肽衍生物及其藥學上可接受的鹽、其製造法及用途的製作方法

2023-12-03 05:39:16 1

專利名稱：肽衍生物及其藥學上可接受的鹽、其製造法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的肽衍生物及其藥學上可接受的鹽，以及其製造法和用途。
背景技術：
大多數牙周病被認為是常駐牙周區域的固有微生物引起的一種感染病。其中，已知特別是稱為牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis)(以下簡記為「P.gingivalis」)的革蘭氏陰性厭氧菌為引起成人牙周炎和急進型牙周炎的重要病原菌(J.Clin.Periodontol.，15，85-93，1988；316-323，1988；J.Dent.Res.，63，441-451，1984)。近年來，已知由P.gingivalis產生的蛋白酶分解牙周組織成分如膠原蛋白和身體自然防禦系統涉及的血清蛋白，並且已知該蛋白酶與P.gingivalis的病原性密切相關(Greiner D.，Mayrand D.Biology of the SpeciesPorphyromonas Gingivalis，Shah H.N.，Mayrand D.和Genco R.J.，227-243頁，CRC出版社，Boca Raton，Ann Arbor，London，Tokyo，1993)。
已知幾種由P.gingivalis產生的具有胰島素樣蛋白酶活性的蛋白水解酶。其中，Lys-gingipain(以下簡記為「KGP」)和Arg-gingipain(以下簡記為「RGP」)是主要的蛋白水解酶。這些酶已知具有高的消化活性，分解高分子量激肽原和纖維蛋白原，被認為與細菌附著、牙周病的發作和牙周組織破壞有關(J.Biol.Chem.，269，406-411，1994)。
通常，使用抑制細菌生長的藥物預防和治療牙周病。這樣的藥物的例子包括抗生素如四環素和二甲胺四環素；天然藥物如白花母菊酊劑和拉坦尼根酊劑；cyclohexadine、凝血酸等。但是，這些藥物存在安全問題或其它問題如不愉快的氣味。日本未審專利公報No.1993-97708號披露了含有ATP酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑等作為有效成分的牙周病治療劑。日本未審專利公報No.1999-139947和2000-191487號披露了含有基質金屬蛋白抑制劑作為有效成分的口腔用組合物。但是，該治療劑和組合物的抗牙周病效果不能令人滿意。近來已知的選擇性抑制RGP的抑制劑是日本未審專利公報No.1999-335274號記載的malabaricon C和日本未審專利公報No.1999-228526號記載的精氨酸衍生物。已知Tissue Culture Engineering，27(9)，343-347，2001記載的賴氨酸衍生物是能夠選擇性抑制KGP的抑制劑。
但是，這些公報沒有記載能夠同時抑制KGP和RGP兩種酶的化合物。
發明的公開本發明的目的是提供一種對KGP和RGP兩種酶具有強抑制活性，從而可以用作牙周病的預防劑或治療劑，並提供其製造方法。
本發明的另一個目的是提供一種能夠抑制KGP和RGP兩種酶的新抑制劑，牙周病用藥物製劑和口腔用組合物。
本發明的另一個目的是提供一種預防或治療牙周病的新方法。
本發明的其它目的和特徵根據以下的描述將更加明顯。
為製造牙周病的有效預防和治療劑，本發明人著眼於以下幾點進行廣泛而深入的研究P.gingivalis在牙周病的發作和發展中起著重要作用；和蛋白水解酶KGP和RGP均促進由P.gingivalis引起的牙周病。結果，本發明人發現了一種能夠強有力地抑制KGP和RGP二蛋白酶的酶活性的新的肽衍生物。本發明人基於以上發現進行了進一步的研究，並完成了本發明。
本發明提供以下對KGP和RGP二酶均具有抑制活性的新的肽衍生物、其藥學上可接受的鹽、及其製造方法和用途。
1.一種式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽 其中X為-CH(OH)-或-CO-；R1為氫或氨基保護基；R2為羥基或低級烷氧基；R3和R4之一為氨基可以被保護基保護的賴氨酸的側鏈(R基)，R3和R4的另一個為胍基可以被保護基保護的精氨酸的側鏈(R基)；以及R5和R6可以相同或不同，並且為氫、低級烷基或芳烷基。
2.根據第1項的式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中X為-CO-。
3.根據第2項的式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中X為-CO-；R1為氫或可以具有取代基的芳烷基氧羰基；R2為羥基或低級烷氧基；R3和R4之一為賴氨酸的側鏈(R基)，R3和R4的另一個為胍基可以被硝基保護的精氨酸的側鏈(R基)；以及R5和R6可以相同或不同，並且為氫或芳烷基。
4.根據第3項的式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中X為-CO-；R1為苄氧羰基；R2為羥基或叔丁氧基；R3為賴氨酸的側鏈(R基)；R4是胍基可以被硝基保護的精氨酸的側鏈(R基)；R5為氫；以及R6為苯乙基。
5.一種製造式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽的方法， 其中X為-CH(OH)-或-CO-；R1為氫或氨基保護基；R2為羥基或低級烷氧基；R3和R4之一為氨基可以被保護基保護的賴氨酸的側鏈(R基)，R3和R4的另一個為胍基可以被保護基保護的精氨酸的側鏈(R基)；以及R5和R6可以相同或不同，並且為氫、低級烷基或芳烷基，該方法包括以下步驟(i)(i)將下式(II)的化合物與下式(III)的化合物縮合，生成式(I-a)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽， 其中R1和R3的定義同上，R2a為低級烷氧基， 其中R4、R5和R6的定義同上，
其中R1、R2a、R3、R4、R5和R6的定義同上。
6.一種製造式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽的方法，該方法包括以下步驟(ii)(ii)將上式(I-a)的化合物氧化，生成式(I-b)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽， 其中R1、R2a、R3、R4、R5和R6的定義同上。
7.一種製造式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽的方法，該方法包括以下步驟(iii)(iii)用酸處理式(I-a)或(I-b)的化合物，生成式(I-c)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽，
其中X、R1、R3、R4、R5和R6的定義同上。
8.一種Arg-gingipain和Lys-gingipain抑制劑，其含有選自由上述第1項所述的式(I)表示的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽組成的組中的至少一種作為有效成分。
9.一種牙周病用藥物製劑，其含有選自由上述第1項所述的式(I)表示的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽組成的組中的至少一種作為有效成分。
10.一種口腔用組合物，其含有藥學上可接受的載體和選自由上述第1項所述的式(I)表示的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽組成的組中的至少一種。
11.一種預防牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的上述第8項所述的Arg-gingipain和Lys-gingipain抑制劑。
12.一種預防牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的上述第9項所述的牙周病用藥物製劑。
13.一種預防牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的上述第10項所述的口腔用組合物。
14.一種治療牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的上述第8項所述的Arg-gingipain和Lys-gingipain抑制劑。
15.一種治療牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的上述第9項所述的牙周病用藥物製劑。
16.一種治療牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的上述第10項所述的口腔用組合物。
17.上述第1項所述的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽在製備上述第8項所述的Arg-gingipain和Lys-gingipain抑制劑中的應用。
18.上述第1項所述的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽在製備上述第9項所述的牙周病用藥物製劑中的應用。
19.上述第1項所述的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽在製備上述第10項所述的口腔用組合物中的應用。
在式(I)中，R1表示的氨基保護基沒有特別的限制，只要不對活生物和合成反應產生不利影響即可。通常使用的氨基保護基，如T.W.Greene「有機合成中的保護基(Protective groups in Organic Synthesis)」，A Wiley-Interscience Publication，John-Wiley Sons，New York，1981，218-287頁中記載的那些是適合的。具體例子包括可以具有取代基的芳烷基氧羰基、可以具有取代基的低級烷氧羰基、取代的磺醯基、乙醯基、苄基、1-金剛烷基氧羰基、環戊基氧羰基等。
可以具有取代基的芳烷基氧羰基的例子包括苄氧羰基(Cbz)；被1～3個C1-4低級烷氧基取代的苄氧羰基如對甲氧基苄氧羰基和對乙氧基苄氧羰基；被硝基取代的苄氧羰基如對硝基苄氧羰基；被1～3個滷原子取代的苄氧羰基如對溴苄氧羰基和2，4-二氯苄氧羰基；二苯基甲氧羰基等。
可以具有取代基的低級烷氧羰基的例子包括可以被1～3個滷原子取代的C2-7直鏈或支鏈低級烷氧羰基如甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧羰基和2，2，2-三氯乙氧羰基。
被取代的磺醯基的例子包括具有一個取代基如C1-6直鏈或支鏈低級烷基或可以被1～3個C1-6直鏈或支鏈低級烷基取代的苯基的磺醯基，如苯磺醯基、對甲苯磺醯基和甲磺醯基。
優選R1表示的氨基保護基為可以具有取代基的芳烷基氧羰基或可以具有取代基的烷氧羰基。特別優選的是可以被低級烷氧基、硝基或滷素取代的苄氧羰基、或可以被滷素取代的C2-7直鏈或支鏈低級烷氧羰基。更優選的是苄氧羰基或2，2，2-三氯乙氧羰基。
R2表示的低級烷氧基的例子包括C1-6直鏈或支鏈低級烷氧基如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基和叔丁氧基。優選叔丁氧基。
R3和R4表示的賴氨酸的側鏈(R基)是指與賴氨酸的α-碳原子鍵合的側鏈或殘基，即4-氨基丁基。該側鏈(R基)的氨基可以被保護基保護。有用的氨基保護基的例子為上述的氨基保護基。優選氨基保護基為可以被1～3個滷原子取代的C2-7直鏈或支鏈低級烷氧羰基。特別優選的是未取代的C2-7直鏈或支鏈低級烷氧羰基。更優選叔丁氧羰基。
精氨酸的側鏈(R基)是指與精氨酸的α-碳原子鍵合的側鏈或殘基，即3-胍基丙基。該側鏈(R基)的胍基可以被保護基保護。保護基沒有特別的限制，只要不對活生物或合成反應產生不利影響即可。通常使用的氨基保護基，如T.W.Greene「有機合成中的保護基(Protectivegroups in Organic Synthesis)」，A Wiley-Interscience Publication，John-Wiley Sons，New York，1981，218-287頁中記載的那些是適合的。具體例子包括硝基；被一個取代基如可以被1～3個C1-6直鏈或支鏈低級烷基取代的苯基、或可以被1～6個C1-6直鏈或支鏈低級烷基取代的色原烷取代的磺基，如對甲苯磺醯基和2，2，5，7，8-五甲基色原烷-6-磺醯基；和被一個取代基如芳烷基或金剛烷基取代的氧羰基，如苄氧羰基、苯乙基氧羰基和1-金剛烷基氧羰基。優選硝基。
R5和R6表示的低級烷基的例子是C1-6直鏈或支鏈低級烷基如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、1-乙基丙基、正己基、異己基、1-乙基丁基等。優選甲基和乙基。
芳烷基的例子包括苯基-C1-6烷基，特別是苄基和苯乙基。
在式(I)的化合物中，優選X為-CO-的那些化合物。特別優選X為-CO-；R1為氫或可以被取代的芳烷基氧羰基；R2為羥基或C1-6直鏈或支鏈低級烷氧基；R3和R4之一為賴氨酸的側鏈(R基)，並且R3和R4的另一個為胍基可以被硝基保護的精氨酸的側鏈(R基)；R5和R6可以相同或不同，並且為氫或芳烷基的那些化合物。特別優選的化合物是X為-CO-；R1為苄氧羰基；R2為羥基或叔丁氧基；R3為賴氨酸的側鏈(R基)；R4為胍基可以被硝基保護的精氨酸的側鏈(R基)；R5為氫和R6為苯乙基的那些化合物。
本發明的化合物的藥學上可接受的鹽沒有特別的限制。其例子包括通過使本發明的化合物與藥學上可接受的酸反應而生成的酸加合鹽。具體例子包括無機酸鹽如鹽酸鹽和硫酸鹽；和有機酸鹽如甲酸鹽、三氟乙酸鹽、乙酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽和甲磺酸鹽、本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽可以是以溶劑化物如水合物的形式。
構成本發明的化合物的胺基酸可以是L-或D-胺基酸。優選L-胺基酸。
根據分子結構中的不對稱碳，本發明的化合物可以對映異構體或非對映異構體的形式存在。所有這些對映異構體或非對映異構體都包括在本發明的範圍內。這樣的化合物可以異構體混合物直接利用、或者通過常規技術進行光學拆分後利用。
式(I)的化合物可以通過以下反應路線製備。
其中，R1、R3、R4、R5和R6的定義同上；R2a為低級烷氧基。
R2a表示的低級烷氧基的例子包括C1-6直鏈或支鏈低級烷氧基，優選甲氧基、乙氧基和叔丁氧基。
步驟(i)本發明的式(I-a)化合物可以通過將式(II)的化合物與根據日本未審專利1999-228526號公報記載的方法合成的式(III)的已知化合物在適當的溶劑中縮合來合成。
縮合反應可以通過常規方法進行。有用的方法包括，例如，使用縮合劑如N，N-二環己基碳二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽等的方法；除縮合劑外還使用添加劑(例如，1-羥基苯並三唑、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧醯亞胺等)的方法；使用氯甲酸異丁酯等的混合酸酐法；疊氮化物法；活性酯法等。
在縮合反應中可以使用任何溶劑，只要其對反應呈惰性即可。有用的溶劑包括，例如，N，N-二甲基甲醯胺、四氫呋喃、二氯甲烷、二氧六環、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮等。這些溶劑可以單獨使用或至少兩種組合使用。相對於每摩爾式(II)化合物，式(III)化合物的量為約0.5～約10摩爾，優選約1～約5摩爾。相對於每摩爾式(II)化合物，縮合劑的量為約0.5～約10摩爾，優選約1～約5摩爾。反應時間為約0.3～約100小時，優選約0.5～約20小時。反應溫度為約-20℃～約100℃，優選約0℃～約40℃。該步驟得到的化合物可以分離或不分離用於下一反應步驟。
其中，R1、R2a、R3、R4、R5和R6的定義同上。
步驟(ii)本發明的式(I-b)化合物可以通過在適當的溶劑中氧化反應路線1得到的式(I-a)化合物來合成。
氧化反應可以通過常規方法進行。有用的方法包括，例如，使用Dess-Martin試劑的Dess-Martin氧化；使用二甲亞碸/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/二氯乙酸的改良Moffat氧化；和使用N-叔丁基苯基亞硫醯亞胺基(sulfinimidoyl)氯化物的氧化。
氧化反應中可以使用任何溶劑，只要其對反應呈惰性即可。有用的溶劑包括，例如，N，N-二甲基甲醯胺、四氫呋喃、二氯甲烷、二氧六環、乙酸乙酯、乙腈、N-甲基吡咯烷酮等。這些溶劑可以單獨使用或至少兩種組合使用。相對於每摩爾式(I-a)化合物，氧化劑的量為約0.3～約10摩爾，優選約1～約10摩爾。反應時間為約0.1～約100小時，優選約0.5～約50小時。反應溫度為約-78℃～約100℃，優選約0℃～約40℃。該步驟得到的化合物可以分離或不分離用於下一反應步驟。
其中，X、R1、R3、R4、R5和R6的定義同上。
步驟(iii)本發明的式(I-c)的化合物可以通過在適當的溶劑中或在不存在溶劑的條件下，用酸處理反應路線1或2得到的式(I-a)或(I-b)的化合物而得到。
該反應中可以使用任何溶劑，只要其對反應呈惰性即可。有用的溶劑包括，例如，氯仿、二氯甲烷、二氧六環、四氫呋喃和乙酸乙酯。有用的酸包括，例如，無機酸如鹽酸和硫酸；和有機酸如三氟乙酸和對甲苯磺酸。相對於每摩爾式(I-a)或(I-b)的化合物，反應中酸的用量為約1～約1000摩爾，優選約1～約100摩爾。反應時間為約0.5～約50小時。反應溫度為約0℃～約100℃，優選約0℃～約30℃。
式(II)的化合物例如可以根據以下反應路線4製備[反應路線4]
其中，R1、R2a和R3的定義同上；R7為低級烷氧基。
R7表示的低級烷氧基的例子包括上述的C1-6直鏈或支鏈低級烷氧基。優選甲氧基、乙氧基和叔丁氧基。
步驟(iv)本發明的式(VI)的化合物可以通過將式(IV)的化合物與已知的式(V)化合物在適當的溶劑中縮合來製備。
縮合反應可以通過常規方法進行。有用的方法包括，例如，使用縮合劑如N，N-二環己基碳二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽等的方法；除縮合劑外還使用添加劑(例如，1-羥基苯並三唑、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧醯亞胺等)的方法；使用氯甲酸異丁酯等的混合酸酐法；疊氮化物法；和活性酯法。
在縮合反應中可以使用任何溶劑，只要其對反應呈惰性即可。有用的溶劑包括，例如，N，N-二甲基甲醯胺、四氫呋喃、二氯甲烷、二氧六環、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮等。這些溶劑可以單獨使用或至少兩種組合使用。相對於每摩爾式(IV)化合物，式(V)化合物的量為約0.5～約10摩爾，優選約1～約5摩爾。相對於每摩爾式(IV)化合物，縮合劑的量為約0.5～約10摩爾，優選約1～約5摩爾。反應時間為約0.3～約100小時，優選約0.5～約20小時。反應溫度為約-20℃～約100℃，優選約0℃～約40℃。該步驟得到的化合物可以分離或不分離用於下一反應步驟(v)。
式(IV)的化合物可以通過例如將WIPO公報WO98/50420號記載的已知化合物進行常規的氨基脫保護反應而得到。有用的脫保護反應包括，例如，催化氫化；使用三甲基甲矽烷基碘化物或三乙基矽烷的方法等。作為在催化還原法中可用的催化劑包括，例如，鈀-碳、氯化鈀等。由於脫保護條件隨前體化合物的保護基的類型而不同，因此式(IV)的化合物可以以游離態或鹽形式得到。這樣的鹽沒有特別的限制，只要其不參與縮合反應即可。其具體例子包括無機酸鹽如鹽酸鹽和硫酸鹽；和有機酸鹽如對甲苯磺酸鹽和甲磺酸鹽。
步驟(v)式(II)的化合物可以通過在適當的溶劑中用鹼水解上述步驟(iv)中得到的化合物(VI)而得到。該反應中可以使用任何溶劑，只要其對反應呈惰性即可。例如，水、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、四氫呋喃等可以單獨使用或者至少兩種組合使用。有用的鹼的例子包括氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀等。相對於每摩爾式(VI)的化合物，鹼量為約1～約10摩爾，優選約1～約2摩爾。反應時間為約0.3～100小時，優選約0.5～約20小時。反應溫度為約0～約100℃，優選約0～約40℃。該步驟得到的化合物可以經分離或不分離用於反應路線1。
通過上述方法得到的本發明的化合物和其它上述的化合物可以通過通常用於化學合成領域的分離和純化技術進行純化，例如重結晶、蒸餾和各種柱色譜技術。
本發明的式(I)的肽衍生物和其藥學上可接受的鹽強有力地抑制通過與牙周病的發作和進展密切相關的P.gingivalis產生的蛋白水解酶KGP和RGP。另外，本發明的肽衍生物由安全性極高的天然胺基酸或其衍生物構成。因此，肽衍生物及在體內產生的其代謝產物也被認為具有極高安全性。
因此，式(I)的肽衍生物及其藥學上可接受的鹽作為Lys-gingipain和Arg-gingipain抑制劑和牙周病用藥物製劑的有效成分是有用的。這樣的Lys-gingipain和Arg-gingipain抑制劑和牙周病用藥物製劑可以用作牙周病的預防劑和治療劑。
式(I)的肽衍生物及其藥學上可接受的鹽也可以與藥學上可接受的載體一體使用，以製備口腔用組合物。本發明的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽可以與藥學上接受的載體混合併作為口腔用製劑如口腔用凝膠製劑、口腔用黏膜附著性軟膏、口腔糊劑、牙周袋插入劑、齒齦附著製劑等；和口腔衛生劑如潔齒劑、洗口液、口香糖、片劑、糖果、錠劑等給用。口腔用組合物可以用作牙周病的預防劑或治療劑。
有用的藥學上可接受的載體包括根據其劑型通常使用的適當的載體。具體例子包括甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、液體石蠟、白凡士林、鉑基(platinumbase)、Eudragit L、海藻酸鈉、丙二醇海藻酸酯、茁黴多糖、黃芪膠、黃原膠、殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酸鈉、聚甲基丙烯酸、甲基丙烯酸乙酯、二甲基氨基乙酸酯、乙酸纖維素、膠原蛋白、atherocollagen、明膠、甘油、甘油三乙酸酯、聚乙二醇400、多乙氧基醚60、硬脂酸40聚烴氧基酯、對羥基苯甲酸丁酯、乙醇、十六醇、甘油單硬脂酸酯、碳酸鈣、碳酸鎂、磷酸氫鈣、角叉菜膠、二辛基磺基琥珀酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、扁柏酚、尿囊素、甘草皂苷、阿拉伯膠、澱粉、玉米澱粉、糖精、糖精鈉、甜菊苷、葡萄糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、硬脂酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫鉀、薄荷醇、桉樹油、胡椒薄荷、綠薄荷、色素、香料、氟化鈉、一氟磷酸鈉等氟化物、氯化溶菌酶、甘菊環等抗炎症劑、和氯化鈉等通常使用的成分。
當各自含有本發明的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽作為有效成分的口腔病用藥物製劑或口腔用組合物的Lys-gingipain和Arg-gingipain抑制劑給予包括人的哺乳動物時，可用的給用方法是將有效成分含量為至少約0.001重量％、優選約0.01～約20重量％的製劑以適量通常一天一次以插入、塗布或清洗的方式使用。
當本發明的Lys-gingipain和Arg-gingipain抑制劑、牙周病用藥物製劑或口腔用組合物作為治療劑使用時，劑量可以根據給藥方式、病人的年齡、性別和其它條件、疾患的程度適當選擇。當給予人時，本發明的有效成分化合物的劑量通常為約0.001～約100mg/kg體重/天，優選約0.005～約10mg/kg/天。
當本發明的Lys-gingipain和Arg-gingipain抑制劑、牙周病用藥物製劑或口腔用組合物作為預防劑使用時，劑量可以根據給藥方式、人或其它哺乳動物的年齡、性別和其它條件適當選擇。當給予人時，本發明的有效成分化合物的劑量通常為約0.001～約100mg/kg體重/天，優選約0.005～約10mg/kg/天。
實施發明的最佳方式提供以下參考例、實施例、製劑例和試驗例更詳細地說明本發明，但本發明的不限於這些實施例。在實施例中，Me表示甲基；Boc表示叔丁氧羰基；Cbz表示苄氧羰基；t-Bu表示叔丁基；和Ph表示苯基。胺基酸的縮寫根據一般使用的IUPAC-IUB的推薦。
參考例1合成了反應路線4所示的式(VI)的化合物所包括的以下化合物。
在含有21克(49.5毫摩爾)(3S)-3-苄氧羰基氨基-7-叔丁氧羰基氨基-2-羥基庚酸甲酯(Cbz-Lys(Boc)ψ[CHOHCO]-OMe)即根據WO98/50420記載的方法製備的已知化合物的1000ml混合甲醇/氯仿(10∶1)溶液中加入4克10％鈀-碳。將所得的混合物在氫氣氛中在室溫下攪拌3小時45分鐘以從賴氨酸的氨基上除去苄氧羰基保護基。反應結束後，濾掉不溶物。濃縮濾液，然後不進行分離和純化而溶於525ml N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中。在冰冷卻的條件下在該溶劑中加入20克(59.4毫摩爾)N-苄氧羰基-L-穀氨酸γ-叔丁酯(Cbz-Glu(O-t-Bu)-OH)、8.7克(64.3毫摩爾)1-羥基苯並三唑、11.4克(59.4毫摩爾)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和13.5克(134毫摩爾)N-甲基嗎啉，並在室溫下攪拌混合物14小時。反應結束後，加入10％檸檬酸水溶液將pH調至3，並用乙酸乙酯萃取反應混合物。順序用飽和食鹽水溶液、5％碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水溶液洗滌乙酸乙酯層，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，蒸掉溶劑並通過矽膠柱色譜法(己烷∶乙酸乙酯＝3∶2～1∶1)分離純化殘餘物，得到18.3克所需化合物的非對映異構體混合物，為白色粉末(收率60％)。以下是該混合物的物性值。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.67(0.3H，d，J＝8.8Hz)，7.54(0.7H，d，J＝9.0Hz)，7.40-7.25(6H，m)，6.73(1H，m)，5.69(0.3H，d，J＝5.9Hz)，5.53(0.7H，d，J＝5.6Hz)，5.02(2H，m)，4.11-3.96(3H，m)，3.61 3.56(3H，s)，2.87(2H，m)，2.20(2H，m)，1.83(1H，m)，1.66(1H，m)，1.59-1.06(6H，m)，1.38(9H，s)，1.36(9H，s)質譜(FAB(+))610(M+H)+性狀白色粉末m.p.101～103℃。
參考例2合成了反應路線4所示的式(II)化合物所包括的以下化合物。
在冰冷卻條件下，在3.53克(5.76毫摩爾)參考例1得到的化合物的四氫呋喃(THF)溶液100ml中加入270毫克(6.43毫摩爾)氫氧化鋰一水合物的水溶液(10ml)。在冰冷卻的條件下將混合物攪拌1小時，在室溫下攪拌30分鐘。反應結束後，減壓濃縮反應混合物。在殘餘物中加入10％檸檬酸水溶液將pH調至3，然後用乙酸乙酯萃取。用飽和食鹽水溶液洗滌乙酸乙酯層，然後用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，蒸掉溶劑，得到3.5克所需化合物，為白色粉末(收率100％)。以下是該化合物的物性值。
1H-NMR(DMSO-d6)δ12.45(1H，br s)，7.49-7.31(7H，m)，6.74(1H，m)，5.38(0.3H，d，J＝5.8Hz)，5.26(0.7H，d，J＝5.8Hz)，5.01(1H，q，J＝12.4Hz)，4.04-3.85(4H，m)，2.86(2H，m)，2.19(2H，m)，1.90-0.90(8H，m)，1.40-1.36(18H，sx2)質譜(FAB(-))596(M+H)+，594(M-H)-性狀白色粉末m.p.48～50℃。
實施例1合成了以下的本發明的化合物。
在冰冷卻條件下，在參考例2得到的化合物263毫克(0.44毫摩爾)的DMF溶液4ml中加入日本未審專利公報號1996-502493記載的6-硝基胍基-(3S)-氨基-2-羥基庚酸N-苯乙基醯胺(H-Arg(NgNO2)-CH(OH)-CONHCH2CH2PH)的鹽酸鹽172毫克(0.44毫摩爾)1-羥基苯並三唑63毫克(0.46毫摩爾)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽89毫克(0.46毫摩爾)和N-甲基嗎啉89毫克(0.88毫摩爾)，並將所得的混合物在室溫攪拌3.5小時。反應結束後，加入10％檸檬酸水溶液將pH調至3，然後用乙酸乙酯萃取。順序用飽和食鹽水溶液、5％碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水溶液洗滌乙酸乙酯層，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，蒸掉溶劑並通過矽膠柱色譜(氯仿∶甲醇＝20∶1)分離純化殘餘物，得到190毫克所需化合物的非對映異構體混合物，為無定形固體(收率46％)。以下是該混合物的物性值。
1H-NMR(DMSO-d6)δ8.50(0.5H，m)，8.25-7.17(14.5H，m)，6.75-6.58(1H，m)，6.01-5.75(2H，m)，4.99(2H，m)，4.25-3.82(5H，m)，3.48-2.97(4H，m)，2.91-2.65(4H，m)，2.20(2H，m)，1.95-1.58(2H，m)，1.52-1.11(28H，m)質譜(FAB(+))；952(M+Na)+，968(M+K)+性狀無定形。
實施例2合成了以下本發明的化合物。
在實施例1得到的化合物105毫克(0.11毫摩爾)的二氯甲烷溶液2ml中加入Dess-Martin試劑144毫克(0.34毫摩爾)，將混合物在室溫下攪拌1小時。反應結束後，加入20％亞硫酸氫鈉水溶液。攪拌混合物5分鐘，用乙酸乙酯萃取。順序用飽和食鹽水溶液、5％碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水溶液洗滌乙酸乙酯層，然後用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，蒸掉溶劑，並通過矽膠柱色譜法(氯仿∶甲醇＝40∶1)分離純化殘餘物，得到101毫克所需的化合物，為無定形固體(收率97％)。以下是該化合物的物性值。
1H-NMR(DMSO-d6)δ9.10-8.00(3H，m)，7.55-7.15(12H，m)，6.80-6.62(1H，m)，5.06-4.94(3H，m)，4.18-3.91(2H，m)，3.21-2.65(8H，m)，2.29-2.18(2H，m)，1.86-0.98(30H，m)LC/質譜ES(+)；925(M+)，ES(-)；924(M-H)-性狀無定形。
實施例3合成了以下本發明的化合物。
在實施例2得到的化合物75毫克(0.08毫摩爾)中加入2ml 4N鹽酸-乙酸乙酯溶液，將混合物在室溫攪拌40分鐘。在反應混合物中加入無水乙醚，通過過濾收集生成的白色沉澱並用無水乙醚清洗，得到59毫克所需化合物，為無定形固體(收率90％)。以下是該化合物的物性值。
1H-NMR(DMSO-d6)δ9.10-8.30(3H，m)，7.75(3H，br s)，7.60-7.11(12H，m)，6.80-6.60(1H，m)，5.06-4.95(3H，m)，4.20-3.95(2H，m)，3.20-2.61(8H，m)，2.31-2.18(2H，m)，1.86-1.00(12H，m)
質譜(FAB(+))；770(M+H)+，768(M-H)-性狀無定形。
製劑例1口腔用軟膏劑實施例1得到的本發明的化合物1.0白凡士林 10.0聚丙烯酸鈉 3.0液體石蠟 餘量總量 100.0(重量％)通過常規方法根據以上配方製備了口腔用軟膏劑。
製劑例2潔齒劑磷酸氫鈣 42.0甘油 19.0角叉菜膠 0.9十二烷基硫酸鈉 1.2糖精 1.0實施例2得到的本發明的化合物1.0對羥基苯甲酸丁酯 0.005香料 1.0水 餘量總量 100.0(重量％)通過常規方法根據以上配方製備了潔齒劑。
製劑例3錠劑阿拉伯膠 6.0葡萄糖 72.0乳糖 19.0
實施例3得到的本發明的化合物 1.5一氟磷酸鈉 0.7香料1.0水 餘量總量100.0(重量％)通過常規方法根據以上配方製備了錠劑。
製劑例4口香糖聚乙酸乙烯酯20.0聚異丁烯3.0碳酸鈣 2.0山梨醇 55.0甘露醇 15.0實施例3得到的本發明的化合物 4.0香料1.0總量100.0(重量％)通過常規方法根據以上配方製備了口香糖。
製劑例5含漱劑乙醇20.0聚氧乙烯(60)硬化蓖麻油 3.0聚乙二醇2.0甘油10.0糖精鈉 0.02實施例3得到的本發明的化合物 0.5香料0.2水 餘量總量100.0(重量％)
通過常規方法根據以上配方製備了含漱劑。
製劑例6嗽口水乙醇 30.0聚氧乙烯(20)失水山梨醇月桂酸酯 1.0聚氧乙烯(40)硬化蓖麻油 0.5氫氧化鈉 0.05糖精鈉 0.05實施例3得到的本發明的化合物0.5香料 0.5水 餘量總量 100.0(重量％)通過常規方法根據以上配方製備了嗽口水。
試驗例1對KGP及RGP的抑制活性的測定通過Abe等人的方法(Journal Biochemistry，1998，123卷，305-312)，使用Cba-His-Glu-Lys-MCA作為底物測定了對Lys-gingipain(KGP)的抑制活性。通過Kadowaki等人的方法(Journal BiologicalChemistry，1994，269卷，21371-21378)，使用Cba-Phe-Arg-MVA作為底物，測定了對Arg-gingipain(RGP)的抑制活性。更具體地，通過以下方法進行測定將50mM L-半胱氨酸100μl、0.1M磷酸鈉緩衝液(pH7.5)200μl、12.3nM含有0.05％「Brij35」(商品名，Aldrich制，聚氧乙烯(23)月桂基醚)的KGP或RGP溶液20μl、蒸餾水80μl和本發明化合物的二甲亞碸溶液100μl混合，並在37℃預溫育5分鐘。然後，加入含有20μM Cbz-His-Glu-Lys-MCA(KGP用)或Cbz-Phe-Arg-MCA(RGP用)的0.1二甲亞碸溶液500μl，然後在40℃溫育10分鐘。然後加入含有10mM碘乙醯胺的乙酸緩衝液(pH5.0)終止酶反應。測定了在380nm激發的460nm的螢光強度(F)。作為對照，使用不含本發明化合物100μl二甲亞碸溶液代替化合物溶液，並且同樣地測定了螢光強度(F0)。通過下式計算酶抑制活性酶抑制活性(％)＝[1-(F/F0)]×100表1示出了試驗結果。
表1

表1顯示本發明的化合物對KGP和RGP兩酶具有優良的抑制活性。
本發明化合物抑制由革蘭氏陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)產生的Lys-gingipain(KGP)和Arg-gingipain(RGP)兩酶的活性，因此例如作為牙周病的預防或治療劑是有用的。
權利要求
1.一種式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽 其中X為-CH(OH)-或-CO-；R1為氫或氨基保護基；R2為羥基或低級烷氧基；R3和R4之一為氨基可以被保護基保護的賴氨酸的側鏈(R基)，R3和R4的另一個為胍基可以被保護基保護的精氨酸的側鏈(R基)；以及R5和R6可以相同或不同，並且為氫、低級烷基或芳烷基。
2.根據權利要求1的式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中X為-CO-。
3.根據權利要求2的式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中X為-CO-；R1為氫或可以具有取代基的芳烷基氧羰基；R2為羥基或低級烷氧基；R3和R4之一為賴氨酸的側鏈(R基)，R3和R4的另一個為胍基可以被硝基保護的精氨酸的側鏈(R基)；以及R5和R6可以相同或不同，並且為氫或芳烷基。
4.根據權利要求3的式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中X為-CO-；R1為苄氧羰基；R2為羥基或叔丁氧基；R3為賴氨酸的側鏈(R基)；R4是胍基可以被硝基保護的精氨酸的側鏈(R基)；R5為氫；以及R6為苯乙基。
5.一種製造式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽的方法， 其中X為-CH(OH)-或-CO-；R1為氫或氨基保護基；R2為羥基或低級烷氧基；R3和R4之一為氨基可以被保護基保護的賴氨酸的側鏈(R基)，R3和R4的另一個為胍基可以被保護基保護的精氨酸的側鏈(R基)；以及R5和R6可以相同或不同，並且為氫、低級烷基或芳烷基，該方法包括以下步驟(i)(i)將下式(II)的化合物與下式(III)的化合物縮合，生成式(I-a)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽， 其中R1和R3的定義同上，R2a為低級烷氧基， 其中R4、R5和R6的定義同上， 其中R1、R2a、R3、R4、R5和R6的定義同上。
6.一種製造式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽的方法，該方法包括以下步驟(ii)(ii)將上式(I-a)的化合物氧化，生成式(I-b)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽， 其中R1、R2a、R3、R4、R5和R6的定義同上。
7.一種製造式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽的方法，該方法包括以下步驟(iii)(iii)用酸處理式(I-a)或(I-b)的化合物，生成式(I-c)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽， 其中X、R1、R3、R4、R5和R6的定義同上。
8.一種Arg-gingipain和Lys-gingipain抑制劑，其含有選自由權利要求1所述的式(I)表示的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽組成的組中的至少一種作為有效成分。
9.一種牙周病用藥物製劑，其含有選自由權利要求1所述的式(I)表示的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽組成的組中的至少一種作為有效成分。
10.一種口腔用組合物，其含有藥學上接受的載體和選自由權利要求1所述的式(I)表示的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽組成的組中的至少一種。
11.一種預防牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的權利要求8所述的Arg-gingipain和Lys-gingipain抑制劑。
12.一種預防牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的權利要求9所述的牙周病用藥物製劑。
13.一種預防牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的權利要求10所述的口腔用組合物。
14.一種治療牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的權利要求8所述的Arg-gingipain和Lys-gingipain抑制劑。
15.一種治療牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的權利要求9所述的牙周病用藥物製劑。
16.一種治療牙周病的方法，包括給予包括人的哺乳動物以有效量的權利要求10所述的口腔用組合物。
17.權利要求1所述的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽在製備權利要求8所述的Arg-gingipain和Lys-gingipain抑制劑中的應用。
18.權利要求1所述的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽在製備權利要求9所述的牙周病用藥物製劑中的應用。
19.權利要求1項所述的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽在製備權利要求10所述的口腔用組合物中的應用。
全文摘要
本發明提供式(I)的肽衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中X為－CH(OH)－或－CO－；R
文檔編號C07K5/02GK1622953SQ0282264
公開日2005年6月1日 申請日期2002年11月14日 優先權日2001年11月16日
發明者山本健二, 須田悅, 淺尾哲次 申請人:大鵬藥品工業株式會社