一種細胞計數的方法
2023-12-01 05:54:26 4
專利名稱：一種細胞計數的方法
技術領域：
本發明涉及一種測量方法，具體地說，是關於細胞計數的方法及其用途，尤其是 該方法在細胞內蛋白印跡中的應用。
背景技術：
細胞計數是在生命科學研究中經常使用的技術。目前有許多方法用於細胞計數，
但是又各有局限經典的血球計數板法及其系列衍生方法(如申請號為01213605.0的 中國專利所述細胞計數方法)雖然測量直觀，但由於細胞分散不利或檢測人員的熟練 程度等原因會產生計數誤差，且單個樣本計數耗時較長，無法同時對大量樣本進行操 作，降低了實驗結果的平行性.；染色法雖然可以滿足批量操作的要求，但是各種染料 的消耗又提高了實驗的成本(如日本專利WO2006t)03696)。尤其是在使用細胞內蛋白 印跡(In-cellwestern,ICW)測量某種蛋白在細胞內的表達的實驗中，需要對細胞的總 數進行計算，使用的螢光染料(如美國專利US5563070，歐洲專利EP0634640等)價 格更是昂貴，同時數據的準確性不高。
發明內容
為了克服現有技術計數準確度不高、成本高昂等不足，本發明提供了一種成本低 廉，數據可靠，批處理結果平行性好的細胞計數方法。
本發明所採用的技術方案步驟包括以下步驟
1. 將需要計數的未知數量的實驗組細胞和至少4組已知數量的標準組細胞貼壁培 養於平面之上；
2. 需要細胞計數時吸去原培養基，用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗細胞一次；
3. 加入濃度為0. 1% 1%的戊二醛溶液浸泡細胞10分鐘~1小時；
4. 吸去戊二醛溶液，用PBS清洗細胞兩次以上；
5. 吸去殘存PBS，並晾乾細胞培養平面；
6. 使用紅外雷射掃描成像系統，選擇660nm—710nm之間任一波長雷射激發，在 大於激發雷射波長40nm處檢測樣品的螢光強度；
7. 結合標準組已知細胞數量與螢光強度繪製標準曲線，得到螢光強度1# 與細胞 數量N標準的關係公式I標a-aXN標準+b，其中a為一元線性相關係數，b為
截距，皆通過標準曲線計算得知； 8.根據標準曲線和實驗組細胞樣品的螢光強度計算實驗組細胞數量，即N實驗二 (I 實驗—b)/a。
所述的戊二醛溶液採用水、生理鹽水、PBS緩衝液作為溶劑配製。
本發明能夠應用於細胞內蛋白印跡，在所述的步驟5中，吸出PBS溶液，用 Ttriton-X100溶液洗滌若干次，每次3 5分鐘；加入封閉劑室溫振蕩1~3小時；加入 纖維連接蛋白抗體於4°C保持10~16小時或室溫下保持4小時，用吐溫洗滌液洗滌若 幹次，每次3 5分鐘；加入800nm螢光標記二抗於室溫振蕩l 3小時，再用吐溫洗滌 液洗滌若干次，每次3 5分鐘；吸去殘存液體並晾乾96孔細胞培養板；在所述的步驟 6之前使用紅外雙色雷射掃描成像系統Odyssey對96孔板進行掃描,780nm雷射激發， 檢測820nm波長處樣品的螢光強度，該螢光強度代表纖維連接蛋白的含量；在所述的 步驟8之後用代表纖維連接蛋白的含量820nm波長處螢光強度除以該實驗組的細胞 數，求出平均每個細胞所表達的纖維連接蛋白的數量。
本發明的有益效果是由於採用戊二醛對細胞進行浸泡處理，在起到固定細胞作 用的同時，利用戊二醛與蛋白質相互作用產生紅外螢光這一現象，結合紅外螢光檢測 設備對細胞數目進行計算，與現有技術相比，本發明體現了簡化實驗步驟，降低成本 (與使用螢光染料相比費用降低十幾倍)，提高實驗精度及結果平行性的有益效果。
下面結合實施例對本發明進一步說明。
具體實施例方式
實施例h使用本發明所述方法進行細胞計數
1. 人骨肉瘤細胞MG-63以未知密度(實驗組)及己知的每孔密度(標準組)16 X104、 8X104、 4X104、 2X104、 1X104、 0.5X104、 0.25乂104個細胞，接入96 孔細胞培養板；
2. 培養6小時待細胞充分貼壁後，吸出培養基，用PBS溶液清洗孔內細胞一次；
3. 向孔內加入加入0.5%戊二醛溶液，其體積應至少可以覆蓋所培養的細胞，靜 置30分鐘；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內細胞至少兩次；
5. 吸去殘存水分，並晾乾96孔細胞培養板；
6. 使用紅外雙色雷射掃描成像系統Odyssey， 680nm雷射激發，檢測720nm波長 處樣品的螢光強度；
7. 結合標準組已知細胞數量與螢光強度繪製標準曲線，得到螢光強度Iwt與細胞 數量N標準的關係公式I標準-aXN標準+b，其中a為一元線性相關係數，b為截 距，皆通過標準曲線計算得知；
8. 根據標準曲線和實驗組細胞樣品的螢光強度計算實驗組細胞數量，即N^二 (I 實驗—b)/a0
採用本發明所述的方法對細胞進行計數，在線性範圍廣(0.25X104 16X104)， 數據結果平行性好，線性程度高(112 = 0.998)，根據所得一元方程及測量樣本的720nm 處螢光強度，可以快速、準確的計算出樣本中的細胞數目。
實施例2:使用本發明所述方法進行細胞計數
1. 人骨肉瘤細胞MG-63以未知密度(實驗組)及已知的密度(標準組)按每孔16 X104、 8XI04、 4X104、 2X104、 1X104、 0.5乂104細胞，接入48孔細胞培養板；
2. 培養6小時待細胞充分貼壁後，吸出培養基，用PBS溶液清洗孔內細胞一次；
3. 向孔內加入加入1%戊二醛(PBS配置)溶液，其體積應至少可以覆蓋所培養的 細胞，靜置10分鐘；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內細胞至少兩次；
5. 吸去殘存水分，並晾乾48孔細胞培養板；
6. 使用紅外雷射掃描成像系統，660nm雷射激發，檢測700nm波長處樣品的螢光 強度；
7. 結合標準組已知細胞數量與螢光強度繪製標準曲線，得到螢光強度1 與細胞數 量N標準的關係公式I標準=aXN +b，其中a為一元線性相關係數，b為截距， 皆通過標準曲線計算得知；
8. 根據標準曲線和實驗組細胞樣品的螢光強度計算實驗組細胞數量，即N錢=(I 實驗—b)/a。
採用本發明所述的方法對細胞進行計數，在線性範圍廣(0.5X104 16X104)， 數據結果平行性好，線性程度高(R2二0.995)，根據所得一元方程及測量樣本的700nm
處螢光強度，可以快速、準確的計算出樣本中的細胞數目。 實施例3:使用本發明所述方法進行細胞計數
1. 人骨肉瘤細胞MG-63以未知密度(實驗組)及已知密度(標準組)按每孔8X
104、 4X104、 2X104、 1X104、 0.5X14細胞，接入384孔細胞培養板；
2. 培養6小時待細胞充分貼壁後，吸出培養基，用PBS溶液清洗孔內細胞一次；
3. 向孔內加入加入0.1%戊二醛(PBS配置)溶液，其體積應至少可以覆蓋所培養 的細胞，靜置l小時；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內細胞至少兩次；
5. 吸去殘存水分，並晾乾384孔細胞培養板；
6. 使用紅外雷射掃描成像系統，710nm雷射激發，檢測750nm波長處樣品的螢光 強度；
7. 結合標準組已知細胞數量與螢光強度繪製標準曲線，得到螢光強度Iff應與細胞 數量N標準的關係公式I標準-aXN標準+b，其中a為一元線性相關係數，b為截 距，皆通過標準曲線計算得知；
8. 根據標準曲線和實驗組細胞樣品的螢光強度計算實驗組細胞數量，即N錢- (I 實驗一b)/a。
採用本發明所述的方法對細胞進行計數，在線性範圍廣(0.25X104 8X104)， 數據結果平行性好，線性程度高(R2^0.996)，根據所得一元方程及測量樣本的720nm 處螢光強度，可以快速、準確的計算出樣本中的細胞數目。
實施例4 :本發明在細胞內蛋白印跡中的應用 以檢測人骨肉瘤細胞MG-63的纖維連接蛋白表達為例
1. 將未知數量的細胞(實驗組)和己知數量的系列標準組MG-63細胞(4X 104、 2X104、 1X104、 0.5X104)接入96孔細胞培養板培養適當時間；
2. 吸去培養基，用PBS溶液小心清洗孔內細胞；
3. 加入0.5%戊二醛(PBS配置)溶液，靜置30分鐘後；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內細胞至少兩次；
5. 吸出PBS溶液，用Ttriton-XlOO溶液洗滌5次，每次5分鐘；加入封閉劑 室溫振蕩2小時；加入纖維連接蛋白抗體於4°C保持16小時，用吐溫洗滌 液洗滌5次，每次5分鐘；加入800nm螢光標記二抗於室溫振蕩1小時， 再用吐溫洗滌液洗滌5次，每次5分鐘；吸去殘存液體並晾乾96孔細胞培 養板；
6. 使用紅外雙色雷射掃描成像系統Odyssey對96孔板進行掃描，780nm雷射 激發，檢測820nm波長處樣品的螢光強度，該螢光強度代表纖維連接蛋白 的含量；
7. 使用紅外雙色雷射掃描成像系統Odyssey對96孔板進行掃描，680nm雷射 激發，檢測720nm波長處樣品的螢光強度，該螢光強度代表細胞數量；
8. 結合標準組已知細胞數量與螢光強度繪製標準曲線，得到720nm波長處熒 光強度I標準與細胞數量N標準的關係公式I鄉=aXN Ml.+b，其中a為一 元線性相關係數，b為截距，皆通過標準曲線計算得知；
9. 根據標準曲線和實驗組細胞樣品的螢光強度計算實驗組細胞數量，即N^ =(I實驗一b)/a;
10. 用代表纖維連接蛋白的含量820nm波長處螢光強度除以該實驗組的細胞 數，求出平均每個細胞所表達的纖維連接蛋白的數量。
實施例5 :本發明在細胞內蛋白印跡中的應用 以檢測人骨肉瘤細胞MG-63的纖維連接蛋白表達為例
1. 將未知數量的細胞(實驗組)和已知數量的系列標準組MG-63細胞(4X 104、 2X104、 1X104、 0.5X104)接入96孔細胞培養板培養適當時間；
2. 吸去培養基，用PBS溶液小心清洗孔內細胞；
3. 加入0.5%戊二醛(PBS配置)溶液，靜置30分鐘後；
4. 吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔內細胞至少兩次；
5. 吸出PBS溶液，用Ttriton-X100溶液洗滌4次，每次3分鐘；加入封閉劑 室溫振蕩3小時；加入纖維連接蛋白抗體於室溫4小時，用吐溫洗滌液洗 滌4次，每次3分鐘；加入800nm螢光標記二抗於室溫振蕩3小吋，再用
吐溫洗滌液洗滌4次，每次3分鐘；吸去殘存液體並晾乾96孔細胞培養板；
6. 使用紅外雙色雷射掃描成像系統Odyssey對96孔板進行掃描，780nm雷射 激發，檢測820nm波長處樣品的螢光強度，該螢光強度代表纖維連接蛋白 的含量；
7. 使用紅外雙色雷射掃描成像系統Odyssey對96孔板進行掃描，680nm雷射 激發，檢測720nm波長處樣品的螢光強度，該螢光強度代表細胞數量；
8. 結合標準組已知細胞數量與螢光強度繪製標準曲線，得到720nm波長處熒 光強度I標準與細胞數量N標準的關係公式I標準-aXN標準+b，其中a為一 元線性相關係數，b為截距，皆通過標準曲線計算得知；
9. 根據標準曲線和實驗組細胞樣品的螢光強度計算實驗組細胞數量，即N實驗 =(I實驗一b)/a;
10. 用代表纖維連接蛋白的含量820nm波長處螢光強度除以該實驗組的細胞 數，求出平均每個細胞所表達的纖維連接蛋白的數量。
細胞內蛋白印跡目的在於檢測細胞中某種蛋白的表達量，為了對不同樣本進行歸 一化處理，以消除實驗樣品中細胞數量的差異而導致的數據誤差，需要對各個樣本的 細胞數進行量化， 一般使用兩種與核酸結合的螢光染料進行細胞計數。將本發明所述 方法運用於細胞內蛋白印跡中，使用戊二醛進行細胞計數，大大降低了成本，同時戊 二醛作為一種已知的固定劑，在該細胞內蛋白印跡中兼有固定細胞和細胞計數的雙重 作用，從而簡化了實驗的操作步驟。
權利要求
1、一種細胞計數的方法，其特徵在於包括下述步驟(a)將需要計數的未知數量的實驗組細胞和至少4組已知數量的標準組細胞貼壁培養於平面之上；(b)需要細胞計數時吸去原培養基，用磷酸鹽緩衝液清洗細胞一次；(c)加入濃度為0. 1％～1％的戊二醛溶液浸泡細胞10分鐘～1小時；(d)吸去戊二醛溶液，用磷酸鹽緩衝液清洗細胞兩次以上；(e)吸去殘存磷酸鹽緩衝液，並晾乾細胞培養平面；(f)使用紅外雷射掃描成像系統，選擇660nm—710nm之間任一波長雷射激發，在大於激發雷射波長40nm處檢測樣品的螢光強度；(g)結合標準組已知細胞數量與螢光強度繪製標準曲線，得到螢光強度I標準與細胞數量N標準的關係公式I標準＝a×N標準+b，其中a為一元線性相關係數，b為截距，皆通過標準曲線計算得知；(h)根據標準曲線和實驗組細胞樣品的螢光強度計算實驗組細胞數量，即N實驗＝(I實驗—b)/a。
2、 根據權利要求1所述的一種細胞計數的方法，其特徵在於所述的戊二醛 溶液採用水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝液作為溶劑配製。
3、 根據權利要求1所述的一種細胞計數的方法，其特徵在於所述的步驟(e) 中，吸出PBS溶液，用Ttriton-XlOO溶液洗滌若干次，每次3 5分鐘；加入封 閉劑室溫振蕩1~3小時；加入纖維連接蛋白抗體於4°C保持10~16小時或室溫 下保持4小時，用吐溫洗滌液洗漆若干次，每次3 5分鐘；加入800nm螢光標 記二抗於室溫振蕩1~3小時，再用吐溫洗滌液洗滌若干次，每次3 5分鐘；吸 去殘存液體並晾乾96孔細胞培養板；在所述的步驟(f)之前使用紅外雙色雷射 掃描成像系統Odyssey對96孔板進行掃描，780nm雷射激發，檢測820nm波 長處樣品的螢光強度，該螢光強度代表纖維連接蛋白的含量；在所述的步驟(h) 之後用代表纖維連接蛋白的含量820nm波長處螢光強度除以該實驗組的細胞 數，求出平均每個細胞所表達的纖維連接蛋白的數量。
全文摘要
本發明公開了一種細胞計數的方法，將需要計數的實驗組細胞和已知數量的標準組細胞貼壁培養於平面之上；吸去原培養基，清洗細胞，加入戊二醛溶液浸泡，用磷酸鹽緩衝液清洗細胞後晾乾細胞；使用紅外雷射檢測樣品的螢光強度；結合已知細胞數量與螢光強度繪製標準曲線，得到螢光強度I標準與細胞數量N標準的關係公式I標準＝a×N標準+b；根據標準曲線和實驗組細胞樣品的螢光強度計算實驗組細胞數量，即N實驗＝(I實驗-b)/a。本發明體現了簡化實驗步驟，降低成本，提高實驗精度及結果平行性的有益效果。
文檔編號C12Q1/02GK101382482SQ200810231880
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月24日 優先權日2008年10月24日
發明者澎 商, 維 張, 李京寶, 哲 王, 田宗成, 續惠雲, 麗 謝, 騫愛榮 申請人:西北工業大學