應用適配子型試劑檢測、鑑定和/或定量化合物的方法

2023-12-01 03:24:21 2

專利名稱：應用適配子型試劑檢測、鑑定和/或定量化合物的方法
技術領域：
本發明屬生物醫學檢驗領域，本發明涉及應用適配子型試劑檢測、鑑定和/ 或定量化合物的方法，該發明還涉及用於該方法的適配子型檢測試劑盒的製備 方法。
背景技術：
目前應用於臨床檢測的試劑大多為抗體類，且多數為進口試劑。由於抗體 製備過程中的差異及穩定性問題，決定了定量測定時每批試劑必須做標準曲線， 這使得操作過程複雜煩瑣，且對一部分免疫原性較小或無免疫原性的物質無法進行檢測。本發明針對以上問題，採用適配子技術，通過SELEX技術的篩選過 程，獲得各種具臨床診斷意義的靶物質的高親和性特異適配子，用於快速、準 確檢測相應的靶物質，以改善現有臨床檢測試劑存在的問題，降低檢測成本， 研發自主創新的化學診斷試劑。寡核苷酸適配子技術是近年來發展起來的一種新型的分子生物學技術，是 採用指數級富集配體的系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選獲得的。SELEX技術是上世紀90年代 初創立的一項篩選技術，是一種研究核酸結構與功能的有效方法，其基本原理 是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸文庫，用它與靶物質混合，形成靶物質核酸 複合物，洗掉未與靶物質結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，以此核 酸分子為模板進行PCR擴增，再進行下一輪的篩選過程。通過重複的篩選與擴 增， 一些與耙物質不結合或與耙物質低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被 洗去，而稱之為"適配子"(apta鵬r)的與耙物質有高親和力的DNA或RNA分 子從隨機庫中被分離出來，且純度隨SELEX過程的進行而增高，從pmol到nmol， 甚至到umol，最後佔據庫的大多數。通過多輪的體外篩選和擴增，能夠從隨 機寡核苷酸文庫中篩選出特異性適配子。 一個典型的SELEX過程可能在幾個星 期至幾個月中篩選出適配子，而運用"自動SELEX技術"，不僅降低了人為因素
的幹擾，更可在數天內完成一個SELEX過程。該技術具有庫容量大、靶分子範 圍廣、親和力高、特異性強等優點，已成功應用於多種靶物質的篩選，除用於 核苷酸序列、蛋白質、胺基酸外，還可用於染料、藥物小分子(如茶鹼)、生長 分子、肽鏈、類固醇、糖類，甚至可用於完整的細胞、病毒、孢子和朊病毒等。 適配子具有高度特異性，通過反向SELEX技術，甚至可以在不知靶目標性質的情況下篩選出其相應的適配子。在臨床檢測方面，特別是對一些未知的致病性 細菌或病毒的研究，雖然不知道其內部結構、功能以及這些物質的表位，但將 其作為耙物質，通過SELEX技術篩選到其相應的適配子，以檢測靶物質，已成為該領域的研究熱點。
適配子對耙分子的識別具有高親和力，並能高特異性地結合靶分子。目前 已篩出的適配子解離常數(kd)—般在0. 05 50pmol/L，高於其他類型的配基。 適配子能夠分辨出靶分子結構上細微的差別，可以區分一個甲基或一個羥基的 差別。適配子可用於單克隆抗體難以區分的結構類似物或交叉抗原的鑑別診斷。 比如hTSH、 hLH、 hCG以及hFSH這4種激素，有相同的a鏈，日鏈的結構也十分相似，因而要製備與其他三種激素無交叉反應的特異單克隆抗體十分困難。 而適配子在這四種激素間無交叉反應。因此，適配子可應用於對特定靶分子的 檢測。現有的應用適配子檢測靶分子的技術中需要將檢測標記物直接連接到適 配子上，不但影響了檢測方法本身的靈活性，而且由於檢測標記物對適配子立 體構像的影響，尤其是當檢測標記物相對較大時，會直接造成適配子的識別、 結合靶分子的親和力、特異性的改變，從而影響檢測的準確性和精度。為此本發明的發明人經過長期研究，提出了含有單側延長臂的適配子片段， 並將其包被在乳膠顆粒上，當血清標本加入試劑時，血清中的待測靶分子和包 含適配子片段的乳膠顆粒形成凝集，使入射光散射，散射光的強度與血清中的 耙物質成正比，通過比濁法可直接檢測出相應靶分子的濃度。該方法不但提供 可供選擇的運用適配子的測試方法，而且可以避免檢測標記物直接與適配子連 接對適配子識別、結合能力的影響。採用適配子型分子做試劑分子可使檢測的 重複性更好，減少批間差異，充分保證測定結果的可靠性。將該檢測試劑應用 於全自動生化分析儀，即可實現檢測的自動化和批量化。另外本方法還具有測
試時間短、試劑成本低、研發周期短、質量穩定等優點。 發明內容本發明的目的是應用適配子型試劑檢測、鑑定和/或定量化合物的方法，該 發明還涉及用於該方法的適配子型檢測試劑盒的製備方法和應用。本發明方法利用指數級富集配體的系統進化技術(SELEX技術)，以具有診 斷價值的各種生物分子，包括核苷酸序列、蛋白質、胺基酸、肽鏈、糖類，或 完整的菌體為靶物質，篩選獲得這些靶物質相應的高特異性適配子，為進一步 利用適配子技術進行臨床診斷提供依據。所述的適配子是篩選獲得的單鏈寡核 苷酸，其來自一種隨機單鏈文庫，所述隨機單鏈文庫可以是DNA也可以是RNA 分子，其兩端為固定序列用於設計引物，中間為隨機序列用於提供與各種靶物 質結合的豐富核酸配基。本發明利用SELEX技術通過反覆的篩選過程，獲得各種待測靶物質的高親 和性特異適配子，然後通過對適配子進行修飾增強其穩定性，再通過單側延長 臂的設計及連接基團將螢光素、生物素、放射性同位素、膠體金或乳膠顆粒等 標記分子連接在適配子分子上，用於從血、尿、組織標本及各種臨床標本中檢 測相應的耙物質，達到快速、準確診斷的目的，包括以下步驟1) 從具臨床診斷意義的各種物質中尋找、製備可用於SELEX技術篩選的 靶物質，包括(1) 具診斷意義的蛋白質、肽鏈，如hTSH、 hLH、 hCG、 hFSH激素；人免 疫球蛋白分子等；(2) 具診斷意義的核苷酸序列，如B型肝炎病毒核酸片段、HIV病毒核 酸片段等；(3) 具診斷意義的細菌或病毒顆粒，如結核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌等。2) 利用SELEX技術篩選獲得各種靶物質的適配子，包括(1) 構建合適的隨機單鏈寡核苷酸文庫，包括單鏈DNA和/或RNA文庫， 其兩端為固定序列用於設計引物，中間為隨機序列用於提供與各種靶物質結合 的豐富核酸配基；(2) 優化PCR擴增條件；(3) 不對稱PCR法或生物素鏈親合素磁珠法製備單鏈DNA文庫；(4) 以硝酸纖維素膜、親和樹脂或微孔板為分離介質的靶物質篩選過程； 3)建立適配子技術檢測臨床待測標本，包括(1) 提供靶物質的高親和性適配子，並對其進行修飾，主要針對RNA適配 子進行修飾；(2) .對適配子分子進行單側延長臂修飾；(3) 採用連接基團將螢光素、生物素、放射性同位素、膠體金或乳膠顆粒 等標記物標記在延長臂末端對獲得的適配子進行標記；(4) 混合含適配子的試劑分子和待檢測、鑑定和/或定量的樣品；(5) 檢測結合物的信號變化。其中單側延長臂為核苷酸片段；適配子可以是微生物、病毒的適配子，蛋 白質、肽類激素的適配子或核酸分子的適配子，優選是各類蛋白質、肽類激素 的適配子；檢測標記物是放射性同位素、化學發光基團、化學螢光基團、乳膠 顆粒、螢光蛋白、酶、抗原、抗體、配體或受體中的一種或多種組合，優選是 乳膠顆粒；本發明提供的適配子型檢測分子的製備方法包括單側延長臂和標記 物的結合過程。本發明提供了本發明方法所述的試劑盒或本發明所述適配子型檢測分子在 臨床檢測、毒品檢測、食品安全檢測中的應用。 本發明提供的人免疫球蛋白E的適配子，其序列為 5'-GGGGACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3'。在適配子序列部分核酸片段為單鏈，可以通過修飾進行延長。而單側延長 臂是與適配子序列相連接的單鏈核酸序列，而且其核酸序列末端連接有檢測標 記物，因此能通過單側延長臂帶有的檢測標記物對被測物進行檢測。在本文中， 核酸用本領域技術人員所熟知的符號來表示其序列，如無特別說明序列表示的 是從5'端至3'端方向的序列順序。本文中的術語"單側延長臂"指的是在適配子序列的一端加入的一段連續 序列，從而使標記分子與含適配子的核酸片段能夠結合在一起，同時不影響適 配子的立體構像，其序列長度通常視適配子的序列長度而定，上述單側延長臂 適的序列長度優選為5至50個鹼基，更優選為5至30個鹼基，更優選為8至 15個鹼基。本文中的術語"適配子"是為本領域技術人員所熟知的，指的是能夠與特 定的耙分子特異結合的單鏈核酸，包括DNA或RNA片段。通過SELEX技術可以 在短時間內獲得特定靶分子的適配子。目前已經有大量的適配子序列被公開， 因此本文中的適配子可以選自微生物、病毒的適配子，蛋白質、肽類激素的適 配子或核酸分子的適配子，優選是蛋白質、肽類激素的適配子，如人免疫球蛋 白E的適配子。由於適配子具有與抗體相似的結合特定靶分子的性質，因此適 配子可以代替抗體在檢測中的作用，並且本發明人在適配子序列的一側設計了 單鏈核酸的延長序列，獲得了本發明第一個方面的方法，使得適配子序列和延 長片段能結合標記分子，然後通過檢測標記分子的信號變化來計算靶分子的存 在與否及其含量，從而檢測、鑑定和/或定量靶分子。本發明可進一步通過發現適配子的結構，對其進行修飾增加穩定性，以抵 抗體內核酸酶的降解；採用標準品進行倍比稀釋檢測製作待測物的標準曲線。 本發明方法將能顯著提高檢測結果的重複性、穩定性，減少檢測的批間差異， 充分保證測定結果的可靠性。可用於臨床靶分子的快速、簡便診斷，可以為實 驗室診斷提供有利依據，本方法還具有測試時間短、試劑成本低、研發周期短、
質量穩定等優點。本發明方法將為臨床診斷開啟新的途徑，也為開發臨床診斷 試劑盒提供了新的研究思路。所以本發明較之常規的臨床檢測方法具有更好的 檢測特異性和重複性，而且還具有以下優點1.檢測時間短。混合適配子檢測 序列和樣品後，通常只要反應5分鐘就可以進行檢測。2.生產成本低。適配子 及其延長臂序列只要通過化學合成和修飾就可以得到，目前DNA合成技術已經 非常成熟，成本極低。而蛋白抗體要通過動物免疫和純化得到，成本較高。3.新 產品研發周期短。通過SELEX技術，可在1個月內得到與目標分子高度特異結 合的適配子；而蛋白抗體的研發時間起碼需要6個月以上。4.產品質量穩定。 核酸分子比蛋白抗體更穩定，易於長時間保存，這使產品的有效期大大延長。在本文中，連接基團是本領域技術人員所知曉的化學基團，它們可以通過 共價鍵將標記分子連接在適配子核酸片段上。這些技術廣泛存在於核酸微陣列、 核酸晶片的核酸固定技術之中。為了能夠更穩定地合成適配子型檢測試劑，本 發明優選的連接基團是抗原或抗體、配體或受體，更優選為生物素或親合素。 在延長臂序列末端通過生物素——親合素的結合使標記分子連接到核酸片段上 形成完整的適配子型檢測試劑。在本發明的一個具體實施方式
中，優選單鏈核 酸片段含有人免疫球蛋白E的適配子序列和單側延長臂序列(連接序列優選為 GCGCGCGC);連接基團為生物素，標記在單側延長臂序列的5'端。在本文中，單側延長臂序列連接的檢測標記物是可以被檢測的物質，包括 但不限於放射性同位素、化學發光基團、化學螢光基團、螢光蛋白、酶、膠體 金顆粒、乳膠顆粒中的一種或多種組合。放射性同位素的合適例子有32P、 1251、 35S、 3H等。化學發光基團有魯米諾等；化學螢光基團包括羅丹明、FITC、 TRITC 等。通過常規的化學合成方法，可以將辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等酶標記 到適配子核酸序列上。而且已經有大量的商品化的檢測標記物及其反應試劑盒 可供使用。在本發明中，優選適配子序列連接的檢測標記物是乳膠顆粒。


圖1是SELEX過程篩選人免疫球蛋白E適配子的流程圖2是未結合人免疫球蛋白E的適配子複合物；圖3是用本發明製備的人免疫球蛋白E檢測試劑盒檢測人免疫球蛋白E的 標準曲線。
具體實施方式
以能與人免疫球蛋白E結合的高親和性DNA適配子的製備方法為例，按照 下列步驟進行1. 製備和純化蛋白所涉及的人免疫球蛋白E的製備和純化為本領域己知技術(可市購)，將獲 得人免疫球蛋白E純品作為篩選靶物質。2. 構建隨機單鏈DNA (ssDNA)文庫和引物(1) 合成隨機ssDNA文庫人工合成長度為79bp的隨機ssDNA文庫，兩端為固定序列，中間35個鹼 基為隨機序列的單鏈DNA庫，其庫容為1014—15[5' —CCCCTGTCAGAAGTGTTTCTC M-(N35)-AGA GAT GAG CAG GCG GAT ACT-3']，其中N代表鹼基A, G， C， T中的 任意一個。隨機單鏈DNA文庫由生物合成公司合成。(2) 引物合成引物由Primer Design5.0軟體設計，上遊引物和下遊引物分別對應於隨機 DNA文庫兩端的固定序列，下遊引物5'端標記生物素。3. 特異性適配子的製備通過SELEX技術針對待測分子所構建的ssDNA文庫進行重複選擇和擴增， 經過數輪嚴格的選擇和擴增，將所獲取的適配子進行克隆、測序，並檢驗其與 靶分子的結合力。篩選次數依據每輪洗滌非特異性吸附DNA或RNA的嚴格程度 以及靶物質的性質而定，將篩選輪數設定為12輪。將10n g人免疫球蛋白E用PH9. 6的碳酸緩衝液包被於酶聯板上，37°(:作 用3小時，同時設定空白對照孔。樣本孔和對照孔用3%的BSA封閉2小時。 將純化的單鏈DNA文庫lng在SELEX結合緩衝液中先與空白對照孔作用40分鐘， 反篩去除與BSA結合的單鏈DNA，然後轉移到人免疫球蛋白E包被孔與蛋白結 合40分鐘，用SELEX結合緩衝液洗滌6次，再加入SELEX洗脫液於8(TC作用 IO分鐘，洗脫下與人免疫球蛋白E結合的ssDNA，經酚氯仿抽提、乙醇沉澱， 得到純化的單鏈DNA。重複上述步驟，12輪後適配子與人免疫球蛋白E的親和 力達到飽和，得到可與人免疫球蛋白E高親和性的單鏈DNA適配子。不經修飾的適配子易被體液中的核苷酸酶降解，如對適配子進行適當的修 飾，則可避免降解。用磷硫乙酸(phosphrothiate)連接物修飾可增強適配子 對核酸酶的抵抗。體液中的核酸酶為嘧啶特異性，取代2'位的嘧啶則可避免 被降解，用2 '氨基或2 '氟基取代嘧啶後再製備適配子，則更適於診斷和治療。4. 適配子親和力測定每輪SELEX篩選產物，以標記生物素的引物進行PCR擴增，用酚氯仿抽提、 乙醇沉澱純化後，測定含量，與待測蛋白分子混合併加入辣根過氧化物酶標記 親和素，顯色測定親和力。5. 適配子的克隆與測序最後一輪篩選出的ssDNA適配子用不帶生物素的引物進行PCR擴增，產物 回收純化後用TaKaRa公司提供的pMD18-TSi即leVector試劑盒連接到pMD18-T 載體上，轉化到大腸桿菌DH5 a ，氨卞抗性篩選，挑取單個生長菌落進行測序。6. 將各單個生長菌落所對應的適配子用生物素標記，量為O.lug，與每 孔10u g包被的人免疫球蛋白E在SELEX結合緩衝液中37'C結合40分鐘，用 SELEX衝洗緩衝液洗滌6次，加入l: 1000的辣根過氧化物酶標鏈黴親合素， 37*€作用30分鐘，用PBS緩衝液洗滌4次，洗去未與人免疫球蛋白E上DNA生 物素結合的酶標鏈黴親合素，然後加入四甲基聯苯胺在室溫顯色作用20分鐘， 加入2M濃硫酸終止顯色反應，450nm酶聯儀測定OD值，選取OD值最高的DNA 適配子，該適配子即為能與人免疫球蛋白E特異結合的DNA適配子，將該適配 子測序獲得其序列，並進行結構分析獲得該適配子的二級結構圖譜(見圖2)。本發明所用的SELEX結合緩衝液為8.1 mM Na2HP04， 1.1 mM KH2P04， 1 mM MgCl2， 2. 7 mM KC1， 138 mM NaCl， pH 7. 4; SELEX衝洗緩衝液為5 mM Na2HP04， 5 mM KH2P04， 2 mM MgCl2, 1% (v/v) Tween-20, pH 7. 4; PBS緩衝液為10 u M PBS buffer, 0. 2 M NaCl， pH 7.9。本發明實驗所用酚氯仿抽提液為25ml的酚，24ml的氯仿，1ml的異戊 醇混合物。將由上述過程獲得的適配子進行單側延長臂修飾，然後通過生物素一親合 素連接基團將螢光素、生物素、放射性同位素、膠體金或乳膠顆粒標記在單側 延長臂的末端，將獲得的適配子轉化為報告適配子，就可從臨床血、尿、組織 標本及培養上清中檢測相應的靶物質，從而達到快速、準確檢測的目的。用本發明獲得的人免疫球蛋白E的適配子代替抗體，進行人免疫球蛋白E 的檢測，具有許多優越性由於適配子與抗原的親和力要強於抗原抗體之間的 親和力，因而適配子與結合抗原間的強特異性結合，幾乎可以完全避免非特異 性結合，而且即使是免疫原性較弱的蛋白也同樣可以獲得其高特異性的適配子； 適配子的篩選比抗體篩選時間更短，易於製備，穩定性好，且容易標記。因此,. 利用SELEX技術篩選人免疫球蛋白E的特異性適配子，將為人免疫球蛋白E的 診斷提供一種新的研究思路。
權利要求
1、 一種應用適配子型試劑檢測、鑑定和/或定量化合物的方法，其特徵在於，利用SELEX技術，以具有診斷價值的各種生物分子，包括核苷酸序列、蛋 白質、胺基酸、肽鏈、糖類或完整的菌體為靶物質，篩選獲得這些靶物質相應 的高特異性適配子，包括以下步驟1) 從具臨床診斷意義的各種物質中尋找、製備可用於SELEX技術篩選的靶 物質，包括(1) 具診斷意義的蛋白質、肽鏈，如hTSH、 hLH、 hCG、 hFSH激素；人免 疫球蛋白分子；(2) 具診斷意義的核苷酸序列，如B型肝炎病毒核酸片段、HIV病毒核 酸片段；(3) 具診斷意義的細菌或病毒顆粒，如結核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌；2) 利用SELEX技術篩選獲得各種靶物質的適配子，包括(1) 構建合適的隨機單鏈寡核苷酸文庫，包括單鏈DNA和/或RNA文庫， 其兩端為固定序列用於設計引物，中間為隨機序列用於提供與各種靶物質結合 豐富的核酸配基；(2) 優化PCR擴增條件；(3 )不對稱PCR法或生物素鏈親合素磁珠法製備單鏈DNA文庫；(4) 以硝酸纖維素膜、親和樹脂或微孔板為分離介質的靶物質篩選過程;3) 建立適配子技術檢測臨床待測標本，包括(1) 提供靶物質的高親和性適配子，並對其進行修飾；(2) 對適配子分子進行單側延長臂修飾；(3) 採用連接基團將檢測標記物在延長臂末端對獲得的適配子進行標記；(4) 混合含適配子的檢測試劑和待檢測、鑑定和/或定量的樣品；(5) 檢測結合物的信號變化。
2、根據權利要求1所述的應用適配子型試劑檢測、鑑定和/或定量化合物 的方法，其特徵在於，所述單側延長臂為核苷酸片段，其序列長度為5至50個 鹼基。
3、 根據權利要求l所述的應用適配予型試劑極測、鑑^^ft/或定量化合物 的方法，其特徵在於，所述適配子是微生物、病毒的適配子或者蛋白質、肽類 激素的適配子或核酸分子的適配子。
4、 根據權利要求1所述的應用適配子型試劑檢測、鑑定和/或定量化合物 的方法，其特徵在於，所述檢測標記物是放射性同位素、化學發光基團、化學 螢光基團、乳膠顆粒、螢光蛋白、酶、抗原、抗體、配體或受體中的一種或多 種組合，優選是乳膠顆粒。
5、 一種應用適配子型試劑檢測、鑑定和/或定量化合物的試劑盒，其特徵 在於，包括通過以下步驟獲得的適配子1) 從具臨床診斷意義的各種物質中尋找、製備可用於SELEX技術篩選的耙 物質，包括(1) 具診斷意義的蛋白質、肽鏈，如hTSH、 hLH、 hCG、 hFSH激素；人免 疫球蛋白分子；(2) 具診斷意義的核苷酸序列，如B型肝炎病毒核酸片段、HIV病毒核 酸片段；(3) 具診斷意義的細菌或病毒顆粒，如結核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌；2) 利用SELEX技術篩選獲得各種耙物質的適配子，包括(1) 構建合適的隨機單鏈寡核苷酸文庫，包括單鏈DNA和/或RNA文庫， 其兩端為固定序列用於設計弓I物，中間為隨機序列用於提供與各種靶物質結合 的豐富核酸配基；(2) 優化PCR擴增條件；(3 )不對稱PCR法或生物素鏈親合素磁珠法製備單鏈DNA文庫；(4) 以硝酸纖維素膜、親和樹脂或微孔板為分離介質的耙物質篩選過程；3) 建立適配子技術檢測臨床待測標本，包括:.(1)提供耙物質的高親和性適配子，並對其進行修飾；(2)對適配子分子進行單側延長臂修飾； (3) 採用連接基團將檢測標記物連接在延長臂宋端對獲得韻適配子進行標記；(4) 混合含適配子的檢測試劑和待檢測、鑑定和/或定量的樣品；(5) 檢測結合物的信號變化。
6、根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述單側延長臂為核苷酸 片段，其序列長度為5至50個鹼基。
7、 根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述適配子是微生物、 病毒的適配子或者蛋白質、肽類激素的適配子或核酸分子的適配子。
8、 根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述的連接基團是抗原 或抗體、配體或受體，生物素或親合素中的一種或多種組合，優選是生物素一 親合素基團。
9、 根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述檢測標記物是放射 性同位素、化學發光基團、化學螢光基團、乳膠顆粒、螢光蛋白、酶、抗原、 抗體、配體或受體中的一種或多種組合，優選是乳膠顆粒。
10、 權利要求5-9任一項所述的試劑盒或權利要求1-4任一項所述的方法 應用在臨床檢測、毒品檢測、食品安全檢測中。
全文摘要
本發明涉及一種應用適配子型試劑檢測、鑑定和/或定量化合物的方法，其特徵在於，利用SELEX技術，以具有診斷價值的各種生物分子，包括核苷酸序列、蛋白質、胺基酸、肽鏈、糖類或完整的菌體為靶物質，篩選獲得這些靶物質相應的高特異性適配子。本發明有益效果為能顯著提高檢測結果的重複性、穩定性，減少檢測的批間差異，充分保證測定結果的可靠性。可用於臨床靶分子的快速、簡便診斷，可以為實驗室診斷提供有利依據，本方法還具有測試時間短、試劑成本低、研發周期短、質量穩定等優點。
文檔編號G01N33/53GK101144814SQ20071016343
公開日2008年3月19日 申請日期2007年10月22日 優先權日2007年10月22日
發明者姚春豔, 府偉靈, 黃君富, 齊永志 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院