有機磷和溶解磷磷酸三《丐的巨大芽孢桿菌(Menkina,1950)。此後研究工作在近100個國家相繼展開，並且取得了巨大成就。研究的重點集中在篩選高效、安全、生存力強的溶磷菌株，並以此作為接種劑，使之在根表和根際建立優勢菌群，達到促進土壤難溶磷溶解和作物增產的目的。Jonhson(1954)最早研究了真菌的溶磷作用，在他分離的三株真菌中，^spwg/〃附m'gw的溶磷作用最好。Rao，etal.(1982)分離到第一株鏈黴菌，可使培養基的pH降低，能溶Ca3(P03)2和磷礦石。BanikandDey(1983)報導了他們分離出的兩株放線菌(鏈黴菌)的溶磷作3用，它們能溶解Ca3(P03)2和AlP04。Taha"a/.(1969)報導了酵母菌真菌的溶轔作用。報導酵母菌溶解無機磷的還有VarshaandPatel(1995)。FalihandWainwright(1995)則報導了一株具有硝化、氧化硫和溶磷等多重作用的酵母菌。Struthers和Siding(1950)的研究結果指出，分泌有機酸是微生物的溶磷機理，減少土壤中Fe3+、A13+離子對PO^的化學固定。Johnston(1952)首次提出只有特定結構的有機酸的作用才是溶磷的主要機制。LouuwandWebley(1959)和Johnston(1959)也證明了有機酸的種類決定溶磷菌的溶磷能力。Duff"a/(1963)測定了能溶解和螯合各種難溶磷酸鹽或礦物使之溶解的陰離子，溶磷細菌能產生2-酮基-葡萄糖酸。溶磷菌產生的葡萄糖酸(Feniceetal.2000)、梓檬酸(Vassilavaaa/.1998)、甲叉丁二酸、草酸、丙烯二羧酸(Parksetal.1998),以及3-N基-3-乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙烯-2-氨基-4-乙酸(NarsianandPatel，2000;Rashid"a/.2004;)，是溶磷作用產生的主要機理。溶磷微生物分泌H"質子是其溶嫌又一機理。研究發現，屍em'c/〃/簡qycpz'"m在培養基中分泌tf增加了培養基酸度(RoosandLackner,1984),溶磷微生物溶解羥基磷灰石有兩種不同方式，一種需要NH/的存在，另一種則無需NH4+(Haideretal,1992;AbdAlla，1996)。溶磷微生物合成氧化還原物質成為其第三個主要溶磷機理。層析技術分析顯示木黴7Hc/2o&wwsp的溶磷物質與鐵結合的複合體的存在，它能夠分泌還原Fe(m)和Cu(II)的複合體，以螯合和還原兩種反應溶解難溶磷(AltomareWa/.,1999)。溶磷微生物在有氧條件下2-酮基葡萄糖酸(2-KGA)產量高，厭氧時產生量急劇下降，有機酸不再成為溶磷的主要途徑，而還原作用扮演重要角色(Hwangbo"a/.，2003)。科學家對溶磷微生物活化土壤難溶磷的能力進行了不懈研究。田間條件下，高粱接種溶磷青黴菌屍emW〃&msp.和臭麴黴A.foetidus，顯著增加了土壤有效磷，而且磷礦石+溶磷菌的作物吸磷量高於重過磷酸鈣(Salih"a/.,1989);利用"P同位素稀釋法研究發現，用屍emW〃/wm6z7q/7(PB)接種的小麥所吸收的磷素有18%來自於難溶性磷源，對於沒有接種過PB的土壤則植物無法利用這種磷源(Asea等，1988)，而且接種屍em'cz'〃/MmMa"的具有溶解土壤微量元素Cu、Fe、Zn等的作用(Kucey，1987));其他溶磷細菌在增加土壤有效磷同時，也表現活化了土壤微量元素(Orhan，e^/.，2006)。使用溶磷微生物肥料能夠提高了作物葉片氣磷含量，土壤有效磷含量，土壤接種溶磷菌比種子表面接種顯著提高土壤有效嫌(KapureandNaik,2004)。小麥接種溶磷菌劑節省磷肥、提高土壤有效磷，收穫后土壤有效磷依然高於未施溶磷菌劑的處理(Suil",2006)。有些溶磷微生物受土壤有效磷購抑制。有些菌株則不受土有效磷的影響(MikanovaandNovakova，.2002)。溶磷草酸青黴菌P8能夠提高磷肥的有效性、防止磷肥向難溶磷的轉化(範丙全等J004)。上述結果表明，溶嫌菌對於提高土壤難溶磷的生物有效性具有巨大應用潛力。溶磷微生物具有促進作物生長和提高作物生物量的作用(H6flichetal.，1995;FreitasWa/,1997;KatiyarWa/"2003;Morales"a/.，2007)，還有促進作物吸磷、提高作物產量效果(Chabot,1996;Peix，"a/.，2001;Hameeda"a/.,2006);豌豆接種屍em'c/〃z'ww6z7a"後增加根毛量22%,增加根毛長度33%，可能增加了吸收養分的面積而達到增產的效果(Gulden,2000;Vessey，2001)。用攜帶潮黴素抗性基因標記溶磷青黴菌屍emW仏'wmn/gw/osom，將獲得的轉化子接種玉米，玉米的乾物重比對照增加28%(Reyes,2002))。溶磷青黴菌真菌接種小麥、苜蓿、兵豆能夠提高產量15-18%(Wakelin"a/.，2007)。據不完全統計，全世界共篩選出36屬，89種溶磷微生物，其中真菌27個種，細菌58個種，放線菌4個種。自上個世紀50年代以來，溶磷微生物肥料進入商業化生產和較大規模的使用。但是，真正用於農業生產的菌株很少。前蘇聯20世紀50年代開展了具有溶磷作用的解磷巨大芽孢桿菌的大面積應用(Cooper,1959)。同時，解磷巨大芽孢桿菌被其它國家引進用於生產(Smith"a/，1961;BajpaiandSundara,1971)。印度自20世紀70年代以來生產和應用了較多的溶磷微生物肥料，產品有Phosphobacterin(SharmaandSingh,1971)、Phosphobacteria(KunduandGaur,1980;Sharma^a/.,1983)、Microphos(TomarWa/.,1994)、Biophos(KambleandMohite，1996)、Phosphotika(AhlawatandRai，1997)和AzoPhos(Premalatha，Wa/.,2004)。加拿大的PhilomBios公司使用溶磷青黴菌屍em'c/〃/Mm&7a"生產溶磷微生物肥料(商品名JumpStart)，平均增產6-9%(GleddieWa/.,1991)。比利時以溶磷細菌生產的菌劑Phosphorene在促進橄欖樹苗生長和磷素吸收效果顯著(Ahmed，"a/.，1999)。我國目前應用最多的還是上個世紀5060年代篩選的溶磷菌株(葛誠，吳薇1995;姜瑞波2005)。人類擁有巨大的溶磷微生物菌種資源與目前較少的溶磷菌種用於溶磷微生物肥料的生產使用，形成了鮮明的對照，這個問題不能不引發人們的深刻思考。國內外的研究報導顯示，幾乎所有作物接種適宜的溶磷微生物菌劑都能夠提高產量，然而卻不是所有的溶磷菌劑都能夠溶解土壤難溶磷，有些溶磷菌株表現促進磷素吸收的作用，而且溶磷作用和促生效果在土壤條件下極不穩定。篩選高效溶磷、環境適應能力強的優良菌株是長期以來科學家追求的目標。但是，依然缺少高效的溶磷菌資源，尤其缺少顯著溶解土壤難溶磷、提高磷肥利用效率、適應不同地域的土壤類型和不同作物品種的能力強的溶磷菌株。加拿大農業部RegKucey博士篩選的拜萊青黴菌(屍emW肌"m)被認為是當前世界上溶磷促生效果最好的菌株，本發明涉及的草酸青黴菌P8的溶磷能力顯著高於拜萊青黴菌。溶磷草酸青黴菌P8菌株能夠溶解土壤多種難溶磷如轔酸三鉤、磷酸八鈣和磷酸十鈣，其促進作物吸磷和促進作物生長的效果在土壤條件下穩定，亦不受磷肥施用的影響。同時，它能夠增強外源難溶磷的生物利用效果，減少土壤對磷肥的固定，阻止有效磷向難溶磷的轉化，從而提高磷肥的利用效率。在溶解難溶Ca3(P04)2和MRP過程中，草酸青黴菌P8分泌有機酸、蛋白質、胺基酸、酸性磷酸酶和多糖，分泌量高低與水溶磷濃度呈高度負相關。溶磷草酸青黴菌P8溶磷作用是有機酸、酸性磷酸酶、蛋白質、多糖共同參與的結果。溶磷草酸青黴菌P8的諸多特性在以往的研究中未見報導。
發明內容本發明的目的是提供一種溶磷草酸青黴菌(屍em'c朋畫P8。本發明的又一目的是提供一種含有青黴菌P8的溶磷菌劑。本發明的第三個目的是提供一種青黴菌P8的應用。本發明的一種溶磷草酸青黴菌P8，是1996年從河北省石家莊太行山麓平原的石灰性褐土中分離。該菌株已於2007年12月15日保藏在中國普通微生物菌種保理中心，保藏號CGMCCNO.2272。本發明所提供的溶磷草酸青黴菌P8，其具有如下微生物學特性1、溶磷草酸青黴菌P8菌落在CYA上25。C生長7d,直徑45-47mm，線狀，產生大量的分生孢子結構，微黃暗棕色，近於水松綠，無滲出液，反面淡黃色。2、麥芽汁瓊脂上25。C生長7d，菌落直徑35-37mm，分生孢子結構較多，中部帶粉紅色，近于洋蔥皮粉紅色，邊緣暗綠色，近於林肯綠反面紫黃褐色。3、在CYA上5。C生長7d，少數萌發；在CYA上37°C生長7d;生長茂盛。4、分生孢子梗發生於基質，180-300pmx3.0-4.0pm，壁平滑；梗基每輪通常2-4個，通常13-20pmx3.0-4.0|mi，彼此近於平行；梗7基每輪通常5-6個，瓶狀或近於圓柱狀，通常9.0-13pmx2.5-3.2|am;分生孢子橢圓型，通常4.8-6.0pmx2.8。本發明的草酸青黴菌P8具有提高土壤溶磷的作用，尤其具有溶解土壤中多種難溶磷的作用，可以防止磷肥的土壤化學固定，提高磷肥利用效率的多種作用功能。適合南方的紅壤、北方的褐土、潮土等多種土壤類型。本發明還提供一種含有草酸青黴菌P8的溶磷菌劑，其由草酸青黴菌P8和添加劑製成溶磷菌劑。所述的溶磷菌劑包括如下重量份的組分草酸青黴菌P8l份添加劑10-15份。上述溶磷菌劑，優選地，包括如下重量份的組分草酸青黴菌P8l份添加劑10份。其中，所述添加劑為草炭或硅藻土，吸附草酸青黴菌P8後，菌體含量達到2xio8cfii/g以上。本發明的溶磷草酸青黴菌P8及其溶磷菌劑，其製備過程如下1、培養基的組成(/L):可溶性澱粉IO克黃豆餅粉IO克玉米粉5克葡萄糖l克蔗糖IO克酵母粉5克(NH4)2S043克K2HP040.2克NaCl2.5克MgS047H20O.l克CaC030.5克FeS04O扁克硼酸(1%)l毫升pH7.02、培養過程將草酸青黴菌P8菌株接種於土豆蔗糖(PDA)培養基上，28-30。C培養48h，然後接入500mL三角瓶，30°C,180r/min下液體培養36h。然後按1。/。接種量接入到15L種子罐中，在220r/min,pH7.0,通氣量0.6vvm下，培養24h後，再按5%的接種量裝入到IOOL的發酵罐中，在220r/min，pH7.0，通氣量0.7wm下，培養3d。發酵完成後，按照l:10-15的比例加入滅好菌的草炭或者硅藻土，混勻，包裝。本發明的草酸青黴菌P8，也可以以麥麩(糠)、稻糠、秸杆粉、發酵畜禽糞便等有機物料作為吸附載體和吸附劑，結合其他添加劑生產溶磷生物肥料。本發明的溶磷草酸青黴菌P8在提高土壤難溶磷有效性、防止磷肥固定和提高磷肥利用率以及在增加作物產量中的應用。菌株保藏信息本發明的溶磷草酸青黴菌P8，編號為CGMCCNO.2272,其分類命名為屍em'c/肌wmojcfl/ZcwmP8,現已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京巿朝陽區大屯路中科院微生物研究所，保藏編號CGMCCN0.2272，保藏日期2007年11月30曰。搖床培養條件下，對草酸青黴菌P8的溶磷機理進行研究可知青黴菌P8分泌有機酸、蛋白質、酸性磷酸酶、多糖的數量受培養基中水溶磷濃度的顯著影響，其分泌量與有效磷濃度呈高度負相關，這些受有效磷水平影響較大的有機分泌物與溶磷相關密切。難溶磷的種類影響有機分泌物的數量，在Ca3(P04)2、FeP04、A1P04三種難溶磷培養9基中，草酸青黴菌P8分泌的有機酸、酸性磷酸酶、蛋白質、多糖都高於水溶磷KH2P04數倍乃至數十倍。這些物質是磷脅迫誘導的產物.經研究表明草酸青黴菌P8溶磷機理為①有機酸不是溶磷的唯一機制，草酸青黴菌P8的溶磷作用是有機酸、酸性磷酸酶、蛋白質、多糖共同參與的結果；②草酸青黴菌P8的溶磷作用與能力受環境中有效磷水平的誘導或影響。本發明的草酸青黴菌P8及其溶磷菌劑，具有如下有益效果1、本發明的草酸青黴菌P8，能提高作物產量、活化土壤難溶磷、防止磷肥固定、減少磷肥用量、提高磷肥利用率、促進根系發育。2、固體培養基上草酸青黴菌P8表現較強的溶解Ca3(P04)2、Ca8H2(P04)65H20、CaHP04、FeP04和骨粉的能力；在液體培養條件下，能有效的溶解摩洛哥磷礦粉，氮源對其溶磷效果有顯著影響，硝態氮高於銨態氮；接種草酸青黴菌P8能夠顯著增加滅菌和不滅菌土壤的有效磷含量，滅菌土壤增加的有效磷略高於不滅菌土壤。具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例l草酸青黴菌菌株P8及其溶磷菌劑的製備1、培養基的組成(/L):可溶性澱粉10克黃豆餅粉10克玉米粉5克葡萄糖l克蔗糖10克酵母粉5克(NH4)2S043克K2HP040.2克NaCl2.5克MgS04.7H20O.l克CaC030.5克FeS040.00l克硼酸(1%)l毫升pH7,02、培養過程將菌株P8接種於土豆蔗糖(PDA)培養基上，28-30。C培養48h,然後接入500mL三角瓶，30°C，180r/min下培養時間36h。然後按1%接種量接入到15L種子罐中，在220r/min,pH7.0，通氣量0.6vvm下，培養24h後，再按5%的接種量裝入到100L的發酵罐中，在220r/min,pH7.0，通氣量0.7vvm下，培養3d。發酵完成後，按照1:IO的比例加入滅好菌的草炭或者硅藻土，混句，包裝。實驗例l草酸青黴菌P8的溶磷能力1、固體培養條件下的溶轔效果在選擇性的改良Pikovskaya培養基(培養基組成(g/L):(NH4)2SO40.5,NaC10.2,KC10.2,MgS04'711200.03,MnSO40.03,FeS040.003,酵母粉0.5，葡萄糖10.0，磷源5.0)上，將在石家莊郊區草地釆集的土壤樣品進行逐級稀釋，以土壤溶液的10"塗布平板，進行了溶轔微生物的分離。根據溶磷圈的大小初步分離出溶磷細菌和真菌70株。然後，在以磷酸三鈣為唯一磷源的選擇性培養基上，進一步比較了這些溶磷菌株的溶磷能力，真菌溶磷能力大於細菌。最後獲得兩株溶磷能力較強的真菌P8和Pnl。以ATCC20851(屍em'c/〃^附.^7a")和巨大芽孢桿菌ATCC14581為對照菌株，對菌株P8和Pnl在不同磷源瓊脂培養基上溶磷圈和菌落生長直徑進行了比較，結果如表l所示。表l溶磷青黴菌在不同褲源瓊脂培養基上菌落生長與溶磷圈直徑(mm)P8PnlATCC20851ATCC14581溶磷圈菌落溶磷圈菌落溶磷菌落溶磷圈菌落骨粉50.5b45.5cb48.5b41.2b無22.5ab15,012.3bFeP0441.2b38.5d40.5d37.5de無21.7bc無10.3cdCaHP0444.5c37.2cd46.3cd41.7c無21.0bc無11.3cCa3(P04)249.2b39.0b45.5bc42.5c24.022.7a無10.3cdCa8H2(P。4)644.7c36.7cd44.3cd39,0cd無22.0bc無10.3cdMPR無43.5d無38.7e無20,3cd無lO.Od卵磷脂無54.7a無58,7a無22.0bc17.013.2aA1P04無25.2e無29.7f無21.3bc無ll.Ocd氟磷灰石無27.7e無29.0f無18.5d無lO.Ocd顯著性p.=磷源間0.00010.00010.010.0001注a,b,c字母不同表明處理之間差異顯著。在以難溶磷酸鹽為唯一磷源的Pikovskaya改良固體鹽培養基上，30。C培養菌株P8、Pnl以及對照菌株ATCC20851(屍e"/"'〃/wm.6z7m7)和巨大芽孢桿菌ATCC14581，對骨粉、FeP04、CaHP04、Ca3(P04)2、磷酸八每、摩洛哥磷礦粉的溶磷能力進行了比較，結果如表2所示。表2接種溶磷菌平板培養基5d的溶磷量(Pmg/20ml)\菌株P8PnlATCC20851ATCC14581磷源溶磷量佔加入溶磷量佔加入溶磷量佔加入溶磷量佔加入mgP%mgP%mgP%mgp%骨粉4.1931.254,5629.110.372.76FeP043.4821.023.3620.28——CaHP044.4124.453.5826.51一—Ca3(P04)26.0230.145.1225.621.467.28-Ca8H"P04)64.70424.854.6124.36——卵磷脂-—_——0.1635.92MPR-—一———A1P04一一-———氟磷灰石——————顯著性磷源間O扁lO扁l0.010.001注"-"表示無溶磷圏或未測有效磷12結果顯示，P8、Pnl表現出較強的溶解骨粉、FeP04、CaHP04、Ca3(P04)2、磷酸八鈣、摩洛哥磷礦粉的能力。溶磷能力顯著高於對照菌株ATCC20851(屍em'c/〃^m.6z7a")和巨大芽孢桿菌ATCC14581。本發明菌株P8溶磷種類多、效率高、適應能力強，表現了良好的應用潛力。2、液體培養條件下的溶磷效果在以難溶磷酸鹽為唯一磷源的液體培養基(培養基組成(g/L):(NH4)2S040.5，NaCl0.2，KC10.2，MgS04'7H200.03,MnS040.03，FeS040.003,酵母粉0.5，葡萄糖IO.O,摩洛哥磷礦粉(過80目篩)5.0)中，3(TC培養草酸青黴菌P8、ATCC20851以及不接菌的對照，160r/min，溶磷能力測定結果如表3所示。表3液體培養條件下不同溶磷菌10d轉化磷礦粉為水溶磷的數量tableseeoriginaldocumentpage13注表中a、b、c字母不同表示處理之間差異顯著，字母相同表示沒有差異；0.01,0.05,ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平；"-"表示未測有效磷P8和ATCC20851菌株都有明顯的溶磷效果，菌株間差異顯著，銨態氮供應時，溶磷青黴菌P8經過10d的培養，50ml培養基中的水溶磷(P)為9,71mg，顯著高於對照菌P20851(5.952mgP)。硝態氮供應時草酸青黴菌P8的溶磷量高於銨態氮，50ml培養基中的水溶磷(P)為12.786mg，佔磷礦粉中總磷的47.5%，高於銨態氮為氮源時溶磷量的7.745mg,(佔施入磷礦粉總磷量的36.07%)。無論使用硝態氮還是銨態氮，草酸青黴菌P8都具有最高的溶磷能力。3、溶磷草酸青黴菌P8溶解土壤磷的效果在三種不同土壤環境，l號土壤為輕壤質潮土，取自北京巿大興區農田，有效磷(P)13.5嗎/g;2號土壤為中壤質潮土，取自河北省武強縣旱薄地糧田，有效磷(P)4.7嗎/g;3號土壤為中壤質脫潮土，取自北京巿昌平區，多年撂荒地，有效磷(P)^g/g5.2。菌株P8具有較顯著的溶磷作用，結果如表4所示。表4盆栽耗竭實驗磷分組(嗎/g)土作物菌劑磷組分總量壤處理Ca2-PCa8-PA1國PFe-P0-PCa10-P1花生有7.80110.3826.8136.604.68447.1620.81無7.32115.2923.8836.714.05456.9630.31玉米有10.06110.8324.9740.414.74458.2640.81無10.51115.2930.4839.814.卯461.1660.61油菜有16.86110.7112.2835.125.35431.5611.81無16.91112.9012.1834.975.36447.4629.72花生有6.3098.0320.7228.293.67375.9532.92無4.5497.0520.2127.933.93380.8534.42玉米有5.4197.4321.5731.523.66384.7543.42無5.6698.3923.1330.763.64393.7554.42油菜有15.1896.1914.0928.454.30382.0540.22無14.5898.7612.4727.514.44373.7531.53花生有5.4775.1413.6328.393.99372.2498.83無6.4778.3416.0628.533.87381.0515.83玉米有7.1975.1914.4530.884.76374.5503.33無6.6874.4516.5329.234.38366.8497.03油菜有15.9671.748.2725.804.67366.3492.83無14.4572.957.2024.224.99359.8483.6顯著性檢驗P二l號土接種P8ns0.05nsnsns0.012號土接種P8nsnsnsnsnsns3號土接種P8tisnsnsnsnsns注0.01,0.05,ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平。草酸青黴菌P8菌劑能夠活化土壤中的磷酸八鈣磷、磷酸鋁和磷酸十鈣等組分，保持較高的Ca2-P含量。花生上P8主要活化Cas-P、Ca1-P,而對CarP的吸收量最高；玉米上主要活化Cag-P、Al-P和CaurP組分；油菜上主要活化Cas-P組分而以Ca2-P形態積累，Cag-P是易於被草酸青黴菌P8活化的部分。土壤類型對草酸青黴菌P8活化難溶磷的有不同程度的影響，對於l號高有效磷土壤，種植玉米、花生、油菜作物活化CaurP組分較多；2號土壤，花生、玉米接種青黴菌P8活化CaurP組分的效果明顯；3號土接種草酸青黴菌P8，只有花生表現溶解CaurP組分的能力。4、草酸青黴菌P8對外源難溶磷的利用盆栽條件下，釆用北京巿大興區的潮土，玉米為供試作物，研究了溶磷草酸青黴菌P8對外源難溶磷的生物有效性的影響效果，試驗用難溶磷包括磷酸三鈣、磷酸八鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、骨粉、氟磷灰石、開陽磷礦石(KYRP)、晉寧磷礦石(JNRP)和摩洛哥磷礦石(MRP)作為供試磷源，溶磷效果如表5所示。表5不同礫源處理土壤有效磷隨時間的變化處理土壤有效磷10d30d60d卯dCK1無6.96de8.96c26.23bed19.91abCK2有13.68cd3.48cd17.65cd8.42cCa3(P04)2有35.09a33.27a42.22abc22.43aBonemeal有23.59b4.94cd16.30cd22.53aA1P04有14.34dc9.22be64.17a15.85abcFeP04有7.32de5.01cd11.59d14,50abcCa8H2(P。4)6有15.16c15.59b59.14a8.35cMRP有6.00e1.24d51.97ab12.57beFA有8.64cde3.62cd21.10cd9.41c顯著性0.010.010.010.05_Signif.P=_注表中a、b、c、ab、abc字母表示處理之間的差異顯著性，字母不同表示處理之間差異顯著，字母相同表示沒有差異；0.01，0.05，ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平。結果顯示，溶磷草酸青黴菌P8對增強難溶磷的生物有效性具有顯著效果。Ca3(P04)2、MRP二種磷源在草酸青黴菌P8的作用下，生物有效性顯著提高，不接種青黴菌P8時幾乎未顯示增加生物產量的效果。本試驗條件下，草酸青黴菌P8對Ca3(P04)2、FeP04、開陽磷礦石、摩洛哥磷礦石的活化能力較強，對晉寧磷礦石和A1P04活化作用較弱，表現了草酸青黴菌P8對難溶磷種類有一定的選擇性。草酸青黴菌P8作用下，3種磷礦石中以摩洛哥磷礦石被作物利用的效果最好；嫌酸三鈣和骨粉釋放磷素較快；磷酸鋁、磷酸八鈣、摩洛哥磷礦石釋放較慢，磷的有效供應時間比較長。草酸青黴菌P8的溶磷效果主要表現在10-60d之間，超過60d溶磷效果下降。實驗例2草酸青黴菌P8促進作物增產作用在盆栽條件下，利用花生、玉米、油菜在3種不同磷水平的石灰性土壤上(l號土壤取自北京巿大興區，土壤為輕壤質潮土，有效磷(P)13.5(ig/g;2號土取自河北省武強縣單薄地，土壤為中壤質潮土，有效磷(P)4.7昭/g;3號土取自北京巿昌平區，土壤為中壤質脫潮土，多年撂荒地，有效磷(P)pg/g5.2),釆用土壤耗竭性連續種植的方法，研究了溶磷草酸青黴菌P8對吸收土壤磷素和作物生長的影響，結果如表6、7、8所示。表6玉米接種青黴菌P8菌劑的生物產量(g/盆)土壤編號菌劑茬數1234平均接種P83.38a4.63a3.18a2.08a3.91a3.441對照2.31b3.69b2.77a1.94a2.98b2.74顯著性0.010.01nsns0.05接種P84.12a4.44a3.35a2.02a3.39a3.462對照3.95a3.29b2.68a1.96a2.69a2.91顯著性ns0.05nsnsns接種P83.84a3.72a2.54a2.13a3.31a3.11對照3.36b3.34a2.20a2.05a2.93a2.77顯著性0.05nsnsnsns注表中a、b字母表示處理之間的差異顯著性，字母不同表示處理之間差異顯著，字母相同表示沒有差異；0.01,0.05，ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平。表7花生接種青黴菌P8菌劑的生物產量(g/盆)茬數set土壤編號菌劑124平均接種P88.71a7.57a6.06a3.83a3.99a6.031對照6.68b6.07b5.27b3.19a3.28a4.90顯著性0.050.050.05Nsns接種P88,04a8.50a6.37a4.00a4.17a6.222對照7.16b7.24b5.49b3.42a3.65b5.39顯著性0.010,010.05Ns0.05接種P87.23a7.48a5.94a3.65a4.13a5.693對照6.56b5.77b4,82b2.84a3.28b4.65顯著性0.050,010.05Ns0.05注表中a、b字母表示處理之間的差異顯著性，字母不同表示處理之間差異顯著，字母相同表示沒有差異；0.01,0.05,ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平。表8油菜接種青黴菌的生物產量(g/盆)茬數土壤編號菌劑12*34平均接種P83.21a15.18a0.85a3.50a5.681對照2.87a10.96b0.70b3.10—a4,41顯著性ns0.050.05ns接種P8-6.07a1.73a0.48a2.762對照-5.99a0.94b0.35a2.42顯著性-ns0.05us接種P81.34a12.7131.41a0.98a4.11對照0.96b7.18b0.88b0.39b2.35顯著性0.010.010.050.05注表中a、b字母表示處理之間的差異顯著性，字母不同表示處理之間差異顯著，字母相同表示沒有差異；0.01，0.05,ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平。結果表明:171、接種草酸青黴菌P8增強了作物從土壤中吸收磷素的能力。生長量大、需磷多的花生增幅最大，玉米次之，油菜最小。有效磷高的土壤接菌效果大於有效磷低的土壤。但油菜吸磷量增幅在低磷土壤上高於高磷土壤。2、接種草酸青黴菌P8具有促進作物生長的作用，無論土壤有效磷高或低接種草酸青黴菌都比不接種生物產量增加，玉米、花生、油菜表現一致的效果。高磷土壤上玉米接種草酸青黴菌P8的效果較好，花生在3種土壤上接菌有良好效果，而油菜則以3號土壤的增產效果最高。表明草酸青黴菌P8有著廣泛的土壤應用範圍和潛力。3、在較低溫度時不同作物對接種草酸青黴菌P8的效果反應不同，玉米生物產量和吸磷量對低溫敏感，其生物產量和吸磷量增加幅度明顯下降；但花生、油菜在低溫時仍有明顯增加生物量和吸磷量的效果。說明草酸青黴菌P8在一定程度上能夠改善低溫造成的不良影響。4、土壤有效磷高低並不影響溶磷草酸青黴菌P8的接種效果。有效磷高的土壤仍可較好地發揮溶磷草酸青黴菌P8的增加作物生物量和吸磷量的作用。3種土壤上接種草酸青黴菌P8菌劑都能提高作物的吸磷量，其生物產量比不接種顯著提高，且在有效磷低的土壤上其增產幅度大於有效磷高的土壤；接種草酸青黴菌P8在一定程度上能緩解和改善低溫對作物生長和磷素吸收的不良影響。無論在有效嫌高還是低的土壤，草酸青黴菌P8都具有活化土壤磷、提高土壤磷素的利用效率和促進作物苗期生長的作用。實驗例3草酸青黴菌P8的田間試驗效果試驗設在河北省武強縣，土壤為中壤質潮土。每畝施用氮肥15kg，P2O510kg。施驗處理3個不施用菌劑(對照)、草酸青黴菌P8和草酸青黴菌Pnl。重複3次。以草碳作為菌株P8、Pnl的吸附載體，按照每畝施用菌劑4kg計算各個小區的菌劑用量，三分之一拌18種，三分之二基施。小區面積8x8m2，小麥品種為冀麥26號，結果如表9所示。表9不同溶磷菌肥對小麥產量的影響(kg/畝)處理號溶磷菌劑千粒重(g)kg/畝比對照增產(％)1CK41.15453.7b-2Pnl42.86482.1a6.863P845,21508.6a12.1注表中a、b字母表示處理之間的差異顯著性，字母不同表示處理之間差異顯著，字母相同表示沒有差異。結果顯示，使用草酸青黴菌P8比不使用菌劑的對照增產顯著，達到12.1%;使用草酸青黴菌Pnl菌劑的小麥產量比對照增產顯著，達到6.86%。草酸青黴菌P8菌劑的增產效果最好。實驗例4草酸青黴菌P8防止土壤磷素固定作用釆用^P示蹤技術，研究了溶磷草酸青黴菌P8對磷肥、土壤有效磷的轉化、固定及其有效性的影響，結果如表IO、11、12所示。表10菌劑施入3周時3"P在6種土壤磷組分中的分布項目磷組分(％)總和Ca2-PCa8-PAl-PFe-PO-PCa10-P土壤處理滅菌30.226.210,222.18.60.7198.1不滅菌27.228.210.523.19.10.6498.7顯著性(p=)0.0010.01Il.S0.014n.s0.01n.s作物無作物28.127.79.622.08.90.6797.1玉米29.925.710.522.88.50.6798.1花生28.228.211.022.99.10.68跳O顯著性0.010.010.01n.sn.sn.s0.05菌劑處理對照28.026.810.322.89.10.7297.8Po+P828.126.910.221.98.60.6597,5P.5+P830.227.810.623.18.90,65100.0顯著性(P^0.010.05n.s0.05n.s0.040.05注P。+P8代表接種草酸青黴菌P8不使用磷肥、P7.5+P8代表施用磷肥P2057.5kg/畝(以15萬公斤土壤計算，折合為每公斤土壤施磷量)與接種青黴菌P8;P8的施用量均為lg/kg土壤；0.01,0.05,ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平。表ll菌劑施用5周"P在土壤6種磷組分中的分布項目_磷組分(％)_總和Ca2-PCa8-PAl-PFe-PO-PCa10-P土壤處理滅菌29.024.315.016.67,00.6692.6不滅菌23.726.99.721.77.50.5990.1顯著性0細0.0050.001O扁0.012n.s0.054作物無作物26.927.312.319.47.40.7194.1玉米26.324.312.519.17.40.57卯.2花生25.725.212.419.06.90.6089,8顯著性n,sn.sn.sn,s0.0280.0210.001菌劑處理對照24.724.711.919.07.50.7088.5Po+P824.625.612.319.37.00.5689.3P.5+P829.726.513.119.27.20.6396.2顯著性0扁n.sn.sn.s0.050.0210.001注P0+P8代表接種青黴菌P8不使用磷肥、P7.5+P8代表施用磷肥P2057.5kg/畝與接種青黴菌P8;0.01,0.05，ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平。表12菌劑施用8周時32P在土壤6種磷組分中的分布項目_磷組分(％)_總和Items_Ca2-PCa8-PAl-PFe-PO-PCa10-P_土壤處理滅菌22.723.116,015.96.62.2786.6不滅菌28.219.413.917.77.91.7088.8顯著性0,0010.0010.0010.0020.0030.0010.00820作物無作物24.921.915.417.17.42.0488.7玉米26.120.715.116.97.61,8787.6花生25,321.314.416.46.72.0886.9顯著性n,stl.Sn.sn.sn.sn.sn.s菌劑處理對照24.521.314.717,97.32.1487.9Po+P824.321.115.217.77.61.9688.0P7.5+P827.521.414.914.86.81.8687.4顯著性0.001n,sn.s0.001n.s0.049n.s注P。+P8代表接種青黴菌P8不使用磷肥、P7.5+P8代表施用磷肥P2057.5kg/畝與接種青黴菌P8;0.01,0.05，ns分別表示處理之間的差異達到極顯著、顯著和不顯著水平。結果顯示，溶磷菌劑具有防止有效磷轉化為難溶的磷酸十錦(Ca1(rP)的作用，增加有效態磷(Ca2-P、Ca8-P)的比例。隨時間延長，施入的"P轉化為CanrP的數量(或比例)逐漸增加，但是相對於未接種菌劑的對照處理，接種草酸青黴菌P8菌劑的土壤磷和肥料磷轉化為CaurP比例最低。溶磷草酸青黴菌P8菌劑能夠防止有效磷向難溶磷CaurP的轉化。根據^P分析結果，磷肥施入土壤3周，很快轉化為其它的磷形態,但是，使用菌劑溶磷菌劑表現出防止有效磷轉化為難溶磷的作用，尤其減少了有效磷向難溶CanrP的轉化量。5周測定數據表明，使用菌劑增加了有效態磷(Ca2-P、Ca8-P)的比例，降低了O-P、CanrP的轉化比例。種植作物能夠減少有效磷轉化為難溶CaurP的比例，土壤滅菌加劇土壤對有效磷的固定，導致有效磷轉化為CanrP的數量增加。隨時間延長，所有處理的土壤3￥轉化為Ca1(rP的數量和比例在增加，至第8周時，不管是肥料磷還是土壤磷，無論是否接種菌劑，轉化為CaurP的比例都較3周、5周顯著增加，已佔施入量的2%以上。但施用菌劑處理轉化為CaH)-P比例仍然是最低，表明菌劑能夠防止有效磷向難溶磷CaK)-P的轉化，並且其效果能夠維持較長時間。21實驗例5溶磷草酸青黴菌P8菌劑對作物生物量的影響通過實施例1的培養過程，製作菌劑，在盆栽條件下，種植玉米，花生，用菌劑(施用量lg/kg土壤)和無機磷肥(施用量為7.5kg/畝)處理、結果如表13所示。表13玉米、花生生物量(mg/盆)作物處理不滅菌土壤滅菌土壤根莖合計根莖合計無磷肥793.01771.02564a475.01584.02059b玉米P8730.01932.02662a1020.72187.03207.7aP2057.5+P8850.01983.02833a1284.02450.73734.7a無嫌肥291.31534.01825.3a344.01451.01795b花生無磷+P8296.71552.51849.2a378.01952.02330aP2057.5+P8377.017卯.52167.5a418.02047.02465a結果顯示菌劑、磷肥+菌劑在不滅菌土壤上增加生物量效果較低,但不同作物稍有差異，菌劑在玉米上效果大於花生，磷肥在花生上效果大於玉米。而在滅菌土壤上，菌劑、菌劑+磷肥處理表現的增產作用高於不滅菌土，菌劑對玉米增產效果大於花生。土壤滅菌有利於發揮溶磷菌劑的增產作用。實驗例6溶磷草酸青黴菌P8在不同土壤條件下的生存能力盆栽試驗條件下，種植作物，通過研究草酸青黴菌P8在土壤中存活數量和分布位置，對青黴菌P8在土壤中生存能力進行了研究，結果如表14、15、16、17、18所示。表14溫度對青黴菌生存的影響效果溫度作物玉米P8菌數存活率生物量.有效磷'0C個/g%g/盆10無3.20xl04a24.86a-3.72a20無2.06xl04b6.98b-1.92ab30無1.79xl04b6.48b-1.68b20有3.37xl04a15.15a1.96a1.11a30有2.27xl04a10.24a2.36a1.29aSignif.溫度0.050.05nsnsp=作物nsnsnsns溫度*作物nstisnsns表15土壤相對水分含量對溶磷青黴菌存活能力的影響水分含量%作物玉米P8菌數個/g存活率%玉米生物量g/pot有效磷"g/g40無有19802162168.917.301.622.422.4370無有16127140997.266.342.153.923.43100無有16745155187.536.982.584.074.53Signif.水分nsnsO扁l0.01P=作物nsnsnsns水分*作物nsnsnsus表16土壤類型與菌劑使用方式對青黴菌P8存活的影響土壤類型菌劑使用方法P8菌數個/g存活率%玉米生物量g/pot有效磷Hg/g不施--2.947.511拌種53913.643.1514.57基施76265.152.9510.63不施--4.4912.632拌種33872.294.5312.89基施70744.784.7713.05不施--2.836.57拌種27331.853.1711.62基施21051.423.1710.76Signif.P=120.050.05ns0.05nsnsnsns3nsusnsns表17土壤類型對P8在玉米根際、非根際土壤定殖的影響土壤出苗14d後P8菌數出苗35d後P8菌數根際土非根際土根際土.非根際土黑土8.22x105a3.71x105a9,86x105a2.92xI05a潮土紅壤7.63x105a5.21xlQ5b4.23>3.68>:105a6,81><105b7.43>0,05表18作物種類對青黴菌P8生存的影響效果作物P8菌數存活率o/。第l茬第2蓬第l茬第2蓬無作物7.69xl04a1.59xl04a57,7a11.93a玉米4.58xl04ab1.05xl04b54.3ab7.卯b花生3.17xl04b1.06xl04b23.8b7.97b油菜3.18xl04b1.05xl04b23,9b7.90bSignif.P=0.050.010.050.01結果表明，土壤溫度、土壤水分、作物種類、土壤類型、菌劑施用方式對草酸青黴菌P8存活影響較大。土壤溫度對施入土壤中的草酸青黴菌P8數量有顯著的影響，無論種植作物與否，低溫處理活菌數量超過高溫處理活菌數量。在無作物時，10。C的存活率最高，平均為24.9%,當溫度升高到20。C和30。C時，存活率大幅度下降，分別為7.0%和6.5%。種植作物條件下同樣顯示出溫度對青黴菌P8存活的影響，30。C時，青黴菌P8的存活率為10.2%，當溫度降為2(TC時，存活率達到15.2%。相同溫度下，種植作物處理的青黴菌P8存活率大於無作物處理。不同水分處理之間對草酸青黴菌P8的存活率的影響沒有差異，土壤較低的水分含量有利於草酸青黴菌P8的生存，水分供應為40%、70%和100%土壤的草酸青黴菌P8的生存率為8.1%、6.8%和7.3%,40%的處理存活率最高，大於100%的水分處理，70%的水分存活率最低，3個水分處理之間差異不顯著。無作物處理的青黴菌P8的存活率為7.2%,有作物的存活率6.9%。施入土壤的青黴菌P8經過44d時間，存活率急驟下降，最高只8.9%，最低的6.3%,90%以上的草酸青黴菌P8失去了活性。因此，延長施入土壤的溶磷菌的存活時間是穩定接種效果的一個重要課題。土壤類型、菌劑施用方式都極大的影響草酸青黴菌P8的存活率。草酸青黴菌8在土壤中經過43d培養，活菌數量大幅度下降。l號土壤>2號土壤>3號土壤，平均為4.4%、3.4%和1.6%。1號土是有效磷高、常年耕種的較肥沃的土壤，有利於溶磷草酸青黴菌的存活；有效磷低2、3號土壤不利於溶磷草酸青黴菌的存活。東北黑土、北京潮土、湖南紅壤種植玉米，接種草酸青黴菌P8，草酸青黴菌P8存活數量黑土>潮土〉紅壤。草酸青黴菌P8在黑土中菌體的存活數量都表現出優勢，可能與黑土中的有機質含量較高以及菌株P8適應土壤環境有關。不同作物種類對草酸青黴菌P8的存活有顯著影響，種植作物的處理草酸青黴菌P8數量都低於無作物處理，無作物處理在35d時存活率為57%，玉米為54.3%，花生、油菜上草酸青黴菌的存活率僅為23.8%和23.9%;81d時，玉米接種草酸青黴菌P8的存活率最高，油菜不利於草酸青黴菌P8的存活。權利要求1、一種溶磷草酸青黴菌(Penicilliumoxalicum)P8，保藏號CGMCCNo.2272。2、一種溶磷菌劑，其特徵在於，含有權利要求1所述的草酸青黴菌P8。3、如權利要求2所述的溶磷菌劑，其特徵在於，所述溶磷菌劑包括如下重量份的組分草酸青黴菌P8l份添加劑10-15份。4、如權利要求3所述的溶磷菌劑，其特徵在於，所述溶磷菌劑包括如下重量份的組分草酸青黴菌P8l份添加劑10份。5、如權利要求3或4所述的溶磷菌劑，其特徵在於，所述的添加劑為草炭或硅藻土，吸附溶磷草酸青黴菌後，菌體含量達到2x108cfU/g以上。6、權利要求1所述的草酸青黴菌P8在提高土壤磷有效性中的應用。7、權利要求1所述的草酸青黴菌P8在防止磷肥固定和提高磷肥利用率中的應用。8、權利要求1所述的草酸青黴菌P8在增加作物產量中的應用。全文摘要本發明提供了一種溶磷草酸青黴菌P8，草酸青黴菌P8具有溶解土壤中多種難溶磷的作用，適合南方的紅壤、北方的黑土、褐土、潮土等多種土壤類型，具有提高作物產量，活化土壤難溶磷、防止磷肥的土壤化學固定，提高磷肥利用效率的多種作用功能。文檔編號C12N1/14GK101643704SQ20081011807公開日2010年2月10日申請日期2008年8月7日優先權日2008年8月7日發明者範丙全,龔明波申請人:中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所