長鏈菊粉調節急性胰腺炎症及其引起的相關組織損傷的作用的製作方法

2023-12-01 03:14:01 2

本發明涉及長鏈菊粉調節急性胰腺炎症及其引起的相關組織損傷的作用，屬於急性胰腺炎的預防和治療技術領域。

背景技術：

菊粉是一類天然果聚糖的混合物。果聚糖是果糖單元通過(2-1)鏈聯接而成並以葡萄糖單元終止的碳水化合物，以膠體形態含於細胞的原生質中。主要見於菊科植物，例如，在菊芋的塊莖、天竺牡丹(大理菊)的塊根、薊的根。研究表明，膳食中的長鏈菊粉可以緩解壞死性結腸炎患者症狀，低發酵寡聚糖、二糖、多元醇飲食可有效減少腸易激症候群患者功能性胃腸症狀，這說明長鏈菊粉在提供營養的同時對炎症也具有一定的調節作用。

急性胰腺炎作為重要的消化疾病之一，會引起全身炎症反應症候群以及多器官功能綜合不全徵，包括腸道屏障受損等，其具體的發病機制尚未完全明確。急性胰腺炎與結腸炎的起因及部位不同，其治療幹預策略也不相同，如丁酸及丁酸梭菌對結腸炎具有緩解作用，但卻對急性胰腺炎無保護作用。如何更有效的預防急性胰腺炎的發生、在臨床上如何更有效的阻斷炎症擴散、治療急性胰腺炎，使它避免發展成重症急性胰腺炎甚至胰腺癌，從而減少胰腺炎的病死率以及併發症發生率，探明急性胰腺炎的發病機制並開發相應的預防和治療方法就尤為重要。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明證明了長鏈菊粉對雨蛙素誘導的急性胰腺炎小鼠發揮預防作用，並降低組織炎症程度。本發明涉及的長鏈菊粉，在安全劑量範圍內對雨蛙素誘導的急性胰腺炎小鼠發揮保護作用，降低炎症程度，可作為有效成分添加到防治急性胰腺炎的膳食中。

本發明所使用的長鏈菊粉結構式如式(1)所示：

其中，n＝10～60

本發明的第一個目的是提供一種預防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療急性胰腺炎的藥物或者藥物組合物，其特徵在於，所述藥物或者藥物組合物以長鏈菊粉作為主要有效成分。

在本發明的一種實施方式中，所述藥物或者藥物組合物還包括藥學上可接受的賦型劑。所述藥學上可接受的賦型劑是指任何可用於藥學領域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。

在本發明的一種實施方式中，本發明的長鏈菊粉可以與其他活性成分組合使用，只要它們不產生其他不利的作用，例如過敏反應。

在本發明的一種實施方式中，本發明的藥物或者藥物組合物可配製成若干種劑型，其中含有藥學領域中常用的一些賦形劑；例如，口服製劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)；可注射的製劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的乾燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部製劑(例如軟膏或溶液)。

在本發明的一種實施方式中，用於本發明藥物組合物的載體是藥學領域中可得到的常見類型，包括：口服製劑用的粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩定劑、懸浮劑、無色素、矯味劑等；可注射製劑用的防腐劑、加溶劑、穩定劑等；局部製劑用的基質、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑等。藥物製劑可以經口服或胃腸外方式(例如靜脈內、皮下、腹膜內或局部)給藥，如果某些藥物在胃部條件下是不穩定的，可將其配製成腸衣片劑。

在本發明的一種實施方式中，所述長鏈菊粉是式(1)中的任一單體或者兩種以上單體按照任意比例混合得到的，都能降低血清胰脂肪酶和/或胰腺組織中MPO表達量、降低血清澱粉酶水平、調節炎症水平。

在本發明的一種實施方式中，所述長鏈菊粉是一類天然果聚糖的混合物，可購自荷蘭sensus公司、比利時beneo orafti公司或者上海開楷貿易有限公司等，也可購自生產或者銷售式(1)長鏈菊粉的公司、生產或者銷售以式(1)長鏈菊粉為主要成分的可用於藥物或者食品的混合物的公司。

本發明的第二個目的是提供一種預防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療急性胰腺炎的食品，所述食品以長鏈菊粉作為主要有效成分。

在本發明的一種實施方式中，所述食品包括保健食品、飲品、腸內營養製劑、膳食補充劑等。

本發明本發明的第三個目的是提供一種降低血清胰脂肪酶和/或胰腺組織中MPO表達量的製劑，所述製劑是以有效劑量的長鏈菊粉作為主要活性成份。

本發明的第四個目的是提供一種降低血清澱粉酶水平和/或提高胰腺組織中抑炎因子IL10表達水平的製劑，所述製劑是以有效劑量的長鏈菊粉作為主要活性成份。

本發明的第五個目的是提供一種降低胰腺組織中促炎症因子TNF-α，IL1β表達水平的製劑，所述製劑是以有效劑量的長鏈菊粉作為主要活性成份。

本發明的製劑是指藥物、保健食品、飲品、腸內營養製劑、膳食補充劑、獸藥或者飼料添加劑等。

本發明的第六個目的是提供長鏈菊粉的新應用；所述長鏈菊粉結構式如下：

其中，n＝10～60。

在本發明的一種實施方式中，所述應用，是製備預防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療急性胰腺炎的藥物、保健食品、飲品、腸內營養製劑、膳食補充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應用，是製備降低血清胰脂肪酶和/或胰腺組織中MPO表達量，或者降低胰腺組織中促炎症因子TNF-α和/或IL1β表達水平的藥物、保健食品、飲品、腸內營養製劑、膳食補充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應用，是製備降低血清澱粉酶水平或者提高胰腺組織中抑炎因子IL10表達水平的藥物、保健食品、飲品、腸內營養製劑、膳食補充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應用。

本發明的有益效果：

本發明證明了只需要進行短期長鏈菊粉餵食(3天)即可對雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎發揮保護作用，可作為有效的成分添加到防治急性胰腺炎的藥物當中，降低臨床上急性胰腺炎的發生發展和炎症程度。此外，發明人也曾嘗試以短鏈菊粉(n＜10)進行餵食，結果發現對於雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎無法發揮保護作用。

本發明通過長鏈菊粉對雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎模型進行預防性處理，對其胰腺組織進行病理組織形態觀察，小鼠血清胰脂肪酶、血清澱粉酶、組織中炎症細胞釋放酶MPO的水平、組織及血清中抑炎因子IL10和促炎性細胞因子TNFα，IL1β進行測定。比較長鏈菊粉處理組與炎症模型組小鼠的各個指標水平，長鏈菊粉處理組小鼠各項指標顯著優於炎症模型組。

附圖說明

圖1是用髓過物氧化酶試劑盒、血清澱粉酶試劑盒和血清胰脂肪酶酶聯免疫吸附法試劑盒分別測定的小鼠胰腺組織中髓過物氧化酶(MPO)水平(圖1A)、血清中的澱粉酶(AMY)水平(圖1B)以及血清中的胰脂肪酶(lipase)(圖1C)，比較長鏈菊粉處理組與炎症模型組的炎症程度；其中，control表示對照組，AP表示急性胰腺炎模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預防處理組。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

圖2是用HE染色的方法觀察胰腺組織的病理變化；其中，control表示對照組，AP表示急性胰腺炎模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預防處理組。

圖3是用酶聯免疫吸附法測定小鼠胰腺組織勻漿上清液中的炎症因子釋放水平，比較長鏈菊粉處理組與炎症模型組的炎症程度；其中，腫瘤壞死因子用TNF-α表示(圖3A)，白介素因子用IL10(圖3B，圖3C)、IL1β(圖3D，圖3E)表示，control表示對照組，AP表示急性胰腺炎模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預防處理組。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

圖4是用螢光定量PCR測定小鼠結腸組織中緊密連接蛋白的mRNA表達，比較長鏈菊粉處理組與炎症模型組的結腸緊密程度；其中，緊密連接蛋白用ZO1，occludin表示，control表示對照組，AP表示炎症模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預防處理組。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

圖5是用酶聯免疫吸附法測定小鼠結腸組織勻漿上清液中的炎症因子釋放水平，比較長鏈菊粉處理組與炎症模型組的炎症程度；其中，白介素因子用IL10、IL1β表示(圖5B、C)，腫瘤壞死因子用TNF-α表示(圖5A)，control表示對照組，AP表示炎症模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預防處理組。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

具體實施方式

實施例1.急性胰腺炎模型建立

將8周齡雌性BALB/C小鼠隨機分成對照組(control)、急性胰腺炎組(AP)、長鏈菊粉預防組(ITF IV)，採用腹腔注射的方式分別給對照組、急性胰腺炎組及預防組小鼠注射生理鹽水(0.90％)和雨蛙素(50ug/kg)；每小時注射一次，連續注射8次。實驗期內，三組小鼠餵食飼料相同，除預防組於注射雨蛙素造模前連續攝入三天5％(長鏈菊粉質量g/普通小鼠飼料總重g)長鏈菊粉飼料。長鏈菊粉購自荷蘭sensus公司。

實施例2.長鏈菊粉抵抗急性胰腺炎發生時胰腺組織MPO的表達

白細胞尤其中性粒細胞的活化作為急性胰腺炎發病機制中的重要一環，在其病理過程中發揮著極其重要的作用。MPO是中性粒細胞的功能標誌和激活標誌，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細胞的功能和活性狀態。中性白細胞中存在有髓過氧化酶，每個細胞所含的酶的量是一定的，約佔細胞乾重的5％，該酶具有使過氧化氫還原的能力，利用這一特點可以分析酶的活力，並測定中心白細胞的數目。其原理如下：

MPO+H2O2→複合物；複合物+AH2(供氫體)→H2O+MPO+A產物

通過供氫體鄰連茴香胺供氫後生成黃色化合物，在460nm處通過比色測定A產物的生成量，從而推算出MPO的活力及H2O2減少的量和白細胞的數目。如圖1A，結果表明，急性胰腺炎組的胰腺MPO活力較正常組明顯上升，長鏈菊粉處理組的MPO活力較疾病組明顯下降。由此可得，經長鏈菊粉預防處理後急性胰腺炎小鼠的胰腺MPO活力顯著下調，從而改善急性胰腺炎。

實施例3.長鏈菊粉降低急性胰腺炎發生時血清澱粉酶(AMY)的水平

已有數據顯示，90％以上急性胰腺炎患者的血清中的AMY都會增高，因此本發明檢測了AMY含量變化。

澱粉酶能水解澱粉生成葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物濃度已知並且過量的情況下，加入碘液與未水解的澱粉生成藍色複合物，根據藍色的深淺可推算出水解的澱粉量，從而計算出AMY的活力。如圖1B，結果顯示，急性胰腺炎組的AMY活力較正常組明顯上升，長鏈菊粉處理組的AMY活力較疾病組明顯下降。由此可得，經長鏈菊粉預防處理後急性胰腺炎小鼠的AMY活力顯著下調，從而改善急性胰腺炎。

實施例4.長鏈菊粉降低急性胰腺炎發生時血清胰脂肪酶(lipase)的水平

血清澱粉酶增高程度常與病情嚴重程度不成正比，且血清澱粉酶也可以在除急性胰腺炎以外的許多疾病中升高，如胃穿孔，胰腺腫瘤等。因此單獨用血清澱粉酶診斷急性胰腺炎是有局限性的。血清脂肪酶在急性胰腺炎發病後活性升高，也可用於急性胰腺炎的測定。通常但其特異性更高，持續時間更長，因此，對血清脂肪酶進行測定以驗證結論的準確性。

採用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定小鼠血清lipase水平。分別向預先包被了小鼠lipase單克隆抗體的酶標孔中加入lipase溫育；溫育後，加入生物素標記的抗lipase抗體，再與聯袂親和素-HRP結合，形成免疫複合物，再經溫育和洗滌，去除未結合的酶，然後加入底物A、B，產生藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠lipase的濃度呈正相關。如圖1C，結果顯示，AP小鼠的血清胰脂肪酶較control組小鼠高，且ITF IV小鼠的血清胰脂肪酶較急性胰腺炎小鼠明顯下調。由此可得，經長鏈菊粉預防處理後急性胰腺炎小鼠血清胰脂肪酶在血清中的表達水平顯著降低，從而改善急性胰腺炎。

實施例5.長鏈菊粉緩解小鼠急性胰腺炎胰腺組織水腫及炎症浸潤程度

用HE染色的方法，將對照組(control)、炎症模型組(AP)、表示長鏈菊粉預防處理組(ITF IV)的胰腺經固定、脫水、染色、脫蠟、透明和封片等主要過程，觀察胰腺組織的組織完整性，胰腺水腫程度和炎症細胞浸潤程度。如圖2，結果顯示，control組胰腺組織結構密實，無明顯裂紋。AP小鼠胰腺組織結構疏鬆，有明顯水腫及炎症浸潤現象，而ITF IV組較AP組則有明顯的改善作用。

實施例6.長鏈菊粉減少急性胰腺炎小鼠胰腺組織中炎症因子的釋放

在急性胰腺炎中，TNFα與IL1β是促炎因子。急性胰腺炎發生後TNFα高表達，阻斷其升高可減輕炎症病情。IL1β在急性胰腺炎早期即升高，並與TNFα協同作用，不但可以刺激自身的釋放，還可以促進彼此的釋放。IL10是一種有效的炎症抑制因子，能降低血清澱粉酶，抑制炎症炎症介導的巨噬細胞的多種功能，包括TNF和IL1的產生，減輕胰腺組織水腫、出血，減輕胰腺炎的嚴重程度。

採用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定小鼠胰腺組織5％勻漿上清液IL10、IL1β和TNFα水平。分別向預先包被了小鼠IL10、IL1β和TNFα單克隆抗體的酶標孔中加入IL10、IL1β和TNFα，溫育；溫育後，加入生物素標記的抗IL10、IL1β和TNFα抗體，再與聯袂親和素-HRP結合，形成免疫複合物，再經溫育和洗滌，去除未結合的酶，然後加入底物A、B，產生藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠IL10、IL1β和TNFα的濃度呈正相關。如圖3A，結果顯示，AP組胰腺TNFα水平明顯高於control組，而ITF IV組的TNFα水平相較於AP組則顯著下調。如圖3B和3C，AP組胰腺與血清中IL10水平明顯低於control組，而ITF IV組的IL10水平相較於AP組則顯著上升。如圖3D和3E，AP組胰腺與血清中IL1β水平明顯高於control組，而ITF IV組的IL1β水平相較於AP組則顯著下調。綜上可得，經長鏈菊粉預防處理後，能夠急性胰腺炎小鼠IL1β和TNFα在其胰腺組織及血清中的表達水平顯著降低，同時IL10在其胰腺組織及血清中的表達水平顯著上調，從而改善急性胰腺炎的胰腺炎症程度。

實施例7.長鏈菊粉緩解小鼠急性胰腺炎引起的結腸組織通透程度。

急性胰腺炎的發生會導致腸道屏障受損，腸道通透性降低。緊密連接蛋白(ZO1、occludin)的含量是反映腸道組織緊密與通透程度的重要指標。

採用螢光定量PCR法(QPCR)測定小鼠結腸組織的緊密連接蛋白mRNA表達相對含量。組織樣品通過使用高通量組織研磨機在trizol中進行破碎，之後使用氯仿等進行抽提，離心後吸取上清，加入等體積的異丙醇進行沉澱RNA，離心後棄上清，用75％乙醇DEPC進行洗滌所得RNA。對得到的RNA進行濃度和純度的測量後，使用Takara反轉錄試劑盒將組織樣品中的RNA反轉到cDNA。根據mRNA設計的引物在正式實驗前需進行QPCR測試其特異性和擴增效率，得到結果後，首先根據熔解曲線判斷引物特異性，選擇標準為：單峰且峰形偏窄，無明顯引物二聚體熔解曲線峰。引物驗證結果良好後進行正式實驗.

使用SYBR Green mix進行相關基因的擴增檢測。擴增程序為：55℃預熱30秒；95℃5分鐘；接下來循環39次：95℃30秒；58℃30秒；之後進行引物特異性檢測，從65℃保持5秒之後每秒上升0.1℃至95℃，觀察引物特異性。如圖4，結果顯示，AP組結腸ZO1和occludin的mRNA水平明顯低於control組，而ITF IV組的ZO1和occludin的mRNA水平相較於AP組則顯著上升。由此可得，經長鏈菊粉預防處理後，急性胰腺炎小鼠腸道緊密連接蛋白(ZO1，occludin)的mRNA表達顯著上調，其從而改善由急性胰腺炎引起的腸道組織通透程度減弱。

實施例8.長鏈菊粉減少急性胰腺炎小鼠結腸組織中炎症因子的釋放

急性胰腺炎會導致腸道屏障受損，其中包括腸道炎症的發生。TNFα與IL1β是促炎因子，IL10是一種有效的炎症抑制因子。本發明中研究了短期長鏈菊粉餵食對由急性胰腺炎引起的腸道組織損傷，包括炎症的改善。

採用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定小鼠結腸組織5％勻漿上清液IL10、IL1β和TNF-α水平。分別向預先包被了小鼠IL10、IL1β和TNF-α單克隆抗體的酶標孔中加入IL10、IL1β和TNF-α，溫育；溫育後，加入生物素標記的抗IL10、IL1β和TNF-α抗體，再與聯袂親和素-HRP結合，形成免疫複合物，再經溫育和洗滌，去除未結合的酶，然後加入底物A、B，產生藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠IL10、IL1β和TNF-α的濃度呈正相關。如圖5A和5C，結果顯示，AP組結腸TNFα與IL1β水平明顯高於control組，而ITF IV組的TNFα與IL1β水平相較於AP組則顯著下調。如圖5B，AP組結腸中IL10水平明顯低於control組，而ITF IV組的IL10水平相較於AP組則顯著上升。綜上可得，經長鏈菊粉預防處理後，急性胰腺炎小鼠IL1β和TNF-α在結腸組織中的表達水平顯著降低，同時IL10在結腸組織中的表達水平顯著上調，從而改善由急性胰腺炎引起的腸道炎症程度。

綜上，本發明採用短期長鏈菊粉餵食(3天)的方法，對雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎模型進行預防性處理，發現短期長鏈菊粉餵食可對雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎發揮保護作用，可作為有效的成分添加到防治急性胰腺炎的藥物當中，降低臨床上急性胰腺炎的發生發展和炎症程度。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。